Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Полярографическое исследование новых NO-доноров -производных гидроксиламина и 4-нитроппразола.

г

На правах рукописи

/УаилХР

Данилов Александр Владимирович

Полярографическое исследование новых ЫО-доноров -производных гидроксиламина и 4-нитропиразола.

15.00.02. - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 1999

Работа выполнена в Государственном Научном Центре РФ

"НИОПИК"

Научный руководитель:

доктор химических наук Н.Б.Григорьев

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор В.Г.Граник Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор А.С.Берлянд доктор химических наук, профессор В.П.Гультяй

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт фармации (НИИФ)

Защита диссертации состоится 1999 г. в ^ часог

на заседании диссертационного совета Д.074.05.06. в Московское медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: Москва, Зубовска* площадь, 1.

Автореферат разослан /V 1999 р.

Учёный секретарь диссертационного совета

Кандидат фармацевтических наук Н.П.Садчикова

Актуальность. Изучение биологического действия оксида азота (N0) - новая и фезвычайно быстро развивающаяся область биохимии и биохимической фармако-тогии. До конца 80-х годов, пока не было доказано существование эндогенного жсида азота (синтезируемого из Ь-аргинина при участии специальных ферментов -ЧО-синтаз в различных органах и тканях), никто не предполагал, что такая простая лолекула, как N0 может выполнять важнейшие функции в организме млекопи-ающих.

Благодаря серии открытии, сделанных в последние годы, выявилась роль ГО в различных биохимических процессах, протекающих в нервной, иммунной и ердечно-сосудистых системах. Материалы этих исследований послужили толчком : поиску новых соединений (потенциальных лекарственных средств), способных меньшать или увеличивать количество оксида азота в функциональных системах рганизма.

В этой связи представляется важным полярографическое исследование кислительных превращений производных гидроксиламина (гидроксамовых ки-лот, оксимов и амидоксимов), являющихся донорами оксида азота.

Проведённые исследования показали перспективность поиска новых анти-ипертензпвных и спазмолитических лекарственных средств в ряду упомянутых роизводных гидроксиламина, фармакологическое действие которых обусловлено ыделением оксида азота. Изучение соединений данного ряда является актуальной щачей в рамках общей программы разработки новых высокоэффективных лекар-гвенных средств.

Кроме того, актуальным является доказательство генерации оксида азота как эи химическом восстановлении, так и при химическом окислении некоторых юизводных аминонитропиразола, что может способствовать поиску новых пер-гективных антигипертензивных и спазмолитических средств среди соединений [иного ряда.

ель. Целыо настоящей работы явилось доказательство генерации оксида азота >и окислительных превращениях гидроксамовых кислот, оксимов и амидоксимов,

а также при химическом восстановлении и при химическом окислении некоторы производных аминонитропиразола.

Для достижения поставленной цели были решены следущие задачи: 1. Разработк метода полярографического детектирования оксида азота при окислении N0 генерирующих соединений (на примере антигипертензивного лекарственного пре парата - молсидомина и гидроксиламина).

2. Полярографическое исследование химического окисления производных гидре ксиламнна (гндроксамовых кислот, оксимов и амидоксимов)

3. Изучение механизма электрохимического и химического восстановления, а так же химического окисления некоторых производных аминонитропиразола, метода ми постояннотоковой и дифференциально-импульсной полярографии. Научная новнзна. На основании полученных результатов предсказана антигипер тензивная и спазмолитическая активность исследованных производных гидрокси ламина, связанная с генерацией оксида азота и подтверждённая результатами био химических испытаний.

Впервые показано, что четвертичные пиридинапьдоксимы (2-ПАМ, 4-ПАЛ и др.), называемые реактнваторами холинэстеразы и являющиеся эффективным] антидотами против отравлений фосфоорганическими веществами, генерируют пр) окислении оксид азота. На основании этого предложен новый механизм действи этих препаратов, связанный с активацией растворимой гуанилатциклазы и накоп лением циклического гуанозинмонофосфата.

Предложен полярографический метод качественного и количественного оп ределения реактиваторов холинэстеразы (2-ПАМ, 4-ПАМ и др.).

Показано, что при химических и электрохимических превращениях некото рых производных аминонитропиразолов генерируется оксид азота и впервьк найдены системы, в которых образование оксида азота реализуется как при окис лении, так и при восстановлении при участии одних и тех же группировок. Практическая значимость. Показана перспективность поиска новых антигипер тензивных и спазмолитических лекарственных средств среди гндроксамовых ки-

слот, оксимов, амидоксимов и производных 4-шпропиразола. Доказана генерация оксида азота при химическом окислении реактиваторов холинэстеразы, что является ключевым моментом в понимании механизма их фармакологического действия. Внедрение в практику. Полярографический метод качественного и количественного определения реактиваторов холинэстеразы (2-ПАМ, 4-ПАМ и др.) может применяться как альтернативный при контроле качества данных препаратов. Апробация работы. Основные результаты выполненной работы были доложены на семинарах в ЦХЛС-ВНИХФИ и международном симпозиуме по медицинской химии (Эдинбург, 1998г.).

Связь выполненной работы с проблемным планом фармацевтических наук и производства. Диссертационная работа выполнена в рамках государственной научно-технической программы "Создание лекарственных средств методами химического и биологического синтеза" (№ Госрегнстрации 01970007161). Публикация результатов исследования. Материалы диссертации отражены в 4 печатных работах.

Положения, выносимые на защиту: - результаты исследования химического окисления производных гидрокенламина.

- полярографическая методика качественного и количественного определения ре-исгиваторов холинэстеразы - днпироксима и 2-ПАМ.

■ результаты исследования электрохимического и химического восстановления, а гакже химического окисления некоторых производных 4-шггропиразола. Материалы и методы исследования. Исследованные соединения были синтези-юваны в ЦХЛС-ВНИХФИ и ГНЦ РФ "НИОПИК". В работе использовались реак-ивы классификации х.ч. Все растворы готовились на дистиллированной воде. 1остояннотоковые полярограммы снимались на полярографе 11ас!е1кЬ, дифферен-(налыго-импульсные - на ПУ-1.

)бъём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора лите-атуры, трёх глав экспериментальных исследований и списка литературы. Работа зложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 24 схемы

и 20 рисунков, библиография включает 175 наименований.

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, её научная новизна и практическая значимость работы.

В обзоре литературы обобщены данные о биологической роли оксида азота, экзогенных донорах оксида азота, методах определения N0 и роли растворимой гуанилатциклазы в молекулярном механизме физиологических эффектов оксида азота.

Вторая глава диссертации посвящена модифицированию разработанного ранее метода полярографического детектирования оксида азота, образующегося при окислении некоторых азотсодержащих соединений феррицианидом калия, позволяющего проводить предварительный скрининг потенциальных >Ю-доноро&. Метод основан на фиксировании пиков восстановления нитропруссид-иона на дифференциально-импульсных полярограммах.

В третьей главе исследована МО-донорная активность некоторых производных гндроксамовых кислот, оксимов и амидоксимов бензольного и пиридинового ряда. Впервые обнаружена генерация оксида азота при окислении гидроксамовых кислот и амидоксимов К3[Ре(СЫ)6]. Предложены механизмы генерации оксида азота при окислении исследованных соединений. Впервые установлена генерация оксида азота при мягком химическом окислении известных реактиваторов холинэ-стеразы (2-ПАМ, 4-ПАМ, дипироксим и др.), ингибированной фосфорганическими соединениями. Рассмотрен процесс электрохимического восстановления реактиваторов холннэстеразы на капельном ртутном электроде и разработан метод их количественного определения.

В четвёртой главе исследована генерация оксида азота при химических и электрохимических превращениях некоторых производных 4-нитропиразолов и впервые найдены системы, в которых образование оксида азота реализуется как при окислении, так и восстановлении при участии одних и тех же группировок (4-нитро-5-гуанидино-3-аминопиразол и 4-нитро-1-иминокарбамоил-3,5-диамино-пиразол).

Полярографическое детектирование оксида азота при окислении молсндоми-на и гидроксиламина феррицианидом калия.

Существуют различные пути метаболизации доноров оксида азота. Так например, метаболизм нитроэфиров и И-нитропиразолов идёт по восстановительному механизму, а трансформация ди-Г^-окисей диазетинов - по гидролитическому.

Вместе с тем, продолжается поиск антигипертензивных лекарственных средств, биотрансформация которых протекала бы по отличному от нитроэфиров и Г^-нитропиразолов механизму. Типичным представителем группы соединеннй, бнотрансформация которых с выделением N0 происходит в результате химического или ферментативного окисления является известное ангиангинальное средство молсидомин - З-морфолиноэтоксикарбонил-М-сиднонимин:

О И-Ы—

О ^N-00^1

Исходя из исследовании продуктов окисления молсидомина, Н.ВоЬп и К.5с1юепаГт§ег в 1991 г предложили механизм его трансформации и выделения при его окислении N0 представленный на Схеме 1.

сГ>к-1 ш^сЛА-у-1 он\

/~Л

_ „О Ы-К-СН2СЫ °2 >С>

V-/ м У_/ <

%

"О

О + N0 -_Д^сн-ск

- н

Схема 1.

Однако, методики доказательства выделения оксида азота при окисленш молсидомина in vitro, предложенные H.Bohn и KSchoenafinger представлягота достаточно трудоёмкими.

По этой причине в настоящей работе предпринята попытка расширить возможно сти предложенного ранее метода предварительной оценки биологической актив ности NO-генерирующих органических соединений - потенциальных вазодилата торов, и применить его к соединениям, биотрансформация которых с выделение?» N0 включает стадию окисления.

Окисление исследуемых соединений проводилось в водных растворах npi различных рН феррицианидом калия. Апробирование методики проводилось ш примере гидроксиламина и молсидомина, - объектах, для которых генерация NO i результате окисления in vivo и in vitro считается надёжно установленным фактом.

Детектирование N0, выделившегося в результате реакции окисления, про> водилось по регистрации пиков восстановления нитропруссид-иона на дифференциально-импульсных или переменно-токовых полярограммах.

В общем случае процесс окисления азотсодержащих соединений феррйциа-нидом калия в щелочном растворе, в результате которого образуется N0, можнс описать следующими уравнениями:

где X - донор оксида азота (восстановленная форма), а У - продукт его окисления.

Учитывая, что окисление обычно проводится в растворах с рН от 7 до 12, протекают следующие реакции:

[Fe(CN)6f • + X-> [Fe(CN)6]4" + NO + Y

[Fe(CN)6]3 • + NO-► [Fe(CN)6]4' + NO"

[Fe(CN)6]4 ■ + NO"-^ [Fe(CN)jNO]2' + CN~

(1)

(3),

(2)

NO" + 20H--^ N0/ + H20

(4)

[Ре(СЫ)6]4- + М02--> [Ре(СЫ)5Ш2]4" + СЫ' (5)

А. так как, в щелочных растворах пики восстановления аниона [Ре(0^)3Н02]4 ~ ниже, чем для [Ре(СЫ)3ЫО]2то полярографирование образующегося нитропрус-:нд-иона целесообразно проводить в области рН 3-5, при которых существует только одна форма - [Ре(СМ)5МО]2~. Таким образом, анализируемый раствор после экисления необходимо подкислить до данных значений рН непосредственно в полярографической ячейке. По высоте первого или второго пика, соответствующих юнцентрации образующихся в процессе окисления N0 или ИСЬ' за определённый промежуток времени, можно оценить выход данных продуктов окисления (В), соторый, в принципе, пропорционален эффективной константе скорости реакции, ю соотношению (6):

и1'2

В= х *100%, (6)

Ь1'2 -Ь1'2

общ X

Ь1-2 -

•де 11 х высота первого или второго пиков восстановления нитропруссид-иона, )бразующегося при окислении исследуемого соединения с известной концентра-

1 9

шей, Ид'д — высота пиков восстановления НП-иона после добавления стандарт-

юго раствора нитропруссида натрия в раствор исследуемого окисленного вещест-1а. Метод позволяет по положению максимумов на дифференциально-импульсной юлярограмме качественно судить об образовании в процессе окисления N0, а 1вличина В даёт информацию о лёгкости высвобождения N0 в ряду определённого :ласса органических соединений.

Из полученных нами данных следует, что окисление молсидомина ферри-[ианидом калия в области рН 7-10 не приводило к образованию нитропруссид-юна даже при длительной выдержке при 80°С (рис. 1).

Усл. сл.

Дифферепциально-импульсные подпрограммы:

(1) - Молсидомин - Ю^М после окисления К3[Ге(СЫ)6] - 10 3 М рЩокисле-

ния)'13,0.

(2) - То же с добавкой нитропруссида - 10 3М.

(3)- Тоже. чгои(1), но рН(окисления)=12.0.

Рис. 1

Только при окислении при более высоких значениях рН (рН=13) на дифференциально-импульсных полярограммах были зафиксированы пики (рис. 1), соответствующие восстановлению нитропруссид-иона (при потенциалах ~0,34 и -0,58 В и В~19%). Данные результаты, по-видимому, свидетельствуют о том, что стадии окисления предшествует стадия гидролиза, что согласуется с приведённой выше схемой 1 - окислительной трансформации молсидомина.

Другим объектом, выбранным для наших испытаний, был также хорошо известный донор оксида азота - ЬШ2ОН. Окисление гидроксиламнна проводилось нами при его концентрации в избытке феррицианида к^лия (10'3М) в

цитратно-фосфатных и цитратно-ацетатных буферных растворах с рН 5-12 при температуре 70°С в течение 15 мин. После подкисления раствора с продуктами окисления лимонной кислотой до рН~5,0 (в случае нейтральных и щелочных растворов) на дифференциально-импульсных полярограммах наблюдались максимумы, возрастающие (соответственно возрастал и выход, так например, при рН 12,0 выход N0 составил ~ 53,5%, а при рН 6,0 ~ 4%) при увеличении рН окисления (рис. 2), при потенциалах восстановления нитропруссид-иона, соответствуюингх обратимым одноэлектронным процессам (7 и 8).

+е

[Ре(СМ)5М)]

+е~+Н +

[Ре(СН)5ЫОГ ^

12.:

7.5

[Ре(СМ)5ЫО]

^ [РеССМЭзШН]3"

12.5

7,5

2.5

05 0.4 0.6 0.8 -Е. П 02 0.4 0.6 0.» -Е. П

(нас.к.1.) (нас к л.)

Дифференциально-импульсные поляре! рачмы:

(1) - ЬПЮП - 10"" М после окисления К,|Ре(СЮ6] - 10"' М рЩокнсле-ния) -6.0, (2) - ю же с добавкой ннгршруссида - 10"' М. (3) - ЬПШН -Ю* М после окисления К1[Ге(СМ)л] - 10'3 М рН(окисления)"12.0. (4) - то же с добавкой нитропруссида - 10"' М.

(7)

(8)

.5

Рис. 2

Это непосредственно свидетельствует об окислении гидроксиламина до N0 или N02 • Увеличение высоты пигсов с возрастанием рН, соответственно, выхода дан-

ных продуктов окисления, связано как с возрастанием окислительного потенциала раствора, так и с элиминированием реакций димеризации промежуточных продуктов окисления, приводящих к образованию электрохимически неактивных N2 и N20. Зависимость выхода от рН представлена на рисунке 3:

Зависимость выхода нигропр.усгнд-ионя от рН при окислении гнлроксилачнна феррнииаиндом калия.

Рис 3

Следует отметить, что предлагаемый модельный метод прогнозирования in vitro NO-донорной активности азотсодержащих органических соединений различных классов по лёгкости высвобождения N0 в результате окисления не претендует на строгость подхода в обосновании биологической (антигипертензивной и спазмолитической) активности конкретного соединения, генерирующего N0. Это можно объяснить прежде всего различием в механизмах чисто химического и ферментативного окисления веществ, которые, кроме NO-донорной группы, должны иметь функциональные группы, тропные к ферменту. Однако он может быть полезен для первичной выборки NO-генерирующих соединений в ряду веществ определённого класса.

Гидроксамовме кислоты, амидоксимы и оксимы как доноры оксида азота

Задачей настоящей работы является исследование NO-донорных свойств производных гидрокснламина - гидроксамовых кислот, амидоксимов и оксимов. С этой целью были выбраны 3 серии соединений - оксимы 1,11, гидроксамовые кислоты III и амидоксимы IV- схема 2:

N

ОН

1

I-V н

СНз „

N

R-

О

<

NH2

R-

ч

он

NH-OH III

N-OH

к R=

з R=2-Py и Я=4-Ру

Схема 2.

Перечисленные выше соединения исследовались нами по методу, описанному ранее. С этой целью проводилось их окисление феррицианидом калия в 0,01 н щелочных растворах с последующим детектированием выделяющегося оксида азота в виде нитропруссид-иона (НП). На рис. 4 стр. 14 представлены полярограм-мы, полученные для некоторых веществ. Результаты представлены в таблице 1.

Пути, ведущие к генерации N0 из изученных оксимов, амидоксимов и гидроксамовых кислот различны, но наблюдаемые факты можно разумно объяснить следующим: при рН 12 все изучаемые оксимы (кроме 1а) и гидроксамовые кислоты 5ыли ионизированы более чем на 90%, и первый шаг в окислении несомненно -этщепление электрона от их аннона с образованием нитроксильного радикала VI -схема 3:

R-CH=N-OH 1,11

"ОН или нр

ОН

r-ch;

R-CH=N-0 V

-NO он"

R-CH=N-0* Via .NO

чон

r-ch;

VIll

Схема 3.

-e

-—> r-£h-n=o -

VI6

> RCHO + NO*

'0

Выход НП-иона при окислсиии исследуемых соединений при pH 12.

R Соединение I II III IV

сн3 а 0,0 - 22,9 25,0

Ph б 0,5 - 9,0 10,0

2-HOQ3H4 в 0,0 - 14,0 -

г 0,0 - 5,1 -

4-НО(#14 Д 0,0 - 6,5 -

4-снзсед е 0,0 - 16,4 -

4-НСедСН2 ж - - - 5,5

2-?у 3 0,0 6,4 0,0 20,6

4-Ру и 7,4 6,2 0,8 29,5

2,6-Ру к - - зд 40,0

Среди исследованных оксимов -1,11, только оксимы In и Нз,н, содержащие в своём составе пиридиновый цикл, имеют повышенное содержание аниона V, переходящего в радикал VI (представленный двумя резонансными структурами Via и VI6) и генерируют N0. Оксимы Iii и 11з,н имеют приблизительно одинаковые выходы оксида азота, тогда как 1з в данных условиях N0 не генерирует.

5,0

3.0

1,0

5.0

3.0

1.0

02 0.4 0.6

02 0.4 0.6

0,8 -Е- В (иас.к.э.)

0.8 -Е,В

(иас.к.э.)

Дифференниально-нмпульсные по.ш рограммы:

(1) - Шк- Ю-1 М после окисления К)[Рс(СЫ)(.] - 10' М рН(окислси.)=12,0

(2)- Тоже с добавкой ни I ропруссидз - 10"5 М.

(3) - 1Ук~ КГ' М после окисления К,[ре(СЫ)(] - Ю'3 М рИ(окислен.)-120

(4)- Тоже с добавкой нтропруссида -10'5 М.

Рис. 4

Я-С

III ▲

||

ОН

,011

я-с

юн

XI

он

я-с

о

N40

IX

-е ,

,0

Я-С

N04

X

Я-С

кон

' XII >\

,ои

Я-С

N0 ХШа

,он

Я-С

^N0 ХШб

'ОН или н-о!

о

ЯСООН + N0'«

,ОН

\

— я-

о

А

,ОН

ОН

XVI

N0

■а

.ОН

XV

N0

\ XIV

N0

Схема 4.

В поведении гидроксамовых кислот существенно следующее: оба промежуточных продукта - доминантная оксо-форма III и минорная имино-форма XI вследствие сопряжения более стабильны по сравнению с анионом IX, а имино-анион X превращается в радикалы XII и XIII (Схема 4). Последний вовлекается в дальнейшие превращения подобно тому, как это происходит для окснмов с интер-медиатом VI.

Исследования реакционных смесей, содержащих Шб,в,е при помощи ТСХ обнаружило присутствие только соответствующих карбоновых кислот. Была также обнаружена неразделяемая сумма продуктов реакции - результат гидроксилирова-ния ароматического кольца и радикальной димеризации.

Амидоксимы - IV могут быть окислены до катион-радикала XVII, подвергающегося далее депротонированию с образованием радикала XVIII - Схема 5.

^ * • 1Ч-ОН ы-он

IV

XVII

мн2

N — 0 XVIIIa

Я-С^ \

N41

ы-он

XX

он

• ^Н2 'ОН или Н£>

\=0 ^N0

XVШб XIX

I -N0'

► ШОН + Я-СЫ XXI

!

У

он

► ЯСОМ^ + ЯСООН

-► N0

Схема 5.

Промежуточное соединение XVIII может вести себя подобно вышеупомянутым ключевым радикалам VI и XIII (Схемы 3 и 4), образуя N0 превращаясь в интермеднат XIX, но тем не менее для подобных соединений это может оказаться и не единственным возможным пу!ём генерации оксида азота (XX ^ XXI).

Вопреки тому факту, что 1\;б при окислении даёт бензамид и бензойную кислоту, как конечные продукты (ТСХ), основным определяемым продуктом реакции является РЬ-СИ (газовая хроматография - масс-спектрометрия). Точных данных по кинетике процесса не имеется, но расход 1Уб в присутствии К3|Те(СМ)6] протекал значительно быстрее, чем щелочной гидролиз, ведущий к образованию бензамида и гидроксиламина. Таким образом перегруппировка некоторых радикальных частиц ведёт к образованию Р11-СЫ (например XVIII-У XX-> XXI) и не

просто гидролиз является основной причиной образования N0 из амидоксимов. Радикал XXI или его анион вполне могут быть предшественниками N0 в данных условиях.

Приведённые выше рассуждения не исключают возможности окисления -ЫН2 группы амидоксимов до -1чЮН, как первый шаг в генерации N0, однако обладающий значительными основными и электронодонорными свойствами СН3С(=МН)КН2 не генерирует оксид азота в данных условиях, что подтверждает Схему 5.

Падение активности в 2 раза при замене СН3 на РИ в Ша/Шб и ^а/П'б можно объяснить за счёт уменьшения реакционной способности радикалов, стабилизированных ароматическим кольцом. В дальнейшем проявление этих эффектов усиливалось при увеличении электроноакцепторных свойств Я, что возможно является ответственным за низкую ЬЮ-донорную активность пиридингидроксамовых кислот - Шз-к. Природа Я лишь незначительно влияет на кислотность =1\Т0Н группы в амидоксимах, а акцепторные свойства пиридинового заместителя

не так важны в стадиях IV-^ XVH-У XVIII, но они играют центральную роль в последующих стадиях, способных объяснить отсутствие полного параллелизма в сериях III и IV.

Кроме юго мы считаем нужным отметить тот факт, что гидроксиламин, гидроксамовые кислоты и четвертичные пиридиновые альдоксимы Из (2-ПАМ) и Ни (4-ПАМ) явились первыми описанными в литературе антидотами при отравлении фосфоорганическими соединениями (ФОС).

Тесты, проведённые в Институте Биологической Химии проф. И.С.Севериной с сотрудниками показали, что все исследованные реактиваторы являются активаторами РГЦ, но различаются по степени активации (таблица 2).

Таблица 2.

Влияние промзводиых оксимов на активность РГЦ человека.

Название Xим№1 еекая формула Выхол NO (%) Активация гуанилатциклазы (%)

Концсшрация соединений (М)

Ю-6 КГ 5 ю-4 ю-3

1,1 '-1РИМС1И."1СН-6ИС-(4-пнридиня льлоксим) бром ил (липироксим) CII-H01I CH'NOH 6 6 N N 1 1 С112-CII2-<:н2 2Пг .1,1 1 50.) 9 200.4-9 320+ 15 420+ 13

гидроксиламин NH2oii 53,5 1 10+2 130+5 210+10 360 + 14

2-пиридинальдоксим (пироксим) сх N C1I-NOH 0.0 140+5 195 + 10 170+3 -

2-пиридиналцлоксим-ме 1 илйолид (2-11ЛМ) Ск I 1 СН3 6,4 120+6 2 10+5 170+5 -

4-чиридипальоксим-мс1и.1Йолил (4-1IAM) CIt-NOH 6 [ 1 СИ, 6.2 110+2 160+5 1 50 j 4 -

Как видно из таблицы для 2-пиридинальдоксима, 2-ПАМ и 4-ПАМ оптимальной концентрацией является 0,01 мМ. При этом наибольшая степень активации фермента отмечена для 2-ПАМ - (210±10)%. Практически того же порядка составляет величина стимулирующего эффекта 2-пиридинальдоксима - (195±10)%, но несколько ниже эффект 4-ПАМ - (160±10)%. Дальнейшее увеличение концентраций этих соединений в пробе (до 0,1 мМ) - снижает их активирующее влияние на гуаннлатциклазу.

Несколько иная зависимость величины стимулирующего эффекта от концентраций соединений отмечена для гндроксиламнна и дипнроксима. Более низкая (чем для упомянутых выше производных пиридинальдоксима) активация гуани-латцнклазы гидроксиламином, при его 0,01 мМ концентрации - (130±5)%, значительно увеличивается - до (210±10)% и (360±14)% при повышении концентрации гидроксиламина до 0,1 и 1,0 мМ, соответственно.

Та же закономерность отмечена и для дипнроксима. Последний оказался наиболее активным стимулятором гуанилатциклазнон активности и его активирующий эффект при 0,01, 0,1 и 1,0 мМ составляет - (200±9), (320±15) и (420±13)%, соответственно.

Другими словами, наблюдается некоторая корреляция между способностью соединений в процессе их химического окисления феррицнанидом калия генерировать оксид азота (в виде нитропруссид - иона) и активировать РГЦ. То есть можно полагать, что отмеченные активирующие эффекты на гуаннлатциклазу исследованных соединений, связаны со способностью последних в процессе их биотранс-формацни, генерировать оксид азота.

Таким образом, все исследованные соединения: гидрокснламин, производные пиридиниевых альдоксимов и биспиридиниевый диоксим, известные как реак-тиваторы холинэстеразы, ингибированной фосфоорганическими соединениями, являются одновременно донорами N0 и активаторами гуанилатциклазы. Поскольку механизм действия реактиваторов холинэстеразы окончательно ещё не выяснен, данная проблема продолжает привлекать к себе внимание.

Имеющиеся данные о способности исследованных оксимов активировать растворимую гуанилатциклазу, впервые указывают на возможное участие этого фермента в процессе реактивации ингибнрованной холинэстеразы. В основе такого участия лежит NO-зависимая активация РГЦ и накопление цГМФ (циклический гуанозин монофосфат). Кроме того, как указывалось выше, оксимы способны генерировать оксид азота и активировать РГЦ. Можно предположить следующий возможный механизм реактивации холинэстеразы. Согласно этому предположению реактпватор холинэстеразы может выполнять двойную функцию: 1) оказывать нуклеофильную атаку на фосфорилированный гидроксил остатка серина в активном центре ингибнрованной холинэстеразы и 2) активировать РГЦ, благодаря способности генерировать оксид азота, что приводит к накоплению цГМФ. Оба процесса будут способствовать дефосфорилированию ингибированной холинэстеразы и восстановлению активности фермента.

Наиболее распространённым методом количественного определения оксимов является гидролиз в концентрированной соляной кислоте с последующим анализом отогнанного из гидролизата карбонильного соединения или кубового остатка солянокислого гидроксиламина. Существуют также методы, основанные на реакции восстановления оксимов до аминов (в первую очередь - солями трёхвалентного титана).

Известно, что оксимы восстанавливаются электрохимически на р.к.э. Электровосстановление оксимов является одним из перспективных методов синтеза функциональных замещённых аминов. Общая схема электровосстановления оксимов в кислых средах предложена Лундом, который показал, что первой стадией процесса электровосстановления протонированных молекул оксимов является расщепление связи N-0 с образованием иминов, которые в дальнейшем восстанавливаются до аминов - схема 6.

В случае альдоксимов - производных пиридинальдегида общий механизм электровосстановления не меняется.

Я-ОФЮН + Н+---►

К

I I н к н

Схема 6.

На постоянного ков ых поляро граммах 2-ПАМ и дипироксима имеются участки анодного тока, связанные с присутствием в их молекулах анионов галогенов, а также хорошо выраженные 4-электронные катодные волны для 2-ПАМ и 8-электронные в случае дипироксима, пригодные для аналитического использования. При оптимальном рН 4 для обоих препаратов наблюдается линейная зависимость предельного тока от концентрации в интервале 10'5+2'10"4 М. Потенциалы полуволн Е1/2 процессов восстановления в этих условиях для 2-ПАМ и диппроксима составляют соответственно -0,64 и -0,58 В (нас.к.э.). Сдвиг Е1/2 дипироксима в положительную сторону по сравнению с 2-ПАМ обусловлен увеличением положительного заряда молекулы, что облегчает процесс восстановления.

Так как зависимость предельного тока от концентрации 2-ПАМ и дипироксима была линейной, то это даёт возможность проводить их количественное определение по методу калибровочного графика и стандартных растворов.

Кроме того, полярографическое определение (в особенности в дифференци-ально-нмпульсном режиме) позволяет осуществить качественное различие препаратов по величине Е|/2, что особенно существенно для 2-ПАМ и дипироксима, имеющих идентичные функциональные группы.

1ЧО-Генерирующая способность некоторых производных 4-нитропиразолов

Нами было изучено электрохимическое восстановление соединений 1а-г, которое проводилось на ртутном капельном электроде в водных буферных растворах электролитов и их химическое восстановление ферроцианидом калия.

Установлено, что соединение 1а в диапазоне потенциалов от -0,30 до -0,90 В (насыщенный каломельный электрод) дает одну 4-элекгронную волну, по характеристикам соответствующую диффузионному ограничению процесса восстановления. этой волны смещается до рН 9 в сторону отрицательных потенциалов при возрастании рН на 60-65 мВ/ед. рН, то есть, с наклоном, близким к аналогичному значению для нитробензола (58 мВ).

Несколько иная картина наблюдается при изучении полярографического восстановления днаминопроизводного 16. И в этом случае на полярограммах в области рН 1-9 наблюдается одна диффузионная волна с Е|Д= -0,50 + -1,10 В (сдвиг в сторону отрицательных потенциалов вызван электродонорным эффектом аминогрупп). Однако, величины предельного тока при рН>8 выше, чем для 1а, что свидетельствует о вкладе 6-электронного процесса восстановления N02 ДО Механизм восстановления меняется еще более существенно при переходе к гуани-диновому производному 1в - наблюдается значительный сдвиг Н1/2 в положительную сторону (-0,15 - -0,45 В), изменение наклона зависимости Е^-рН (около 40 мВ) и примерно двукратное уменьшение высоты волны по сравнению с высотой волны для соединения 16. В кислых небуферных растворах на полярограммах 1в при более отрицательном потенциале появляется еще одна

нн2

волна с Е1/2 = -1,00 В, возрастающая при добавлении нитрита натрия и соответствующая, следовательно, образующемуся на первой волне протонированному нитрит-аниону, а при рН>8 появляется также дополнительная анодная волна с Е1/2= -0,15 В (при рН 9,2), связанная, вероятно, с окислением гуанидинового фрагмента. В случае соединения 1г волны восстановления чрезвычайно растянуты (начало волны при рН 7-0,15 В; выход на предельный ток при -0,35 В), что указывает на сильную необратимость процесса восстановления. Существенно, однако, что и в этом случае в кислом небуферном растворе фиксируется волна НЫОг. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что если для соединений 1а и 16 не наблюдается разрыва С-ИОз -связи, то для веществ 1в и 1г такое расщепление (с образованием оксида азота) в какой-то мере имеет место. Для подтверждения этих данных проведено химическое восстановление соединений 1а-г ферроцианидом калия в слабокислых цитратно-фосфатных буферных растворах с рН 5, которое, при образовании N0 приводит к полярографически активному нитропруссид-аниону, легко фиксирующемуся на дифференциально-импульсных полярограммах. Для соединений 1в и 1г на дифференциально-импульсных полярограммах в буферных растворах рН 5 (10 "3 М К,,[Ре(СЫ)6] + 10 "4 М 1в или 1г) после нагревания раствора при 70°С в течение 15 мин. появлялись пики восстановления нитропруссид-иона. Напротив, для соединений 1а, 16 наблюдать образование оксида азота не удалось. Очевидно, что основную роль в создании возможности фрагментации с образованием оксида азота должны играть гуанндиновая группа в положении 5 соединения 1в и амидиновый фрагмент в положении 1 соединения 1г. При разработке такой схемы (являющейся только предположительной) мы исходим из того, что процессы для обоих соединений должны быть сходными, с одной стороны, а протекание их должно быть невозможно для аминопроизводных 1а, б. Представляется вероятным, что в обоих случаях определяющим процессом является разрыв С-И-связи в гуанидиновой или амидиновой частях молекул с образованием соответствующих радикалов

- типа Л и типа Б, которые далее взаимодействуют между собой с образованием амидннов (2) или путем их последующего гидролиза до карбамидов (3).

"Л ,N02

+е

ЧЛ ,N02

N4

(Б)

--N. X

Н,К 1\%

+с,-+Н+ /¡~\

к

I

Схема 7.

2

По сходной схеме для 1г:

-► А + Б -► 2 -► 3

Схема 8.

Сложность доказательства постулированных направлений восстановления заключается, прежде всего, в том, что выход оксида азота в этой реакции весьма невелик (см. выше) и одновременно протекает ряд других процессов, связанных, по-видимому, с восстановлением нитрогруппы, гидролизом гуанидинового и ами-динового фрагментов и т.д. Вполне очевидно, что если принять эту схему, образование N0 при восстановлении соединений 1а, б невозможно.

Структура соединений 16, в, г дает основание и для другой гипотезы - наличие гуанидинового и амидинового фрагментов в последних двух соединениях и орто-расположение амино- и нитро-групп в пиразоле 16 дает возможность предпо

дожить, что при окислении каждое из этих соединений в той или иной мере способно претерпевать деградацию с образованием оксида азота. Некоторые аналогии, связанные с окислительной трансформацией гуанидинов и амндинов с высвобождением N0 описаны в литературе.

При окислении соединения 1г феррицианидом калия в буферном растворе с рН 12 по описанной выше методике после нагревания при 70°С в течение 15 мин на дифференциально-импульсной полярограмме зафиксированы пики, соответствующие электровосстановлению образовавшегося ннтропруссид-иона. Аналогичная картина наблюдалась и для соединений 16, в (но не для соединения 1а). Возможно, окисление протекает по направлениям, в той или иной мере сходным с окислением аргинина с образованием цитруллина. Например, для 1в Схема 9:

НА Ж02 Н2М щ НА ,N02

УК УЧ. ГК

Схема 9.

Нам представляется, однако, что возможен и другой вариант, связанный с образованием при окислении производных фуроксана. Тогда схема образования N0 может выглядеть следующим образом:

Схема 10.

Выводы.

1. Модифицирован разработанный ранее метод полярографического детектиро вания оксида азота, образующегося при окислении некоторых азотсодержащих соединений (потенциальных лекарственных средств) феррицианидом калия, позволяющий проводить предварительный скрининг потенциальных МО-доноров. Метод основан на фиксировании пиков восстановления нитроирус-сид-иона на дифференциально-импульсных полярограммах.

2. Исследована МО-донорная активность некоторых производных гидроксамовых кислот, оксимов и амидоксимов бензольного и пиридинового ряда. Впервые обнаружена генерация оксида азота при химическом окислении гидроксамовых кислот и амидоксимов феррицианидом калия и предложены механизмы генерации оксида азота при окислении исследованных соединений.

3. Впервые установлена генерация оксида азота при химическом окислении известных реактиваторов холинэстеразы (2-ПАМ, 4-ПАМ, дипнроксим и др.), ингибированной фосфорганическими соединениями.

4. . Исследовано полярографическое восстановление реактиваторов холинэстеразы

на капельном ртутном электроде, на основании чего предложен метод количественного определения данных лекарственных средств.

5. Показано, что при химических и электрохимических превращениях некоторых производных 4-нитропиразолов генерируется оксид азота и впервые найдены системы, в которых образование оксида азота реализуется как при окислении, так и восстановлении при участии одних и тех же группировок (4-ннтро-5-гуанидино-3-аминопиразол и 4-нитро-1-иминокарбамоил-3,5-диаминопира-зол).

6. Установлено, что 4-жггропиразолы, в которых нитрогруппа связана с ароматическим 5р2-гибридизованным углеродным атомом, способны в условиях проведённого эксперимента выступать в роли генераторов оксида азота.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. В.И.Левина, А.В.Данилов, Н.Б.Григорьев. Полярографическое детектирование оксида азота при окислении некоторых азотсодержащих соединений феррициани-дом калия. // Хим.-фарм. ж. - 1998 - № 4 - с. 53-56.

2. В.НЛевина, А.В.Данилов, Н.Б.Григорьев. Количественное определение некоторых четвертичных пиридинальдоксимов полярографическим методом. // Хим.-фарм. ж. - 1998 -№ 11 - с. 52.

3. L.N.Koikov, A.V. Daniiov, N.B.Grigoryev, V.G.Granik. Oximes, amidoximes and hydroxamic acids as nitric oxide donors. // Mendeleev Commun. - 1998 - № 4 - p.165-168.

4. L.N.Koikov, N.B.Grigoryev, AV.Danilov, V.G.Granik. Oximes, amidoximes and hydroxamic acids as nitric oxide donors. Abstracts of XlVth Intern. // Symposium of Medicine Chemistry-Edinburgh - 1998 - p.38.