Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Исследования по разработке состава, технологии и стандартизации лекарственных препаратов на основе биомассы спирулины

На правах рукописи

ВОРОНИН АЛЕКСАНДР ВАСИЛЬЕВИЧ

РГБ ОД

- 8 ню/] т

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ СОСТАВА, ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БИОМАССЫ СПИРУЛИНЫ

Специальность 15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь, 2002

На правах рукописи

ВОРОНИН АЛЕКСАНДР ВАСИЛЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ СОСТАВА, ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БИОМАССЫ СПИРУЛИНЫ

Специальность 15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь 2002

Работа выполнена в Самарском государственном медицинском университете

Защита диссертации состоится «14» июня 2002 г. в 13 часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.068.01. при Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614000, Пермь, ул. Ленина, д. 48.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии.

Научные руководители

доктор фармацевтических наз'к профессор C.B. Первушкин доктор биологических наук, профессор И.Ф. Шаталаев

Официальные оппоненты

доктор фармацевтических наук, профессор Ю.А. Хомов кандидат фармацевтических наук H.A. Ванькоза

Ведущая организация

НИИ Фармакологии РАМН, г. Москва

Автореферат разослан гэ » 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Среди огромной номенклатуры профилактических и лекарственных средств особое место принадлежит препаратам растительного происхождения, которые по фармакологической активности, как правило, не уступают препаратам, из полученных синтетическим путем индивидуальных соединений и проявляют минимум возможных побочных эффектов.

Исследования биологически активных соединений биомассы спирулины (5р1ги1та рЫепз/'з, сем. ОясИШопасеае) показали перспективность использования данной фитосубстанции как лекарственного средства, а также создания на ее основе новых лекарственных средств широкого спектра терапевтического действия.

Воздействие агрессивных экологических факторов внешней среды на организм человека вызывает развитие оксидантного стресса, сопровождающегося снижением функции защитной антиоксидантной системы. Установлено, что чрезмерное накопление продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в организме приводит к изменениям структурно-функциональной организации мембран, формированию патологических состояний - воспатению, дистрофии, функциональным нарушениям.

Комплекс антиоксидантов биомассы спирулины и флаволигнаны плодов расторопши пятнистой подавляют реакции ПОЛ, нарушение регуляции которых является патогенетическим механизмом целого ряда заболеваний. Это является предпосылкой для создания на базе данных объектов комплексных препаратов, обладающих сочетанным антиоксидантным, гепатопротекторным и иммуномодулирующим действием.

Создание эффективных и безопасных препаратов для местного лечения воспалительных заболеваний слизистой оболочки носа и околоносовых пазух, связанных с раздражением после, операций на перегородке носа и околоносовых раковинах, респираторными инфекциями,

сезонными и несезонными аллергическими реакциями, в настоящее время является одной из ведущих проблем оториноларингологической практики.

С учетом известной роли ПОЛ в развитии воспаления практический интерес представляет разработка новых подходов к фармакотерапии воспалительного процесса слизистой в оториноларингологической практике с применением препаратов противовоспалительного действия, содержащих комплекс антиоксидантов природного происхождения. Вышеизложенное свидетельствует о перспективности разработки на основе биомассы спирулины фитопрепаратов для оториноларингологической практики, обладающих регенерирующим и противовоспалительным действием.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является создание лекарственных препаратов - дозированного порошка гепатопротекторного действия «Растоспир» и геля противовоспалительного, регенерирующего действия для оториноларингологии «Лороспир».

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие конкретные задачи:

1. Изучить динамику фракционного состава белков, изоферментного спектра ключевых оксидоредуктаз биомассы спирулины в процессе культивирования.

2. Экспериментально обосновать методические подходы к стандартизации биомассы спирулины и препаратов на ее основе.

3. Разработать методики качественного и количественного анализа биологически активных соединений биомассы спирулины: каротиноидов, фикоцианина и общего белка.

4. Изучить гепатопротекторную активность и технологические свойства композиций биомассы спирулины и плодов расторопши пятнистой, разработать оптимальный состав, технологию дозированного порошка

«Растоспир», определить показатели качества, стабильность в процессе хранения.

5. Разработать оптимальный состав и технологию геля «Лороспир», определить показатели качества, стабильность в процессе хранения.

6. Разработать методики качественного и количественного анализа предложенных препаратов.

7. На основании результатов исследований разработать проекты фармакопейных статей предприятия «Спнрулины биомасса», «Растоспир», «Лороспир» гель».

Научная новизна. Изучена динамика фракционного состава белков и спектра изоферментов (лактат-, малат-, глутаматдегидрогеназы) биомассы спирулины как перспективной субстанции для создания новых лекарственных средств с целью определения оптимального срока созревания культуры спирулины в закрытых фотобиореаторах при заданных условиях культивирования.

Показана целесообразность замены методики количественного анализа ß-каротина в биомассе спирулины с применением PCO калия бихромата методикой, основанной на использовании удельного показателя поглощения ß-каротина. Изучены электрофоретические и спектральные характеристики пигмента фикоцианина, разработана

спектрофотометрическая методика количественного определения фикоцианина в биомассе спирулины с использованием удельного показателя поглощения при длине волны 620 нм.

Обоснованы методические подходы к анализу биомассы и препаратов спирулины, включающие комплексную оценку качества по доминирующим биологически активным соединениям - пигментам (ß-каротин, фикоцианин) и белкам методами тонкослойной хроматографии, спектрофотометрии, электрофореза.

Практическая значимость. В результате проведения комплекса исследований разработаны и предложены к внедрению:

методики качественного и количественного анализа биомассы сине-зеленой микроводоросли БрциНпа р1а1епз!.ч (проект ФСП принят к рассмотрению Фармакопейным комитетом, письмо №29-251/1813 от 23.03.99);

методики качественного и количественного анализа препарата «Растоспир» (проект ФСП направлен на рассмотрение в Фармакопейный комитет, письмо №575 от 15.12.01);

методики качественного и количественного анализа- препарата «Лороспир гель» (проект ФСП направлен . на рассмотрение в Фармакопейный комитет, письмо №576 от 15.12.01).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на II Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 1999); научно-практической конференции «Современные тенденции развития фармации» (Самара, 1999); международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000); VII, VIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва 2000, 2001); региональной конференции «Достижения проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики» (Курск, 2001); IV Международном симпозиуме «Новые ¡к нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001); Первом губернском съезде врачей, посвященном 150-летию Самарской губернии (Самара, 2001), научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы» (Пермь, 2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.

Связь задач исследования с планом НИР. Диссертационная работа выполнена в соответствие с тематикой научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ государственной регистрации темы 0199.0007535) и тематикой Проблемной комиссии по фармации № 36.08 РАМН, МЗ РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты экспериментальных исследований по обоснованию составов, технологии и показателей качества лекарственного препарата на основе биомассы спирулины - гель «Лороспир». комбинированного препарата на основе биомассы спирулины и плодов расторопши- «Растоспир».

2. Данные исследований по разработке методических подходов к стандартизации сырья и препаратов биомассы спирулины.

3. Результаты исследований по разработке методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов спирулины.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 176 страницах, содержит 38 таблиц, 19 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 181 источник, из которых 72 на иностранных языках.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований биомассы спирулины, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава и стандартизации данного сырья, фармакологических свойств и применению в медицинской практике.

В главе 2 представлена характеристика объектов исследования -биомассы спирулины. Приведены методики фитохимического, технологического, биофармацевтического изучения лекарственных препаратов, контроля их качества.

В главах 3-5 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по созданию новых лекарственных препаратов на основе биомассы спирулины, разработке методик качественного и количественного анализа.

В приложение вынесены материалы по разработке нормативной документации (фармакопейные статьи предприятия).

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах, на рисунках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования Объектом исследования являются биомасса спирулины (5'р^гиНпае Ыотазза), культивируемая в закрытых стерильных фотореакторах на среде Зарруко. Были использованы плоды расторопши пятнистой (8уПЬит тапапит (Ь.) СаегШ.); вспомогательные вещества: глицерин (ФС 42-220284), аэросил (ГОСТ 14922-77), ареспол (ТУ 2219-005-29053342-97) и другие, соответствующие требованиям действующей нормативной документации.

В диссертационной работе использованы следующие методы исследования: метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) - для изучения фракционного состава белков и изоферментного спектра ключевых оксидоредукгаз биомассы спирулины; методы колоночной, тонкослойной хроматографии, спекгрофотометрии в УФ и видимой области спектра - для идентификации и количественного определения биологически активных веществ биомассы спирулины, плодов расторопши пятнистой и лекарственных препаратов на их основе; метод газо-жидкостной хроматографии - для определения остаточных органических растворителей; метод ротационной вискозиметрии - для изучения структурно-механических свойств гелей с биомассой спирулины на различных основах;

микробиологический метод - для определения микробиологической чистоты лекарственных препаратов.

Изучение фракционного состава белков и молекулярных форм оксидоредуктаз при культивировании биомассы спирулииы

Биомасса спирулины культивируется промышленным способом в условиях, в которых одновременно протекают анаэробные и аэробные процессы, поэтому для изучения были выбраны следующие ферменты -ключевые оксидоредуктазы: лактатдегидрогеназа (ЛДГ) - фермент анаэробного метаболизма, малатдегидрогеназа (МДГ) - фермент цикла трикарбоновых кислот, глутаматдегидрогеназа (ГДГ) - ключевой дезаминирующий фермент метаболизма белков и аминокислот.

з Л 1 г л е

А - 3-х дневная культура;

а, б, в - 3-х дневная культура; Б - 4-х дневная культура,

г, д, е - 4-х дневная культура.

Рис. 1. Электрофореграммы белков Рис. 2. Денситограммы белков биомассы спирулины биомассы спирулины

Результаты исследований количественного содержания белка в биомассе спирулины показали, что определенные колебания наблюдаются в течение всего периода культивирования биомассы и стабилизируются на 4-5

день, количество белка составляет 38±4% без учета структурного и щелочерастворимого белка,

Исследования биомассы спирулины методом электрофореза в ПААГ показали наличие 6-10 белковых фракций (рис. 1, 2). Относительное содержание белка каждой фракции изменяется в течение 24 часов, что свидетельствует об интенсивности метаболических процессов в культуре.

Изменения фракционного состава белков в биомассе спирулины обусловлены синтезом молекулярных форм ферментов в зависимости от возраста культуры, что подтверждается результатами исследований молекулярных форм ЛДГ, МДГ и ГДГ.

Использование параметра зависимости степени гетерогенности вышеуказанных дегидрогеназ от сроков культивирования в сочетании с данными о фракционном составе белка позволяет определить возраст культуры. Определение возраста и сроков созревания культуры только по содержанию биомассы в единице объема среды культивирования мы считаем нецелесообразным, поскольку данный показатель -достигает относительно постоянной величины 1,5-1,6 г/л на 4-5 день, далее практически не меняется в течение 1 -1,5 месяцев.

Исследования по стандартизации биомассы спирулины

При разработке методик качественного и количественного анализа биомассы спирулины за основу взяты подходы к стандартизации, которые позволяют объективно оценить качество биомассы и идентифицировать ее от других хлорофиллсодержащих видов лекарственного растительного сырья.

Предложена схема выделения из биомассы спирулины каротиноидов, хлорофилла и фикоцианина, основанная на их различной растворимости в органических растворителях и воде. В ходе экстракции высушенной биомассы спирулины ацетоном извлекается липофильная фракция, в состав которой входят каротиноиды и хлорофилл. Из биомассы спирулины после

экстракции ацетоном, получают водное извлечение, содержащее фикоцианин и водорастворимые белки. ' : ■

Разработана методика ТСХ-анализа каротиноидов и хлорофилла: выбраны оптимальные условия хроматографирования, позволяющие эффективно разделять и идентифицировать данные соединения. В результате проведенных экспериментов с различными хроматографическими системами предпочтение было отдано системе хлороформ-этанол 19:1. На хроматограммах1 обнаруживается доминирующее пятно желтого цвета с величиной Яг около 0,8 (Р-каротин) и пятно зеленого цвета с величиной Иг около 0,9 (хлорофилл А).

№

Л >1 К,..,

| И , <* И <, ..........•■•

-"'I• , ( '11 ? ■ ................;

I ' ............;..................

'300 330 ЯГО ?50 5ОТ 550 ИТ пш

оьи

Рис. 3. Спектр поглощения водного экстракта из биомассы спирулины

Для идентификации фикоцианина предложен

спектрофотометрический метод - обнаружение характерного максимума поглощения при 620+2 нм. Выбор данного максимума обусловлен способом выделения фикоцианина, т.к. присутствующие в водном экстракте водорастворимые белки значительно поглощают в УФ-области и максимум при 320 нм не является характерным (рис. 3).

В некоторых литературных источниках отмечают существование зависимости между значением рИ водного раствора фикоцианина и положением максимумов в спектре поглощения. Полученные данные -спектры фикоцианина при различных значениях рН, свидетельствуют об отсутствии такой зависимости. При изменении рН от 2,0 до 9,0 изменяется лишь интенсивность максимума при 620 нм.

По критерию вклада в фармакотерапевтический эффект для количественного анализа были выбраны две группы биологически активных соединений биомассы спирулины: каротиноиды и белки.

Выбор экстрагента при выделении каротиноидов определяется свойствами каротиноидов, а также характером сырья. Установлено, что ацетон при сравнительно небольшом выходе экстрактивных веществ обеспечивает максимальное извлечение каротиноидов (94,0 мг%) в ряду исследованных экстрагентов — хлороформ, гексан, смеси гексан-ацетон, гексан-хлороформ в различных соотношениях.

Рис. 4. Спектр поглощения ß-каротина, выделенного из биомассы спирулины (А) и PCO ß-каротина (Б)

Экстракцию из биомассы спирулины проводили ацетоном, выделенные каротиноиды переводили в слой н-гексана. Полученный гексановый раствор подвергали хроматографической очистке на оксиде алюминия 2 степени активное™ по Брокмаиу, обеспечивающей отделение пигментов, поглощающих при значении аналитической длины волны 450 нм. Объективным критерием полноты очистки считали идентичность спектров поглощения гексанового раствора после очистки и спектров поглощения рабочего стандартного образца (PCO) ß-каротина (ВФС 42-2625-95) (рис. 4).

Расчет количественного содержания ß-каротина проводили двумя способами: с использованием PCO калия бихромата и по удельному показателю поглощения ß-каротина в н-гексане при длине волны 450 нм. Величина удельного показателя поглощения составила 2773. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет ±3,83% - с использованием удельного показателя поглощения; ±5,05% - с использованием PCO калия бихромата.

В водном извлечении из биомассы спирулины после экстракции ацетоном определяли белок биуретовым методом, т.е. фактически анализировали общее количество водорастворимого белка, в качестве аналитической длины волны выбрано значение 540 нм. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,31 %.

Для количественного определения фикоцианина разработана спектрофотометрическая методика. Изучены факторы, влияющие на экстракцию фикоцианина, получен PCO, определена величина удельного показателя фикоцианина при 620 нм в 0,1 М фосфатном буфере 8,97, который использовался при расчетах результатов количественного определения. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет ±3,37%.

• Анализ 5 серий образцов биомассы спирулины, заложенных на хранение, проведенный с использованием предложенных методик показал, что' нижний предел содержания р-каротина в биомассе спирулины составляет 40 мг%, а содержание белка - 30%. Также были определены другие числовые показатели биомассы спирулины, представленные в таблице 1.

Таблица 1

Показатели качества биомассы спирулины

№ п/п Показатель качества Нормируемое значение

1 2 3

1. Внешние признаки Цельное сырье. Порошок с размерами частиц 1-2 им или пластинки 3-6 ым голубовато-зеленого цвета, своеобразного запахй и специфического вкуса. Измельченное сырье. Порошок культуры, проходящий сквозь сито с отверстиями диаметром 0.5 мм. Цвет голубовато-зеленый. Запах своеобразный. Вкус специфический

2. Микроскопия Размер клеток 6-8 мхм в ишр;и:у и 2-6 мкм в длину, которые образуют регулярные нити (спирали) размером от 35 до 50 мк-м. имеющие голубовато-зеленый цвет.

3. Подлинность Пятна желтого цвета с Яг около 0,8 ф-каротин), зеленого цвета с Кг около 0,9 (хлорофилл); Максимум поглощения прн б20±2 ны (фикоцканин)

4. Количественное определение Р-каротина не менее 40 мг%; Белка ке менее 30%.

5. Потеря в массе при высушивании Не более 10%

6. Зола общая Не более 9%

7. Зола, нерастворимая в 10 хлористводородной кислоте Не более 2% (для цельного и измельченного сырья)

8. Частиц, не проходящих сквозь сиго 0.5 мм Не более 5% (для измельченного сырья)

9. Частиц, проходящих сквозь сито 0,1 мм Не более 10% (для измельченного сырья)

10. Номинальная масса 30 г (±3%), 50 г (±3%), 100 г (±3%) (для фасованного сырья)

И. Микробиологическая чистота Категория 4Б

На основании результатов изучения стабильности биомассы спирулины при хранении установлен срок годности 2 года.

Разработка состава, технологии и стандартизация дозированного порошка «Растоспир» Сырьем для производства данного препарата является биомасса спирулины (Вюта.ыа 8р1'гиИпае рШеп.нх), культивируемая закрытым способом НПП «Поиск» (г. Самара), плоды расторопши пятнистой обезжиренные в порошке (Ртсшз 5)7уЫ тапат йеИр1йи^ риЬегаШ), получаемых экстракционным способом в ходе производства масла расторопши (ООО «Золотой корень», г. Самара).

Препарат предложен в виде дозированного порошка. На основании результатов изучения влияния различных композиций биомассы спирулины и порошка плодов расторопши обезжиренного на показатели, характеризующие функцию печени: активность аланинаминотрансферазы (АлаТ), щелочной фосфатазы крови (ЩФ), общее содержание триглицеридов в крови и печени, при токсическом гепатите у крыс, выбрано массовое соотношение указанных компонентов 20:80.

Таблица 2

Технологические свойства биомассы спирулины, порошка плодов

расторопши пятнистой обезжиренного и препарата «Растоспир»

Показатель Биомасса спирулины Плоды расторопши «Растоспир»

Сыпучесть -10°, кг/с 3,92±0,2 7,14±0,5 7,20+0,4

Угол естественного откоса, в градусах 40+4 29+3 32±2

Насыпная масса, кг/см3 515±19 487±23 499+12

Пористость, % 57±1 55+1 55±1

Влажность, не более % 10 7 10

Размер частиц, мм 0,5 1 1

Для разработки параметров получения дозированного порошка «Растоспир» изучены технологические свойства порошков биомассы спирулины и плодов расторопши обезжиренных (табл. 2).

Технологическая схема включала следующие стадии:

1. Собранные в стадии полной зрелости и высушенные плоды расторопши пятнистой, соответствующие требованиям ВФС 42-3380-99, измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм;

2. Порошок плодов расторопши обезжиривали в замкнутом цикле с помощью сжиженного газа хладон-12, контролировали содержание остаточных органических растворителей.

3. Просеивание порошков биомассы спирулины (диаметр отверстий сита 0,5 мм и 0,2 мм) и плодов расторопши пятнистой обезжиренных (диаметр отверстий сита 1 мм и 0,2 мм).

4. Порошок биомассы спирулины и обезжиренных плодов расторопши пятнистой смешивали в соотношении 1:4 в смесителях до получения однородной массы.

5. Фасовку готового порошка осуществляли с использованием фасовочной машины ФМ-3 с весовым дозатором.

А

г

» т

Рис. 5. УФ-спекгр спиртового экстракта препарата «Растоспир»

Для определения подлинности препарата «Растоспир» предложены спектрофотометрия: максимум поглощения спиртового экстракта при 289 нм (флаволигнаны плодов расторопши) (рис. 5); максимум поглощения водного

экстракта препарата при 620 нм (фикоцианин) и метод ТСХ (каротиноиды, хлорофилл биомассы спирулины - система хлороформ - этанол 19:1; флаволигнаиы плодов расторопши - система углерод четыреххлористый -ацетонитрил 6:4).

Для количественного определения в препарате «Растоспир» выбраны Р-каротин биомассы спирулины и сумма флаволигнанов плодов расторопши. Ошибка единичного определения методики количественного определения р-каротина в препарате «Растоспир» с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,37%, суммы флаволигнанов (в пересчете на силибин) - ±5,31%.

Таблица 3

Показатели качества препарата «Растоспир»

№ п/п Показатель качества Нормируемое значение

1 2 3

1. Описание Зеленовато-коричневый порошок со специфическим орехово-грибным запахом. Вкус порошка горьковатый, вяжущий.

2. Микроскопия Должны быть видны клетки, которые образуют спирали размером от 35 до 50 мкм зеленовато-голубого цвета. Обрывки перикарпия, состоящие из слоя кутикулы и эпидершльного слоя, представленного палисадно вытянутыми клетками.

3. Подлинность Пятна желтого цвета с Яг около 0,8 (|3-каротин); зеленого цвета с Кг около 0.9 (хлорофилл); Максимы поглощения при 620±2 нм (фикоцианин); Максимум поглощения при 289±2 ни (флаволигнаны); Пятно фиолетового вдета с Яг около 0,8 (силибин) в УФ-свете,

4. Потеря в массе при высушивании Не более 10%

5. Отклонения в массе порошков 3 г (±3%)

6. Количественное определение р-каротина не менее 5 мг%; Суммы флаволигнанов в пересчете на силибин не менее 2,0 %.

7. Микробиологическая чистота Категория 4Б

Анализ 5 серий препарата «Растоспир» показал, что нижний предел содержания р-каротина в препарате составляет 5 мг%, а содержание суммы флаволигнанов в пересчете на силибин - 2,0%. Также определены другие показатели качества препарата, представленные в таблице 3.

На основании результатов изучения стабильности препарата «Растоспир» при хранении установлен срок годности 3 года.

Разработка состава, технологии и стандартизация геля для

оториноларингологической практики «Лорослир» Обоснование состава лекарственных средств на основе биомассы спирулины включало экспериментальный выбор оптимальной концентрации биомассы спирулины и состава вспомогательных веществ.

Концентрация биомассы спирулины в геле 1% выбрана в результате биофармацевтических исследований по критерию высвобождения комплекса биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью, в агаровые пластинки.

-Анализ данных позволил сделать вывод о целесообразности использования гидрофильных основ (основ ареспола, аэросил-глицериновых), как наиболее приемлемых в терапии состояний, главным патогенетическим механизмом которых является воспалительный процесс. Были приготовлены композиции на аэросилглицериновой основе с содержанием аэросила 3-10% и на основе ареспола с концентрацией последнего 0,5-3%, установлено, что их вязкость увеличивается прямо пропорционально концентрации полимера в лекарственной форме.

При введении 5% аэросила или 1% ареспола образовывались вязкие гели мазеобразной консистенции, удовлетворяющие предъявляемым к ним требованиям оптимума консистенции для гидрофильных мазей. Для дальнейших исследований выбраны, составы представленные в таблице 4.

Таблица 4

Состав образцов геля «Лороспир»

Состав и содержание действующих веществ, г Основа ареспола, г Аэроснлглицерикозая основа, г

Биомассы спирулины -1,0 Основы - до 100,0 Ареспола - 1,0 Натрия гидроксида (до рН 6,0-7,0) -1,0 Глицерина — 60,0 Воды очищенной до 100,0 Аэросила - 5,0 Глицерина - 70,0 Воды очищенной до 100,0

Изучение структурно-механических свойств геля «Лороспир» проводили путем оценки ряда реологических параметров: касательного напряжения сдвига, эффективной вязкости, механической стабильности, коэффициентов динамического разжижения (табл. 5).

Таблица 5

Реологические параметры геля «Лороспир»

Основа Диапазон эффективной вязкости при скорости сдвига 0,33-145,8с'1, Пас Эффективная вязкость при 9,00 с"1, 20 С, Пас Касательное напряжение сдвига, Пз Коэффициенты динамического разжижения, /о

К,, К<12

Основа ареспола 32,54-0.41 4,03 36,27 33,93 68.37

Аэроснл-глицерин. основа 108,03-1,07 10,35 93,15 34,78 77,03

Значения эффективной вязкости при скорости сдвига 0,33-145,8 с"1 геля «Лороспир» на основе ареспола и аэросилглицериновой основе полностью укладываются в границы реологического оптимума консистенции для гидрофильных мазей. В процессе эксперимента обнаружено, что при увеличении скорости сдвига с 0,33 с"1 до 145,8 с"1 наблюдается падение вязкости геля «Лороспир» на основе ареспола в среднем в 80 раз, на аэросилглицериновой основе - в 100 раз.

По рассчитанным значениям эффективной вязкости геля «Лороспир» строили графики зависимости вязкости от скорости сдвига в логарифмических координатах, которая обратно пропорциональна и характеризует гель как структурированную систему (рис. 6).

Для определения тиксотропных свойств геля «Лороспир» изучена зависимость касательного напряжения сдвига от скорости сдвига (рис. 7).

Установлено, что исследуемая лекарственная форма обладает слабыми тиксотропными свойствами, которые характеризуют хорошую намазываемость на слизистую и способность к выдавливанию из туб, указывают на высокую стабильность систем.

In V ,

¿0 ■

. 2 1

0<-1—4-1-•-1-1-1-1-1-1-1 «...

12 3 4s In»

i - на основе ареспола; 2 - на азросил-глицериновой основе

Рис. 6. Логарифмическая зависимость эффективной вязкости геля «Лороспир» от скорости сдвига

Особый интерес при проведении реологических исследований представляют наблюдения за изменением структурно-механических свойств гелевых систем в двух диапазонах скорости деформирования (Dr): 3,0-5,4 и 27,00-145,8 с"1, так как первый в среднем соответствует реальной скорости движения ладони пациента по поверхности слизистой при нанесении, а второй соответствует в среднем скоростям технологической обработки геля. Как видно из таблицы 5, коэффициенты динамического разжижения геля «Лороспир» достаточно высоки (К<п = 33,93, К©. = 68,37 на основе ареспола и Kd, = 34,78, Кц = 77,03 на аэросил-глицериновой основе), что обеспечивает более качественное диспергирование внесенных в основу субстанций и разжижение в режиме перемешивания, более качественное нанесение пациентами, а также облегчает заполнение туб или банок на стадии фасовки готовой продукции.

Базируясь на данных исследования реологических характеристик гелевых основ и в соответствии с общепринятыми правилами приготовления мазей с учетом физико-химических свойств лекарственной субстанции и вспомогательных веществ разработана технология получения геля «Лороспир» на аэросилглицериновой и основе ареспола.

S SO ?5 1Р0 125 150 175

1 - на основе ареспола; 2 - на аэросилглицериновой основе

Рис. 7. Реограмма течения геля «Лороспир

Стандартизацию геля «Лороспир» осуществляли в соответствии с принципом унификации методов анализа в ряду лекарственное сырье -. фитосубстанция - лекарственная форма.

Анализ 5 серий геля «Лороспир» показал, что нижний предел содержания Р-каротина составляет 3 мг%. Также были определены другие показатели качества препарата, представленные в таблице 6.

Таблица 6

Показатели качества геля «Лороспир»

№ п/п Показатель качества Нормируемое значение

1 2 3

1. Описание Однородная мазеобразная масса темно-зеленого цвета со своеобразным запахом.

2. Микроскопия При рассмотрении образца геля под микроскопом видны нити размером от 35 до 50 мкм.

3. Подлинность Штиа желтого цвета с Яг около 0,8 (Д-каротия); зеленого цвета с Кг около 0,9 (хлорофилл); Максимум поглощения при 620±2 нм (фикоциания).

4. Количественное определение р-каротшга в препарате должно быть не менее 3 мг%

5. рН 6.0-7,0

6. Размер частиц Не более 0,5 мм

7. Номинальная масса 10 г (±5%), 15 г (±5%)

8. Потеря в массе (высыхаемостъ) Не более 5%

8. Микробиологическая чистота Категория 2

На основании результатов изучения стабильности геля «Лороспир» при хранении установлен срок годности 2 года.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Экспериментально обоснована целесообразность оценки фракционного состава белков и изоферментного спектра ключевых оксидоредуктаз (лактат-, малат-, глутаматдегидрогеназы) биомассы спирулины методами электрофореза в полиакриламидном геле с целью определения оптимального срока созревания культуры спирулины в закрытых фотобиореакторах при заданных условиях культивирования.

2. В результате изучения химического состава биомассы спирулины экспериментально обоснованы методические подходы к стандартизации

сырья и препаратов на ее основе, для оценки качества биомассы спирулины предложено определение р-каротина (не менее 40 мг%), фикоцианина, общего белка (не менее 30%).

3. В соответствии с предложенными подходами к стандартизации биомассы спирулины разработаны методики качественного и количественного анализа Р-каротина, фикоцианина, общего белка.

4. С использованием разработанных методик анализа изучена стабильность биомассы спирулины в ходе хранения, установлен срок годности, который составил 2 года.

5. На основании фотохимических, доклинических, технологических исследований обоснованы лекарственная форма, оптимальный состав, рациональная технология комплексного гепатопротекторного препарата на основе биомассы спирулины и плодов расторопши пятнистой «Растоспир», определены показатели качества: содержание Р-каротина не менее 5 мг%, содержание суммы флаволигнанов в пересчете на силибин не менее 2,0%.

6. На основании - биофармацевтических, технологических исследований установлена оптимальная концентрация биомассы спирулины и состав гидрофильных основ геля противовоспалительного, регенирирующего действия для оториноларингологнческой практики «Лороспир», определены показатели качества: размер частиц (не более 0,5 мм), рН водного извлечения (в пределах 6,0-7,0), Р-каротина не менее 3 мг%.

7. Разработаны методики качественного и количественного анализа дозированного порошка «Растоспир», геля «Лороспир».

8. Установлены сроки годности, составившие для дозированного порошка «Растоспир» 3 года и для геля «Лороспир» - 2 года.

9. По результатам проведенных исследований разработаны проекты ФСП: «Спйрулины биомасса», «Растоспир», «Лороспир» гель».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Spirulina platensis - экопротектор антноксидантного действия и ее стандартизация / C.B. Первушкин, A.A. Сохииа, A.B. Воронин // Сб. мат. межунар. научно-практ. конф. «Экология и жизнь». - Пенза, 1999. - С. 2022. * . •

2. Влияние условий культивирования на образование витаминов мнкроводорослъго Spirulina platensis / C.B. Первушкин, И.Ф. Шаталаев, A.B. Воронин И Сб. мат. II межунар. научно-практ. конф. «Экология и жизнь». - Пенза, 1999. - С. 121.

3. Спектрофотомегрический анализ пигментов Spirulina platensis /-■ C.B. Первушкин, И.Ф. Шаталаев, A.B. Воронин // Тезисы докл. научно-практ. конф. «Современные тенденции развития фармации». - Самара, 1999. - С. 91-92.

4. Методические подходы в изучении оксидоредуктаз в культуре микроводоросли Spirulina platensis / И.Ф. Шаталаев, A.B. Воронин, C.B. Первушкин // Сб. мат. Всеросс. научно-практ. конф. «Лабораторное дело: организация и методы исследований» - Пенза, 1999. - С. 42-43.

5. Закрытый способ культивирования биомассы Spirulina platensis / C.B. Первушкин, МО. Тархова, A.B. Воронин// VII Рос. нац., конгр. «Человек и лекарство». Тез. докл. - M., 2000. - С. 463.

6. Изучение фракционного состава белков микроводоросли Spirulina platensis / A.B. Воронин, C.B. Первушкин, A.A. Сохина // IV Междунар. симп. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». -M., 2001.-Т. III.-С. 436-438.

7. Количественный анализ пигментов микроводоросли Spirulina platensis / C.B. Первушкин, A.B. Воронин, A.A. Сохина // Там же. - T. II. - С. 382384.

8. Исследования по созданию геля ранозаживляющего, антимикробного и противовоспалительного действия / A.A. Сохина, C.B. Первушкин, A.B. Воронин // Сб. мат. конф. «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики». - Курск, 2001. - С. 156-157.

9. Исследования по стандартизации биомассы Spirulina platensis / C.B. Первушкин, A.B. Воронин, A.A. Сохина//Там же. - С. 216-217.

10.Исследования по разработке лекарственного средства «Растоспир» гепатопротекторного, антноксидантного и иммуномодулирующего действия / C.B. Первушкин, A.A. Сохина, A.B. Воронин // Там же. - С. 218-219.

1 ¡.Первушкин C.B. Исследования по созданию капель для ЛОР-практики на основе Spirulina platensis / C.B. Первушкин, A.B. Воронин, A.A. Сохина // VIII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». Тез. докл. - М., 2001. - С. 601-602.

12.Первушкин ■ C.B. Метод количественного анализа хлорофилла и каротиноидов микроводоросли Spirulina platensis / C.B. Первушкин, A.B. Воронин, И.Ф. Шаталаев // Там же. - С. 703.

13.Исследования по разработке фитопрепарата гепатопротекторного действия / A.B. Воронин, C.B. Первушкин, A.A. Сохина // Первый Губернский Съезд Врачей. Сб. тезисов и статей. - Самара, 2001. - С. 112113.

14. Новый фитопрепарат для ЛОР-практики / C.B. Первушкин, A.A. Сохина, A.B. Воронин//Там же. - С. 371-372.

15.Первушкин C.B. Стандартизация биомассы спирулины / C.B. Первушкин, A.B. Воронин, A.A. Сохина // Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы. Мат. научно-пракг. конф. -Пермь, 2001.-С. 132-133.

16. Количественное определение фикоцианина в биомассе спирулины / C.B. Первушкин, A.B. Воронин, A.A. Сохина// Фармация. -2001. - Т.50, №5. -С. 16-17.

17.Экопротектор биоантиоксидантного действия - подходы к стандартизации / C.B. Первушкин, М.О. Тархова, A.B. Воронин // Труды VII Всерос. конгр. «Экология и здоровье человека». - Самара, 2001. - С. 127-128.

18. Методики идентификации различных пигментов и количественного спекгрофотометрического определения суммарного содержания каротиноидов и белка в фитомассс Spirulina plaiensis (Nords.) Geilt. / C.B. Первушкин, В.А. Куркин, A.B. Воронин //Раст. ресурсы. - 2002. - Т. 38, вып. 1.-С. 112-119.