Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Поиск биологически активных соединений среди продуктов взаимодействия 2-арил-4-гидрокси-6Н-1,3-тиазин-6-онов с замещенными силициловыми альдегидами и их аналогами

ПОИСК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ СРЕДИ ПРОДУКТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 2-АРШГ-4-ГИДРОКСИ-6#-1,3-ТИАЗИН-6-ОНОВ С ЗАМЕЩЕННЫМИ САЛИЦИЛОВЫМИ АЛЬДЕГИДАМИ И ИХ АНАЛОГАМИ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

003472 120

Санкт-Петербург - 2009 г.

003472120

Работа выполнена на кафедре органической химии ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации.

Научный руководитель: Доктор химических наук, з.д.н. РФ, академик

РАЕН, профессор Ивин Борис Александрович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук,

профессор Молдавер Бенюмен Лейбович доктор фармацевтических наук, профессор Кузнецов Петр Васильевич

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации.

Защита состоится 30 июня 2009 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.088.01 при ГОУ. ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197341, Санкт-Петербург, проспект Испытателей, 14.

Автореферат разосланХ~^мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук

Марченко Н.В.

1 Общая характеристика работы Актуальность темы. Среди огромного числа гетероциклических соединений особое место занимают 1,3-гетероазины, в том числе замещенные гидро-кси(оксо)пиримидины, что обусловлено участием многих из них в важных биохимических и физиологических процессах и применением в медицинской практике. Гиааналоги таких пиримидинов - гидрокси-1,3-тиазины, изучены значительно меньше. Работами кафедры органической химии СПХФА показано, что производные гидрокситиазинов являются перспективной группой гетероциклов для создания эффективных биологически активных веществ. В частности установлено, что 2-арил-4-гидрокси-6//-1,3-тиазин-б-оны представляют собой новую группу противоопухолевых агентов с необычным механизмом действия.

Известно, что конденсация производных полигидроксипиримидинов и гидрокси-1,3-тиазинов с альдегидами является удобным методом получения биологически активных соединений. При этом наличие в молекуле ароматического альдегида нуклеофильной орто-гидроксигруппы открывает широкие возможности для синтеза новых гетероциклических систем. Среди продуктов взаимодействия таких гидроксилсодержащих альдегидов с производными по-лигидроксипиримидина были обнаружены соединения с противовирусной, про-тивомикробной, противогрибковой и другими видами активности. Данные о реакциях гидрокси-1,3-тиазинов с салициловыми альдегидами в литературе отсутствуют. В связи с этим исследование взаимодействия производных 1,3-тиазинов с функционально замещенными альдегидами представляет несомненный интерес как с точки зрения получения новых эффективных лекарственных средств, так и с позиций теоретической и синтетической органической химии.

Целью работы являлся поиск эффективных малотоксичных биологически активных соедииений среди продуктов реакции 2-арил-4-гидрокси-6#-1,3-тиазин-6-онов с замещенными салициловыми альдегидами и их аналогами.

Задачи исследования: разработка технологичных методов синтеза новых биологически активных производных 2#-хромена, хинолина и бензо[6]тиина взаимодействием 2-арил-4-гидрокси-бЯ-1,3-тиазин-6-онов и их азааналогов с альдегидами, содержащими гидрокси-, амило- и меркаптогруппу; установление строения синтезированных соединений; определение их острой токсичности; исследование некоторых видов биологической активности и их связи со строением синтезированных веществ, разработку методик стандартизации наиболее эффективного соединения. •

Научная новизна. Впервые изучено взаимодействие 2-арил-4гидрокси-6/7-1,3-тиазин-б-онов с салициловыми альдегидами и их аналогами, доказано строение продуктов реакции, определена их токсичность и исследованы некоторые виды биологической активности. Показано, что:

- 2-Арил-4-гидрокси-6Я-1,3-тиазин-б-оны реагируют с салициловыми альдегидами, образуя Л^-тиоароилкумарин-З-карбоксамиды, а с 2-амино- и 2-мер-каптобензальдегидами - //-тиоароил-2-оксохинолин- и 7У-тиоароил-2-оксо-бензо[£]тиин-3-карбоксамиды, соответственно. Выход конечных продуктов увеличивается при использовании в реакции пиридина, благодаря образованию более нуклеофильных анионов тиазинов.

- 1-Метил-2-арил-4-гидроксипиримидин-6-оны реагируют с салициловыми альдегидами в присутствии пиридина иначе, чем их тиааналоги - 2-арил-4-гид-рокси-бЯ-1,3-тиазин-б-оны, и образуют 1 -метил-2-арилхромено-[4,3-d\пири-мидин-4,5-дионы, а не УУ-[(метилимино)(арил)метил]кумарин-3-карбоксамиды.

- Взаимодействие 2-арил-4-гйдрокси-6Я-1,3-тиазин-6-онов с. 2-гидрокси-циклогекс-1-ен-1- и 3-гидрокси-1Я-инден-2-карбальдегидами в присутствии пиридина протекает с образованием А^тиоароил-2-оксо-5,6,7,8-тетрагидро-2Я-хромен- и -2Я,5Я-индено[1,2-£]пиран-3-карбоксамидов, соответственно.

- Реакция 2-арил-4-гидрокси-6Я-1,3-тиазин-6-онов с 3-формилхромонами приводит к образованию смеси 2-арил-5-(4'-оксохромен-3'-ил)-6,7-дигидро-4Я,5Я-пирано[2,3-с/][1,3]тиазин-4,7-дионов и Л7-тиоароил-5-гидрокси-2-оксо-2Я,5Я-пирано[3,2-с]хромен-3-карбоксамидов. Выход последних повышается при наличии электроноакцепторных заместителей в молекуле 3-формил-хромона и при проведении реакции в присутствии пиридина.

- Среднесмертельные дозы N-тиоароилкумарин-3-карбоксамидов колеблются в пределах 1500-2100 мг/кг. Логарифмы обратных молярных средне-смертельных доз практически не зависят от липофильности соединений и подчиняются параболической зависимости от параметров электронных свойств заместителя в положении 6 кумарина.

- /V-Тиобензоил-б-фтор- и -6-хлоркумарин-З-карбоксамиды тормозят рост солидной опухоли Эрлиха in vivo. Ж-Тиоароилкумарин-З-карбоксамиды обладают умеренным действием против вируса гриппа A/Viktoria/35/72 (H3N2) и A/Mallard/NT/12/02 (H7N3).

- /V-Тиобензоилкумарин-З-карбоксамиды с электроноакцепторными заместителями в положении 6 проявляют умеренную противосудорожную активность.

- Аг-Тиобензоил-5-гидрокси-9-бром-2Я,5Я-пирано[3,2-с]хромен-2-он-3-карбоксамид обладает выраженным противогрибковым действием, сравнимым с активностью флуконазола.

- Подлинность субстанции iV-тиобензоил-б-фторкумарин-З-карбоксамида следует устанавливать методами УФ и ИК спектроскопии, чистоту - методом ТСХ, количественное определение следует проводить методом прямой алкалиметрии в неводной среде.

Практическая значимость. Разработаны технологичные методы получения производных jV-тиоароил-кумарин-, -2-оксохинолин-, -2-оксобензо-[6]тиин-, -2-оксо-2Я,5Я-индено[1,2-6]пиран-, -2-оксо-2Я-5,б,7,8-тетрагидро-циклогекса[Ь]пиран-, и -2-оксо-5-гидрокси-2Я,5Я-пирано[3,2-с]хромен-3-кар-боксамидов. Обнаружена новая группа малотоксичных противоопухолевых агентов. Выявлена зависимость токсичности и противоопухолевого эффекта /V-тиобензоилкумарин-З-карбоксамидов от электронных свойств заместителя в положении 6 кумаринового цикла. Разработаны методики стандартизации наиболее перспективного соединения - N-тиобензоил-б-фторкумарин-З-кар-боксамида. По итогам работы оформлены акты внедрения полученных результатов в учебный процесс ГОУ ВПО СПХФА и в научно-исследовательскую работу ФГУ «НИИ Онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологии».

Положения, выносимые на защиту.

1. Новый метод синтеза Л^-тиоароилкумарин-, -2-оксохинолин- и -2-ок-собензо [Ь]тиин-3 -карбоксамидов.

2. Удобный способ получения 1-метил-2-арилхромено[4,3-с/]пиримидин-4,5-дионов.

3. Перспективный метод синтеза новых А-тиоароил-2-оксо-5,6,7,8-тет-рагидро-2Я-хромен- и -2-оксо-2Я,5Я-индено[1,2-6]пиран-3-карбоксамидов.

4. Удобный метод синтеза новых Л'-тиоароил-5-гидрокси-2Я,5Я-пирано-[3,2-с]хромен-2-он-3 -карбоксамидов.

5. Наличие противоопухолевой активности у малотоксичных А'-тио-бензоил-6-фтор- и -6-хлоркумарин-З-карбоксамидов.

6. Методики стандартизации субстанции А'-Тиобензоил-б-фторкумарин-3-карбоксамида.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом НИР Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии «Исследование путей синтеза, строения, физических и химических свойств, биологической активности и связи между ними в ряду 0-, Б-со-держащих гетероциклических соединений с целью поиска новых лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01200852357).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международной конференции «Современные тенденции органической химии» (Санкт-Петербург, 2004), конференциях «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем» (Санкт-Петербург, 2004), «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006, 2008), региональной научной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), научно-практической конференции «Фармация из века в век: достижения, проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 2008), IV международной научно-практической конференции «Динамика научных исследований» (София, 2008), IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современных наук» (Рггетуз1, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи, в том числе 2 - в журнале, рекомендованном ВАК, тезисы 6 докладов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературных данных, экспериментальной части, обсуждения экспериментальных данных, выводов и приложения, содержит 37 таблиц и 84 рисунка. Библиография включает 179 ссылок на литературные источники.

2 Основное содержание работы 2.1 Взаимодействие 2-арил-4-гидрокси-бЯ-1,3-тиазин-6-онов с 2-гидрокси-, 2-амино- и 2-меркаптобензальдегидами

Ранее было показано, что полиоксипиримидины реагируют с 2-гидрокси-бензальдегидами, образуя производные кумарин-3-карбоксамида и хромено-[4,3-^пиримидина (Москвин, 1998). О взаимодействии тиааналогов таких пи-

римидинов - 2-арил-4-гидрокси-6Я-1,3-тиазин-6-онов, с салициловыми альдегидами не сообщалось. Нами было установлено, что продуктами реакции 4-гид-рокси-1,3-тиазинов (I а-г) с салициловыми альдегидами (II а-м) и их аналогами (II н, о) являются А'-тиоароилкумарин-З-карбоксамиды (III а-э) (рис. 1), а в случае 2-амино- и 2-меркаптобензальдегидов - #-тиоароил-2-оксохинолин-3-карбоксамиды (IV а, б) и Лг-тиоароил-2-оксобензо[6]тиин-3-карбоксамиды (IV в, г), соответственно. Раскрытие тиазинового цикла происходит в результате разрыва связи С6-Б интермедиата (VI). Такое направление реакции можно объяснить меньшей теплотой образования (расчет методом РМЗ) соединения (VII), чем хроменотиазина (VI) (-16 ккал/моль и -2 ккал/моль, соответственно).

55-73%

I, R1 = 4-МеО (а), Н (б), 4-С1 (в), 4-N02 (г);

II, X = О, R2 = Н, R3 = Et2N (а), МеО (б), НО (в), Ме (г), Н (д); R3 = Н, R2 = МеО (е), НО (ж), Ме (з), F (и), С1 (к), Вг (л), N02 (м); X = NH, R2 = R3 = Н (н); X = S, R2 = R3 = Н (о);

III, X = О, R1 = 4-МеО, R2 = Н, R3 = Bt2N (а), МеО (б), НО (в), Ме (г), Н (д); R3 = Н, R2 = МеО (е), НО (ж), Ме (з), F (и), С1 (к), Вг (л), N02 (м); R1 = Н, R2 = Н, R3 = Et2N (н), МеО (о), НО (п), Ме (р), Н (с); R3 = Н, R2 = МеО (т), НО (у), Ме (ф), F (х), С1 (ц), Вг (ч), N02 (ш); R1 = 4-С1, R2 = R3 = Н (щ); R1 = 4-N02, R2 = R3 = H(3);

IV, X = NH, R1 = R2 - R3 = H (a); R1 = 4-MeO, R2 = R3 = H (6);

X = S,R'=R2 = R3=H(b); R1 = 4-MeO, R2 = R3 = H (r).

Рисунок 1

Было показано, что вариация температуры, соотношения реагентов и продолжительности процесса не влияют на направление реакции, но существенно изменяют выход конечных продуктов. Наименьший выход кумаринов (III) наблюдался при проведении реакции в кипящем этаноле (15-25%), что обусловлено расщеплением тиазинового цикла спиртом. В апротонных растворителях (1,4-диоксан, тетрагидрофуран) выхоч повышался до 50%, а наилучшие результаты были достигнуты при использовании полярных апротонных растворителей: диметилформамида (выход 43-60%), диметилсульфоксида (48-63%) и особенно пиридина (58-72%). Следует отметить, что высокий выход продукта (>70%) также наблюдался при проведении реакции в среде ТГФ, содержащего 10% (по объему) пиридина.

Индивидуальность синтезированных соединений (III а-э, IV а-г) доказана методом ТСХ, состав подтвержден данными масс-спектров и элементного анализа, строение - методами ЯМР 'Н и 13С, УФ и ИК спектроскопии. На примере кумарина (III с) строение было подтверждено встречным синтезом из тиобен-замида и хлорангидрида кумарин-3-карбоновой кислоты.

В масс-спектрах соединений (III а-э, IV а-г) присутствуют пики молекулярных и дочерних ионов [М\+' [М?' - ArCNHT - S]\ [Af - ArCS+ - HNCO]\ [ M" - ArCN - CO]+', [M" - ArCN - CO - Sf, [KÍ' - ArCN - СО]".

В спектрах ПМР растворов веществ (III а-э, IV а-г) в DMSO-¿4 наблюдаются синглеты групп NH (12.5-13.1 м.д.) и С4Н кумаринового цикла (8.8-9.2 м.д.), сигналы протонов бензольных колец кумарина и тиобензоильного фрагмента (6.6-8.2 м.д.) с соотношением интегральных интенсивностей 1:1. В спектрах ЯМР |3С характеристичными являются сигналы атомов углерода групп С=0 (159-161 м.д.), C=S (198-202 м.д.) и пиранового цикла [160-165 м.д. (С2), 111-118 м.д. (С3), 149-150 м.д. (С4)]. В ИК спектрах кристаллических образцов соединений (III а-э, IV а-г) наблюдаются полосы амидной группы 0=C-NH [-3400 см"1 (vJV-H), 1660-1690 см-1 (vC=0, «амид I») и 1530-1570 см"1 (оЛ'-Н, «амид II»)] и лактонного фрагмента 0=С-0 -С (1720-1740 и 1170-1190 см"1). В УФ спектрах растворов соединений (III а-э, IV а-г) в ацегонитриле наблюдаются четыре полосы поглощения: 204-212, 280-300,335-350 и 500-520 нм.

Как уже указывалось, использование полярных растворителей, и в особенности пиридина, по сравнению с неполярными, ускоряет образование веществ (III) и увеличивает их выход. Так как тиазины (I) обладают кислотными свойствами (рКа ~4.5, Куклин, 1998), можно полагать, что последние в пиридине депротонируются. Образующийся анион характеризуется большей реакционной способностью, чем неионизованная молекула, что можно проиллюстрировать результатами квантово-химических расчетов (табл. 1), проведенных полуэмпирическими (РМЗ, AMI) и неэмпирическим (Хартри-ФЪка) методами. Таблица 1 - Энергии ВЗМО, заряды (q) на атоме углерода С5 и орбитальные коэффициенты (с) атомных орбиталей атома углерода С5 1,3-тиазина (I а), его аниона и тиазина (VIII)__■_

№ соединения 9 с Евзмо

РМЗ AMI ab initio, STO-3G РМЗ AMI ab initio, STO-3G РМЗ AM! ab initio, STO-3G

1а -0.349 -0.335 -0.142 0.534 0.564 0.495 -9.69 -9.61 -6.73

I а анион -0.617 -0.552 -0.276 0.746 0.743 0.723 -4.47 -4.42 0.45

VIII -0.350 -0.339 ГЖТ39~ 0.543 0.594 0.504 -9.54 -9.47 -6.59

Как и следовало ожидать, энергия ВЗМО, величина отрицательного заряда на реакционном центре тиазина (I) - атоме С5 и вклад атомной орбитали атома С5 в ВЗМО тиазина (I) существенно возрастают при ионизации тиазина, что указывает на повышение его реакционной способности в реакциях нуклео-фильного присоединения, к которым относится и конденсация с альдегидами. Действительно, не обладающий кислотными свойствами 2-арил-4-метокси-6Н- 1,3-тиазин-6-он (VIII) не взаимодействует с салициловыми альдегидами даже при многочасовом кипячении смеси реагентов в пиридине, были выделены

лишь исходные соединения. Таким образом, синтез кумаринов (III) следует проводить в полярных основных растворителях, обеспечивающих возможность образования более активного аниона тиазина (I).

Можно было предполагать, что азааналоги 1,3-тиазинов (I) - 1-метил-2-арил-4-гидроксипиримидин-6-оны (IX) будут реагировать с салициловыми альдегидами в присутствии пиридина с образованием аналогов соединений (III) - кумаринов (X). Однако нами были получены 1-метил-2-арилхромено-[4,3-с/]пиримидин-4,5-дионы (XI а-т) (рисунок 2). Лишь в случае 4-гидрокси-салицилового альдегида были выделены продукты гидролиза веществ (X) -Л'-ароилкумаршг-З-карбоксамиды (XII а, б).

41 1 + (А^Г*2 Пирид"н

„Л -Н2°

'I ХТХ"2

IX а, 6

На-к

СНз х

Н2о|-Н3СГШ2 ХПа.б

О

О*

ОЛи1

1 си

л2

[01

СЛк1 о^-о-^^к3

Х1а-г

IX, Я1 = 4-МеО (а), Н (б);

II, И2 = Н, Я3 = МеО (а), НО (б), Ме (в), Н (г); II3 = Н,Я2 = МеО (д), Ме (е), Б (ж), С1(з),Вг(и),Ш2(к);

XI, К1 = 4-МеО, Я2 = Н, Я3 = МеО (а), Ме (б), Н (в); Я3 = Н, Я2 = МеО (г), Ме (д), Б (е), С1 (ж), Вг (з), N02 (и); Я1 = Н, Я2 = Н, Я3 = МеО (к), Ме (л), Н (м); Я3 = Н, Я2 = МеО (н), Ме (о), Р (п), С1 (р), Вг (с), Ж>2 (т);

XII, Я1 = Н, Я = Н, Я5 = НО (а); Я1 = 4-МеО, Я2 = Н, Я3 = НО (б).

Рисунок 2

В масс-спектрах всех, хромено[4,3-с/)пиримидинов (XI а-т) присутствует пик молекулярного иона, дальнейшая фрагментация которого включает последовательное элиминирование молекул АгОЫ и СО. Спектры ПМР соединений (XI а-т) характеризуются наличием сигналов протонов бензольных колец (6.68.2 м. д.) и Л'-метильной группы (3.4 м. д.). В спектрах ЯМР 13С присутствуют сигналы атомов углерода пиримидинового (106-108 м.д., 155-160 м. д.), пира-нового (110-155 м. д.) и бензольных колец (112-158 м. д.). В Ж спектрах кристаллических образцов соединений (XI а-т) наблюдаются полосы валентных колебаний лактонной группы 0=С-0-С (1730-1760 и 1180-1195 см"1). В УФ спектрах растворов соединений (XI а-т) в ацетонитриле присутствуют три максимума поглощения при 205-210, 260-280, и 300-320 нм.

2.2 Взаимодействие 2-арил-4-гидрокси-6Д-1,3-тиазин-6-онов с 2-гидроксициклоалк-1-енкарбальдегидами

К структурным аналогам салициловых альдегидов можно отнести производные 3-гидроксипропеналя, в которых также сочетаются альдегидная и гид-

роксильная группы, разделенные двумя 5р2-гибридизованными атомами углерода. Наиболее доступными представителями таких соединений являются 2-гид-роксициклогекс-1-ен-1- и 3-гидрокси-1Я-инден-2-карбальдегиды (XIII и XIV). Оказалось, что 1,3-тиазины (I а, б) реагируют с альдегидами (XIII и XIV) в присутствии пиридина, образуя Л^-тиоароил-2-оксо-5,6,7,8-тетрагидро-2Я-хромен- (XV а, б) и Лг-тиоароил-2-оксо-2Я,5Я-индено[1,2-Ь]пиран-3-карбоксамиды (XVI а, б), соответственно (рис. 3).

1 1 I J пиридин I пиридин

А As ^--АЛАО А

I и, 6

Ar = 4-МеОС6Н4,1 (а), XV (а), XVI (а); С6Н5,1 (б), XV (б), XVI (б).

Рисунок 3

В масс-спектрах пиранонов (XV а, б; XVI а, б) присутствуют пики молекулярного [М\ и дочерних ионов [Л/4" - ArCNH+ - S]"; [kf - ArCS+ - HNCO]'; [M" - ArCN - CO]+"; и [Af - ArCN - CO - S]+'. В спектрах ПМР растворов соединений (XV а, б; XVI а, б) в DMSO-ök в присутствуют синглеты групп NH (13.0 м.д.) и С4Н пиранового цикла (8.5-8.8 м.д.) и сигналы протонов у sp3-гибридизованных атомов углерода (1.7-2.7). В спектрах ЯМР 3С характеристичными являются сигналы атомов углерода карбонильной и тиокарбониль-ной групп (166 и 200 м.д.), пиранового цикла [С (162 м.д.), С3 (115 м.д.), С4 (153 м.д.), С5 (116 м.д.) С (160 м.д.)] и зр3-гибридизованных атомов углерода (21-28 м.д.). В ИК спектрах кристаллических образцов соединений (XV а, б; XVI а, б) наблюдаются полосы амидной группы 0=C-NH (-3400 см"1 (vA'-H), 1680-1690 см"1 (vC=0, «амид I») и 1530-1570 см'1 (dN-Н, «амид II»)] и лактон-ного фрагмента 0=С-0-С (1720-1730 и 1170-1190 см"1). УФ спектры растворов соединений (XV а, б; XVI а, б) в ацетонитриле характеризуются наличием четырех полос поглощения: 204-210, 270-300, 340-350 и 400-490 нм.

Таким образом, и 2-гидроксибензальдегиды (II), и 2-гидроксициклоалк-1-енкарбальдегиды (XIII, XIV) реагируют с тиазинами (I), образуя производные 7У-тиоароил-2-оксо-2Я-пиран-3-карбоксамидов.

2.3 Взаимодействие 2-арил-4-гидрокси-6Я-1,3-тиазин-6-оиов с хромон-3-карбальдегидами

Также как и салициловые альдегиды, хромон-3-карбальдегиды вступают в реакцию гетероциклизации со многими реагентами, в том числе с соединениями с активной метиленовой группой. Однако взаимодействие производных барбитуровой кислоты с 3-формилхромонами ограничивается образованием 5-(4'-оксохромен-3'-ил)метиленовых производных (Haas, 1981). В литературе отсутствуют данные о взаимодействии тиааналогов таких пиримидинов -

2-арил-4-гидрокси-6Я-1,3-тиазин-6-онов (I), с хромон-3-карбальдегидами (XVII). Оказалось, что 1,3-тиазины (I) реагируют с альдегидами (XVII) (рис. 4), образуя смесь Лг-тиоароил-5-1идрокси-2-оксо-2Я,5Я-пирано[3,2-с]хромен-

3-карбоксамидон (XVIII а-м) и 2-арил-5-(4'-оксохромен-3'-ил)-6,7-дигидро-4Я,5Я-пирано-[2,3-^][1,3]тиазин-4,7-дионов (XIX а-к), суммарный выход которых составляет 45-70%.

I, Я1 = 4-МеО (а), Н (б);

XVII, Я2 = Н, Я3 = Ме (а), Н (б); Я3 = Н, Я2 = МеО (в), НО (г), Ме (д), С1 (е),Вг(ж),Ш2(з);

XVIII, Я1 = 4-МеО, Я2 = Н, Я3 = Ме (а), Н (б); Я3 = Н, Я2 = Ме (в), С1 (г), Вг (д), Ы02 (е); Я1 = Н, Я2 = Н, Я3 = Ме (ж), Н (з); Я3 = Н, Я2 = Ме (и), С1 (к), Вг (л),Ш2(м).

XIX, Я1 = 4-МеО, Я2 = Н, Я3 = Ме (а), Н (б); Я3 = Н, Я2 = МеО (в), НО (г), Ме (д); Я1 - Н, Я2 = Н, Я3 = Ме (е), Н (ж); Я3 = Н, Я2 = МеО (з), НО (и), Ме (к).

Рисунок 4

В масс-спектрах соединений (XVIII а-м) присутствует мало интенсивный (/„„.=1-7%) пик молекулярного иона и пики ионов [Л/" - Н"]+ и [Л/"* - ОН']+, интенсивность 10-15%, характерные для гидроксилсодержащих соединений. Наиболее интенсивными являются пики осколочных ионов: [МГ - С02]+\ \М"~ С02 - АгСШ* - Б]' и [М* - С02 - АгС8+ - НЫСО]'.

В спектрах ПМР растворов соединений (XVIII а-м) в ВМЪО-с16 характеристичными являются синглеты групп №1 (12.5-12.9 м.д.), С4Н (8.6-8.9 м.д.) и дублеты С5Н (7.1-7.3 м.д. Гц) и С5ОН (6.5-6.6 м.д. 7=6 Гц). В спектрах ЯМР 13С присутствуют сигналы атомов углерода карбонильной и тиокарбонильной групп (159-161 и 198-202 м.д.), пиранового цикла [С2 (160-162 м.д.), С3 (110115 м.д.), С4 (147-149 м.д.)], С5 (91-98 м.д.), и бензольных колец хромена и бен-зоильного фрагмента (112-158 м.д.). В ИК спектрах кристаллических образцов соединений (XVIII а-м) наблюдаются полосы уО-Н (-3400 см'1), уС=0 (1670— 1690 см*1, «амид I»; и 1720-1740, 0=С-0), 5Л'-Н (1535-1560 см"1 «амид И») и vC-0 (1170-1190 см"1). УФ спектры соединений (XVIII а-м) в ацетонитриле характеризуются наличием четырех полос поглощения: 206-215, 250-260, 280-310 и 390-410 нм.

В масс-спектрах пиранотиазинов (XIX а-к) присутствует пик молекулярного иона, дальнейшая фрагментация которого включает последовательное элиминирование молекулы АгС^М и двух молекул СО.

В спектрах ПМР соединений (XIX а-к) характеристичными являются сигналы группы С5НС6Н2 дигидропиранового цикла, образующие спиновую сис-

тему АВХ: дублет С5-Нх (4.6-4.8 м. д.), J„ ~ 8.4-9.5 Гц; дублет дублетов С6-Нь (3.2-3.5 м. д.), Jab ~ 15-17 Гц и Jbl ~ 8.7-9.5 Гц; дублет С6На (2.4-2.7 м. д.), Jab ~ 15-17 Гц. В спектрах ЯМР 13С присутствуют сигналы двух нр3-гибри-дизованных атомов углерода пиранового цикла С6 (35-41 м.д.) и С5 {32-37 м.д.), отсутствующие в спектрах исходных соединений. В ИК спектрах соединений (XIX а-к) наблюдается полоса валентных колебаний карбонила лактонной группы вблизи 1710-1740 см"1 и полоса колебаний группы С-О-С в области 1170-1190 см'1. Электронные спектры спиртовых растворов 0.001-0.002% веществ (XIX а-к) характеризуются наличием трех полос поглощения (205-210, 260-280, 340-360 нм).

На соотношение выходов соединений (XVIII и XIX) влияют электронные свойства заместителя в исходном хромоне и условия проведения реакции. Хро-моны (XVII) с электроноакцепторными заместителями (Br, CI, N02) образуют главным образом пиранохромены (XVIII), в то время как хромон с электроно-донорным заместителем (MeO, XVII в) реагирует с тиазинами (I) образуя преимущественно пиранотиазины (XIX). Незамещенные и алкилхромоны образуют смесь веществ (XVIII) и (XIX). Выход пиранохроменов (XVIII) также повышается при наличии в реакционной массе пиридина.

2.4 Биологическая активность синтезированных соединений 2.4.1 Острая токсичность

Результаты оценки острой токсичности синтезированных соединений по методу Миллера-Тейнтера позволяют отнести кумарин-3-карбоксамиды (III) к малотоксичным соединениям (LD5o = 1500-2100 мг/кг, рисунок 5). Еще менее токсичны пиранохромены (XVIII з, и, л), LD50 = 2200-2400 мг/кг.

2417

III к III 3 III ф III д III и III ц III с III х III е III л III м III ч III т III ш III о XVIIIXVIII XVIII

зил

№ соединения

Рисунок 5 - Величины LD50 соединений (III д, е, з-м, о, с, т, ф-ш; XVIII з, и, л) Оказалось, что значение логарифма обратной молярной среднесмертель-ной дозы [Ig(M/LD5o)] 6-замещенных кумарин-3-карбоксамидов (III с, т, ф-ш)

незначительно линейно возрастает с увеличением липофильности молекулы (л-констант Хэнша) (рисунок 6).

2,50

2,40 -: 'S

Log(M/LD50) = 0,0618л + 2,2789 г =0,96 СНз CI

НОг 330J1

"0CH31 2,20

i -0,4 -0,2

0,2 0,4

71

0,6

0,8

1

Рисунок 6 - Зависимость показателя токсичности (логарифма обратной молярной среднесмертельной дозы) соединений (III с, т, ф-ш) от липофильности (гс-константы) заместителя

Гораздо большее влияние на токсичность оказывают электронные свойства заместителя в положении 6 кумарина. Величины [lg(M/LD5o)] характеризуются квадратичной зависимостью от резонансной константы R Свэна-Лаптона (рисунок 7а). Зависимость токсичности от с7я-константы Гаммета, учитывающей оба эффекта, характеризуется тоже квадратичной функцией, однако достоверность ее меньше (рисунок 76).

Log{M/LD50) = -0.1559(a„f + 0.0783(а„)+ 2.305 г = 0.69

-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1

R__

а б

Рисунок 7 - Зависимости показателя токсичности (логарифма обратной молярной среднесмертельной дозы) соединений (III с, т, ф-ш) от электронных эффектов заместителя [резонансной константы R Свэна-Лаптона (а) и <т„-константы

Гаммета (б)]

2.4.2 Противоопухолевая активность

При выборе вида исследуемой биологической активности учитывались результаты расчета вероятных биологических эффектов синтезированных соединений с помощью программы PASS. Согласно этим данным, вероятность

проявления соединениями (III с, т, ф-ц, ш) противоопухолевой активности составляет 36-63%, противовирусной - 66-85%. В литературе имеются указания на наличие цитотоксического действия in vitro у iV-арилкумарин-З-кар-боксамидов, сходных по строению с синтезированными соединениями (N. S. Reddy et al., 2005). В связи с этим представлялось целесообразным изучить противоопухолевую и противовирусную активности кумаринов (III).

Исследование противоопухолевого действия кумаринов (III с, т, ф-ц, ш) проводилось в ФГУ «НИИ Онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологии» под руководством д. м. н. А. Н. Стукова на мышах SHR самцах на модели солидной опухоли Эрлиха. Исследуемые соединения вводили в форме стабилизированной твином-80 суспензии в стерильном физрастворе внутрибрюшинно (в/б) или перорально (п/о) в дозе 100 мг/кг ежедневно в течение 5 дней, начиная через 48 часов после перевивки опухоли. С 7 дня после перевивки у всех мышей измеряли размеры опухоли и определяли её объем по формуле: V = АхВ2хл/6, где «А» - наибольший размер опухоли, мм, «В» - размер в перпендикулярном направлении. Измерения производились до 21 дня после перевивки. На рис. 8 представлены кривые зависимости объема опухолей от времени.

0 2 4 6 8 10 12 14 ¡6 18 20 1 о 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Деньпйблюденн* __Деш. наблюдения

а....................б

Рисунок 8 - Динамика изменения объема опухолей под влиянием веществ (Шт,х)(а)и(Шс,ф,Ц,ш)(б)

Противоопухолевую активность веществ оценивали по проценту торможения роста опухоли (Т%), индексу эффективности (ИЭ) и коэффициенту активности (К*): Т% = [(Ук-Уэ)/Ук]х100%; ИЭ = Уэ/Ук, где Vk и Уэ - средние объемы опухоли в контрольной и испытуемой группе, соответственно. Расчет коэффициента активности проводился по формуле: К* = 1-[(1п Уэ-In Уэ")/(1п Ук-\\\Vk )], где Vk и Уэ - средние объемы опухоли на определенный момент времени в контрольной и испытуемой группе, соответственно; Ук° и Уэ" - средние объемы опухоли в начале эксперимента в контрольной и испытуемой группе, соответственно. Коэффициент активности характеризует противоопухолевое действие препарата с учетом скорости роста опухоли в исследуемой и контрольной группах. Параметры роста опухолей представлены в табл. 2,

Установлено, что вещества (III х, ц) проявляют выраженный .противоопухолевый эффект: торможение роста опухоли в разные сроки эксперимента составило 40-68% и 60-87%, соответственно. Эффект 6-фторпроизводного (III х)

проявлялся и при пероральном введении, хотя и в меньшей степени - торможение роста опухоли составило 16-56%. У остальных веществ достоверной противоопухолевой активности выявлено не было.

Таблица 2 - Параметры роста солидной опухоли Эрлиха _ под влиянием веществ (III с, т, ф-ц, ш)_

№ соединения Критерий Дни после перевивки

7-й 10-й 12-й 14-й 17-й 19-й 21-й

Т% -87.2 4.4 20.8 16.8 9.6 21.0 12.1

III т, в/б ИЭ 0.53 1.05 1.26 1.20 1.11 1.27 1.14

К* - 0.45 0.44 0.35 0.26 0.27 0.22

Т% 43.6 68.3 68.3 63.1 48.1 49.8 38.7

III х, в/б ИЭ 1.77 3.16 3.16 2.71 1.93 1.99 1.63

к* - 0.39 0.29 0.18 0.03 0.04 -0.02

Т% 50.1 50.8 55.8 47.8 33.0 30.9 15.6

III х, п/о ИЭ 2.01 2.03 2.26 1.92 1.49 1.45 1.19

к* - 0.УГ 0.06 -0.02 -0.11 -0.11 -0.16

Дни после перевивки

8-й 10-й 12-й 14-й 16-й 18-й 20-й

т% -2.4 29.9 8.6 27.1 16.9 13.3 27.1

III с, в/б ИЭ 0.98 1.43 • 1.09 1.37 1.20 1.15 1.37

к* - 0.69 0.18 0.23 0.10 0.08 0.14

т% -12.0 10.9 10.2 -8.4 10.4 1.8 1.1

III ф, в/б ИЭ 0.89 1.12 1.11 0.92 1.12 1.02 1.01

к* - 0.42 0.35 0.02 0.11 0.06 0.05

т% 87.3 85.5 72.0 58.8 60.8 63.9 69.2

III ц, в/б ИЭ 7.90 6.88 3.57 2.42 2.55 2.77 3.25

к* - -0.25 -1.24 -0.81 -0.56 -0.48 -0.37

т% 29.3 27,6 10.9 43.9 50.9 48.9 46.7

III ш, в/б ИЭ • 1.41 1.38 1.12 1.78 2.04 1.96 1.87

к* • - -0.04 -0.36 0.16 0.18 0.15 0.12

Интегральным критерием противоопухолевого действия веществ, учитывающим как величину, так продолжительность терапевтического эффекта, служит индекс роста опухоли (ИРО), определяемый по формуле: ИРО = S^/Sr, где Бэ и Sk - площади под кинетической кривой роста опухоли в испытуемой и контрольной группе, соответственно (таблица 3). Как видно, значения индекса роста опухоли после введения кумаринов (III х) и (III ц) составляют 0.48 и 0.33, соответственно, что также свидетельствуют о наличии у этих соединений противоопухолевого эффекта.

Другим критерием противоопухолевого действия веществ является увеличение продолжительности жизни (УПЖ) животных в эксперименте по сравнению с контролем, рассчитываемое по формуле: УПЖ = [(СПЖЭ-СПЖк)/СПЖк]х100%, где СПЖк - средняя продолжительность жизни живот-

ных в контроле, СПЖэ - средняя продолжительность жизни животных, получавших препарат, (таблица 3). Как видно из представленных результатов, средняя продолжительность жизни мышей, получавших вещества (III х, ц) на 2030% превышает этот показатель для мышей контрольных групп. В остальных случаях не наблюдается существенной разницы в продолжительности жизни по сравнению с контролем.

Таблица 3 - Площади под кинетическими кривыми (S), индекс роста опухоли (ИРО), средняя продолжительность жизни (СПЖ) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ) мышей под влиянием применения веществ (III с, т, ф-ц, ш)

Группа S±m ИРО СПЖ, дни УПЖ, %

Контроль, в/б 10106±2525 1 39.5 -

III с, в/б 8317+2982 0.82 (р>0.1) 41.5 5 (р>0.1)

III ф, в/б 9877+3904 0.98 (р>0.1) 39.5 0(р>0.1)

III ц, в/б 3353±907 0.33 (р<0.05) 52.0 32 (р<0.05)

III ш, в/б 5712±1745 0.57 (р>0.1) 43.0 9 (р>0.1)

Контроль, в/б 38909±5152 1 40.5 -

III т, в/б 34190+5293 0.88 (р>0.1) 42.5 5(р>0.1)

III х, в/б 18740±4636 0.48 (р<0.05) 50.5 25 (р>0.05)

Контроль, п/о 41239±6512 1 40.0 -

III х, и/о 26566+4403 0.64 (р<0.1) 48.0 20 (р>0.05)

противоопухолевое действие растет (величина

ИРО = 1.257(оп) -1 -0962(cn) + 0.6295 г = 0.85

NOi

Было установлено, что ИРО снижается) с уве- ,— личением электроноак- 1 цепторных свойств заместителя. Исключением является кумарин с нитрогруппой (III ш), который менее активен, чем можно было ожидать. Таким образом, проявление максимальной противоопухолевой активности можно предполагать у кумаринов (III), замещенных в положении 6 атомами галогена или ацильнон группировкой С(О)R (значение оп составляет 0.2-0.6).

В качестве препарата сравнения был использован гидрохлорид доксору-бицина (10 мг/кг, однократно в/б). Полученные для него данные (Т%=61-84%,

-0,3-

♦ CI

0,40

-0,20

0,00

0,20 0,40

0,60

0,80

1,00

Рисунок 9 - Зависимость противоопухолевой активности соединений (III с, т, ф-ш) от константы с„

ИРО=0.60), свидетельствуют о том, что 6-хлор- и 6-фторкумарины (III ф, х) обладают выраженной противоопухолевой активностью in vivo на модели солидной опухоли Эрлиха, причем по силе эффекта они сопоставимы и даже превосходят препарат- сравнения - гидрохлорид доксорубицина.

2.4.3 Противовирусная активность

Согласно данным программы PASS, вероятность проявления противовирусной активности кумаринами (III) составляет 66-85%. Исследования проводили в ГУ НИИ гриппа РАМН совместно с к.м.н. Деевой Э. Г. Противовирусное действие оценивали с использованием штаммов вируса гриппа A/Viktoriа/35/72 (H3N2) и A/Mallard/NT/12/02 (H7N3). Культивирование вируса осуществляли на фрагментах хорион-аллантоисной оболочки (ХАО) и на первичной культуре клеток почек собак (MDCK). После контакта вируса с клетками при 36-37°С в течение 1 ч в лунки добавляли исследуемы^ соединения в концентрациях 25, 50 или 75 мкг/мл. Через 48 часов инкубации устанавливали титр вируса по реакции гемагглютинации с 0.5% взвесью куриных эритроцитов. Вирус-ингибирующее действие оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем (рис 10).

5 75 мкг/мл ■ 50 мкг/мл □ 25 мкг/мл

2525 25 25

lllc III Ж ШЦ III Ч IIIUI j ¿ Шт Шф

: 2 35

¡■30

I 25

: 15

' е-10

* о

III т

lllx III ц Шч Ulm

75 МКГ/МЛ 2 35 _ 50 мкг/мл . о ia □ 25мкг/мл, £ 30

.....—: ; о

* Í 25

т Шф lllc lllx III u

В Г

Рисунок 10 - Противовирусное действие веществ (III с, т, ф-ш) на штамме вируса гриппа A/Viktoria/3 5/72 (H3N2) на монослое клеток (а) и на фрагментах ХАО (б), и на штамме вируса гриппа A/Mallard/NT/12/02 (H7N3) на монослое клеток (в) на фрагментах ХАО (г)

Из полученных результатов следует, что 6-фтор- и 6-метилкумарины (III х, ф) оказывают умеренное противовирусное действие, в то время как остальные исследованные соединения практически не тормозят репликацию вируса на данных моделях.

2.4.4 Антибактериальная и противогрибковая активности

Исследования проводили на кафедре микробиологии СПХФА, совместно с к.биол.н., Е. П. Ананьевой. В качестве тест-микроорганизмов для определения антибактериальной и противогрибковой активностей были выбраны грамполо-жительные (Staphylococcus aureus) и грамотрицательные (Escherichia coli) бактерии, и дрожжи Candida albicans. Микробная нагрузка составляла 1000 клеток/мл. Определяли минимальную бактерицидную и бактериостатическую концентрацию соединений. Исследуемые соединения растворяли в диметилсуль-фоксиде (ДМСО). Было установлено, что 20% раствор ДМСО в воде в тех же экспериментах антибактериальной активностью не обладал. Подавление роста культур Staphylococcus aureus и Escherichia coli наблюдалось при концентрации веществ (III с, т, ф-ц, ш; XVIII з, и, л) от 150 до 2000 мкг/мл, что намного превышает активную концентрацию препарата сравнения - фурацилина (0.6 мкг/мл). Фунгицидная активность в отношения С. albicans проявляется также при высоких концентрациях. Исключением является 9-бромпиранохромен (XVIII л), оказывающий фунгицидное действие в концентрации 40 мкг/мл, что сравнимо с активностью препарата сравнения - флуконазола (32 мкг/мл).

2.4.S Противосудорожная активность

В соответствии с данными прогноза по программе PASS вероятность проявления противосудорожного действия соединениями (III, XVIII) составляет 50-70%. Противосудорожная активность изучали на модели судорог у мышей, вызванных внутрибрюшинным введением 0.1% раствора тиосемикарбазида (84 мг/кг). Суспензии веществ в воде (стабилизатор - твин-80) вводили однократно, внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг. Было установлено, что кумарины (III ц-ш), содержащие электроноакцепторные заместители (бром, хлор, нитрогруппа) в бензольном кольце, оказывают умеренное противосудорожное действие: латентный период развития судорог увеличивался на 30-40% по сравнению с контролем. Кумарины (III с, т, ф), содержащие электронодонорные заместители, и пиранохромены (XVIII з, и, л) противосудорожной активностью не обладали.

2.5 Методы стандартизации iV-тиобензоил-б-фторкумарин-З-карбоксамида (III х)

Учитывая низкую токсичность (LDj0 = 1680 мг/кг) соединения (III х) и проявленную им противоопухолевую активность in vivo, можно рекомендовать проведение дальнейших фармакологических исследований этого соединения, что требует разработки методик его стандартизации. Так как кумарин (III х) синтезирован впервые, отсутствует стандартный образец, на основании которого можно было бы интерпретировать результаты анализа субстанции. Поэтому в первую очередь предстояло разработать такой образец.

2.5.1 Разработка стандартного образца iV-тиобензоил-б-фторкумарин-З-карбоксамида (III х)

Стандартный образец был получен трехкратной перекристаллизацией соединения (III х) из толуола до постоянной величины оптической плотности 0.001% раствора в ацетонитриле при 300 т\ Подлинность стандартного образца определяли по данным ЯМР 'Н, |3С и масс-спектрам (табл. 4). Температура плавления вещества составляет 210-212°С (метод 1а, ГФ XII). Наличие в молекуле вещества атома фтора устанавливали методом сжигания в колбе с кислородом в соответствии с требованиями ГФ XI.

Таблица 4 - Данные ЯМР 'Н, 13С и масс-спектров vV-тиобензоил-б-фтор-кумарин-3-карбоксамида (III х)_

Спектр 'Н, 5, м.д. 12.85 ± 0.07 с (1Н), 8.94 ± 0.06 с (1Н), 7.85 ± 0.07 д (1Н, J2 Гц), 7.82 ± 0.08 (2Н, 78 Гц), 7.62-7.56 м (ЗН), 7.45 ± 0.08 т (2Н, У8Гц)

Спектр 13С, 5, м.д. 202.0 ± 0.6, 160.0 ± 0.5, 159.7 ± 0.5, 150.3 ± 0.6, 148.4 ± 0.5, 142.0 ±0.7, 131.9 ±0.6, 128.2 ±0.4, 127.3 ±0.6, 121.9 ±0.6, 120.5 ±0.6,119.1 ±0.6,118.2 ±0.6, 115.6 ±0.6, 115.1 ±0.6

Масс-спектр, m/z (/отн, %) 327 (37), 196 (33), 164 (27), 191 (100), 163 (27), 132 (42), 121 (18), 119 (21), 107 (25), 77 (28), 57 (23), 51 (27)

Чистоту стандартного образца определяли методом ТСХ (пластины "Сорбфил" ПТСХ-П-А-УФ, метилендихлорид). На хроматограмме присутствовало одно пятно с Rf=0.^%. Методом ГЖХ определяли содержание остаточных растворителей (пиридина, ТГФ, толуола), которое не превышало предельные значения по ОФС 42-0057-07 «Остаточные органические растворители». Содержание влаги (не более 0.5%) устанавливали методом высушивания.

Количественное определение стандартного образца проводили методом неводного титрования в среде ДМФА, титрант - 0.1М натрия метилат в спирте метиловом, точку эквивалентности устанавливали потенциометрически. 1 мл 0.1 М натрия метилата соответствует 0.03273 г СпНюОзКБР, которого в пересчете на сухое вещество должно быть не менее 99.0% и не более 101%.

2.5.2 Разработка методов стандартизации субстанции /У-тиобензоил-б-фторкумарин-З-карбоксамида

Подлинность вещества можно устанавливать с применением УФ и ИК спектроскопии. Электронный спектр раствора в ацетонитриле с концентрацией вещества 0.001-0.002% характеризуется наличием трех максимумов поглощения при 204±2 нм, 300±1 нм и 340±1 нм в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм (рис. 11а). Соотношение О30(Д)з40 составляет 1.43-1.47. Идентификация вещества может быть проведена по положению максимумов в УФ спектре и по полному совпадению полос поглощения в рабочем и стандартном ИК спектрах (КВг, рисунок 116).

Рисунок 11 - УФ спектр в ацетонитриле (а) и ИК спектр в таблетках с КВг (б) б-фтор-Л'-тиобензоилкумарин-З-карбоксамида (III х)

Хранение субстанции при повышенной температуре и относительной влажности может привести к гидролизу А'-тиобензоил-б-фторкумарин-З-карбоксамида (рисунок 12) с образованием токсичного тиобензамида (XX).

Рисунок 12

Чистоту кумарина (III х) устанавливали методом ТСХ (пластины "Сорб-фил" ПТСХ-П-А-УФ, метилендихлорид). При хроматографировании субстанции было обнаружено одно пятно с Rj =0.78. На хроматограмме частично разложившегося вещества присутствуют пятно кумарина (III х) и три дополнительных пятна, одно из которых соответствует тиобензамиду, i?/=0.48.

Для установления чистоты был также предложен метод ВЭЖХ. В ходе разработки методики был установлен оптимальный температурный режим хро-матографирования и соотношение компонентов подвижной фазы (ацетонитрила и воды). Лучшие результаты были достигнуты при использовании смеси ацето-нитрил-вода 7:3, элюирование проводили в изократическом режиме при 40°С.

Установлено, что на хроматограмме субстанции кумарина (III х) (рисунок 12а) присутствует пик со временем удерживания 0.82 мин., относительная площадь которого составляет не более 1.0%, и отсутствует пик тиобензамида, время удерживания которого в этих же условиях составляет 1.6 мин. Изменения в чистоте субстанции при протекании процессов разложения видны на хроматограмме (рис. 126): более чем в два раза увеличивается содержание примеси со временем удерживания 0.8 мин и появляются два дополнительных пика, один из которых соответствует тиобензамиду (время удерживания 1.6 мин). Следует отметить, что при разработке методики не удалось достигнуть оптимальных значений параметров пригодности хроматографической системы (коэффициент разделения пиков, эффективность колонки, коэффициент асимметрии пика), поэтому в НД для оценки чистоты субстанции предлагается метод ТСХ.

■сН-г-1-1-1-,-.-■-1-1-1-1---1---------1-1-1-. -1-1-1-1-1-.-1-1-1-i-.-1-n-1---1-1-1-1-1-1

1 2 3 « SC 7 8 9 1« 11 12 13 14 15 1С 17 It 1» 2* щ 1 .2 3 4 SC 7 I 9 1« 11 12 13 14 15 1С 1? 18 19 21 на.

а б

Рисунок 12 - Хроматограммы субстанции (а) и кумарина (III х), подвергнутого частичному разложению (б)

Методом ГЖХ определяли содержание остаточных количеств пиридина, тетрагидрофурана и толуола, которые, не превышали пределов, указанных в ОФС 42-0057-07 «Остаточные органические растворители». Содержание влаги в субстанции составило не более 1.0%, устанавливали методом высушивания.

Количественное определение субстанции (III х) проводили методом неводного титрования в среде ДМФА, титрант - раствор натрия метилата в спирте метиловом, точку эквивалентности устанавливали потенциометрически. Количественное определение субстанции (III х) можно проводить и методом УФ спектрофотометрии с использованием стандартного образца. Однако сравнение этих двух методов по их метрологическим показателям (табл. 5) позволяет сделать вывод о преимуществе титриметрического метода.

Таблица 5 - Метрологические характеристики предложенных методов количественного определения кумарин-3-карбоксамида (III х) __

Метод определения Истин ное значение, ji Число степеней свободы, f Среднее значение, X Дисперсия, s2 Стандартное отклонение, s Доверительный интервал, х+Дх Относительная погрешность определения, Е, %

1.УФ 99.20 9 98.94 2.36 1.54 98.94+0.95 0.96

2. Титриметрия 99.20 9 99.13 0.39 0.63 99.13±0.39 0.39

Метод определения t-Критерий Стьюдента Критерий Фишера

t=[(x-nWq/s W95,f) FTa6,(99%,fbf2) FBU4 = Si /s2

1.УФ 0.53 2.26 5.351 6.005

2. Титриметрия 0.35

Так как Рвыч > ¥^<¡„(99%, 9, 9), то с вероятностью 99% различие дисперсий для каждого метода признается статистически значимым, что позволяет сделать заключение о более высокой воспроизводимости титриметрии. Таким образом, количественное определение субстанции Л-тиобензоил-6-фторкумарин-З-карбоксамида следует проводить методом неводного титрования в среде диме-тилформамида. 1 мл 0.1 М раствора метилата натрия соответствует 0.03273 г

C17H10O3NSF, которого должно быть не менее 98% и не более 101% (в пересчете на сухое вещество).

Для предотвращения гидролиза и иных процессов разрушения активного вещества хранить субстанцию следует в сухом защищенном от света месте, при температуре не выше 25 °С.

3 Выводы,

1. Конденсация 2-арил-4-гидрокси-6Я-1,3-тиазин-6-онов с 2-гидрокси-, 2-амино- и 2-меркаптобензальдегидами в присутствии пиридина - новый общий препаративный метод синтеза TV-тиоароил-кумарип-, -2-оксохинолин- и -2-оксобензо[6]тиин-3-карбоксамидов.

2. Реакция 1-метил-2-арил-4-гидроксипиримидин-6-онов с салициловыми альдегидами - удобный метод получения новых 1-метил-2-арил-хромено[4,3-с/]пиримидин-4,5-дионов.

3. Взаимодействие 2-арил-4-гидрокси-6Я-1,3-тиазин-6-онов с 2-гид-роксициклогекс-1-ен-1- и 3-гидрокси-1Я-инден-2-карбальдегидами в присутствии пиридина - перспективный метод синтеза новых А'-тиоароил-2-оксо-5,6,7,8-тетрагидро-2Я-хромен- и А^-тиоароил-2-оксо-2Я,5Я-индено[1,2-6]пи-ран-3 -карбоксамидов.

4. Простой путь синтеза труднодоступных Лг-тиоароил-5-гидрокси-2Я,5Я-пирано[3,2-с]хромен-2-он-3-карбоксамидов - реакция 2-арил-4-гид-рокси-6Я-1,3-тиазин-6-онов с 3-формилхромонами в присутствии пиридина.

5. Токсичность 6-замещенных jV-тиоароилкумарин-З-карбоксамидов мало зависит от их липофильности и характеризуется квадратичной зависимостью от величины резонансного эффекта заместителя (Д-константы Свэна-Лаптона).

6. 6-Замещенные iV-тиобензоилкумарин-З-карбоксамиды являются новыми перспективными соединениями, ингибирующими рост карциномы Эрли-ха in vivo и обладающими умеренным противовирусным действием против вируса гриппа A in vitro. Наибольшее влияние на противоопухолевую активность этой группы веществ оказывает природа заместителя в положении 6 кумарина: активность возрастает по мере увеличения электроноакцепторных свойств заместителя и достигает максимума у 6-фтор- и 6-хлорпроизводных.

7. Подлинность субстанции jV-тиобензоил-б-фторкумарин-З-карбокса-мида рекомендуется устанавливать методами УФ и ИК спектроскопии, чистоту - методом тонкослойной хроматографии, количественное определение следует проводить методом прямой алкалиметрии в неводной среде.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Шутов, Р.В. Исследования азолов и азинов. CXXVL Новый метод синтеза кумарин-3-карбоксамидов / Р.В. Шутов, А.Н. Калужских, A.B. Москвин, Б.А. Ивин // Журнал общей химии. - 2006. - Т. 76. - Вып. 5. - С. 845-855.

2. Шутов, Р.В. Исследования азолов и азинов. CXXVIII. Взаимодействие 2-арил-4-гидрокси-6Н-1,3-тиазин-6-онов с 3-формилхромонами / Р.В. Шу-TOBj E.B. Куклина, Б.А. Ивин // Журнал общей химии. - 2009. - Т. 79. - Вып. 5.-С. 876-878.

3. Шутов, P.B. Взаимодействие полигидрокситиазинов с карбонильными соединениями и их аналогами - прекрасный путь синтеза новых биологически активных веществ / Р.В. Шутов, А.Н. Калужских, A.B. Крылов, М.В. Сопова, А.Г. Козьмина, В.Ц. Болотова, С.М. Бахтина, Б.А. Ивин // Сборник научных трудов "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции", Пятигорск. - 2006. - Вып. 61. - С. 405-407.

4. Шутов, Р.В. Исследование синтеза и биологической активности новых jV-тиоароилкумарин-З-карбоксамидов / Р.В. Шутов, Б.А. Ивин // Сборник научных трудов "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции", Пятигорск. -2008. - Вып. 63. С. 519-521.

5. Шутов, Р.В. Взаимодействие 2-арил-4-гидрокси-6Н-1,3-тиазин-6-онов с алифатическими и ароматическими альдегидами - путь к синтезу новых биологически активных систем / Р.В. Шутов, А.Н. Калужских, A.B. Крылов, М.В. Сопова, J1.E. Михайлов, Б.А. Ивин // Международная научно-практическая конференция, посвященная 85-летию академии, «Выпускник фармацевтического вуза (факультета) в прошлом, настоящем и будущем»: материалы конференции. Санкт-Петербург, 2004. - С. 118-122.

6. Шутов, Р.В. Взаимодействие 2-арил-4-гидрокси-6Н-1,3-тиазин-6-онов с замещенными салициловыми альдегидами - путь к синтезу ациламидов кума-ринкарбоновых кислот / Р.В. Шутов, А.Н. Калужских, Б.А. Ивин // Молодежная конференция по органической химии, посвященная 280-летию СПбГУ, «Современные тенденции органической химии»: материалы конференции. Санкт-Петербург, 2004. - С. 103.

7. Шутов, Р.В. Взаимодействие 2-арил-4-гидрокси-6#-1,3-тиазин-6-онов с 2-гидрокси-, 2-амино- и 2-тиобензальдегидами - перспективный путь синтеза новых биологически активных соединений // Региональная научная конференция студентов и аспирантов «Молодые ученые - практическому здравоохранению»: тезисы докладов. Санкт-Петербург, 2007. - С. 127-128.

8. Шутов, Р.В. Разработка методов стандартизации субстанции А'-тиобензоил-6-фторкумарин-З-карбоксамида / Р.В. Шутов, Н.В. Довгалева, М.П. Блинова, Б.А. Ивин // Научно-практическая конференция «Фармация из века в век»: материалы конференции. Санкт-Петербург, 2008. - С. 202-205.

9. Шутов, Р.В. Разработка методов синтеза и контроля качества субстанции JV-тиобензоил-б-фторкумарин-З-карбоксамида / Р.В. Шутов, Н.В. Довгалева, Б.А. Ивин // Материали за IV международна научна практична конференция «Динамика изследвания - 2008». София, 2008. ~ С. 10-13.

Ю.Шутов, Р.В. Исследование синтеза и биологической активности новых производных конденсированных пирано[3,2-с]хроменов / Р.В. Шутов, Е.В. Кук-лина, Б.А. Ивин // Materialy IV miedzynarodowej naukowe-praktycznej konfer-encji «Perspektywiczne opracowania nauki I techniki - 2008», Przemysl, 2008. -C. 24-26.

На правах рукописи

Шутов Роман Вадимович

Поиск биологически активных соединений среди продуктов взаимодействия 2-арил-4-гидрокси-6#-1,3-тиазин-6-онов с замещенными салициловыми альдегидами и их аналогами

15.00.02 — Фармацевтическая химия, фармакогнозия .

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать Н.В. Андриановой

Подписано к печати 22.05.2009. Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Печать ризограф.

_Гарнитура «Тайме». Печ. л.3,0. Тираж 100 экз. Заказ 786_

Санкт-Петербург 2009

Актуальность темы. Среди огромного числа гетероциклических соединений особое место занимают 1,3-гетероазины, в том числе замещенные гидрокси(оксо)пиримпдпны, что обусловлено участием многих из них в важных биохимических и физиологических процессах и применением в медицинской практике. Тиааналоги таких пиримидинов - гидрокси-1,3-тиазины, изучены значительно меньше. Работами кафедры органической химии СПХФА показано, что производные гидрокситиазинов являются перспективной группой гетероциклов для создания эффективных биологически активных веществ [140, 142, 148, 164]. В частности установлено, что 2-арил-4-гидрокси-6#-1,3-тиазин-6-оны представляют собой новую группу противоопухолевых агентов с необычным механизмом действия [142].

Известно, что конденсация производных полигидроксипиримидинов п гидрокси-1,3-тиазпнов с альдегидами является удобным методом получения биологически активных соединений [139, 147, 152]. При этом наличие в молекуле ароматического альдегида нуклеофильной оршо-гидроксигруппы открывает широкие возможности для синтеза новых гетероциклических систем. Среди продуктов взаимодействия таких гидроксилсодержащих альдегидов с производными полигидроксипиримидипа были обнаружены соединения с противовирусной, противомикробной, противогрибковой и другими видами активности [151, 162]. Данные о реакциях гидрокси-1,3-тиазинов с салициловыми альдегидами в литературе отсутствуют. В связи с этим исследование взаимодействия производных 1,3-тиазинов с функционально замещенными альдегидами представляет несомненный интерес как с точки зрения получения новых эффективных лекарственных средств, так и с позиций теоретической и синтетической органической химии.

Целью работы являлся поиск эффективных малотоксичных биологически активных соединений среди продуктов реакции 2-арил-4-гидрокси-6Н-\ ,3-тиазин-6-онов с замещенными салициловыми альдегидами и их аналогами.

Задачи исследования: разработка технологичных методов синтеза новых биологически активных производных 2#-хромена, хинолина и бен-зо[£]тиина взаимодействием 2-арил-4-гидрокси-6#-1,3-тиазин-6-онов и их азааналогов с альдегидами, содержащими гидрокси-, амино- и меркапто-группу; установление строения синтезированных соединений; определение их острой токсичности; исследование некоторых видов биологической активности и их связи со строением синтезированных веществ, разработку методик стандартизации наиболее эффективного соединения.

Научная новизна. Впервые изучено взаимодействие 2-арил-4-гид-рокси-6#-1,3-тиазин-6-онов с салициловыми альдегидами и их аналогами, доказано строение продуктов реакции, определена их токсичность и исследованы некоторые виды биологической активности. Показано, что:

- 2-Арил-4-гидрокси-677-1,3-тиазин-6-оны реагируют с салициловыми альдегидами, образуя #-тиоароилкумарин-3-карбоксамиды, а с 2-амино- и 2-меркаптобензальдегидами - 7У-тиоароил-2-оксохинолин- и А^-тиоароил-2-оксобензо[£]тиин-3-карбоксамиды, соответственно. Выход конечных продуктов увеличивается при использовании в реакции пиридина, что связано с образованием более нуклеофильных анионов тиазинов.

- 1-Метил-2-арил-4-гидроксипиримидин-6-оны реагируют с салициловыми альдегидами в присутствии пиридина иначе, чем их тиааналоги —

2-арил-4-гидрокси-6#-1,3-тиазин-6-оны, и образуют 1-метил-2-арилхромено-[4,3-с?]пиримидин-4,5-дионы, а не Д/-[(метилимино)(арил)метил]кумарин

3-карбоксамиды.

- Взаимодействие 2-арил-4-гидрокси-6#-1,3-тиазин-6-онов с 2-гидрокси-циклогекс-1-ен-1- и 3-гидрокси-1#-инден-2-карбальдегидами в присутствии пиридина протекает с образованием А^-тиоароил-2-оксо-5,6,7,8-тетрагидро-2#-хромен- и А^тиоароил-2-оксо-2/7,5Я-индено[1,2-6]пиран-3-карбокса-мидов, соответственно.

- Реакция 2-арил-4-гидрокси-6#-1,3-тиазин-6-онов с 3-формилхромо-нами приводит к образованию смеси 2-арил-5-(4'-оксохромен-3'-ил)-6,7-дигидро-4#,5//-пирано [2,3-d\ [ 1,3]тиазин-4,7-дионов и TV-тиоар о ил-5 -гидрокси

2-оксо-2//,5//-пирано[3,2-с]хромен-3-карбоксамидов. Выход последних повышается при наличии электроноакдепторных заместителей в молекуле

3-формилхромона и при проведении-реакции в присутствии пиридина.

- Среднесмертельные дозы jV-тиоароилкумарин-З-карбоксамидов колеблются в пределах 1500-2100 мг/кг. Логарифмы обратных молярных средне-смертельных доз практически не зависят от липофильности соединений и подчиняются параболической зависимости от параметров электронных свойств заместителя в положении 6 кумарина.

- тУ-Тиобензоил-б-фтор- и -6-хлоркумарин-З-карбоксамиды тормозят рост солидной опухоли Эрлиха in vivo. JV-Тиоароилкумарин-З-карбоксамиды обладают умеренным противовирусным действием на модели вируса гриппа A/Viktoria/35/72 (H3N2) и A/Mallard/NT/12/02 (H7N3).

- iV-Тиобензоилкумарин-З-карбоксамиды с электроноакцепторными заместителями в положении 6 кумарина проявляют умеренную противосудо-рожную активность.

- Аг-Тиобензоил-5-гидрокси-9-бром-2Я,5//-пирано[3,2-с]хро.мен-2-он-3-карбоксамид обладает выраженным противогрибковым действием, сравнимым с активностью флуконазола.

- Подлинность субстанции JV-тиобензоил-б-фторкумарин-З-карбок-самида следует устанавливать методами УФ и ИК спектроскопии, чистоту — методом ТСХ, количественное определение следует проводить методом прямой алкалиметрии в неводной среде.

Практическая значимость. Разработаны технологичные методы получения производных Л^-тиоароил-кумарин-, -2-оксохинолин-, -2-оксобензо-[Ь]тиин-, -2-оксо-2Я,5//-индено[1,2-£>]пиран-, -2-оксо-2Я-5,6,7,8-тетрагидро-циклогекса[6]пиран-, и -2-оксо-5-гидрокси-2Я,5Я-пирано[3,2-с]хромен-3-кар-боксамидов. Обнаружена новая группа малотоксичных противоопухолевых агентов. Выявлена зависимость токсичности и противоопухолевого эффекта iV-тиобензоил-кумарин-З-карбоксамидов от электронных свойств заместителя в положении 6 кумаринового цикла. Разработаны методики стандартизации наиболее перспективного соединения — А-тиобензоил-6-фтор-кумарин-3 -карбоксамида.

Положения, выносимые на защиту^ ^

1. Новый метод синтеза Л^-тиоароилкумарин-, -2-оксохинолин- и -2-ок-собензо[6]тиин-3-карбоксамидов.

2. Удобный способ получения 1-метил-2-арш1хромено[4,3-^пи-римидин-4,5-дионов.

3. Перспективный метод синтеза новых 7У-тиоароил-2-оксо-5,6,7,8-тет-рагидро-2//-хромен- и -2-оксо-2//,5//-индено[1,2-/?]пиран-3-карбоксамидов.

4. Удобный метод синтеза новых А^-тиоароил-5-гидрокси-2//,5#-пи-рано [3,2-с] хромен-2-он-З -карбоксамидов.

5. Наличие противоопухолевой активности у малотоксичных ТУ-тио-бензоил-6-фтор- и -6-хлоркумарин-З-карбоксамидов.

6. Методики стандартизации субстанции 7У-Тиобензоил-6-фтор-кумарин-3 -карбоксамида.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом НИР Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии «Исследование путей синтеза, строения, физических и химических свойств, биологической активности и связи между ними в ряду О-, 8-со-держащих гетероциклических соединений с целью поиска новых лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01200852357).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной конференции «Современные тенденции органической химии» (Санкт-Петербург, 2004), конференциях «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем» (Санкт-Петербург, 2004), «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006, 2008), региональной научной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые — практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), научно-практической конференции «Фармация из дукции» (Пятигорск, 2006, 2008), региональной научной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), научно-практической конференции «Фармация из века в век: достижения, проблемы и пути их решения», (Санкт-Петербург, 2008), IV международной научно-практической конференции «Динамика научных исследований», (София, 2008), IV международной научно-практической конференции «АкШа1пе ргоЫешу похуосгеБпусЬ паик», (Рггетуз1, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи, в том числе 2 - в журнале, рекомендованном ВАК, тезисы 6 докладов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературных данных, экспериментальной части, обсуждения экспериментальных данных, выводов и приложения, содержит 37 таблиц и 84 рисунка. Библиография включает 179 ссылок на литературные источники.

выводы

1. Конденсация 2-арил-4-гидрокси-6#-1,3-тиазин-6-онов с 2-гидрокси-, 2-амино- и 2-меркаптобензальдегидами в присутствии пиридина — новый общий препаративный метод синтеза iV-тиоароил-кумарин-, -2-оксохинолин-и -2-оксобензо [6] тиин-3 -карбоксамидов.

2. Реакция 1-метил-2-арил-4-гидроксипиримидин-6-онов с салициловыми альдегидами — удобный метод получения новых 1-метил-2-арил-хромено[4,3-йГ]пиримидин-4,5-дионов.

3. Взаимодействие 2-арил-4-гидрокси-6.Н-1,3-тиазин-6-онов с 2-гид-роксициклогекс-1-ен-1- и 3-гидрокси-1#-инден-2-карбальдегидами в присутствии пиридина - перспективный метод синтеза новых тУ-тиоароил^-оксо-5,6,7,8-тетрагидро-2#-хромен- и Л^-тиоароил-2-оксо-2//,5//-индено[1,2-6]пи-ран-3-карбоксамидов.

4. Простой путь синтеза труднодоступных тУ-тиоароил-5-гидрокси-2//,5//-пирано[3,2-с]хромен-2-он-3-карбоксамидов - реакция 2-арил-4-гнд-рокси-6#-1,3-тиазин-6-онов с 3-формилхромонами в присутствии пиридина.

5. Токсичность 6-замещенных iV-тиоароилкумарин-З-карбоксамидов мало зависит от их липофильности и характеризуется квадратичной зависимостью от величины резонансного эффекта заместителя (^-константы Свэна-Лаптона).

6. 6-Замещенные JV-тиобензоилкумарин-З-карбоксамиды являются новыми перспективными соединениями, ингибирующими рост карциномы Эр-лиха in vivo и обладающими умеренным противовирусным действием против вируса гриппа A in vitro. Наибольшее влияние на противоопухолевую активность этой группы веществ оказывает природа заместителя в положении 6 кумарина: активность возрастает по мере увеличения электроноакцепторных свойств заместителя и достигает максимума у 6-фтор- и 6-хлорпроизводных.

7. Подлинность субстанции iV-тиобензоил-б-фторкумарин-З-карбокса-мида рекомендуется устанавливать методами УФ и ИК спектроскопии, чистоту — методом тонкослойной хроматографии, количественное определение следует проводить методом прямой алкалиметрии в неводной среде.

Автор выражает благодарность Любови Федоровной Стрелковой за регистрацию ИК спектров, Валентину Ивановичу Захарову за регистрацию спектров ЯМР и Александру Даниловичу Мишареву за регистрацию масс-спектров.