Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Определение фоксима при судебно-химическом исследовании трупного материала

^МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ОРЛОВА Алевтина Михайловна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОКСИМА

ПРИ СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ ТРУПНОГО МАТЕРИАЛА

15.00.02 - Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидат фармацевтических наук

МОСКВА - 1993

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФВДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И.М. СЕЧЕНОВА

на правах рукописи

ОРЛОВА Алевтина Михайловна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОКСИМА ПРИ СУДЕБНО-ХИШЧВСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ ТРУПНОГО МАТЕРИАЛА

15.00.02 - Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте судебной медицины Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, с.н.с. Горбачева H.A.

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, с.н.с. Дементьева H.H. кандидат фармацевтических наук, доцент Кузнецова Н.И.

Ведущая организация: Пермский фармацевтический институт

Защита диссертации состоится " "_ 1993 г.

в _ часов на заседании специализированного Совета Д 074.05.06

при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова ( I2I0I9, Москва, Суворовский бульвар, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова ( Москва, Зубовская пл., I)

Автореферат разослан " " _ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета

Д.074.05.06 кандидат фармацевтических наук,

доцент Садчикова Н.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фоксим (валексон, волатон), о,о-диэтил-тиофосфорил-альфа-цианобензальдоксим - фосфорорганический пестицид (ФОП), токсичный для человека и животных. Незнание или нарушение правил обращения, небрежность при хранении и использовании часто приводят к тяжелым и смертельным отравлениям ФОП. Встречаются также отравления с суицидной целью. Среди смертельных отравлений пестицидами одно из первых мест занимают именно острые отравления ФОП, что объясняется широким применением этих препаратов в быту и их высокой биологической активностью, связанной, в основном, с антихолинэстеразным механизмом действия ФОП на организм человека.

Фоксим также представляет токсикологический интерес. Препараты фоксима (концентрат эмульсии, аэрозоли), выпуск которых в стране начат в 1985 г., уже в 1986-87 гг. явились причиной отравлений людей со смертельным исходом.

Клиническая картина острых отравлений ФОП однотипна, патолого-анатомические и гистологические изменения не характерны, поэтому при установлении природы пестицида, вызвавшего отравление, ведущую роль в судебно-медицинской диагностике отравлений ФОП играют результаты судебно-химического исследования. Однако фоксим в судебно--химическом отношении не изучен.

В этой связи и с учетом основополагающей роли судебно-химического анализа при диагностике смертельных отравлений исследование фоксима является одной из актуальных задач токсикологической и судебной химии.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - разработать эффективную, чувствительную и специфичную методику изолирования, очистки, обнаружения и количественного определения фоксима при судебно-химическом анализе трупного материала. Предусматривалась

возможность унификации ее с применяемыми в судебно-химической практике методиками анализа на другие ФОП.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить в опытах на растворах и на модельных смесях с трупным материалом и предложить надежные реакции, способы обнаружения и количественного определения фоксима; установить пределы обнаружения и определения фоксима;

- изучить условия отделения фоксима от технических примесей препарата, эмульгаторов, других ФОП, а также лекарственных препаратов, имеющих токсикологическое значение и используемых в терапии при отравлениях ФОП;

- провести сравнительную оценку эффективности экстрагентов различной природы при изолировании фоксима из трупного материала, разработать эффективную методику его извлечения из внутренних органов трупа человека;

- изучить и выбрать оптимальные методы отделения фоксима от соэк-страктивных веществ, извлекаемых из органов трупа человека и дифференцированных с учетом содержания в них жира и степени гнилостного разложения;

- получить ориентирующие данные о сохраняемости фоксима в трупном материале, подобрать условия пролонгирования его сохраняемости;

- применить разработанную методику для исследования экспертного материала при смертельных отравлениях фоксимом; получить данные по распределению фоксима во внутренних органах трупа человека.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое изучение фоксима в судебно-химическом отношении.

В качестве предварительного исследования на группу ФОП в отношении фоксима изучена, оценена и рекомендована энзимная агар-диффузионная проба.

Изучены условия экстракции фоксима из водных растворов и трупного материала. Дана сравнительная оценка способов изолирования фоксима из трупного материала различными органическими растворителями. Разработаны и обоснованы методы изолирования фоксима из трупного материала с использованием в качестве экстрагентов - гексана и ЗСЙ раствора ацетона в гексане.

Экспериментально установлены и оценены методы очистки извлечений из трупного материала. Для очистки первичных извлечений применены: вымораживание в растворе ацетона, экстракционное перераспределение между гексаном и диметилформамидом, адсорбционная хроматография на колонке с активированным углем, препаративное хроматографическое выделение на слое сорбента в селективной подвижной фазе - бензол. Разработана последовательность применения этапов отделения соэкстрактивных веществ в зависимости от степени гнилостности объекта исследования, содержания в нем жира и последующих методов качественного и количественного анализа.

Для идентификации фоксима, выделенного из трупного материала, предложен комплекс реакций и методов, экспериментально изученных и охарактеризованных в аналитическом отношении. Доказательство фоксима включает анализ методом ТСХ в двух различающихся по разделяющей способности хроматографических системах с применением комплекса химических реакций обнаружения функциональных групп молекулы фоксима, энзимной агар-диффузионной реакцией, методами ГЖХ, УФ- и ИК-спектроскопии. Определены оптимальные условия выполнения анализа данными методами.

Изучены и предложены для исследования трупного материала два метода количественного определения фоксима - фотоколориметрический, рекомендованный для определения миллиграммовых количеств фоксима, и метод ГЖХ. Разработанные методики обеспечивают получение воспроизводимых результатов.

Изучены и определены условия анализа, обеспечивающие избирательность обнаружения и определения фоксима в отношении: соэкстрак-тивных веществ из органов трупа; основных технических примесей препарата и эмульгаторов, входящих в состав технологических форм фоксима; основных применяемых и встречающихся в токсикологической практике страны ФОП; лекарственных веществ, используемых в терапии отравлений ФОП и других, имеющих токсикологическое значение.

Изучен вопрос сохраняемости фоксима в трупном материале. Предложены условия пролонгирования его сохраняемости.

Получены данные по распределению фоксима в органах человека при смертельных отравлениях.

Практическая значимость полученных результатов. Разработанная методика изолирования фоксима из трупного материала гексаном с использованием метода ТСХ для обнаружения препарата и метода фотоколориметрии для его количественного определения унифицирована с применяющимся в практике судебно-химических лабораторий способом изолирования и определения наиболее распространенных в стране ФОП. Это позволяет производить анализ из одной навески органа, что су-щественно]зокршцает время проведения анализа, его трудоемкость. Предложенный в качестве альтернативного способ изолирования фоксима из трупного материала 30$ раствором ацетона в гексане дал возможность повысить эффективность извлечения препарата и чувствительность его обнаружения и определения.

Комплексное использование рекомендованных для идентификации фоксима методов Г1Х, УФ-, ИК-спектроскопии и энзимной агар-диффузионной реакции, в дополнении к исследованию методом ТСХ, позволило существенно повысить избирательность и чувствительность обнаружения и определения фоксима.

Разработанные методики судебно-химического анализа фоксима в трупном материале без глубоких гнилостных изменений и гнилостно-разложившемся апробированы в ряде Бюро СМЭ страны при исследова-

нии внутренних органов людей", погибших вследствии отравления фок-симом. Методики внедрены в практику с 1991 г. ("Информационное письмо о судебно-химическом определении фоксима в трупном материале").

Апробация работы и публикации. По материалам диссертационных исследований опубликовано в печати 7 научных работ, издано "Информационное письмо о судебно-химическом определении фоксима в трупном материале", получено Авторское свидетельство на изобретение. Основные положения и результаты исследований доложены и обсуждены: на заседаниях секции судебных химиков Московского отделения научного общества судебных медиков (май, октябрь 1985 г.), на научных конференциях НШ судебной медицины Минздрава РФ (1985,1987гг.), на семинаре для экспертов-химиков Бюро судебно-медицинской экспертизы страны по судебно-химическому анализу ФОН ( Москва, 1989г.); апробированы при проведении судебно-химических экспертиз (декабрь 1985 г.,июль 1986 г., январь,март,апрель 1987 г.).

На защиту выносятся:

- энзимная агар-диффузионная проба для предварительного исследования на группу ФОП;

- комплекс реакций и методов, обеспечивающий достаточную чувствительность и специфичность при качественном и количественном определении фоксима;

- сравнительная оценка способов изолирования фоксима из трупного материала различными растворителями; унифицированный способ изолирования фоксима гексаном;

- способы очистки полученных извлечений в зависимости от характера объекта исследования; схема исследования фоксима;

- модифицированный способ изолирования фоксима из трупного материала 30% раствором ацетона в гексане;

- сохраняемость фоксима в трупном материале;

- распределение фоксима во внутренних органах людей, погибших в результате смертельных отравлений фоксимом.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложенной в семи главах, выводов, списка литературы. Работа изложена на 253 страницах, иллюстрирована 20 рисунками, 34 таблицами,схемой. Библиография включает 180 источников, из них 48 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

В первой главе ( обзор литературы) приведены сведения о токсичности фоксима, его метаболизме, проведен анализ литературных данных, касающихся методологии и методов исследования ФОП и фоксима в биологических объектах, что позволило обоснованно подойти к выбору методов для анализа фоксима и способов отделения его от мешающих веществ.

Во второй главе дана характеристика объектов исследования, методика очистки технического препарата фоксима, характеристики приборов, реактивов и других материалов, использованных в работе, дано описание приготовления реагентов и методов статистической обработки результатов.

Третья глава содержит описание условий обнаружения фоксима с помощью химических, биохимических и физико-химических методов анализа.

В четвертой главе описаны результаты изученных методов количественного определения фоксима.

Пятая глава посвящена разработке схемы исследования трупного материала на фоксим. Изучено влияние эндогенных соединений тканей органов. Экспериментально подобраны условия пробоподготовки и анализа фоксима. Изучена избирательность схемы исследования.

В шестой главе приведены результаты опытов i.n vitto по

(

сохраняемости фоксима в трупном материале.

В седьмой главе дано подробное описание разработанной методики судебно-химического исследования фоксима.

В восьмой главе представлены результаты экспертиз внутренних органов людей, погибших вследствии отравления фоксимом; приведены результаты по распределению фоксима в органах человека.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Фоксим (молекулярная масса 298,3) - малолетучая жидкость коричневого цвета с температурой кипения 10242 при 0,01 мм рт.ст.; хорошо растворим в хлороформе, спиртах, ацетоне, бензоле, ксилоле; растворимость в воде при 20°С - 7 мг/мл. Препарат стабилен в нейтральной среде, под действием кислот и щелочей гидролизуется. В работе использовали препарат с содержанием действующего вещества 91,8%, очищенный по стандартной методике.

Методы обнаружения фоксима

Для идентификации фоксима нами были изучены методы ТСХ, ПКХ, УФ- и ИК-спектроскопия. Рассмотрена возможность использования в анализе трупного материала предварительной (на группу ФОП, отдельная навеска) энзимной агар-диффузионной пробы. При этом установлено, что предел обнаружения фоксима составляет 0,1 - 0,5 мг препарата в 20 г органа, т.е. в отношении фоксима проба не имеет отрицательного судебно-химического значения, однако использование ее при с.удебно-химическом исследовании целесообразно. Также установлено, что чувствительность самой энзимной реакщш в слое агар-агара достаточно высока: предел обнаружения фоксима в растворе составил 0,12 мкг в пробе. Реакция использована нами при обнаружении фоксима в трупном материале после очистки извлечений по общей схеме, что позволило повысить избирательность ее в отношении соэкстрактивных веществ из органов трупа и других ФОП.

Для идентификации фоксима' методом ТСХ с цёлыо отделения препарата от других ФОЛ (перечислены в разделе "избирательность...") и от соэкстрактивных веществ из органов трупа изучены и выделены отличающиеся по своим свойствам и дополняющие друг друга две хро-матографические системы: I - пластинки с силикагелем КСК и пластинки "Силуфол", подвижная фаза - бензол; II - пластинки "Силуфол", импрегнированные 60% раствором диметилформамида в метаноле, подвижная фаза - гексан, насыщенный диметилформамидом. Для обнаружения фоксима на пластинках изучены и выбраны цветные реакции, основанные на выявлении функциональных групп молекулы препарата: реакции с палладиевым и бромфеноловым синим реактивами (на соединения, содержащие донорный атом серы), с 4-(п-нитробензил)пиридином ¿4-НБЛ реактив (на соединения, способные к алкилированию) и реакция обнаружения органически связанного фосфора (реакция по фосфору). Подобраны оптимальные условия проведения ТСХ анализа, определены значения Rj фоксима, других ФОП и соэкстрактивных веществ. Установлено, что наиболее чувствительными являются реакции с палладиевым и 4-НБП реактивами, причем на пластинках "Силуфол" в подвижной фазе бензол чуствительность несколько выше, чем при использовании второй хро-матографической системы. Предел обнаружения фоксима (в зависимости от используемой хроматографической системы) с палладиевым и 4-НБП реактивами составил 0,2-1,2 мкг, с бромфеноловым синим реактивом -1,0-2,4 мкг, реакцией по фосфору - 3,6 мкг в пробе. Соэкстрактивные вещества не мешают обнаружению фоксима.

Изучение и подбор оптимальных условий ГЖХ анализа на фоксим проводили на приборе "Peiktn-Elme/t ".модель 900 с использованием детектора по фосфору на.двух стеклянных колонках с различающимися по полярности неподвижными жидкими фазами: колонка 100 х 0,096 см, заполненная хроматоном N-AW -JMCS с W> SE -30 и колонка 200 х 0,064 см, заполненная хромосорбом "У AW-DMCS с 2,5$ ХЕ-60. Установ-

лено, что при работе на колонке с Е^бЕ-30 температура испарителя должна составлять 190°С, температура термостата колонок - 165°С; при работе на колонке с 2,Й ХЕ-60 температура испарителя и колонок должна составлять 2Ю°С. В обоих случаях скорость потока газа-носителя азота особой чистоты составляла 40 мл/мин., водорода - 37,5 мл/мин., воздуха - 305 мл/мин. Температура нагрева капсулы - 530°С; скорость движения диаграммной ленты 5 мм/мин.; рабочая шкала электрометра 8-КГ^А. Идентификацию фоксима рекомендовано проводить на колонке с неподвижной фазой 5$,5Е -30: абсолютное время удерживания фоксима 185 сек., относительно метафоса - 1,36. При этом фок-сим не отделяется от актеллика, байтекса, карбофоса и трихлормета-фоса-3. Для исключения указанных ФОП (при положительном результате анализа на данной колонке) предложена дополнительная колонка с неподвижной фазой 2,5^ ХЕ-60, на которой эти ФОП детектируются, а фоксим не идентифицируется. Избирательность обнаружения фоксима повышается при оценке полученных результатов в совокупности с результатами ТСХ анализа, где неши достигнуто отделение вышеуказанных ФОП от фоксима. Подобраны аликвоты растворов соэкстрактивных веществ, при которых они не мешают обнаружению препарата. Предел обнаружения фоксима составил 0,5 нг в пробе.

Результаты УФ-спектроскопического исследования показали, что УФ-спектр раствора фоксима в гексане характеризуется максимумом поглощения при 277 нм; предел обнаружения препарата - 1,0 мкг/мл. Установлено, что на результаты анализа фоксима, выделенного из трупного материала, существенное влияние оказывают соэкстрактивные вещества, в том числе после предварительного отделения их методом ТСХ.

Исследование фоксима методом ИК-спектроскопии проводили на двухлучевом инфракрасном спектрофотометре ИКС-29 в области 4200 --400 см-* при нанесении препарата в виде тонкой пленки на стекло

из монокристалла кремния. Проведено отнесение колебательных частот, полученных в ИК-спектре. Установлено, что для идентификации фоксима могут быть использованы характеристические полосы поглощения с колебательными частотами 630-855 (основная в данной тиофосфорильной группе - 750), 930,1020,1165,1650,2230 (основная характеристическая полоса, соответствующая валентным колебаниям нитрильной группы) см-* С —10 см-*). Предел обнаружения фоксима составил I мг в пробе. Соэкстрактивные вещества не оказывали существенного влияния на результаты обнаружения фоксима.

Методы количественного определения фоксима

С целью использования для количественного определения фоксима в трупном материале нами были изучены фотоколориметрический метод, метод УФ-спектрометрии для определения нативного соединения и метод ГЖХ. Способ фотоколориметрического определения по реакции образования синего фосфорномолибденового комплекса широко используется в судебно-химической практике для количественного определения ФОП. Он основан на окислении ФОП смесью концентрированных серной и азотной кислот до фосфат-иона, при взаимодействии которого с аммония молибдатом в кислой среде образуется аммония фосфомолибдат, представляющий собой соль фосфорномолибденовой гетерополикислоты. Эта кислота обладает выраженными окислительными свойствами и легко реагирует с восстановителем, образуя молибденовую синь. В качестве восстановителя использовали аскорбиновую кислоту. Расчет содержания фосфорорганического соединения проводили по градуировочному графику, построенному по калия дигидрофосфату. Оптическую плотность растворов при .Я эфф_630 нм измеряли в кварцевых кюветах с рабочей длиной 20 мм на фотоэлектроколориметре ФЭК-56ГШ. Градуировочный график строили в интервале концентраций от 5 до 40 мкг фосфора. Графическая зависимость оптических плотностей от концентрации фосфора выра-

жалась прямой линией у = 0,011 х. Отношение остаточной дисперсии к дисперсии воспроизводимости эксперимента показало, что данное уравнение адекватно экспериментальным данным. Предел определения составил 5 мкг фосфора в определяемом объеме (50 мл), относительная ошибка единичного определения - 1,9%. По полученному графику проводили расчет содержания фоксима, взятого для минерализации, используя фактор пересчета 9,63. Результаты определения фоксима покали, что препарат окисляется полностью: возврат добавленного в количествах от 0,5 до 5,0 мг фоксима составил от 103% до 108%. Относительная ошибка определения составляла от ^ 2,7% до - 4,2%; предел определения - 0,05 мг фоксима в пробе (или I мкг/мл по фосфору). Установлено, что при определении фоксима в трупном материале, требуется тщательное отделение его от соэкстрактивных веществ, поскольку реакции, на которых основан метод, дают различные фосфороргани-ческие вещества, в том числе естественносодержащиеся в органах.

При УФ-спектрометрическом исследовании растворов фоксима в гек-сане (при 277 нм) зависимость оптической плотности от концентрации препарата описывалась уравнением регрессии у = 0,04 + 0,041 х. Предел определения фоксима составил 1,0 мкг/мл. С целью снижения влияния соэкстрактивных веществ, выявленного при качественном анализе, проведен подбор оптимального разведения извлечения. Предварительные опыты с пробами печени, к которым добавляли фоксим, и исследование очищенных извлечений с учетом оптимального разведения их показали, что чувствительность определения фоксима б два и более раз ниже, чем при использовании при этом фотоколориметрического метода. В этой связи мы сочли нецелесообразным дальнейшее изучение данного метода с целью рекомендации его для определения фоксима в трупном материале.

ГЖ-определение фоксима проводили на колонке с неподвижной фазой 5%5Е-30 в тех же условиях, что при проведении качественного

анализа. При оценке результатов определения использовали метод внутреннего стандарта, в качестве которого выбран метафос (абсолютное время удерживания метафоса - 136 е.,фоксима - 185 е.). Количественный обсчет полученных на хроматограмме пиков производили по их площадям. Градуировочный график зависимости отношения площадей пиков фоксима и метафоса от содержания фоксима описывался уравнением параболы у = 0,150 + 0,008 х^ /"у - отношение площади пика фоксима к площади пика метафоса, х - концентрация фоксима в нг/мкд7- Из полученного уравнения выведена формула расчета "х". Установлено, что при концентрациях фоксима от I до 10 нг/мкл определяется от 83,7% до 101,7% препарата. Относительная погрешность среднего результата не превышала +9,9$. Лучшая воспроизводимость и точность определения фоксима (относительная ошибка -1,1%) наблюдалась при концентрации препарата 10 нг/мкл. Рекомендовано это учитывать при определении фоксима в трупном материале (при достаточных количествах выделенного препарата) с целью подбора такой аликвоты извлечения, концентрация фоксима в которой соответствовала бы приблизительно 10 мкг в I мл исследуемого раствора при введении в колонку I мкл. Предел определения фоксима в растворах гексана составил I нг в пробе (сигнал не менее &% рабочей шкалы).

Методы изолирования, обнаружения и определения фоксима в трупном материале

Изолирование фоксима и очистка полученных извлечений. В судеб-но-химической практике для анализа трупного материала на ряд ФОП, проявляющих, как и фок(;им, гидрофобные свойства, разработаны методики , где в качестве экстрагента использован гексан и достигнута унификация по этапам изолирования и выделения, что представляло для нас практический интерес. Проведенные опыты по оценке экстракции фоксима в системе вода-гексан показали, что при однократной

экстракции гексаном степень извлечения фоксима составляет в среднем 95,9$, коэффициент распределения в системе - 23,4, т.е. фоксим достаточно хорошо экстрагируется гексаном из нейтральной водной среды.

Сравнительную оценку влияния природы растворителя на эффективность выделения фоксима проводили на модельных опытах с печенью. Для извлечения фоксима использовали гексан, диэтиловый эфир, бензол, ацетон, хлороформ. Пробы настаивали с растворителем при комнатной температуре в присутствии безводного натрия сульфата в течение 2, 12 и 2 часов и исследовали по единой методике: отделение экстрактивных веществ осуществляли экстракционным перераспределением в системе гексан-ДМФА 1:1, затем препаративным хроматографическим выделением на слое кремневой кислоты, качественное исследование - методом ТСХ, количественное определение - фотоколориметрическим методом. Результаты опытов представлены в таблице I.

Таблица I.

Определение фоксима, добавленного в количестве I мг к 25 г печени при извлечении различными растворителями

Использованный растворитель Метрологические характеристики

и. X % Зх 6 А % ^ %

ацетон 5 64,2 2,9 6,5 0,10 ±12,6 64,2 ± 4,Е

бензол 5 41,2 3,1 6,9 0,17 -20,8 41,2 ± 8,6

гексан 9 60,9 1,6 4,7 0,08 - 7,4 60,9 ± 4,Е

хлороформ 5 64,0 3,0 6,8 0,11 ¿13,0 64,0 ± 8,с

эфир диэтило- 5 37,5 7,2 16,1 0,43 ¿53,3 37,5 ± 20,0

вый

При качественном анализе особенно выявились преимущества извлечения гексаном: меньшая масса экстрактивных веществ, более однородный их состав обеспечили получение воспроизводимых результатов. При извлечении ацетоном и хлороформом наблюдали сильное влияние соэкстрактивных веществ (образование эмульсий, перегрузки сорбента).

Полученные данные послужили основанием для выбора в качестве растворителя гексана при изолировании из органов трупа фоксима и позволили унифицировать методику изолирования фоксима с методиками изолирования других ФОП.

Для очистки экстрактов были изучены способы вымораживания жиров в ацетоне, экстракционного перераспределения между двумя несме-шившощимися растворителями, метод препаративного хроматографическо-го выделения, адсорбционная колоночная хроматография. Все способы экспериментально обоснованы и оценены качественно и количественно. Разработаны дифференци/рованные схемы очистки фоксима от соэкстрак-тивных веществ, извлекаемых гексаном из органов трупа: без глубокого гнилостного разложения; с большим содержанием жира; гнилостно- разложившихся. Установлено, что потери добавленного фоксима (опыты на растворах) при его выделении по разработанным схемам не превышают 8%. Разработанная методика судебно-химического анализа фоксима представлена в виде схемы.

Обнаружение и определение фоксима в трупном материале. Нами показана применимость и эффективность изученных методов обнаружения и количественного определения к исследованию фоксима, выделенного из органов трупа. Установлено, что методы применимы только после очистки извлечения по разработанной схеме исследования. С целью устранения влияния соэкстрактивных веществ подобраны оптимальные аликвоты конечного элюата для проведения анализа изученными методами. Проведена сравнительная количественная оценка методики изолирования фоксима из трупного материала.

Установлено, что при анализе тканей без глубоких гнилостных изменений предел обнаружения фоксима методом ТСХ и энзимной реакцией по совокупности исследований составляет в 25 г печени и почек 0,24 мг, желудка и кишечника - 0,28 мг; при исследовании методом ПКХ предел обнаружения фоксима в 25 г печени составляет 5,0 мкг,

СХЕМА АНАЛИЗА ФОКСИМА В ТРУПНОМ МАТЕРИАЛЕ С УЧЕТОМ ХАРАКТЕРА ОБЪЕКТА

ИССЛЕДУЕМЫЙ ОРГАН,масса 25 г.

/незагнивший: -,

с большим содержанием жира:----,

гнилостно-измененный: .....J

т-----

I

! •: 1 т

вымораживание

жиров в ацетоне

ОЧИСТКА ЭКСТРАКТА

ИЗВЛЕЧЕНИЕ гексаном в присутствии безводного натрия сульфата

____1

экстракционное перераспределение в системе гексан- ДМФА

препаративная хроматография на слое крем-

сл

I

ТСХ энзимная ГНСХ реакция

УФ-,ИК-спектро-скопия

фотоколориметрический ПКХ метод

метода УФ-спектроскопии - 0,5 мг, ИК-спектроскопии - 5,0 мг. При исследовании 25 г органов методика позволяет выделять и определять фотоколориметрическим методом в среднем в печени 61,3% добавленного (I мг) фоксима, в почках - 56,2%, в желудке и кишечнике - 50,0 -51,5$. Предел определения фоксима при этом составил: в печени -0,5 мг, в почках - 0,2 мг, в желудке и кишечнике - 0,3 мг. При исследовании методом ГЖХ методика позволяет выделять и определять в 25 г печени от 44,0% до 52,0$ добавленного (100-10 мкг) фоксима; предел определения - 10,0 мкг препарата.

При анализе гнилостноизмененной печени предел обнаружения фоксима по совокупности исследований методом ТСХ и энзимной реакцией составил 0,5 мг в 25 г органа; методика позволяет выделять и определять фотоколориметрическим методом в среднем 51,0$ добавленного (1мг) фоксима, предел определения - 0,85 мг препарата. Результаты определения фоксима в трупном материале представлены в таблице 2.

Модифицированный способ изолирования фоксима из трупного материала. С учетом данных, полученных при извлечении фоксима из печени различными растворителями, нами разработана альтернативная методика изолирования фоксима 30$ раствором ацетона в гексане применительно к анализу органов без глубоких гнилостных изменений с использованием схемы очистки, разработанной для этих органов. Это повысило эффективность выделения фоксима и чувствительность его определения в сравнении с извлечением гексаном. Методика позволила выделить и определить фотоколориметрическим методом в 25 г печени в среднем 76,6$ добавленного (I мг) препарата; предел определения фоксима при этом составил 0,3 мг, предел обнаружения - 0,1 мг.

Избирательность схемы исследования. Схема исследования фоксима в трупном материале избирательна в отношении соэкстрактивных веществ, выделенных из незагнивших тканей органов, содержащих большое коли-

Таблица 2

Определение фоксима в органах трупа (масса 25 г.)

Орган Добавлено фоксима п. Метрологические характеристики

фотоколориметрический метод X {%) 5* 5 А (±*>

печень от 0,9 до 10,0 мг 18 61,3 1,2 4,9 0,08 4,0 61,3 ± 2,4

почки от 0,2 до 1,0 мг 16 56,2 1,7 6,8 0,12 6,4 56,2 ± 3,6

желудок от 0,3 до 1,0 мг 12 51,5 1,5 5,1 0,10 6,3 51,5 ± 3,2

кишечник от 0,3 до 1,0 мг 12 50,1 1,3 4,4 0,09 5,6 50,1 ± 2,8

печень» 0,5 мг 5 43,9 2,7 6,0 0,14 16,9 43,9 ± 7,4

гнилостно-измененная печень 1,0 мг 10 51,6 1,6 4,9 0,09 6,4 51,6 ± 3,5

метод 1ЖХ

печень 100,0 мкг 5 44,0 0,9 1,9 0,04 5,4 44,0 ± 2,4

печень 10,0 мкг 5 52,0 0,5 1,1 0,02 2,7 52,0 ± 1,4

I

1—1 -о

чество жира и гнилостноизмененных. Она избирательна также в отношении: технических примесей (альфа-цианобензальдоксим,диэтилхлортио-фосфат) и составных частей технологических форм фоксима (эмульгаторы ОП-7 и 0П-Ю,эмульсоген И-40-Б); ряда ФОП, встречающихся в судебно-медицинской практике (актеллик,байтекс,бромофос,бутифос,гар-дона,дибром.ДДВФ,диазинон,дифос,дурсбан,карбофос,метафос.метилнит-рофос,сайфос,трихлорметафос-3,фосдрин,фталофос.фосфамид,хлорофос, цианокс,цидиал,циодрин); фосфорорганических лекарственных препаратов (бензотэф,дипин,тиодипин,тиофосфамид,циклофосфан); лекарственных препаратов, используемых в терапии отравлений ФОП (атропин, производные барбитуровой кислоты) и других, имеющих токсикологическое значение (производные фенотиазина, I,4-бензодиазепина, морфин и др.). На основании полученных данных при изучении избирательности схемы исследования проведена оценка и обоснованы условия использования способов обнаружения и определения фоксима. Избирательность методики повышается при совокупном использовании предложенных методов исследования фоксима.

Сохраняемость фоксима в трупном материале и способы ее пролонгирования

Данные о сохраняемости токсичного вещества в трупном материале имеют важное значение при оценке результатов судебно-химического анализа. Исследования проводили с тканью печени, к которой добавляли фоксим. Параллельно исследовали контрольные пробы. Объекты хранили при комнатной температуре, в морозильной камере, а также с добавлением консерванта этанола. Установлено, что фоксим в течение 30 суток разлагается при хранении при комнатной температуре; консервирование объектов этанолом и замораживание и хранение их в морозильной камере пролонгирует сохраняемость фоксима до 45-75 суток. Дополнительных продуктов превращения фоксима при хранении не наблюдали. Полученные данные о сравнительно быстром разложении фоксима при

хранении подтверждены результатами анализа экспертного материала.

Применение разработанных методик в экспертной практике

Методики определения фоксима в трупном материале применены в экспертизах внутренних органов людей, погибших вследствии отравления фок-симом. В трех случаях отравления были вызваны приемом концентрата эмульсии фоксима и при исследовании определены миллиграммовые количества препарата. В четырех случаях отравления были связаны с приемом препаратов "Аэротокс" и "Аэроантимоль", содержащих 0,2 и 0,1% фоксима (соответственно) и этиловый спирт (95$). В этих случаях были определены, в основном, микрограммовые количества фоксима.

Анализ результатов проведенных экспертиз показал, что наибольшие количества фоксима при приеме его внутрь, независимо от уровня содержания препарата в органах (мг или мкг количества), обнаруживаются в желудочно-кишечном тракте, несколько меньшие - в почках и наименьшие - в печени, головном мозгу.

Результаты некоторых экспертиз приведены в таблицах 3 и 4.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые для целей судебно-химического анализа разработана методика изолирования и определения фоксима в органах трупа, включая гнилостноизмененные. Методика унифицирована с применяющимся в практике судебно-химических лабораторий способом изолирования гексаном и определения распространенных в стране ФОП. Это позволяет производить анализ из одной навески органа, сокращая время и трудоемкость анализа, экономя реагенты.

2. Изучена возможность извлечения фоксима различными органическими растворителями при исследовании трупного материала, дана сравнительная качественная и количественная оценка способов изолирования фоксима из трупного материала. Обоснован выбор гексана для изолирования фоксима из трупного материала. Методика позволяет выделить

Таблица 3

Ж исследование внутренних органов из трупов лиц, погибших после приема внутрь аэрозолей фоксима

Орган Найдено фоксима в мг/100 г органа трупа

Экспертные случаи

4 5 6 7

печень не обнаруж. обнаруж. (~0,02) не обнаруж. -

почки обнаруж. (-0.03) — - -

желудок 1,48 0,44 0,16 0,09

тонкий кишечник 0,48 0,04 0,08 обнаруж. (—0,02)

мозг не обнаруж. - - -

легкие не обнаруж. - - -

Знак "-" означает, что орган не прислан на исследование.

Таблица 4

Определение фоксима во внутренних органах трупа гр. А. (отравление концентратом эмульсии)

Орган Найде но фоксима (мг/100 г.)

на 6-е сутки после смерти через 45 суток хранения объектов на холоду

печень почки желудок тонкий кишечник 22,5 101,3 177,2 577,8 0,9 20,8 167,6 506,5

из 25 г внутренних органов и определить при использовании фотоколориметрического метода: в печени- 61% добавленного (1мг) фоксима, в почках- 56%, в желудке и кишечнике- 51%. При использовании метода ГЖХ а 25 г печени определяется в среднем 44-52$ добавленного (10-100 мкг) фоксима.

3. Предложен модифицированный способ извлечения фоксима из органов трупа без глубоких гнилостных изменений с помощью 30% раствора ацетона в гексане, что позволило повысить эффективность извлечения фоксима из 25 г печени до 76,6% и в два раза увеличить чувствительность методики по сравнению с унифицированным способом извлечения гексаном: предел определения препарата в 25 г печени составляет 0,3 мг, предел обнаружения - 0,1 мг.

4. Разработаны, экспериментально обоснованы и оценены качественно и количественно способы очистки извлечений из трупного материала. Очистка извлечений включает: вымораживание в растворе ацетона, экстракционное перераспределение в системе гексан-ДМФА, хрома-тографическое выделение на колонке активированного угля, препаративное хроматографическое выделение на слое сорбента в подвижной фазе- бензол. Разработана последовательность применения этапов отделения соэкстрактивных веществ с дифференциацией в зависимости от степени гнилостности объекта исследования, содержания в нем жира

и последующих методов качественного и количественного анализа.

5. Изучены и применены для анализа органов трупа способы обнаружения, включающие энзимную реакцию, исследование методами ТСХ, ПКХ, УФ- и ИК-спектроскопии. По совокупности исследований энзимной агар-диффузионной реакцией и методом ТСХ в двух различающихся по разделяющей способности системах растворителей с применением комплекса рекомендованных химических реакций обнаружения функциональных групп молекулы фоксима методика позволяет обнаруживать в 25 г органа: в печени и почках - 0,24 мг фоксима, в желудке и кишечнике -

- 0,28 мг. Предел обнаружения фоксима методом ПКХ на колонке с неподвижной фазой 5%5Е-30 составляет 5,0 мкг в 25 г печени. Методом УФ-спектроскопии (Л■ „_ 277 нм) обнаруживается до 0,5 мг препарата в 25 г печени. Идентификация в ИК-области спектра проводится по полосам поглощения с колебательными частотами 750,930,1020,1165,2230 см_1(± Юсм-^). Основная характеристическая полоса поглощения для фоксима - 2230 см-"''. Предел обнаружения составляет 5,0 мг фоксима в 25 г органа.

При исследовании гнилостно-измененного трупного материала по совокупности исследований энзимной агар-диффузионной реакцией и методом ТСХ методика позволяет обнаруживать до 0,5 мг фоксима в 25 г органа.

6. Изучены для исследования трупного материала два метода количественного определения фоксима - фотоколориметрический (по синему фосфорно-молибденовому комплексу после окисления препарата до орто-фосфата) и метод ИХ. При использовании фотоколориметрического метода предел определения фоксима в 25 г органа составляет: в печени-0,5 мг, в почках- 0,2 мг, в желудке и кишечнике- 0,3 мг. При ГЖХ исследовании предел определения фоксима в 25 г печени составляет 10,0 мкг. Предел определения фоксима в 25 г гнилостно-измененной печени при использовании фотоколориметрического метода - 0,85 мг.

7. Изучены условия анализа, обеспечивающие избирательность обнаружения и определения фоксима в отношении: экстрактивных веществ из органов трупа; технических примесей и эмульгаторов, входящих в состав технологических форм препарата; основных ФОП, встречающихся в токсикологической практике; лекарственных вещее.з, используемых

в терапии отравлений ФОП и других,имеющих токсикологическое значение.

8.Изучена в отношении фоксима предварительная энзимная агар-диффузионная проба на ФОН, применяемая в практике судебно-химичес-ких отделений. Предел обнаружения фоксима составляет в 20 г печени-

0,10 мг, почек- 0,19 мг, желудка- 0,21 мг. Проба не имеет для фоксима отрицательного судебно-химического значения.

9. Получены ориентирующие данные о сохраняемости фоксима в трупном материале и о возможности ее пролонгирования. Добавленный

к 25 г печени в количестве 10 мг, фоксим может быть определен в течение 30 суток хранения при комнатной температуре; консервирование этанолом пролонгирует сохраняемость фоксима до 75 суток. Сохраняемости фоксима, добавленного в количестве I мг к 25 г печени, до 45 суток способствует хранение объектов в замороженном состоянии. Полученные данные, свидетельствующие о сравнительно быстром разложении фоксима при хранении объектов исследования, подтверждены результатами анализа экспертного материала.

10. Разработанные методики определения фоксима в трупном материале применены в экспертизах внутренних органов людей, погибших от отравления фоксимом. В случаях, где отравления были вызваны приемом внутрь концентрата эмульсии, фотоколориметрическим методом были определены миллиграммовые количества фоксима. При отравлениях препаратами "Аэротокс" и "Аэроантимоль", содержащими до 0,2% фоксима, методом ГЖХ были определены микрограммовые количества препарата.

11. Анализ экспертного материала в случаях острых летальных отравлений фоксимом свидетельствует, что при введении препарата внутрь наибольшие его количества обнаруживаются в желудке с содержимым, в кишечнике, затем в почках и печени. Эти органы рационально использовать в судебно-химическом исследовании при подозрении на отравление фоксимом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I.Горбачева H.A., Орлова A.M. Способ определения фоксима в секционном материале. Авт свидетельство на изобретение №1196772 от 8.08.85. Гос.комитета СССР по делам изобретений и открытий.

2. Горбачева H.A., Орлова A.M. Обнаружение фоксима при.судеб-но-химическом исследовании биологического материала.//Фармация.М.: Медицина.-1986.- №3.- С.48-52.

3. Горбачева H.A., Орлова A.M. К вопросу ТСХ-анализа фоксима, выделенного из биологического материала.// Фармация.-М.¡Медицина.-1986.- №5.- С.47-49.

4. Орлова A.M. Изолирование и количественное определение фоксима в биологическом материале.// Судебно-медицинская экспертиза. -М. : Медицина. -1986.- №4.- С.48-51.

5. Орлова A.M. Определение фоксима при судебно-химическом исследовании загнившего трупного материала.// Фармация.-М.:Медицина.- 1987.- »5.- С.40-44.

6. Орлова A.M. Изолирование фоксима при судебно-химическом исследовании трупного материала.// Фармация.-М.:Медицина.- 1988.-№1.- С.50-52.

7. Орлова A.M. Обнаружение фоксима при судебно-химическом исследовании трупного материала с использованием методов УФ- и ИК-спектрометрии.// Некоторые вопросы химико-токсикологического анализа. :Сборник научных трудов.-Барнаул.¡Алтайский гос.мед.ин-т МЗ РСФСР - 1989.- С.26-32.

8. Информационное письмо о судебно-химическом определении фоксима в трупном материале.- М.¡Минздрав СССР.- 1991.- 17 с.

9. Орлова A.M., Саломатин Е.М. Определение фоксима в трупном материале методом газо-жидкостной хроматографии.// Судебно-медицинская экспертиза.-М.¡Медицина.- 1992.- №2.- С.32-35.