Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование соединений группы фторхинолонов иммобилизованных на различных носителях

На правах рукописи

Карлов Павел Михайлович

003474305

ИССЛЕДОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ГРУППЫ ФТОРХИНОЛОНОВ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА РАЗЛИЧНЫХ НОСИТЕЛЯХ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Курск-2009 2 5 (ИОН 2003

003474305

Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении Высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Сипливая Любовь Евгеньевна Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Яцкж Валентина Яковлевна кандидат фармацевтических наук, доцент Дурицин Евгений Петрович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

А , ,

Защита состоится «)»и \ю/Л 2009 г. в 1*4 часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (205041, г.Курск, ул.К.Маркса, д.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава. Автореферат разослан «| » уа 1оус/2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Соединения группы фторхинолонов являются значимой группой химиотерапевтических средств с выраженным антибактериальным эффектом. Они проявляют высокую противомикробную активность как против грам положительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Однако, имеется ряд побочных эффектов, характерных в большей или меньшей степени для всех препаратов группы. Это артро-, кардио-, гепато-, нефротоксичность, фотосенсибилизадия. Серьезность побочных действий, выявленных в клинических исследованиях, предопределило снятие с медицинского применения ряда фторхинолонов и поиск способов снюкения интенсивности и количества проявляемых побочных эффектов.

Перспективным направлением в терапии различных патологий является использование технологий направленного транспорта лекарственных средств, позволяющих значительно снизить юс системную токсичность, удлинить время полувыведения препаратов из организма, уменьшить терапевтическую дозу и кратность введения. Контролируемая и целенаправленная доставка в организм гнтабактериальных препаратов основана на использовании различных носителей или векторов, обладающих тропностью к определенным органам или их клеткам. В качестве векторов могут выступать гормоны, ферменты а также микроконтейнеры: липосвмы, капсулы из человеческого альбумина и аутоклетки крови. Наиболее выгодными с точки зрения биологической совместимости считаются системы доставки, в которых используются собственные клетки организма, в частности, эритроциты, лейкоциты и тромбоциты.

Для получения клеточных форм фторхинолонов с дозированным содержанием действующего вещества необходима точная, экспрессная, легко воспроизводимая и экономически выгодная методика их стандартизации. Для количественного определения фторхинолонов в субстанциях и лекарственных формах фармакопейным является метод титрования в неводных средах, который характеризуется большой трудоемкостью и длительностью, а также высокой токсичностью используемых реактивов. В современных лабораториях большое распространение получил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, но высокая стоимость одного анализа, трудоемкость и необходимость наличия высококвалифицированного специалиста для работы с хроматографом снижают возможные темпы распространения данного метода.

В последние годы всё большее внимание исследователей привлекают оптические метода анализа, одним из которых является спектрофотометрия. К достоинствам данного метода можно отнести высокую воспроизводимость и экспргсгность. Анализ литературных источников показывает, что спектрофотометричегкие методики

количественного определения фторхинолонов разработаны недостаточно. В связи с этим возникает необходимость разработки экспрессной и точной методики количественного определения фторхинолонов в субстанциях, лекарственных формах и иммобилизованных в клеточные носители.

Цель и задачи исследования.

Цель работы - получение клеточных форм соединений группы фторхинолонов, разработка методик их анализа.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные

задачи:

1. Разработать методики качественного и количественного определения фторхинолонов в субстанциях и лекарственных формах;

2. Выделить и получить клеточные носители: эритроцитарные (ЭН) и лейкоцитарные (ЛН);

3. Получить клеточные формы фторхинолонов;

4. Разработать методики выделения исследуемых препаратов из клеточных носителей и биоматериала.

5. Разработать методики качественной оценки и количественного определения клеточных форм фторхинолонов;

6. Изучить иммуномодулирующую и антиоксидантную активности изучаемых фторхинолонов, иммобилизованных в ЭН и ЛН при токсическом поражении почек, осложненном стафилококковой инфекцией.

Научная новизна исследований.

Впервые получены клеточные (эритроцитарные и лейкоцитарные) формы норфлоксацина, офлоксацина и цопрофлоксацина. Изучено влияние различных факторов на динамику включения и высвобождения фторхинолонов из клеточных носителей. Экспериментально обоснована возможность использования ЭН и ЛН для транспорта изучаемых веществ, определены их сроки хранения.

Разработаны спектрофотометрические методики количественного определения фторхинолонов в субстанциях и таблетках, которые отличаются простотой, достаточной точностью и экспрессностью.

Исследованы условия выделения фторхинолонов из биологических материалов при помощи колоночного варианта гель-хроматографии.

Предложены методики количественного спеетрофотометрического определения фторхинолонов в плазме крови, гемолизате клеток и в клеточных носителях, которые отличаются достаточной точностью, чувствительностью и экспрессностью.

4

Проведена сравнительная оценка метрологических характеристик разработанных спектрофотометрических методик с данными анализа методом ВЭЖХ, что позволило сделать объективные выводы о преимуществах и недостатках сравниваемых методов.

Установлено, что введение эритроцитарных клеточных форм фторхинолонов животным с ОПН в сочетании со стафилококковой инфекцией снижало выраженность иммуносупрессии, процессов перекисного окисления липидов и активировало антиоксидантную защиту эритроцитов. Введение лейкоцитарных клеточных форм фторхинолонов крысам с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией нормализовало данные процессы.

Практическая значимость работы.

Разработанные методики спектрофотометрического количественного определения норфлоксацина, офлоксадина и ципрофлоксацина гидрохлоридов в субстанциях и таблетированной лекарственной форме могут быть использованы для контроля качества рассматриваемых препаратов.

На основе колоночного варианта гель-хроматографического выделения фторхинолонов из биологических материалов разработаны методики количественного определения норфлоксацина, офлоксадина и ципрофлоксацина в плазме крови и гемолизате клеточных носителей. Представленные методики могут быть использованы в клинических лабораториях для проведения терапевтического мониторинга при лечении исследуемыми препаратами, а также для их количественной оценки при использовании клеточных форм фторхинолонов.

Представленные методики имеют ряд преимуществ перед существующими: повышают объективность и оперативность анализа, не уступая по чувствительности и точности определения.

Полученные результаты внедрены в научную и практическую работы кафедр КГМУ, БГУ и ВГМА, а также в работу Курского филиала ФГУ по контролю предметов медицинского назначения Росздрава.

Связь задач исследования с проблемным планом

фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме "Фармация" межведомственного научного совета №36. Номер государственной регистрации 01.2.00703415.

Основные положения, выносимые на защиту:

-методики спеетрофотометрического определения норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина в субстанциях и таблетированой лекарственной форме;

-методики количественного спектрофотометрического определения норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина плазме крови и гемолизате клеток крови;

-методика количественной оценки фторхинолонов при иммобилизации их в ЭН и

ЛН;

-результаты изучения включения и высвобождения исследуемых веществ из ЭН и ЛН, стабильности клеточных носителей;

-иммунометаболическая активность клеточных форм фторхинолонов при токсическом поражении почек в условиях стафилококковой инфекции.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на конференциях молодых учёных и студентов КГМУ (Курск, 2007-2009г.), итоговых научных конференциях КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2008, 2009гг.), международной конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании» (Одесса, 2007г.), а также представлены в сборниках тезисов докладов соответствующих конференций й сессий. Апробация работы проведена на научно-практической конференции кафедр фармакогнозии и ботаники, фармацевтической технологии, экономики и управления фармации, фармацевтической, токсикологической и аналитической химии.

Публикации.

Основное содержание работы отражено в 9 публикациях, 1 из которых - в международной печати, 2 публикации - в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных научных трудов.

Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (6 глав), общих выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста, содержат 12 рисунков, 37 таблиц и 6 формул. Список цитируемой литературы включает 268 источников, из которых 128 на иностранных языках.

В первой главе (обзор литературы) приводятся обобщенные данные по физико-химическим и фармакологическим свойствам препаратов группы фторхинолонов,

методам их анализа, а также сведения по использованию технологии направленного транспорта лекарственных препаратов в организм.

Вторая глава включает в себя материалы и методы исследования, использованные в работе.

Третья глава диссертации посвящена качественному анализу исследуемых препаратов к разработке методик их количественного анализа в субстанциях и в таблетированной лекарственной форме.

Четвертая глава включает экспериментальные данные по разработке методик изолирования и количественного определения фторхинолонов в плазме крови и гемолизахе клеток крови.

В пятой главе проводится сравнение предлагаемых методик спектрофотометрического определения фторхинолонов с существующими методиками их анализа методом ВЭЖХ.

Шестая глава посвящена вопросам выделения и получения клеточных форм фторхинолонов, разработке методик их количественного определения, изучения стабильности и устойчивости к десорбции.

Седьмая глава содержит данные о иммунометаболической активности клеточных форм фторхинолонов в условиях токсического поражения почг-к, осложненного стафилококковой инфекцией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали заводские субстанции норфлсксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина гидрохлоридов, а также таблеточные массы препаратов, отвечающие требованиям действующей нормативной документации (ФС).

В качестве стандартов при разработке методик количественного определения использовали стандартные образцы норфлоксадина, офлоксацина и ципрофлоксацина.

Для выполнения экспериментов использовали растворители и peaimmu, имеющие квалификацию "химически чистый" или "чистый для анализа". Для выделения антибиотиков из биологических материалов были применены бисерно полимерные гели декстрана марок G-10, G-15, G-25, G-50 ("Pharmacia Fine Chemicals", Швеция).

Клеточные носители выделяли из донорской крови. В экспериментах с живогными кровь получали из яремной вены под эфирным наркозом. Эритроциты выделяли путем 2-х кратного отстаивания в растворе Na-фосфатного буфера, содержащего 3% декстрана Т-500, и последующей очисткой с помощью HBS-целлюлозы в На-фосфатном буфере (В. Beutleretal., 1985)

Для включения антибиотиков в эритроцитарные носители (ЭН) использовали метод гипоосмотического гемолиза в модификации (Жумадияов с соавт., 1990). Для получения суспензии лейкоцитов гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл крови) смешивали с 3% желатином (ОД мл/мл) и выдерживали 15-20 мин при 37°С. После оседания эритроцитов слой плазмы, обогащенной лимфоцитами, переносили в силиконизированные пробирки. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об. мин, дважды отмывали раствором Хенкса и помещали в среду 199. Количество клеток подсчитывали под микроскопом в камере Горяева. Для включения антибиотиков в лейкоцитарные носители (ЛН) использовали методику Лохвицкого С. В . (Лохвицкий СВ., 1992).

Острую почечную недостаточность, сочетанную со стафилококковой инфекцией, моделировали путем однократного внутрижелудочного введения 2мг/кг ртути дихлорида и внутрибрюшинной инъекцией предварительно оттитрованных доз суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus, содержащих 1*10® микробных тел в 0,5 мл раствора, крысам породы Вистар массой 150-180 г. Все исследования на животных проводили с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей» (г. Страсбург, Франция, 1986).

Препараты вводили внутримышечно пятикратно с интервалом 12 ч в разовых дозах 3 мг/кг. Дозы фторхинолонов, вводимых в ЭН и ЛН, составили 6 мг/кг. ЭН и ЛН с включенными фторхинолонами вводили внутривенно двукратно с интервалом 48 ч. Используемые дозы препаратов соответствовали рекомендованным терапевтическим дозам фторхинолонов, пересчитанным с учетом соотношения поверхности тела биологического объекта и его массы по общепринятой формуле межвидового переноса доз с применением коэффициента пересчета в зависимости от массы тела (Freireich М, et all и Улановой И.П. и др.).

Гуморальный иммунный ответ (ГИО) индуцировали однократным внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 2*108 клеток на 0,1 кг массы тела. Интенсивность развития ГИО на ЭБ оценивали на 5-е сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа клеток, образующих антитела (АОК) к ЭБ методом прямого локального гемолиза (Мальберг, К., 1987г.).

Антиоксидантный потенциал эритроцитов оценивали по активности супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионредукгазы (ГР). Выраженность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах оценивали по содержанию ацилгидроперекисей (АГП) и малонового диальдегида (МДА) (Макаренко В.В., 1988, Бенисевич В.И., Идельсон Л.И., 1973).

Используемое в работе оборудование: ИК-спектрофотометр «Avatar 360 FT- IR E.S.P.» (США), спектрофотометр СФ-46; Хроматограф Waters Alliance 2695 с диодно-матричным детектором 2998; Колонка 150 х 4,6 мм YMC-PackODS-A 3 мкм 12 нм.

Методики количественного определения разработаны на молельных смесях, в которых содержание исследуемого вещества было известно. Полученные результаты обрабатывали в соответствии с требованиями и с использованием пакета прикладных программ "Statistica 8.0". Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Вилкоксона-Мана-Уитни.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для разработки методик количественной оценки фторхинолонов, включенных в ЭН и ЛН, были разработаны методики количественного определения препаратов в субстанциях и таблетках.

В целях идентификации и разработки методик количественного определения исследованы спектральные характеристики норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина в УФ- и ИК- областях (рис. 1,2). Рассчитаны удельные и молярные коэффициенты светопоглощения, открываемый минимум и другие критерии (таблица 1).

100 {

50 ■]

1800 16СО 1400 1200 1000 600 600

Ш-1

Рисунок 1

ИК - спектр субстанции офлоксацина от 400 до 2000 см"1

Рисунок 2

УФ - спектр субстанции офлоксацина 200-400 нм

Затем были получены серии последовательных разведений (п 8-9), по ним построены калибровочные графики и рассчитаны уравнения калибровочных графиков (таблица 1).

Таблица 1

Результаты изучения зависимостей оптической плотности от концентрации фторхинолонов

критерии норфлоксацин офлоксацин ципрофлоксацин

п 8 9 9

Интервал линейности 1-10 мкг/мл 2-10 мкг/мл 1,5-10 мкг/мл

г 0,9998 0,9997 0,9999

Уравнение калибровочного 0=0,12980*С - Е)=0,08470*С - ЕМ),10315*С

графика 0,001510 0,001867 0,000230

£ 40690 23463 31163

Ь 1см 1298 847 1032

с„„„., мкг/мл 0,78 1,54 1,06

По полученным данным разработаны методики количественного спекгрофотометрического определения исследуемых веществ в субстанциях и таблетках.

При анализе субстанции около 0,1 г анализируемого фторхинолона (точная навеска) растворяли в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, объем раствора доводили до метки тем же растворителем. Аликвоту полученного раствора (4-6 мл) переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и объем раствора доводили водой очищенной до метки. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на

спектрофотометре в максимуме поглощения при соответствующей длине волны в кювете с толщиной рабочего слоя 1 см на фоне воды очищенной.

При анализе таблетированной лекарственной формы производили истирание не менее двух таблеток для получения таблеточной массы, затем проводили растворение точной навески порошка в воде очищенной. Проводили фильтрования полученного раствора при помощи беззольного фильтра. Объем полученного фильтрата доводили до 100 мл. Затем следовали методике, описанной для субстанций, исходя из теоретической концентрации раствора.

Разработка методик анализа фторхинолонов в биологических жидкостях, в частности, в плазме и клеточной массе, явилась логическим продолжением работы.

Плазма крови и гемолизат клеток крови представляют собой сложные гетерогенные системы, содержащие большое число эндогенных органических соединений, концентрации которых часто соизмеримы с концентрациями исследуемых лекарственных средств. В связи с этим анализ препаратов в них, как правило, проводят в два этапа На первом этапе полученные образцы биопроб обрабатывают с целью отделения изучаемых препаратов от сопутствующих веществ эндогенного происхождения, а на втором проводят идентификацию и количественное определение лекарственных веществ с помощью соответствующего инструментального метода.

Определение оптимальных условий удаления белка

Гемолиз клеток крови проводили путём добавления к клеточной массе семикратного количества воды, а для наиболее полного гемолиза проводили замораживание и размораживание клеточной массы.

Плазму крови и гемолизат подвергали очистке от белка различными осадителями (таблица 2). Оптимальным осадителем явился 30% раствор кислоты трихлоруксусной. Полноту осаждения компонентов крови оценивали по величине остаточной оптической плотности.

Исследования показали, что, как для плазмы крови, так и для гемолизата клеток крови оптимальное соотношение осадителя н биоматериалов 1:1 (таблица 3). Поэтому при выполнении методики к 2 мл плазмы крови или гемолизата клеток прибавляли 2 мл 30% раствора трихлоруксусной кислоты.

Таблица 2

Выбор оптимального осадителя

Способ осаждения Оптическая плотность

Плазма крови Гемолизат крови

Кипячение 0,354 0,384

10% раствор хлорной кислоты 0,330 0,363

20% раствор хлорной кислоты 0,216 0,245

30% раствор хлорной кислоты 0,129 0,160

10% раствор цинка сульфата+ 0,1 М раствор гидроксида наггрия 0,258 0,296

10% раствор трихлоруксусной кислоты 0,244 0,302

20% раствор трихлоруксусной кислоты 0,163 0,201

30% раствор трихлоруксусной кислоты 0,059 0,103

Отделение осажденного белка проводили центрифугированием от 3 до 15 мин при 8000 об/мин. Результаты отражены в таблице 4. Как видно из представленной таблицы, оптимальное время центрифугирования составляет 5 мин.

Таблица 3

Влияние соотношения осадителя и биоматериалов на полноту осаждения белка

Соотношение осадителя и биомаягериала Оптическая плотность

Плазма крови Гемолизат эритроцитов

0,5:1 0,893 0,914

0,75:1 0,334 0,353

1:1 0,071 0,101

1,5:1 0,068 0,087

Таблица 4 Влияние времени центрифугирования на полноту осаждения белка

Время центрифугирования Оптическая плотность

Плазма крови Гемолизат эритроцитов

3 0,336 0,353

5 0,069 0,103

10 0,069 0,109

15 0,068 0,102

Исследования показали, что действием 30% раствора трихлоруксусной кислоты не удается полностью избавиться от эндогенных компонентов биоматериатов, мешающих определению фторхинолонов. В связи с этим нами была исследокана возможность дополнительной очистки плазмы крови и гемолизата клеток методом гель-хроматографии.

В эксперименте использовали различные сефадексы, такие как 0-10, С-15,0-25, О-50, 0-75, которые выдерживали в воде очищенной в течение определённого времени при комнатной температуре. Так как сефадекс проявляет свойства слабого катионита и абсорбирует фторхинолоны из водных растворов в качестве элюента использовали раствор кислоты хлороводородной. Для полного элюирования изучаемых веществ достаточна её концентрация 0,01 М.

Подготовленную пробу вводили на поверхность геля в колонке и начинали процесс элюирования водой очищенной, при этом фторхинолоны оставались вверху колонки, а все сопутствующие вещества плазмы илигемолизата быстро выходили из колонки. В среднем выход элементов крови наблюдался с 8 по 12 фракции по 2 мл. Элюирование продолжали до 20 фракций для полноты удаления веществ, мешающих определению. Затем проводили смену элюента и промывали колонку 0,01 М раствором кислоты хлороводородной со скоростью 1 мл/мин. Элюаты собирали в пробирки фракциями по 2 мл, фторхинолоны выходили из колонки в 5-й-б-й фракциях. Содержание лекарственных препаратов в полученном элюате определяли спектрофотометрически по разработанной нами методике. Было установлено, что высота слоя сефадекса, равная 33 см, достаточна для разделения фторхинолонов и эндогенных компонентов крови.

Для оптимизации методики нами было уменьшено количество геля в колонке, что позволило значительно сократить время анализа и не сказалось на качестве разделения компонентов. Достаточно 11 см геля, что соответствует 3 г сухого сефадекса на 2 мл пробы.

Методика количественного определения фторхинолонов в плазме крови и гемолнзате клеток крови.

К 2 мл плазмы крови или гемолизата клеток крови прибавляли 2 мл 30% трихлоруксусной кислоты, перемешивали и центрифугировали 5 мин при 8000 об/мин. рН среды супернатанта доводили до нейтральной реакции, пробу количественно переносили в колонку с сефадексом й-Ю, предварительно уравновешенную водой очищенной. Через колонку пропускали 40 мл воды очищенной, затем проводили замену элюента на 0,01 М раствор кислоты хлороводородной. Первые 6 мл отбрасывали, а следующие 4 мл

13

собирали. Полученный элюат использовали для количественного определения фторхинолонов по методике, описанной для субстанций.

Для определения метрологических характеристик разработанных методик и сравнения их с наиболее распространенным в фармацевтическом анализе методом ВЭЖХ было проведено количественное определение фторхинолонов в образцах с известным их содержанием.

Для этого брали десять проб офлоксацина, норфлоксацина и ципрофлоксацина с концентрацией 5 мкг/мл и проводили определение по разработанной нами методике. Параллельно проводили количественное определение фторхинолонов методом ВЭЖХ. Для сравнения разработанной методики с методикой НД провели совместную статистическую обработку двух выборок, полученных при определении каждого из препаратов в субстанциях, таблетках и биоматериале (таблицы 5,6,7). Сравнительная оценка методик анализа проводилась путем сопоставления правильности и воспроизводимости полученных результатов.

Таблица 5

Метрологические характеристики при определении фторхинолонов в субстанциях

(ш=10; К95%;9)=2,26; Р(99%;9;9)=5,37)

метод Ц Х% Бх ДХ 8% ^ВЫЧ Рвьл

норфлоксацин

спектрофотометрический 100,0 99,73 1,06 0,34 0,78 0,78 0,83 1,25

ВЭЖХ 100,0 99,6 1,33 0,38 0,87 0,87 1,10

офлоксацин

спектрофотометрический 100,0 99,78 1,03 0,34 0,76 0,77 0,69 1,19

ВЭЖХ 100,0 99,53 1,55 0,41 0,94 0,94 1,19

ципрофлоксацин

спектрофотометрический 100,0 99,77 1,10 0,35 0,79 0,79 1,19 1,84

ВЭЖХ 100,0 99,55 2,02 0,47 1,07 1,07 1,00

Таблица б

Метрологические характеристики при определении фторхинолонов в таблетках(ш=10; ^95%;9)=2,26; Р()9%;9;9)=5Г37)

метод Х% Бх ДХ £ /О ¿выч Рцыч

норфлоксацин

спектрофотометрический 100,0 99,77 2,19 0,49 1,11 1,12 0,49 2,17

ВЭЖХ 100,0 99,29 1,01 0,34 0,76 0,75 2,23

офлоксацин

спектрофотометрический 100,0 99,80 2,11 0,48 1,09 1,10 0,44 2,07

ВЭЖХ 100,0. 99,42 1,02 0,34 0,76 0,77 1,82

ципрофлоксацин

спектрофотометрический 100,0 99,88 1,57 0,42 0,94 0,94 0,30 1,65

ВЭЖХ 100,0 99,44 0,95 0,32 0,73 0,74 1,82

Результаты сравнительной оценки количественного определения фторхинолонов свидетельствуют о том, что оба метода являются правильными и равно воспроизводимыми при определении в субстанциях и таблетках. При этом спектрофотометрический метод анализа значительно проще в исполнении и в два раза быстрее.

Таблица 7

Метрологические характеристики при определении фторхинолонов с: плазме крови

(т=10; 1(95%;9)=2,26; Р(Э9%;9;9)=5^7)

метод И Х% Бх ДХ е % ^ВЫЧ Рвы*

норфлоксацин

спектрофотометрический 100,0 94,55 2,67 0,55 1,23 1,3 10,53 1,09

ВЭЖХ 100,0 94,15 2,46 0,52 1,18 1,25 11,81

офлоксацин

спектрофотометрический 100,0 94,30 2,61 0,54 1,22 1,29 11,16 1,02

ВЭЖХ 100,0 93,79 2,97 0,57 1,30 1,38 11,40

ципрофлоксацин

спектрофотометрический 100,0 94,51 2,85 0,56 1,27 1,35 10,28 1,03

ВЭЖХ 100,0 93,59 2,76 0,55 1,25 1,34 12,19

При определении в биоматериале воспроизводимость обоих методов находится в тех же пределах, а правильность методов может быть скорректирована за счет введения поправочных коэффициентов для конкретной колонки, компенсирующих потери.

Методика количественного определения фторхинолонов в клеточных носителях 1 мл лекарственной формы, представляющий собой клеточные носители с инкапсулированными фторхинолонами в количестве 0,9 мг препарата на 2 мл крови, подвергали гемолизу путем замораживания. Полученную взвесь центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин. К полученному гемолизату прибавляли 2 мл 30% трихлоруксусной кислоты, перемешивали и вновь центрифугировали 5 мин при 8000 об/мин. Супернатант нейтрализовали и количественно переносили в колонку с сефадексом С-10, предварительно уравновешенную водой очищенной. Пропускали через колонку 40 мл воды очищенной, затем проводили замену элюента на 0,01 М раствор кислоты хлороводородной. Первые 6 мл элюата отбрасывали, а следующие 4 мл собирали. Полученный элюат разводили, исходя из теоретической концентрации. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре в максимуме поглощения при соответствующей длине волны в кювете с толщиной рабочего слоя 1 см. Содержание лекарственных веществ рассчитывали по уравнениям калибровочных графиков с использованием поправочного коэффициента для конкретной колонки.

Степени включения исследуемых веществ в ЭН и ЛН довольно близки между собой (таблицы 8,9).

Таблица 8

Количественное содержание фторхинолонов в надосадочной жидкости и гемолизате носителей при включении в эритроцитарные носители

№ Препарат Метрологические характеристики

п/п гемолизат носителя надосадочная жидкость

1 Норфлоксацин Х±ДХ = 15,88± 2,43 е= 15,30% Х±ДХ = 80,52± 2,88 е =3,57 %

2 Офлоксацин Х±ДХ = 17,72± 2,39 е=13,50% Х±ДХ =81,62 ±3,45 г = 4,23%

3 ципрофлоксацин Х±ДХ =17,98 ± 2,33 е=13,00% Х±ДХ = 79,10± 2,96 6 = 3,74%

Таблица 9

Количественное содержание фторхинолонов в надосадсчнон жидкости и гемолизате носителей при включении в лейкоцитарные носители

№ Препарат Метрологические характеристики

п/п гемолизат носителя надосадочная жидкость

1 Норфлоксацин Х±ДХ= 15,74±2,76 е=17,50% Х±ДХ = 80,3б± 2,94 е =3,66 %

2 Офлоксацин Х±ДХ = 17,28±1,53 е=8,83% Х±ДХ =81,36 ± 3,98 6 = 4,90%

3 ципрофлоксацин Х±ДХ =17,24 ±2,45 6= 14,20% Х±ДХ = 78,98± 3,46 е = 4,38%

Для мучения устойчивости клеточных носителей к возможной десорбции и выделению фторхинолонов в кровеносном русле были проведены следующие исследования. ЭН и ЛН с включенными фторхинолонами по описанной ранее методике дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида, а затем инкубировали в аутологичной плазме при 37°С в течение 0,5; 1; 3; 6; 12 и 24 ч. Содержание фторхинолонов определяли спектрофотометрически по разработанной нами методике. Результаты исследования представлены в таблицах 10 и 11.

Таблица 10

Содержание фторхинолонов в надосадочной жидкости при отмывании

клет очных носителей

фторхинолон Найдено,%

После первого отмывания После второго отмывания

Норфлоксацин в ЭН 0,48±0,03 0,06±0,01

Офлоксацин в ЭН 0,45±0,03 0,06±0,01

Ципрофлоксацин в ЭН 0,46±0,03 0,08±0,02

Норфлоксацин в ЛН 0,49±0,03 0,09±0,01

Офлоксацин в ЛН 0,51 ±0,03 0,05±0,01

Ципрофлоксацин в ЛН 0,47±0,03 0,07±0,02

Примечание: в этой и следующей таблице содержание фторхинолонов указано в процентах по отношению к их количеству в ЭН или ЛН.

Таблица 11

Содержание фторхинолонов в плазме крови после инкубации клеточных

носителей

фторхинолон Время инкубации, ч

0,5 ¡1 3 6 12 24

Найдено,%

Норфлоксацин в ЭН 1,4*0,2 4,3±0,3 11,1*0,9 15,4*1,2 25,6*2,1 35,4*3,1

Офлоксацин в ЭН 1,2±0,1 3,9*0,4 12,4*1,1 16,3*1,3 31,2*2,5 38,3*2,9

Ципрофлоксацин в ЭН 1,2*0,1 4,5±0,3 10,8±1,0 15,2*1,6 26,4*1,9 33,7*3,2

Норфлоксацин в ЛН 1,3*0,1 4,1±0,4 9,6*0,7 13,5*1,2 27,2*2,3 36,8*3,6

Офлоксацин в ЛН 0,9*0,2 3,8±0,3 10,6*0,9 17,3*1,5 29,7*2,0 42,1*2,6

Ципрофлоксацин в ЛН 1,1*0,1 3,3±0,3 12,1*0,8 16,5*1,6 30,1*2,4 40,3*3,3

Для изучения стабильности клеточных носителей без препаратов и с включенными фторхинолонами мы инкубировали ЭН и ЛН в изотоническом растворе натрия хлорида при различных температурах. Пригодность свободных ЭН и ЛН определяли по способности включать фторхинолоны, а ЭН и ЛН с включенными фторхинолонами - по способности сохранять терапевтическую концентрацию лекарственных средств. В результате было установлено, что свободные ЭН и ЛН сохраняют способность включать фторхинолоны в течение 10 дней в условиях хранения при 5°С, а клетки с включёнными фторхинолонами хранятся не более двух-трёх суток (таблица 12).

Таблица 12

Сроки годности ЭН и ЛН при различных режимах хранения

Температура,°С

Условия опыта 5 10 15 20 25

Срок хранения, дни

Свободные ЭН 10 8 6 3 1

Свободные ЛН 10 7 6 2 -

Норфлоксацин в ЭН 3 1 - - -

Офлоксацин в ЭН 2 1 - - -

Ципрофлоксацин в ЭН 2 1 - - -

Норфлоксацин в ЛН 3 1 - - -

Офлоксацин в ЛН 2 1 - - -

Ципрофлоксацин в ЛН 2 1 - - -

Нарушение функций иммунной системы является одним из ранних последствий острых форм инфекционных заболеваний. Для острой почечной недостаточности, вызванной воздействием токсического или микробного агента, характерна трудно корригируемая иммуносупрессия. Одной из причин развивающейся иммуносупрессии является усиление интенсивности перекисного окисления липидов клеточных мембран, нарушения их состава и структуры.

Нами изучено в сравнительном плане влияние фторхинолонов при ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией, на отдельные биохимические • и иммунологические показатели при различных технологиях введения: свободные и клеточные формы.

Установлено, что при введении ртуш дихлорида в сочетании с инфицированием резко повышается уровень мочевины и креатинина, что свидетельствует о развитии острой почечной недостаточности. У крыс с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией, снижается интенсивность ГИО на ЭБ.

В эритроцитах крыс с ОПН, в сочетании со стафилококковой инфекцией количество антиокислительных ферментов (СОД и ГР) было тих, а содержание продуктов ПОЛ (АГП и МДА) выше, чем в группе здоровых животных.

Полученные данные свидетельствует о системных нарушениях у животных с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией.

Введение свободных фторхинолонов нормализовало выделительную функцию почек на 11-12 день. После введения норфлоксадина, офлоксацина и левофлоксацина отмечалось усиление угнетения ГИО (таблица 13), ПОЛ и снижение антиоксидантной защиты эритроцитов.

Введение эритроцигарных форм фторхинолонов нормализовало уровни мочевины и креатинина на 7-8 сутки и значительно повышало выраженность ГИО на ЭБ.

Введение фторхинолонов, иммобилизованных в ЭН, снижало ПОЛ и увеличивало активность ферментов антиоксидантной системы эритроцитов.

Введение лейкоцитарных форм норфлоксадина, офлоксацина и левофлоксацина нормализует выделительную функцию почек на 5-6 сутки. Введение фторхинолонов, иммобилизованных в ЛН нормализует ГИО на ЭБ, процессы ПОЛ, аятиоксидантную защиту эритроцитов (таблица 13, рис. 3).

Таблица 13

Изменение ГИО животных с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией, при

введении различных форм фторхинолонов.

№ Группа АОК, тыс./орган

свободные ЭН ЛН

1 контроль (здоровые крысы) 28,2±2,7 29,1±2,8 28,4±2,2

2 крысы с ОПН + стафилококк 15,3±1,4*' 16,2±1,6*' 15,9±1,5*'

3 здоровые крысы + норфлоксацин 27,9±2,8 28,4±2,6 39,8±2,9*'

4 здоровые крысы + офлоксацин 29,1 ±2,5 29,6±3,1 37,9±2,2*1

5 здоровые крысы + левофлоксацин 24,9±2,4 27,2±2,7 38,9±2,5*'

6 крысы с ОПН + стафилококк + норфлоксацин 12,4±1,1*а 22,1±1,б'|>2 27,1±3,4

7 крысы с ОПН + стафилококк + офлоксацин 12,6±1,3*г 21,9±1,7'и 29,1 ±2,7

8 крысы с ОПН + стафилококк + левофлоксацин 9,4±1,1*2 22,8±1, б"1'2 28,1±3,1

Отмечено, что выраженность иммуномодулирующего действия изучаемых клеточных форм фторхинолонов не зависит от структуры препарата.

МДА

—й—4

ГР

Рис. 3

Влияние эритроцигарных и лейкоцитарных форм фторхинолонов на показатели ПОЛ и аигиокснданггкого статуса эритроцитов крыс с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией.

Обозначения: I - контроль; 2 - ОПН и стафилококк; 3 - ОПН и стафилококк + ЭН с левофлоксацином; 4 - ОПН и стафилококк + ЛН с левофлоксацином

Таким образом, использование эритроцитарных и лейкоцитарных носителей с

целью транспорта фторхинолонов является эффективным. Результаты экспериментальных

20

ЛГИ

сод

исследований показали, что в качестве носителей фторхинолонов при ОПН и ОПН в сочетании с инфицированием стафилококком, наиболее обосновано использование клеток белой крови, учитывая их способность быстро накапливаться в области очага острого воспаления.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики идентификации фторхинолонов спектрофотометрическим способом в ИК- и УФ-областях. Рассчитаны удельные и молярные показатели поглощения исследуемых препаратов.

Для норфлоксацина 8=40690, E1%uu=1298, офлоксоцина е=23 463, Е'\„=847, ципрофлоксацина е=31163, Е1%1см=1032.

Пределы обнаружения составляют для норфлоксацина 0,78 мкг/мд, офлоксацина -1,54 мкг/мл, ципрофлоксацина -1,06 мкг/мл.

2. Предложены спектрофотометрические методики количественного определения изучаемых фторхинолонов в субстанциях и таблетках. Относетелыгая ошибка определения в субстанциях составляет для норфлоксацина 2,08 %, офлоксацина - 1,76%, ципрофлоксацина -1,11%. Относительная ошибка определения в таблетках составляет для норфлоксацина - 2,62%, офлоксацина - 3,18%, ципрофлоксацина - 2,69%.

3. Подобраны оптимальные условия осаждения белка плазмы креви и гемолизата клеток. Оптимальным осадителем является 30% раствор трихлоруксусной кислоты в соотношении 1:1. Определены условия выделения изучаемых веществ из биологических материалов при помощи колоночного варианта гель-хроматографии, разработан микровариант гель-хроматографии с использованием центрифугирования. Наиболее полное отделение фторхинолонов от эндогенных веществ наблюдается при использовании сефадекса G-10 и элюента 0,01 М раствора кислоты хлороводородной.

4. Разработаны методики количественного спектрофотометрического определения норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина в плазме крови, гемолизате клеток и в клеточных формах. Относительная ошибка определения для норфлоксацина не превышает 3,41%, офлоксацина- 3,00%, ципрофлоксацина-3,53% .

5. Изучены особенности включения исследуемых веществ в ЭН и ЛН. Препараты имеют близкие значения включения, не превышающие 20%. Установлена достаточная устойчивость ЭН и ЛН к возможной десорбции фторхинолонов.

6. Проведена сравнительная оценка методик количественного спектрофотометрического определения фторхинолонов с известными методиками ВЭЖХ.

Сравнительная метрологическая оценка их результатов говорит о сравнимых, удовлетворяющих требованиям НД значениях правильности и воспроизводимости.

7. Установлено, что введение эритроцитарных форм норфлоксацина, офлоксацина и левофлоксацина животным с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией, повышало интенсивность ГИО на ЭБ, антиоксидантную защиту эритроцитов, снижало выраженность ПОЛ.

Введение лейкоцитарных форм норфлоксацина, офлоксацина и левофлоксацина животным с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией нормализовало ГИО на ЭБ, процессы ПОЛ, антиоксидантную защиту эритроцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карлов, П.М. Идентификация и количественное определение соединений группы фторхинолонов в субстанциях и лекарственных формах / П.М. Карлов // Молодежная наука и современность: 72 -я итог, межвуз. конф. студентов и молодых ученых: в 2 ч.Ч. II. - Курск: КГМУ, 2007. - С. 116.

2. Иммунометаболическая активность направленного транспорта фторхинолонов при инфекционном и токсическом поражении почек/Г.В. Сипливый, A.B. Кукурека, Л.Е. Сипливая, П.М. Карлов // Университетская наука: взгляд в будущее: сб. тр. 72-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН: в 3 т. Том 111.- Курск: КГМУ, 2007. - С. 182-184.

3. Карлов, П.М. Спектрофотометрическое определение норфлоксацина в субстанции и лекарственных формах / П.М. Карлов, Л.Е. Сипливая // Университетская наука: теория, практика, инновации: тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2008. - С. J

4. Карлов, П.М. Спектрофотометрическое определение офлоксацина в субстанции и лекарственных формах / П.М. Карлов, Л.Е. Сипливая // Университетская наука: теория, практика, инновации: тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2008. - С.

5. Карлов, П.М. Спектрофотометрическое определение ципрофлоксацина в субстанции и лекарственных формах / П.М. Карлов, Л.Е. Сипливая // Университетская наука: теория, практика, инновации: тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2008.

6. Иммунометаболическая активность направленного транспорта фторхинолонов при инфекционном и токсическом поражении почек / О.И. Братчиков, Г.В. Сипливый, П.М. Карлов, Л.Е. Сипливая // Университетская наука: теория, практика,

22

инновации: тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2008.

7. Карлов, П.М. Спектрофотометрическое определение фторхинолонов в субстанциях и лекарственных формах / П.М. Карлов //Современные проблемы и пуги их решения в науке, транспорте, производстве и образовании: сб. тр. -Одесса, 2007. - Т. 18. -С. 49-50.

8. Иммунометаболическая активность фторхинолонов иммобилизованных в клеточные носители при токсическом поражении почек, в условиях стафилококковой инфекции / А.И. Лазарев, Г.В. Сипливый, О.И. Братчиков и др. // Урология. - 2009. - № 2. -С. 13-18.

9. Карлов, П.М. Анализ фторхинолонов в субстанциях, лекараственных формах и биожидкостях / П.М. Карлов, Л.Е. Сипливая // Курский науч.-практ. веста. «Человек и его здоровье». - 2009. - № 1. - С. 143-148.

КАРЛОВ ПАВЕЛ МИХАЙЛОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ГРУППЫ ФТОРХИНОЛОНОВ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА РАЗЛИЧНЫХ НОСИТЕЛЯХ

АВТОРЕФЕРАТ

©Издательство ООО "Учитель". Курск, ул. Садовая, 31. Лицензия ИД №03838

Сдано в набор 29. 05.2009 п Подписано к печати 29.05.2009 г.

Формат 60x84/16 Компьютерный набор и верстка. Бумага писчая К»1 Усл. печ. л. 1,0 Заказ № 113 Тираж 100 экз.

Актуальность темы.

Соединения группы фторхинолонов являются значимой группой химиотерапевтических средств с выраженным антибактериальным эффектом. Они проявляют высокую противомикробную активность как против грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Однако имеется ряд побочных эффектов, характерных в большей или меньшей степени для всех препаратов группы. Это артро-, кардио-, гепато-, нефротоксичность, фотосенсибилизация. Серьезность побочных действий, выявленных в клинических исследованиях, предопределило , снятие с медицинского применения ряда фторхинолонов и поиск способов снижения интенсивности и количества проявляемых побочных эффектов.

Перспективным направлением в терапии различных патологий является использование технологий направленного транспорта г лекарственных средств, позволяющих значительно снизить их 'системную токсичность, удлинить время полувыведения препаратов из организма, уменьшить терапевтическую дозу и кратность введения. Контролируемая и целенаправленная доставка в организм антибактериальных препаратов основана на использовании различных носителей или векторов, обладающих тропностью к определенным органам или их клеткам. В качестве векторов могут выступать гормоны, ферменты а также микроконтейнеры: липосомы, капсулы из человеческого альбумина и аутоклетки крови. Наиболее выгодными с точки зрения биологической совместимости считаются системы доставки, в которых используются собственные клетки организма, в частности, эритроциты, лейкоциты и тромбоциты.

Для получения клеточных форм фторхинолонов с дозированным содержанием действующего вещества необходима точная, экспрессная, легко воспроизводимая и экономически выгодная методика их стандартизации. Для количественного определения фторхинолонов в субстанциях и лекарственных формах фармакопейным является метод титрования в неводных средах, который характеризуется большой трудоёмкостью и длительностью, а также высокой токсичностью используемых реактивов. В современных лабораториях большое распространение получил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, но высокая стоимость одного анализа, трудоемкость и необходимость наличия высококвалифицированного специалиста для работы с хроматографом снижают возможные темпы распространения данного метода.

В последние годы всё большее внимание исследователей привлекают оптические методы анализа, одним из которых является спектрофотометрия. К достоинствам данного метода можно отнести высокую воспроизводимость и экспрессность. Анализ литературных источников показывает, что спектрофотометрические методики количественного определения фторхинолонов разработаны недостаточно. В связи с этим возникает необходимость разработки экспрессной и точной методики количественного определения фторхинолонов в субстанциях, лекарственных формах и иммобилизованных в клеточные носители.

Цель и задачи исследования.

Цель работы - получение клеточных форм соединений группы фторхинолонов, разработка методик их анализа.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи:

1. Разработать методики качественного и количественного определения фторхинолонов в субстанциях и лекарственной форме;

2. Выделить и получить клеточные носители: эритроцитарные (ЭН) и лейкоцитарные (ЛН);

3. Получить клеточные формы фторхинолонов;

4. Разработать методики выделения исследуемых препаратов из клеточных носителей и биоматериала.

5. Разработать методики качественной оценки и количественного определения клеточных форм фторхинолонов;

6. Изучить иммуномодулирующую и антиоксидантную активности изучаемых фторхинолонов, иммобилизованных в ЭН и ЛН при токсическом поражении почек, осложненном стафилококковой инфекцией.

Научная новизна исследований.

Впервые получены клеточные (эритроцитарные и лейкоцитарные) формы норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина. Изучено влияние V различных факторов на динамику включения и высвобождения фторхинолонов из клеточных носителей. Экспериментально обоснована возможность использования ЭН и ЛН для транспорта изучаемых веществ, определены их сроки хранения.

Разработаны спектрофотометрические методики количественного определения фторхинолонов в субстанциях и таблетках, которые отличаются простотой, достаточной точностью и экспрессностью.

Исследованы условия выделения фторхинолонов из биологических материалов при помощи колоночного варианта гель-хроматографии.

Предложены методики количественного спектрофотометрического определения фторхинолонов в плазме крови, гемолизате клеток и в клеточных носителях, которые отличаются достаточной точностью, чувствительностью и экспрессностью.

Проведена сравнительная оценка метрологических характеристик разработанных спектрофотометрических методик с данными анализа методом ВЭЖХ, что позволило сделать объективные выводы о преимуществах и недостатках сравниваемых методов.

Установлено, что введение эритроцитарных клеточных форм фторхинолонов животным с острой почечной недостаточной (ОПН) в сочетании со стафилококковой инфекцией снижало выраженность иммуносупрессии, процессов перекисного окисления липидов и активировало антиоксидантную защиту эритроцитов. Введение лейкоцитарных клеточных форм фторхинолонов крысам с ОПН, осложненной- стафилококковой инфекцией нормализовало данные процессы.

Практическая значимость работы.

Разработанные методики спектрофотометрического количественного определения норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина гидрохлоридов в субстанциях и таблетированной'лекарственной форме могут быть .использованы для контроля качества рассматриваемых препаратов.

На основе колоночного варианта гель-хроматографического выделения фторхинолонов, из биологических материалов разработаны ' методики количественного определения норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина в плазме крови и гемолизате клеточных носителей. Представленные методики могут быть использованы в клинических лабораториях для проведения терапевтического мониторинга при лечении исследуемыми препаратами, а также для их количественной оценки при использовании клеточных форм фторхинолонов.

Представленные методики имеют ряд преимуществ перед существующими: повышают объективность и оперативность анализа, не уступая по чувствительности и точности определения.

Внедрение результатов работы:

На основании проведенных исследований разработаны методики анализа норфлоксоцина, офлоксацина и ципрофлоксацина в субстанциях, лекарственной форме и биоматериале.

- методика определения норфлоксацина в субстанции и таблетках (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 10.03.2008, кафедры фармацевтической технологии Курского государственного медицинского университета с 17.03.2008, кафедры биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 10.03.2008, кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. Бурденко с 10.03. 2008, кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 15.03.2008, в работу Курского филиала ФГА по контролю за изделиями медицинского назначения Росздрава с 13.04.2008).

- методика определения офлоксацина в субстанции и таблетках внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 10.03.2008, кафедры фармацевтической технологии Курского государственного медицинского университета с 17.03.2008, кафедры биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 10.03.2008, кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. Бурденко с 10.03. 2008, кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 15.03.2008, в работу Курского филиала ФГА по контролю за изделиями медицинского назначения Росздрава с 13.04.2008).

- методика определения ципрофлоксацина в субстанции и таблетках (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 10.03.2008, кафедры фармацевтической технологии Курского государственного медицинского университета с

17.03.2008, кафедры биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 10.03.2008, кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. Бурденко с 10.03. 2008, кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 15.03.2008, в работу Курского филиала ФГА по контролю за изделиями медицинского назначения Росздрава с 13.04.2008).

- методика определения ципрофлоксацина в биоматериале и клеточных носителях (внедрена в учебный и научный процесс кафедры клинической фармакологии Курского государственного медицинского университета с 17.03.2008).

- методика определения офлоксацина в биоматериале и клеточных носителях (внедрена в учебный и научный процесс кафедры клинической фармакологии Курского государственного медицинского университета с 17.03.2008). I

- методика определения норфлоксацина в биоматериале и клеточных носителях (внедрена в учебный и научный процесс кафедры клинической г фармакологии Курского государственного медицинского университета с 17.03.2008).

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на конференциях молодых учёных и студентов КГМУ (Курск, 2007-2009г.), итоговых научных конференциях КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2008, 2009гг.), международной конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании» (Одесса, 2007г.), а также представлены в сборниках тезисов докладов соответствующих конференций и сессий. Апробация работы проведена на научно-практической конференции кафедр фармакогнозии и ботаники, фармацевтической технологии, экономики и управления фармации, фармацевтической, токсикологической и аналитической химии.

Публикации.

Основное содержание работы отражено в 9 публикациях, 1 из которых - в международной печати, 2 публикации — в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных научных трудов.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета. Номер государственной регистрации 01.2.00703415.

Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения. Обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (6 глав), общих выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста, содержат 12 рисунков, 40 таблиц и 6 формул. Библиография включает 226 источников, из которых 109 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики идентификации фторхинолонов спектрофотометрическим способом в ИК- и УФ-областях. Рассчитаны удельные и молярные показатели поглощения исследуемых препаратов.

Для норфлоксацина 8 = 40690, Е1%1см = 1298, офлоксоцина 8 = 23463, Е1%1см = 847, ципрофлоксацина 8 = 31163, Е1%1см = 1032.

Пределы обнаружения составляют для норфлоксацина 0,78 мкг/мл, офлоксацина - 1,54 мкг/мл, ципрофлоксацина -1,06 мкг/мл.

2. Предложены спектрофотометрические методики количественного определения изучаемых фторхинолонов в субстанциях и таблетках. Относительная ошибка определения в субстанциях составляет для норфлоксацина 2,08 %, офлоксацина - 1,76%, ципрофлоксацина -1,11%. Относительная ошибка определения в таблетках составляет для норфлоксацина - 2,62%, офлоксацина - 3,18%, ципрофлоксацина - 2,69%.

3. Подобраны оптимальные условия осаждения белка плазмы крови и гемолизата клеток. Оптимальным осадителем является 30% раствор трихлоруксусной кислоты в соотношении 1:1. Определены условия выделения изучаемых веществ из биологических материалов при помощи колоночного варианта гель-хроматографии, разработан микровариант гель-хроматографии с использованием центрифугирования. Наиболее полное отделение фторхинолонов от эндогенных веществ наблюдается при использовании сорбента сефадекса С-10 и элюента 0,01 М раствора кислоты хлороводородной.

4. Разработаны методики количественного спектрофотометрического определения норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина в плазме крови, гемолизате клеток и в клеточных формах. Относительная ошибка А определения для норфлоксацина не превышает 3,41%, офлоксацина - 3,00%, ципрофлоксацина —3,53% .

5. Изучены особенности включения исследуемых веществ в ЭН и ЛН.

Препараты имеют близкие значения включения, не превышающие 20%. Установлена достаточная устойчивость ЭН и ЛН к возможной десорбции фторхино лонов.

6. Проведена сравнительная оценка методик количественного спектрофотометрического определения фторхинолонов с известными методиками ВЭЖХ. Сравнительная метрологическая оценка их результатов говорит о сравнимых, удовлетворяющих требованиям НД значениях правильности и воспроизводимости.

7. Установлено, что введение эритроцитарных форм норфлоксацина, офлоксацина и левофлоксацина животным с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией, повышало интенсивность ГИО на ЭБ, антиоксидантную защиту эритроцитов, снижало выраженность ПОЛ.

Введение лейкоцитарных форм норфлоксацина, офлоксацина и левофлоксацина животным с ОПН, осложненной стафилококковой инфекцией нормализовало ГИО на ЭБ, процессы ПОЛ, антиоксидантную защиту эритроцитов.

Заключение

Анализ литературных источников показывает, что в настоящее время препараты группы фторхинолонов являются широко востребованными в современной клинической практике, они проявляют высокую антимикробную активность против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Однако обладают рядом выраженных системных побочных эффектов: артро-, кардио-, гепато-, нефротоксичность, иммуносупрессия, нарушение окислительно-восстановительного потенциала эритроцитов, которые снижают возможности их применения, в частности, в педиатрии и гериатрии.

Новые перспективы открылись перед фармакотерапией в результате разработки систем для целенаправленной, органоспецифической и контролируемой доставки лекарственных, профилактических и диагностических средств в очаг поражения в человеческом организме. С этой целью используют технологию иммобилизации лекарственных препаратов. Широкое распространение получило пространственное отделение лекарственного препарата от остального объема реакционной среды с помощью полунепроницаемых мембран (физическая иммобилизация). Для такой иммобилизации используют липосомы, капсулы из человеческого альбумина, магнитные микросферы и так далее.

Однако большинство известных носителей имеют ограничение по диапазону и количеству лекарств, которые они могут связывать, а также обладают токсичностью и иммуногенностью.

Одним из способов снижения количества и выраженности побочных эффектов является НТ лекарственных препаратов к органам-мишеням с использованием аутологичных клеток крови.

Системы доставки, в которых используют собственные клетки организма, наиболее выгодны с точки зрения биологической совместимости. Наиболее доступными для иммобилизации являются клетки крови, которые могут быть использованы в качестве «контейнеров» с включенными в них препаратами. Преимуществом этого метода иммобилизации является возможность получения препаратов с высоким содержанием включенного лекарственного соединения. Иммобилизованные в мембранных структурах вещества хорошо сохраняют свою фармакологическую активность, а их стабильность часто существенно возрастает. Для получения клеточных форм лекарственных препаратов и, в том числе, фторхинолонов со сторого дозированным количеством действующего вещества необходима точная, экспрессная, легко воспроизводимая и экономически целесообразная методика их количественного определения.

Однако существующие методики определения качества препаратов группы фторхинолонов на данном этапе представляет собой либо морально-устаревшую нормативную документацию или отрывочные данные по анализу современными методами, требующими дорогостоящей аппаратуры и реактивов, что позволило автору выбрать актуальное направление исследования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования

В работе использовали заводские субстанции норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина гидрохлориды, а также таблеточные массы препаратов, отвечающие требованиям действующей нормативной документации (ФС).

В качестве стандартов при построении калибровочных графиков и при количественном определении использовали стандартные образцы норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина гидрохлоридов фирмы «Мегск», Германия [211].

Анализируемые и стандартные растворы лекарственных веществ готовили в мерных колбах, отмеривая объёмы с точностью до десятых долей миллилитра. Навески лекарственных веществ для приготовления стандартных растворов и модельных смесей отвешивали с точностью до пятого знака после запятой. Модельные смеси после приготовления термостатировали при 37°С.

Объектами исследования служили также эритроциты и плазма крови, полученные от здоровых доноров (людей и животных). Экспериментальные исследования выполнены на крысах Вистар массой 150 - 180 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим в условиях вивария Курского медицинского университета и не имеющих видимых заболеваний. Животные содержались на обычном кормовом рационе вивария.

2.2. Характеристика реактивов, сорбентов и оборудования

Для выполнения экспериментов использовали растворители и реактивы, имеющие квалификацию "химически чистый" или "чистый для анализа". Для выделения изучаемых фторхинолонов из биологических материалов были применены бисерно полимерные гели декстрана марок G-10, G-15, G-25, G-50 ("Pharmacia Fine Chemicals", Швеция).

Используемое в работе оборудование: ИК-спектрофотометр «Avatar 360 FT- IR E.S.P.» (США), спектрофотометр СФ-46; Хроматограф Waters Alliance 2695 с диодно-матричным детектором 2998; Колонка 150 х 4,6 мм YMC-Pack ODS-A 3 мкм 12 нм; весы аналитические АДВ-200; термостат ТС-80М-2; центрифуга ЦЛН-2.

2.3. Выделение аллогенных эритроцитов

Для выделения эритроцитов и лейкоцитов использовали донорскую кровь или кровь животных (крыс). В экспериментах с животными кровь получали из яремной1 вены, под эфирным наркозом. Эритроциты выделяли путем 2-х кратного отстаивания в растворе Na-фосфатного буфера, I содержащего' 3% декстрана Т-500, и последующей очисткой с помощью HBS-целлюлозы в Na-фосфатном буфере и хранили при 4°С. Перед употреблением эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость и верхнюю лейкоцитарную плёнку. Полученный осадок эритроцитов ресуспендировали в 0,15 M растворе натрия хлорида и центрифугировали при 3000 об/мин (описанную операцию повторяли не менее трёх раз). Присутствие лейкоцитов в суспензии эритроцитов контролировали при микроскопировании.

2.4. Выделение лейкоцитов

Для получения суспензии лейкоцитов гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл крови) смешивали с 3% желатином (0,1 мл/мл) и выдерживали 15-20 мин при 37°С. После оседания эритроцитов слой плазмы, обогащенной лимфоцитами, переносили в силиконизированные пробирки. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин, дважды отмывали раствором Хенкса и помещали в среду 199. Количество клеток подсчитывали под микроскопом в камере Горяева.

2.5. Включение фторхинолонов в клеточные носители

Для получения эритроцитарной клеточной формы норфлоксацина, офлоксацина, ципрофлоксацина использовали модифицированный метод гипоосмотического гемолиза [37]. С этой целью эритроциты доноров, выделенные из 5 мл крови, дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путём центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. К осадку клеток добавляли семикратный объем охлаждённой до 0°С воды очищенной и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 25 мин. К полученным клеточным носителям приливали семикратный объём изучаемого фторхинолона, растворённого в охлаждённой до 0°С воде i очищенной.

Взвесь инкубировали в течение 20 мин при 4°С, затем добавляли 1/9 объёма 9% раствора натрия хлорида для восстановления цёлостности мембраны эритроцитов и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После включения препарата в эритроциты, последние дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида, затем осаждали при 8000 об/мин в течение 10 мин.

Для получения лейкоцитарной клеточной формы изучаемых фторхинолонов использовали методику Лохвицкого C.B. [63]. Полученную взвесь лейкоцитов в соответствии с методикой инкубировали в течение двадцати минут с двукратным количеством антибиотика при комнатной температуре и периодическом встряхивании.

2.6. Экспериментальная модель

Острое токсическое поражение почек, сочетанное со стафилококковой инфекцией, моделировали путем однократного внутрижелудочного введения 2мг/кг ртути дихлорида и внутрибрюшинной инъекцией предварительно оттитрованных доз суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus, о содержащих 1*10 микробных тел в 0,5 мл раствора. Все исследования на животных проводили с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей».

Препараты вводили внутримышечно пятикратно с интервалом 12 ч в разовых дозах 3 мг/кг. Дозы фторхинолонов, вводимых в ЭН и JIH, составили 6 мг/кг. ЭН и ЛН с включенными фторхинолонами вводили внутривенно двукратно с интервалом 48 ч. Используемые дозы препаратов соответствовали рекомендованным терапевтическим дозам фторхинолонов, пересчитанным с учетом соотношения поверхности тела биологического объекта и его массы по общепринятой формуле межвидового переноса доз с применением коэффициента пересчета в зависимости от массы тела.

2.7. Методы оценки изменения в биохимических и иммунологических показателях

Гуморальный иммунный ответ (ГИО) индуцировали однократным внутрибрюшинным введением антигена - эритроцитов барана (ЭБ) в дозе о

2*10 клеток на 0,1 кг массы тела. Для выделения ЭБ использовали консервированную в растворе Ольсвера кровь, хранящуюся при 4 °С. При приготовлении взвеси ЭБ их несколько раз отмывали изотоническим раствором натрия хлорида, путем центрифугирования при 4000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Интенсивность развития ГИО на ЭБ оценивали на 5-е сутки после иммунизации, путем определения в селезенке числа клеток, образующих антитела (АОК) к ЭБ методом прямого локального гемолиза [56,66].

Антиоксидантный потенциал эритроцитов оценивали по активности супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионредуктазы (ГР). Выраженность перекисного окисления липидов в эритроцитах оценивали по содержанию ацилгидроперекисей (АГП) и малонового диальдегида (МДА). Состояние выделительной функции почек оценивали по концентрации мочевины и креатина в крови [7,56,65].

2.8. Статистическая обработка результатов

Методики количественного определения разработаны на модельных смесях, в которых содержание определяемого вещества было известно. Полученные результаты обрабатывали в соответствии с требованиями и с использованием пакета прикладных программ '^айвйса 8.0". Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдентаи Вилкоксона-Мана-Уитни [21,57,64].

Глава 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФТОРХИНОЛОНОВ В СУБСТАНЦИЯХ И ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ

Для количественного определения препаратов группы фторхинолонов в настоящее время наиболее часто используется метод ВЭЖХ (рекомендован для ципрофлоксацина). Фармакопейные статьи предприятий рекомендуют метод титрования в неводных средах для норфлоксацина и офлоксацина. Данные методы характеризуются большой трудоёмкостью, длительностью, сложностью или дороговизной оборудования. Возможность проведения анализа часто ограничена отсутствием необходимого типа оборудования.

В последние годы всё большее внимание привлекают экспрессные методы анализа, одним из которых является спектрофотометрия. К достоинствам данного метода можно отнести возможность использования небольших объёмов исследуемых образцов, высокую чувствительность и простоту исполнения, что особенно ценно при проведении фармакокинетических исследований.

В связи с этим нами были разработаны спектрофотометрические методики количественного определения норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина, основанные на их избирательном светопоглощении в ультрафиолетовой области.

3.1. Изучение спектральных характеристик норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина

Для установления подлинности норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина нами были получены ИК-спектры субстанций изучаемых фторхинолонов. Полученные ИК-спектры сравнивали со спектрами стандартных образцов. Используемый метод позволил качественно определить субстанции, а также оценить их чистоту [38,52].

Исследование спектров в инфракрасной области осуществляли на ИК-спектрофотометре «Avatar 360 FT- IR E.S.P.» (США) в области волновых чисел 4000-400 см"1.

Подготовку к снятию ИК-спектров проводили следующим образом: пробы готовили методом прессования навески норфлоксацина, офлоксацина или ципрофлоксацина с калия бромидом в соотношении 1:100. С этой целью 100 мг калия бромида и 1 мг исследуемого фторхинолона перемешивали и перетирали в течение 15 минут в агатовой ступке. Навеску полученной смеси в количестве 30 мг помещали в пресс и спрессовывали таблетку. Таблетку, содержащую исследуемый фторхинолон, помещали в ИК-спектрометр и регистрировали спектр. Полученные спектры представлены на рис. 1-6. При проведении сравнения данных спектров со спектрами стандартных образцов, сопоставлены пики [38,133].

Пропускание

Рисунок 1.

ИК - спектр субстанции офлоксацина в области спектра от 400 до 4000 см"1

Пропускание

1600

1000

800

Рисунок 2.

ИК - спектр субстанции офлоксацина в области спектра от 400 до 2000 см"1

55

1800

1400

1200

1000

Рисунок 3.

ИК - спектр субстанции ципрофлоксацина в области спектра от 400 до 2000 см"1

3500 3000 2500 2000 1500 1000 см-1

Рисунок 4.

ИК - спектр субстанции ципрофлоксацина в области спектра от 400 до 4000 см"1

Рисунок 5.

ИК - спектр субстанции норфлоксацина в области спектра от 400 до 2000 см"1

Рисунок 6.

ИК - спектр субстанции норфлоксацина в области спектра от 400 до 4000 см"1

Полученные результаты сравнения ИК-спектров исследуемых фторхинолонов с ИК-спектрами стандартных образцов свидетельствовали об идентичности и чистоте используемых субстанций офлоксацина, норфлоксацина и ципрофлоксацина [110,111].

Для разработки спектрофотометрической методики количественного анализа офлоксацина, норфлоксацина и ципрофлоксацина были сняты электронные спектры поглощения их водных растворов в ультрафиолетовой области спектра на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной рабочего слоя 1 см на фоне воды очищенной [8,52,68].

Спектры фторхинолонов имеют по одному выраженному максимуму поглощения при длине волны 276 ± 2 нм - норфлоксацин, 291 ± 2 нм -офлоксацин и 278 ± 2 нм - ципрофлоксацин. В качестве растворителя была выбрана вода, как наиболее дешевый и доступный растворитель. В целях упрощения дальнейшего анализа биоматериала все измерения проводили при нейтральном значении рН. Полученные спектры представлены на рис. 7-9.

Длины волн в максимумах поглощения были использованы для дальнейшей разработки методики количественного определения.

Рисунок 7

УФ - спектр субстанции офлоксацина в области 200-400 нм

Рисунок 8

УФ - спектр субстанции ципрофлоксацина в области 200-400 нм О

276,7

0,00

2,00

0,50

1,50

1,00

200,00

250,00

300,00

350,00

400,00 пт

Рисунок 9

УФ - спектр субстанции норфлоксацина в области 200-400 нм

3.2. Изучение зависимостей оптической плотности от концентрации норфлоксацина, офлоксацина и ципрофлоксацина

Известно, что оптическая плотность (А) по закону Бугера - Ламберта — Бера прямо пропорциональна молярному коэффициенту поглощения (е), концентрации определяемого вещества (С) и толщине слоя раствора (1)

Предварительно были определены интервалы линейности калибровочных графиков, которые представлены в таблице 5. Готовили стандартные растворы изучаемых препаратов с различным содержанием определяемых веществ и проводили исследование с учётом установленных

8,19,20];

А = £ *С*1

1); оптимальных условий.

Для построения калибровочных графиков проводили определение 8-9 (т) концентраций офлоксацина, норфлоксацина и ципрофлоксацина (таблицы 2-4) и строили графики зависимостей оптической плотности от концентрации препаратов.

Наличие линейной зависимости между переменными величинами не всегда является очевидным. По этой причине экспериментальные данные, полученные при калибровке, вначале использовали для оценки жёсткости, т.е. степени неслучайности линейной связи оптической плотности и концентрации определяемого вещества. О жёсткости линейной связи можно судить по величине коэффициента корреляции, который вычисляется по формуле [19]:

2); тЕГ - ат^ШтЕТу,2 N где ш — число опытов; х — концентрация антибиотика, мкг/мл; у - оптическая плотность (А).

Чем ближе коэффициент корреляции к единице, тем менее случайна наблюдаемая линейная зависимость между переменными величинами. Для расчёта коэффициента корреляции использовали данные, полученные при построении калибровочных графиков, приведённые в таблицах 2-4. Результаты расчётов представлены в таблице 5.

Линейная зависимость выражается уравнением общего вида:

У = Ь*Х + а (3); где У - оптическая плотность; X - концентрация определяемого вещества; Ъ — угловой коэффициент; а — свободный член линейной зависимости.

Уравнения калибровочных графиков представлены в таблице 5, где А -оптическая плотность; С — концентрация фторхинолона, мкг/мл.