Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование и аналитический контроль сырья и лекарственных средств, содержащих алкалоиды спорыньи эрготоксиновой группы

На правах рукописи

рГБ ОД

* 4 АПР ¡р" ~

КОНПРОВА ЕЛЕНА ЛЕОНИДОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ И АНАЛИТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ сырья И ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ. СОДЕРНАШ АЛКАЛОИДЫ

спорыньи эрготоксиновои группа

19.00.02. - фармацевтическая хиния и фармакогнозия

Автореферат на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Носква-199$ г.

Работа выполнена в Научно-производствзннон объединении "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" (НПО "ВИЛЙР").

Официальные оппоненты:'

доктор фармацевтических наук Костенникова З.П. доктор фармацевтических наук, профессор' Прокофьева В,И.

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский химико-фармацевтический институт им. Серго Ордноникидзе (ВНИХФИ)

Защита ссстоится "М."-Ш&ЫзА___1995 г. в "Й^часов на заседании Диссертационного Совета Д 074.28.01 при Научно-исследовательском институте фармации (117418, г.Москва. ул.Красикова. 34).

Научные руководители:

доктор химических наук. ' профессор Толкачев О.Н.

доктор Апологических наук Наин С.С.

С диссертацией монно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института фармации.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета (Д 074.28.01) кандидат фармацевтических наук,

•стариий научный сотрудник Л.М.Боброва

обцая характеристика работы

Актуальность темы. Алкалоиды эрготоксиновой группы (с( -эргокриптин, /6 -эргокриптин. эргокристин и эргокорнин), со-дераациеся а рожках спорыньи, обладают высокой фармакологической активностью и аироко используются в медицинской практике. Известный лекарственный препарат Парлодел С2-бром- о< -зргокриптина мезилат) незаменим при лечении заболеваний, связанных с нейрогорнональныыи наруианиями: акромегалия, галакторэя, аменорея, болезнь Паркинсона, лечение бесплодия, некоторые гормональнозаБисимые опухоли и др. До настоящего времени времени аналогов ему не было.

Разработанный в НПО "ВИЛАР" новый оригинальный препарат Абергин - это первое отечественное лекарственное средство по действию соответствующее Парлоделу. Абергин (сумма 2-бром-^- и 2-бром-,^-эргок-риптиноэ мвзилатов> успевно прошел клинические испытания, показав более продолвительное лечебное воздействие по сравнению с Парлоде-лом и с 1993 г разреяен к применении как дофаминэргическое средство.

Исследовательские работы, связанные с поиском новых препаратов на основе зргоалкалоидов, в том числе разработка технологии производства, стандартизация лечебных средств, селекция итаммов спорыньи перспективных для создания новых лечебных средств содерзащих алкалоиды эрготоксиновой группы и т.д.,- требуют всестороннего аналитического обеспечения работ.

Представленная работа является аналитической частью общих исследований, связанных с разработкой препарата "Абергин", а такае изучением сырья - различных втамиов эрготоксиновой спорыньи.

Цель работы. Цельи настоян^ исследований является разработка методик качественного и количественного определения алкалоидов эрготоксиновой группы. стандартизации нового лечебного средства Абергин и аналитического обеспечения технологии его производства. а такае изучения алкалоидного состава в различных селекционных и дикорастущих штаммах спорыньи.

Основные задачи работ ы.Для достияения поставленной цели необходимо:

- выбрать достоверные аналитические методы качественного и количественного определения алкалоидов эрготоксиновой группы:

- изучить хроматограрческое поведение зргоалкалоидов при использовании методов ТСХ и ВЭВХ, подобрать уг -овия разделения и «етоды детекции зргоалкалоидов при анализа методом ТСХ;

- изучить спектральные характеристики зргоалкалоидов методами

ИК-. УФ-, ЯНР-спвктроскопии и подобрать условна анализа:

- разработать методики определения содержания примесей в технических полупродуктах и лекарственном препарате Абергин;

- разработать ВФС на лекарственное вещество и таблетки йбергина:

- разработать методики определения соотновения эргокриптинов в техническом и готовом продуктах, обеспечивавцих контроль различных стадий технологии производства йбергина. стандартизации препарата и исследования направления химических реакций:

- разработать методики анализа компонентного состава смеси алкалоидов эрготоксиновой группы в различных субстанциях и «таймах спорыньи, получаемых в процессе селекции и испытания новых втаммов:

Научная новизна. При изучении зависимости хромато-графического поведения зргоалкалоидов от применяемых в условиях ТСХ систем растворителей и сорбентов разработаны условия (пластинки "Сорбфил"; система:дихлорметан-диоксак-петролейный эфир 70-100"-аммиак), позволявшие достичь оптимального внутригруппового разделения 2-бром-о< - и 2-бром-^-эргокриптинов и родственных ив примесей. На основе химических реакций зргоалкалоидов, в т.ч. окисления и термолиза, разработаны методики детекции на тонкослойных пластинках (пластинки "Сорбфил"- 43! раствор хлорамина-Б: пластинки "Силуфол" -активный хлор), позволиввие достичь минимальных пределов обнаружэ-.ния эргоалкалоида в пятне около 0,075 мкг и 0,005 мкг соответственно. На основании полученных данных разработаны методики определение примесей в препарате Абергин и его полупролуктах методом ТСХ.

В процессе изучения направления разложения йбергина в растворах с различными значениями pH выявлены закономерности!первоначально происходит изменение зргопептинов с образованием С8-эпииеров,12'-0СНз-производных, деструкция вещества начинается с распада по пептидной части молекулы: методом сканирования обнаружено, что скорость и направление деструкции З-бром-л-зргокриптина и 2-бром-4 -эргокриптина одинаковы), положенные в основу аналитических исследований, связанных с разработкой методик анализа препарата и его полупродуктов.

При изучении зависимости хроматографического поведение зргоалкалоидов. их 2-бром-производных, С8-зпимеров и родственных примесей от применяемых в условиях В32Х параметров хрокатографирования подобраны условия (злвент, скорость потока и др.) положенные в основу методики определения примесей в Абергине и его полупродукте. Установлены- оптимальные параметры В38Х на хроматографе 'Иилихром' (критерий разделения, коэффициент линейности детектора и др.), на осио-еанки которых разработана методика определения соотновения зргоал-калоиаав в йбергине. покаэаввая. что 2-6ром-,<- и З-брои-yg-зрго-

криптины содераатся в препарате в примерно эквимолярной пропорции.

Нетодом ЯМР выявлены характеристические сигналы протонов алкалоидов эрготоксиновой группы (протоны ОН-. NH-пептидной и NH-индоль-ной группировок), от использования различных растворителей обнару-аена зависиность располонения перечисленных сигналов в Ц-ЯМЧ-спек-трах (результат сольватации эргоалкалоидов в растворах), что явилось основой оригинальной методики (по располоаении отдельных сигналов в ^Н-ЯУР-спэктрах растворов в сиэси бензол-хлороформ 7:1), позволивией вести прянув идентификации алкалоидов эрготоксиновой группы в смеси и одновременно определять их соотноиение.

Определен методом ЯМР алкалоидный состав 10 селекционных и дико-растуцих итамиов спорыньи, на основании полученных данных селектирован высокопродуктивный эргокристиновый атамм (наилучший по показателям содернания целевого алкалоида и уроаайности), позволиваий создать снрьевув базу для разработки и освоения производства нового препарата на основе дигидроэргокристина.

Практическая значимость работ. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методика количественного определения 2-бром-<к- и ß -зргокриптина мезилата и тартрата. методика количественного определения абергина в таблетках (ВОС 42-2244-93 на йбергин, ВФС 42-2243-93 на таблетки Абергина. АКТ от 20.12.94 г. НПО ВЙЛАР):

- качественные характеристики очищенной суммы о< - и ß -зргокриптина (включены в ОПР на производство Абергина от 12.12.1992 г., АКТ от 27.12.94 г. ПЭЗ ВИЛЙР);

- показатели качества суммы о<- и^-эргокриптинов.как рабочего стандартного образца: методики определения подлинности,посторонних примесей, количественного содервания и др. '(СТП 84-10-39-47-93 "Сумма d- иp-зргокриптинов - PCO",АКТ от 28.12.94 г.ПЭЗ ВИЛЙР.НПО ВИЛАР);

- показатели качества лекарственного вечества Абергин и таблеток Абергина: методики определения подлинности, посторонних примесей, количественного содерианиа и др. (ВФС 42-2244-93 на Абергин, ВФС 42-2245-93 на таблетки Абергина^

- результаты анализа компонентного состава алкалоидоа зрготоксино-, вой группы в селекционных втаамах спорыньи методом ЯИР использованы э работах по селекции новых, высокопродуктивных птаммов спорыньи (АКТ от 27.12.94 г. НПО ВИЛАР):

- методики определения содервания примесей методами ТСХ и ВЭВХ. методики определения соотновениз эргокриптинов методами сканирования. B3IX и ЯМР (использованы в исследовательских работах при разработке нового лекарственного препарата Абергин, задииенного патентом РО

- 4 -

N 1801006, ЙКТ от 20.12.94 г. НПО ВИЛАР).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на научно-практической конференции "Экологическая патология и ее фармакокоррекция" (Чита,1991 г). Материалы ВФС на лекарственное вещество и таблетки йбергина рассмотрены Фармакологическим Государственным комитетов (Протокол N 20, заседание от 10.12.92), Комиссией по Фитопрепаратам ФК (Протокол N 8, заседание от 13.5,93) и утвервдены Фармакопейным комитетом для использования (ВФС 42-2245-93 и ВФС 42-2244-93 от 28.10.93 г).

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соотвествии с планом научно-исследовательских работ НПО "ВИЛАР" (номер государственной регистрации 01890043151) и ыенведомственного Совета по фармации N 4? АМНРО.

Публикации. Результаты работ опубликованы в 2 научных работах. 2 ВФС и защищены патентом РФ Н 1801006.

Основные пол о гения, выносимые на защиту:

- параметры хроматографического разделения эргоалкалоидов методом ТСХ и методики детекции эргоалкалоидов на тонкослойных пластинках:

- результаты изучения направления деструкции эргоалкалоидов; методики определения примесей в техническом и готовом продукте

методами ТСХ и В38Х, параметры хроматографического разделения эргоалкалоидов и их примесей методом ВЭШХ:

- результаты изучения спектральных характеристик алкалоидов эрго-токсиновой группы в зависимости от их строения и условий проведения анализа методами НФ-. ЯМР-спектроскопии и сканирования;

- методики качественного и количественного определения эргоалкалоидов в сырье, техническом продукте и лекарственном средстве Абергин:

- результаты изучения склероциев селекционных втанмов спорыньи -возмовных источников сырья для разработки и освоения производства нового лекарственного препарата на основе дигидроэргокристина;

Обьеы и структура диссертации. Диссертационная работа излоиена на 236 страницах мавинописного текста и состоит из введения, 'обзора литературы (Глава 1). обсунде-ния результатов экспериментов (Глава 2). экспериментальной части (Глава 3), выводов, списка литературы и приловения (35 страниц). В тексте имеется 31 таблица. 44 рисунка. Список цитируемой литературы содераит 21? источников, из которых 70 на русской языке и 147 на иностранных языках.

Во введении обосновавается актуальность тены, формулируется цель и задачи исследования, отмечены новизна и практическая значимость полученных результатов, а такае излозень основные полоаения, выносимые на защиту.

Глава 1 представляет собой обзор литературы, посвященный описании алкалоидов эрготоксиновой группы - сведения об их распространении в растительном мире, применение в медицине. Охарактеризованы строение и основные химические свойства зргопептинов, а такае наиболее распостраненные методы аналитического контроля. В Главе 2 - обсуадаится результаты:

- разработки методик количественного определения зргоалкалоидов а препарате Йбергин с использованием методов неводного потенциометри-ческого титрования и НФ-спектрофотометрии:

- разработки методик определения посторонних примесей с применение методом В32Х и ТСХ, определения оптимальных условий хроматографи-ческого разделения и детекции алкалоидов эрготоксиновой группы методом ТСХ, изучения направления разловения эргокриптинов;

- разработки методик определения соотнесения алкалоидов эрготоксиновой групп« в сырье, техническом и готовом продуктах с использованном методов сканирования, B3SX и 9UP;

- исследования методом ЯМР спектральных характеристик алкалоидов эрготоксиновой группы в зависимости-от применяемого в анализе растворителя и изучения алкалоидного состава селекционных эрготоксино-внх итаимоэ спорыньи;

- изучения ИК-спектров и показателя оптического вращения Абергина:

Глава подразделена на семь частей, в соответствии с содерванием репаемнх задач4

Глава 3 - экспериментальная часть содёраит описание используемых материалов, объектов исследования, аппаратуры и некоторых методик, разработанных в процессе проведения исследовательских работ.

В прилоиении вынесены утвераденные для применения методики анализа зргоалкалоидов и ВФС на йбергин и таблетки Абергина.

СОДЕРЮНИЕ РАБОТЫ

1. Определение количественного содернания зргоалкалоидов методом неводного титрования.

Метод неводного титрования.дает возмозность определения содерза-ния зргоалкалоидов по части молекулы, отвечавшей за биологическуп активность - остатку лизергиновой кислоты (Рис.1).

С^СНз ioi

АЛКАЛОИДЫ ЗРГ0Т0КСИН0В0Й ГРУППЫ; о<-ЭРГ0КРИП7ИН ( R= -CHj-CH-CHj)

0-ЭРГОКРИПТИН ( R= -СН-СгН5 )

сн3

ЭРГОКОРНИН ( R= -СН-СН5 )

сн3

ЗРГОКРИСТИН ( R= -CH2-C6Hs)

АБЕРГИН" - сумма 2-бром-е<-эргокриптина мезилата и 2-брои-/5 -эргокриптина иезилата

Рис.!

В процессе разработки препарата исследовалась возногность получения виннокислых солей и солей метансульфокислоти 2-брон- <* - и 2-бром-£-эргокриптинов, анализ которых вели методом потенционетри-ческого титрования в среде уксусная кислота-уксусный ангидрид (1:7) 0.1 Ы раствором хлорной кислоты. Ошибка единичного определения методик не превыиала +2.9Х (Таблица 1).

Метрологические характеристики методики количественного определения Абергина и 2-бром-е< и/з-эргокриптинов тартратов ОТ)

Образец п f X.Z S Р.Х tfP.f) ZE+

Абергин 6 5 98.85 0.81 95 2,571 2,08 2.1

ЭТ 10 9 87.63 1.14 95 2,262 2.54 2.9

Анализ бромэргокриптинов тартратов показал непостоянство состава получаемых субстанций. При определении содержания винной кислоты (метод неводного титрования в среде спирта - 0.05И иетанол-бензольт ниы раствором едкого натра) полученные данные не соответствовали расчетным - субстанция состава СэаНцоВгНбО^ * СцНцОб (М.м. 654.6 + 150,1 = 804,7) должна содервать около 18.72 винной кислоты, а при составе С52 Нц0 ВГН5О5 * 1/2 СчНц0с (Н.м.654.6 + 75.05 = 729.7) -10.32 винной кислоты (Таблица 2). Из-за возникшей в этом случае проблемы стандартизации виннокислых солей, разработка нового лекарственного средства была продолжена с получением солей метансуль-Фокислоты.Содервание метансульфокислоти определяли методом неводного потенциоыетрического титрования в среде 50% спирта 0,1 Н растворе:: едкого натрагСэаНчоВгЛ^Оу.» CH3SO4H (И.м.654.6 * 96.1 = 750.7). где содержание С^ОцН . должно составлять около 12.8%. Овибка еди-

Таблииа 1

ничного определения методики составила ± 2,8% (Таблицы 2, 3).

Таблица 2

Содервание действующего вещества, винной кислоты и метансульфо-кислоты в образцах эргокриптинов тартратов ОТ) и Абергина (АБ)

Номер Количественное Содервание Содервание метан-

серии содержание. X винной сульфокислоты. У.

образца (от Э? до 102 X) кислота, 'А (от 12.5 до 13,4)

ЭТ СН0В85 82.1 17,8

ЭТ СН0585 88.3 12,2

АБ 011288 99.5 12,90

АБ 021288 99,4 12.54

Таблица 3

Петрологические характеристики методики количественного определенна метансульфокислоты в лекарственной вецестве Абергин

п Г 1л Б Р Л <(Р.П ДХ! У.11

10 9 12.76 0.16 95 2,262 0,36 2.8

Разработанные мэтодики вкличэны в ВФС на лекарственное вецвство Абергин.

2. Анализ Абергина методом УФ-спектрофотоыетрии

Природные эргоалкалоиды иыеат УФ-спектры с ^ пах около 313 нм и Да1п около 270 на, что отравает сопрявение индольной части молекулы с двойной связыз в половении СЭ=С10 (Рис.2). На располовениэ пах и п1п УФ-спектра в основном влияет строение только лизергиновой части молекулы (9,Ю.-дигидропроизводные имеют спектр,характерный для других производных индола; 2-бром-производные иыепт размытый максимум в области 303 - 308 нм). что позволяет использовать метод при изучении продуктов деструкции и прогнозировать структуру неизвестных соединений.

УФ-спектры растворов в 502 спирте: Абергина (-); Нипагина (----);

«<-Зргокриптина С---9,10-Дигйдроэргокриптинов (......).

Содержание йбергина в лекарственной форме (таблетки йбергина по 0,004 г) определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 305 ни. Из семи компонентов, составляющих таблеточную массу, поглощение в ЗФ-свете имеет только нипагин. у которого при длине волни 305 нк поглощения не наблюдается (Рис.2). Оиибка единичного определения методики составила около ± 3,32 (Таблица 4).

Таблица 4

Петрологические характеристики методики количественного определения таблеток йбергина по 0,004 г

п Г Х*100 мг 5 п "ИР.П дХ± ±ЕХ

10 9 390 5,70 95 2,26 12,88 3,3

Достоверность методики и отсутствие систематической ошибки доказано опытами с добавками'и искусственными смесями.

Спектрофотометрический метод был использован такяе при изучении качества таблеток йбергина по тестам "Растворение" и "Однородность дозирования". ■ '

Одна из наиболее слоаных задач стандартизации Йбергина - это определение посторонних примесей. Зргоалкалоиды являются сильно лабильными соединениями, они легко окисляются, подвержены фотолизу,термолизу, быстро разлагаются при воздействии кислорода воздуха,света, в присутствие кислот, оснований,тявелых металлов и многих других факторов. Образующиеся продукты деструкции ыогут вызывать невелательную коррецию фармакологического действия препарата. Поэтому содервание примесей в препаратах с эргоалкалоидами строго регламентируется как в суммарном количестве, так и содервание кавдой отдельной примеси.

Повышенное содервание примесей в технической полупродукте (сумме и- и ^-эргокриптинов, предназначенной для бронирования) приводит к росту побочных реакций и уменьвенив выхода целевого продукта. Для определения содервания примесей нами применены методы ВЗЗХ и ТСХ.

3. Определение посторонних примесей методом ВЭ1Х .

При разработке метода ВВП была использована готовая методика, приспособленная для применения на месте производства препарата -ПЗЗ ВИДЙР, где подбор концентрации пробы, скорости потока и соотно-вения элвента проводился экспериментально, для достиешшя достаточного для проведения анализа отделения целевых эргоалкалоидов от сопутствующих примесей: хроматограф марки "Дюпон-бВгЗ'ЧСВй),колонка

- э -

- 250 х 4.S ма; сорбент - "Зорбакс С-8": элиент: метиловый спирт -0.01 а раствор карбоната аммония: скорость потока - 2 мл/мин; детекция в УФ-свете (254 нм); ввод пробы - 100 мкл (20 мкг): проба -0.22 раствор образца в метиловом спирте. При анализе технического полупродукта соотношение элвента составило 68:32, использовалось такие соотношение 65:35, при этом время удерживания отдельных соединений возрастало примерно в 2 раза. При анализе Абергина соотношение элвента составило 72:28. Отнесение пиков на хроматогранках проведено с использованием свидетелей: некоторых алкалоидов эрго-токсиновой группы и сумм примесей, полученных при очистке испытуемых образцов.

Время удераиааниа технического полупродукта (суммы <Л- и ß -зр-гокриптинов в виде одного пика) составило около 9,6 мин (Хроматог-ракыа А): время удераивания Абергина: сумма 2-бром-сС - и 2-бром-/3 -зргокриптинов наблпдается о видэ одного пика около 9,1 мин (Хрома-тограмма Б) (Рис.3).

Хроматограмма А Хроматограмма'Б

Содераание примесей определяли с помоаьи интегратора по плоиадям пиков. Полученные данные является относительными, т.к. не учтены иолекулярные масса и коэффициенты поглощения отдельных примесей ¡¡з-за отсутствия их полной идентификации.

Поэтому, при определения содерзания примесей в техническом полупродукте. показатели образца серии 20.04.86 бы--! приняты за стандартные. так как этот образец в процессе бронирования показал максимальный выход целевого продукта (Таблица 5).

9,1

Рис.3

Таблица 5

Характеристика технических продуктов Ссодераание алкалоидов.в X -определено методом неводного титрования)

Наименование испытуемого образца Описание (мелкокристаллический порошок) Потеря в массе при высушивании, У. Содер-аание алкал-идов, г Содержание примесей. г

вэах ТСХ

1.Серия 8.3.86 "Загрузка 6а" Светло-се- 16,7 рый с зеленым оттенком 80,3 более 25 более 13

2.Серия 16.12.85 "Сумма эргокрип-тинов.бензол." Белый с кремовых оттенком 2.4 89,5 около 6 около 2

3.Серия 24.3.86 "Загрузка 3" Светлот серый 13,5 78,5 более 20 более 12,5

4.Серия 24.3.86 "Загрузка 2" Светлосерый • 14,7 78.3 . около 13 около 12.5

5.Серия 20.04.86 "Сумма зргокрип-тинов,очищен." Белый с кремовым оттенком 4,2 88,2 около 5 около 2,9

При анализе Абергина,в связи с отсутствием стандарта,проводилось сравнительное определение суммы примесей методом ТСХ (Таблица 6).

Таблица 6

Результаты анализа образцов Абергина методом ВЗЕХ (содерванив примесей методом ТСХ по ВФС 42-1274-82 не превышает ЗУ.)

N серии Абергина Относительное содервание суммы примесей, в У.

1. 040687 2.2

2. 280587 0.8

3. 280287 2.4

4. 27028? 3,3

Таблица 7

Метрологические характеристики методики определения содержания примесей (1) относительно суммы целевых алкалоидов (2) методом ВЭ1Х

1,7. п Г Б1 Б п т:с р. г > +Е.Х '

1. 2,03 5 4 0.3559 0,5966 95 2,78 1.68 81,70

2. 37.96 5 4 0,3525 0,5937 95 2.78 1.65 1,68

ОзиОка единичного определения суммы примесей равной 22 составила около * 822 (Таблица 7).

Разработанные методики ВЗЕХ использованы в исследовательских работах по изучении качества продуктов, нарабатываемых при внедрении технологии производства препарата Абергина.

- 11 - .

4. Определения посторонних примесей & использованием метода ТСХ.

Разработку методик определения примесей в препарате Абергин проводили при использовании готовых пластинок с сияикагелем (аарок "Силуфол" (Чехословакия) и "Сорбфил" (Россия)).

Изучено направление деструкции Абергина (хранение в течении 19 ч IX растворов в смеси хлороформ-метиловый спирт 1:1 при рН=7: рН=3 и рН=9) в сравнении с Парлоделом (Рис 4).

Хроиатограммы образцов Абергина (Аб) к Парлодела (П) при изучении направления разлозения эргокриптинов

0 час 10 час 19 час

рн 3 1 о о о о з8 © О 0 й60 Оц г о о % я Г &6© ©л О О а Ш в 8 8 8 ° г,*0 *п

рн 7 Ю О э! @ 5(8 о йб® ©п. Ю О щ © о _ о О 0 01 1 ©з О 0.5 о о о Об© ' °Л

РН 9 Ю О ъЩ © О Пб о ' оп ю о ё 1 г» 1 1 а я йв9 & II 'О О1

На хроматогракках наблидаитса пятна сумма 2-брон-с<- и 2-бром-^-зр-гокриптининов (1): суммы 2-Бром-12'-0СНз-производных (2): 2-Брои-е{ -зргокриптин (3): 2-Брон-£-зргокриптин (4).и окр? -енных примесей (5) эргокриптинов( э УО-свете при.360 ны обладают нелтой флуоресценцией;.

Рис.4

Обнаружено, что 2-бром-с(-эргокриптин и 2-бром-^-эргокриптин имеют одинаковую скорость разлозения. которая протекает по аналогичному пути. В растворах с рН=7 и рН=9 химическое изменение эргоалкалоидов происходит с образования С8-зпимеров, в кислой среде - с образования 12'-0СНз-производных. Далее происходит распад по пептидной части молекулы, и последней стадией является деструкция лиэергиновой части. Необходимо отметить, что скорость химических превращений, характер и количество образующихся примесей зависит такяе от характера используемых растворителей, освещенности, температурного режима, доступа в реакционную среду воздуха и т.д.

Наиболее устойчивы зргоалкалоиды в растворах с нейтральной средой. За показатель начала разлокения эргоалкалоидов моано считать образование С8-эпимеров и метокси-производных. Для предотвращений появления артефактов при хроматографировании, работы рекомендуется проводить в темном помещении при свете красной лампы, использовать только свенеприготовленные смеси растворителей и растворы образцов. Некоторые растворители подвергают дополнительной очистке.

При выборе оптимальных условий разделения компонентов препарата и сопутствующих примесей проведено изучение влияния различных способов импрегнирования и активирования пластинок перед хроматографиро-ванием. При использовании пластинок "Сорбфил" наилучшие результаты получены при их активировании С100°С - 5 мин), а для пластинок "Си-луфол" основое значение имело только качество серии пластинок.

Системы для хроматографирования подбирали с использованием около 20 растворителей. Для пластинок марки "Силуфол" било апробировано более 30 подвижных фаз,для пластинок "Сорбфил" - более 40. Поло-вительные результаты получены при использовании систем, содер&авих до 70-90% апротонного инертного растворителя. На основании экспериментальных данных, для пластинок "Силуфол" использована система растворителей дихлорметан-диоксан-955! спирт-конц.аммиакС36:3:1:0.1 >, смесь растворителей для нанесения - хлорофорн-нетанол (1:1): для пластинок "Сорбфил" разработана система дихлорметан-диоксан-петро-лейный эфир 70-100° -аммиак (30:6:4:0,6). смесь растворителей для нанесения - хлороформ-метанол (4:1).

При разработке способа детекции хроматограым был исследован ряд обиепринятых при анализе алкалоидов и эргоалкалоидов реактивов и других, которые подбирались с учетом способности эргоалкалоидов к реакциям окисления, конденсации и гидролиза. Всего исследовано более 30 различных способов детекции: в 9Ф-свете. реактивы Драгендор-Фа. ван-Урка, Эрлиха и их кодификации, обработка активные хлором и

- 1Ь -

йодом, растворами едких щелочей, тиосульфата и метабисульфита натрия, тиомочевины. хлорной кислоты, хлорамина-Б и др. Всв'язи с тем, что максимальное количество образца при нанесении на пластинку "Си-луфол" составило - 100 мкг. на пластинку "Сорбфил" - 200 мкг, а со-дернание отдельной примеси доляно определяться от 0,02 до 0,5%, предел обнаруаения зргоалкалоида, при выборе способа детекции, дол-яви составлять около 0,2 мкг в пятне или маньвв.

В результате проведенных исследований разработаны следующие методики определения примесей. На пластинках "Силуфол-254" предлоаен "диапазонный" способ визуальной оценки - наносят 100, 50 и 10 мкг, детекция хроматограмы ведется в УФ-свете при 254 и 360 нм. При 254 им определяются 2-бром-производные эргоалкалондов (С8-эпиаеры- и ме-токси-проиэводные.согласно характеру деструкции они иыевт суммарное содерзание в пятне в зквинолярной пропорции). Предел обнаружения бромпроизводиых составил 0,5 мкг,таким образом этот способ позволяет определить до 0,25 мкг примеси в отдельности,В 100 мкг препарата допускается два дополнительных пятна, отсутствие которых в 50 мкг препарата свидетельствует, что их содераание не превызает 2%. При 360 нм обнарунивастся нативные зргоалкалоида и продукты окисления -предел их обнаружения около 0,02 ккг.0 100 мкг препарата допускается до четырех пятен приаесей этого типа,отсутствие которых в 10 нкг препарата говорит, что их содерзаниэ менее IX (Рис.5). Аналогично определяется содераание примесей в таблетках йбергина*

Определение содераание приаесей в лекарственном средстве' йбергин (Аб) на пластинках "Силуфол-254" (1) и "Сорбфил" (2) 1. 2.

УФ - 254 на УФ-360 на

О о • * * 100 50 10 акг | @ 8 08 § § о О • • • 100 50 10 ккг

О О

О о

© о Й5§ 0 © О О е о О О

0

150 3 1,5 0,75 75мкг

Рис.5.

- 14-. йнализ технического полупродукта, предназначенного для бромиро-вания также проведен "диапазонным" методом на пластинках "Силуфол" по отсутствию пятен примесей в 10 мкг -образца, что было предложено на основании исследования методом ТСХ образца серии 200486. показатели качества которого приняты за стандартные (Таблица 5). Этот методика включена в регламент на производство препарата Абергин.

Разработанные для пластинок марки "Сорбфил" условия хроматографирования и оригинальный способ детекции - обработка хроматограмы 4% раствором хлорамина-Б с последуваим нагревом (120°С - 15 мин), далее детекция в НФ-свете при 360 нм (предел обнаружения вещества около 0,075 ыкг) - позволили использовать способ визуальной оценки примесей по икале разведений (Рис.5): наносят 150 мкг Абергина или 75 ыкг, выделенных из таблеток и вкалу. полученную разведением раствора Абергина. Содержание примесей определяется путем сравнения каждого пятна примеси с одним из двух пятен на вкале сравнения, после чего подсчитывается суммарное содержание. Зтот способ дает возможность обнаружить все родственные примеси, за исключением продуктов окисления, которые являются окраиенными соединениями и их содержание предложено стандартизовать по окраске растворов. Методика с использованием пластинок "Сорбфил" была вклвчена в B0C на Абергин и таблетки Абергина.

Следующая аналитическая задача - это определение соотношения эргоалкалоидов. Используемое для получения Абергина сырье, технический и готовый продукты содержат смесь эргокриптинов, соотновение которых должно сохраняться в процессе производства препарата.. Определение соотновения необходимо для стандартизации состава препарата, контроля производства, изучения алкалоидного состава в различных втаммах спорыньи и др. В зависимости от ревения поставленной задачи были использованы методы сканирования, БЭЙХ и SUP.

5. Анализ соотновения эргокриптинов методом сканированием

Метод сканирования использован для определения соотношения эргокриптинов в техническом и готовом продуктах, изучения направления химических реакций и деструкции эргоалкалоидо". Он позволяет дать оценочную характеристику исследуемых объектов, а простота и высокая скорость определения удобны при проведении больвих объемов работ.

ТСХ проводили вывеизложенныки методами, сканирование хроиатог-рамм вели на денситометре марки "Хромоскан 200/201" (Джойс-Лоебл)

при использовании светофильтров с длинами волн от 240 до 504 нм. При этом било найдено, что некоторые примеси зргоалкало'идов спектрально отличаются от исследуемых соединений и не наблюдаются на денситограмме при использовании светофильтра с 340 нм, что предотвращает наложение пиков. Для получения пятен зргоалкалоидов с устойчивой интенсивностьа окраски, хроматограммы перед сканированием предлоаено обрабатывать хлором (хлорная камера - 15 мин, далее нагрев при 120°С - 10 минКРис.6).

Денситограмма (1) полученная сканированием хроматограммы (2) образца технического полупродукта: суммы о<-зргокриптина (А) и Д-эргокриптина (Б), при условиях: светофильтр - 340 нм, щелевая апертура - 1505, скорость 1:1

А Б

2.

Рис.6

Измерение соотношения зргоалкалоидов вели методом нормировки по высотам пиков с учетом их вклада при наложении, Ошибка единичного определения составила около + 7.3Х (Таблица 8).

Таблица Э

Метрологические характеристики методики определения соотноаения зргоалкалоидов методом сканирования

п í X 3 ?,Х {СР.П ДХ+

11 10 573 18,82 95 2,23 41,96 7.32

Была изучена зависимость высоты пика от содерзаниа вещества в пробе, проведены опыты с добавками, при этом обнаруяена возиозность

появления систематической ошибки при определении соотношений компонентов, различающихся более чек на 10/., что могет быть обьяснено как ошибкой, возникающей при наложении пиков на денснтограыае. так и некоторыми физико-химическими параметрами процесса хроматографи-рования (размер и форма пятна, содергание вещества, различные сорб-ционные параметры и др.). Однако при измерении эквимолярных соотношений. учетом этих параметров мовно пренебречь.

При анализе Абергина полученные данные сравнивали с результатами определения методом ВЭЙХ (Таблица Э), в целом были получены сопоставимые значения.

Таблица Э

Определение соотношения 2-брои- ос-зргокриптина(А) и 2-бром-/б-эргокриптина (Б) в Абергине методами сканирования и ВЭНХ

Нонер серии Абергина ТСХ с последующим сканированием ВЗЕХ

А ,г ъл а. г Ъ.У.

Серия N 1

Серия N 2

Серия Н 3

Серия N 4

51

52

38

39

49 48 62 61

57

58 35 35

43 42 65 65

Методом сканирования показано, что з процессе производства препарата значительных изменений соотновенкя л- и /3 -эргокрипткнов не наблюдается, алкалоиды содержатся в примерно зквимолярном соотношении (1:1, + 10%) и в процессе их разловения в различных средах их соотношение не изменяется.

6. Анализ соотнесения зргокриптинов в Абергине методом ВЭЕХ

Для стандартизации готового продукта и контроля технологического процесса на последних стадиях получения препарата, требовалась методика обладающая большей точностью и не зависящая от содержания компонентов в смеси. Для этого использован метод ВЭ§Х. разработка которого проводилась на основе готовой методики, приспособленной для хроматографа "Нилихром".

Выбор рабочей концентрации пробы проведен экспериментально. Рассчитан коэффициент линейности детектора по зотновениа высот пиков 2-броы-д- к 2-Сроы-л-эргокриитину, Определение проводили на основе метода наименьших квадратов,в нашем случае коэффициент линейности составил 1 1 0.07%. В процессе исследования растворов с содержанием сумм алкалоидов от 1,2 до 0.2 мг/кл, возрастание оаибки определения до ± 102 было отмечено при использовании концентраций

сумм алкалоидов в пробе менее 0,5 мг/мл. Для уменьиения ошибки определения и предотврацения появления систематической оЪибки било предложено проводить анализ при достижении критерия разделения не менее 1,2 (при критерии разделения = 0.6 метод приобретал систематическую опибку+3.52 в сторону завышения 2-броа-/6 -эргокриптина). Анализ проводили на хроматографе "Ыилихром", колонка - КЙХ-2, 2*64 мм: стационарная фаза - Силасорб С18, 5 мкм: подвижная фаза - тет-рагидрофуран - 0,01 Н раствор гидрофосфата аммония (47:53); .скорость потока - 30 мкл/мин: критерий разделения не менее 1.2: детек-: циа при 254 нм, объем пробы - 1 мкл (CZ г 1 мг/ил) (Рис.?)'.

Хроматограмма образца йбергина

Хроматограмма образца йбергина: сумма 2-бром-е(-эргокриптина незилата (1) и 2-брои-^-эргокриптина.иезилата (2).

Рис.7

Овибка единичного определения методики составила около 5% (Таблица 10). Достоверность методики подтверждена опытами с добавками.

Таблица 10

Метрологические характеристики методики определения соотнонениа зргоалкалоидов методом ВЭНХ

п f Х,Б/Й*100 S Р.Х <(Р.Г> лх± +н л

11 10 184 4,35 95 2,23 9,72 5.3

Нетодика позволила стандартизовать йбергин как смесь 2-брои-л и /3 -эргокриптинов мезилатов в примерно эквимолярноа соотновении, а также показала возможность частичной потери 2-броа- се -эргокриптина мезилата при очистке препарата методом колоночной хроматографии, что было учтено при отработка этой стадии технологичоского процесса.

- 18 -

7. Анализ состава эргоалкалоидо* методом ЯМР

При изучении алкалоиднсго состава в различных втаммах склероций спорыньи и субстанциях, выделяемых из различных штаммов - необходимым этапом является их идентификация. Нами, для решения этой проблемы использован метод ЯИР, который позволил быстро, с сохранение« испытуемого образца, провести прямую идентификацию зргоалкалоидов, содер*ащихся в смеси и одновременно определить их соотноиение,

. Спектры получали на ЯНР-спектрометрах марок "Нй-ЮОД" и "Дкеми-ни-200" (Вариан.СЕА). Разработка методики основывалась на способности' зргоалкалоидов сольватираватьсп с молекулами растворителя, приводящей к изменении конфигурации зргоалкалоидов в растворе и соответственно к изменении положения сигналов протонов отдельных групп в^Н-ЯИР-спектре. При разработке использовали 1 У. растворы сумы зргоалкалоидов в дейтерированных хлороформе, метаноле, бензоле, БИБО и их смесях в различных соотношениях.

Наиболее чувствительными к изменение растворителя оказались сигналы протонов НН-группы индольной части молекулы зргоалкалоидов, ИН-пептидной группировки и ОН-группы пептидной части молекулы зргоалкалоидов (Рис.1): использование смесей СБС1зс БН50. ИеОБ или С^ приводило к изменении полояения перечисленных сигналов, при этом на их полокение и внешний вид оказывало влияние концентрация испытуемого образца и температурный режим.

Таким образом экспериментально была подобрана смесь растворителей С0С1з~С^Об (1:7), в которой сигнал протона ЙН-группы индольной части молекулы сдвигался в более сильное поле, в результате чего в области от 7,5 до 10 м.д. оставалось две группы сигналов, удобных для проведения анализа компонентного состава: сигнал протона №1-пе-птидной' группировки молекулы имеет вид синглета, сигналы отдельных алкалоидов располояены в области от 9,6 до 10 м.д. в следующей последовательности: <х-эргокриптин (1 -эргокриптин (2). эргокор-нин (3) и эргокристин (4). Сигнал протона ОН-группы пептидной части молекулы зргоалкалоида наблюдается в виде дублета (3:1.8), причем сигналы, отдельных алкалоидов располокены в области от 7,9 до 8,2 м.д. в следувщей последовательности со стороны слабого поля:^-эргокриптин (2). эргокорнин (3),«^-эргокриптин (1) и эргокристин (4). Различие в химическом сдвиге отдельных зргоалкалоидов обусловлено непосредственным влиянием заместителей при С5* пептидной части молекулы (лейцин, изолейцин, аланин, фенилаланин) (Рис.8).

Фрагменты АН-ЯМР-спектра суммы ¿-эргокриптина (1), ^-зргокрип-тина (2). эргокорнина (3) и эргокристина (4) в смеси растворителей бензол-хлороформ (1:7)

Рис.8

Анализ 1% растворов образцов в смеси растворителей СПС^-СгВ^ (1:7) проводили при следуваих параметрах: АТ=1: БН=3000: РН=13: НТ=500 или 1 ООО: ИЕгО.гЭ: АР=0.49: Р^32К. температура комнатная.

Соотноаение эргоалкалоидов рассчитывали как по пиковым, так и по интегральным интенсивностян сигналов. Обработка данных с выдачей результатов анализа в цифровой форме производится автоматически. Ооибка единичного определения компонента, с содержанием 3% составила около ±.1ЗХ (Таблица 11), она ыоает быть уменьшена з.а счет увеличения величины отноаэния сигнал/аун, что. достигается увеличением числа накоплений (ИТ).

Достоверность полученных результатов была подтверядена опытами на исскцственных смесях.

Таблица 11

Метрологические характеристики определения соотнопения эргоалкалоидов методом ЯМР (смесь <*-эргокриптина (40,92). /S -эргокрип-тина (55.32) и эргокорнина (3,22))

X п f S Р2 *(P.f> ДХ± tEZ

40.9 4 3 0.238 95 3.18 0.7В 1.8

55.9 4 3 0.218 95 3.18 0.69 1.2

3.2 4 3 0.129 95 3.18 0.41 12,8

Разработанная методика ЯНР использована при изучении субстанций, выделенных на ПЭЗ ВИЛР в 84-91 г.г. из склероций спорыньи эргокрип-тинового зтаыма и стандартизации сумм et- и /$-эргокрипгинов. как Рабочего Стандартного Образца (PCO), предназначенного для контроля качества спорыньи зргокриптинового этамка (методика включена в СТП 54-!0-33-4?-93 "PCO сумма <х- и ^-зргокуилтиков").

.' Метод ЯМР использован при изучении состава алкалоидов эрготок-синовой группы в склероциях различных селекционных и дикорастущих итаммов спорыньи в процессе их испытания и оценки,данные анализа по трехлетним полевым испытаниям представлены в Таблице 12. Полученные данные использовали в исследовательских работах по селекции высокопродуктивного зргокристинсодерващего итаын'а, перспективного для создания нового лечебного средства на основе дигидрозргокристина.

Таблица 12

Результаты компонентного анализа методом ЯИР селекционных - эргокристиновых штаммов спорыньи уроаая 1990-1992 г.г.

ЙИФР итамма Относительный состав алкалоидов арготоксиновой группы: зргокристин (К).<*.-зргокриптин (А). ,6-эргокриптин (Б), X .

1990 г. 1991 г. 1992 г.

К : А : Б К : А : Б К : А : Б

1. Н-322

2. Н-322/БЦА/ " 1 а

А-1-1-2-5 Й-1-1-2-6

6. А-5-4-4-10

7. А-1-1-20

8. 581

9. 210 10.202

3.

4.

5.

54 80 84 94

94

95 100 100 100

23 14

23 6 8

86 14

85 91

91

92 91

100 Э4 100

86 14

87 13

88 12 90 10 88 12 90 10 87 13 95 5 97 3 97 3

Помимо представленных разработок, при контроле качества Аберги-на изучены его ИК-спектры, показатель оптического вращения, показатели цветности и растворимости, которые были вклвченц в ВФС на Абергин.

ВЫВОДЫ

1. В результате изучения и сравнительной оценки методов неводного титрования, ТСХ, сканирования, В38Х, УФ-, ИК-. ЯМР-спектроско-пии, для анализа алкалоидов эрготокенновой группы выбраны оптимальные методы для количественного и качественного анализа зргоалкалои-дов. Это позволило добиться всестороннего аналитического обеспечения исследовательских работ по создании препарата Абергин, аналитического котроля технологии производства и стандартизации препарата, а так<е изучения селекционных штаммов спорыньи.

2. С использованием методов неводного титрования и УФ-спвктрафо-тометрии разработаны методики количественного определения зргокрип-

тинов, позволяиниэ вести контроль качества препарата Абе^гин. Показано. что спектрофотометрическая методика применима при изучении продуктов деструкции эргоалкалоидов и прогнозирования их структуры.

3. Изучено хроматографическое поведение эргоалкалоидов методом ТСХ на пластинках "Силуфол" и "Сорбфил" в различных системах растворителей. на основании полученных данных подобраны оптимальные условия хроматографирования.

4. Исследованы различные способы детекции эргоалкалоидов на пластинках "Сорбфил" и "Силуфол", на основании экспериментальных данных разработан новый метод детекции эргоалкалоидов на пластинках "Сорбфил" ( с использованием 42 раствора хлорамина-Б), позволяющий определить до 0,075 ыкг образца. Разработан метод детекции эргоалкалоидов (с использованием активного хлора), примененный для обработки хроматограмм перед сканированием.

5. С применением метода ТСХ разработаны и предложены для использования методики определения посторонних примесей в технической сумме "с<- и^-эргокриптинов" (включена в регламент на производство препарата), с лекарственном веществе и габлотках Абергина (включены в БОС 42-2244-93 и ВФС 42-2245-93).

8. Изучено хроматографическое поведение эргоалкалоидов методом ВЗЯХ на хроматографе ыарки "Дюпон", полученные данные использованы при разработке методики определения содержания примесей.

7. Разработана методика определения соотношения зргоалкалоидоз с использованием метода сканирования^ овибка единичного определения методики составила около +72.

8. Разработана методика определения соотноаения эргокриптинов в препарате Абергин с использованием метода ВЕХ на хроматографе "Ми-лихром". овибка единичного определения методики составила ¿¡¡.3%.

9. Изучены спектральные характеристики эргоалкалоидов методом ЯНР в различных смесях дейтерированных растворителей, на основании полученных данных разработана методика анализа компонентного состава алкалоидов эрготоксиновой группы в смеси. Ооибка единичного определения компонента с содераанием 3% составила около + 12%.

10. Составлены и утверждены ВФС на лекарственное вещество и таблетки АбергинаШС 42-2244-33 и ВФС 42-2245-33), СТП 64-10-39-47-93 "сумма с* - и /ь -эргокриптинов - рабочий стандартный образец".

И. Нетодоа ЯНР исследован компонентный состав алкалоидов эрготоксиновой группы в 10 селекционных зтаымах спорыньи. На основании полученных данных по трехлетний лолевыа испытаниям, селектирован высокопродуктивный зргокристиновый зтамм спорыньи, который по пока-

зателям содержания целевого зргоалкалоида и урожайности соответствует уровне лучших зарубежных. Этот втамм служит основной создания отечественной сырьевой базы для разработки и освоения производства нового лекарственного препарата на дигидрозргокристина.

Основное содержание диссертации излоаено в следуацих работах:

1. Комарова Е.й., Вейченко В.И. "Определение качественного и количественного состава смеси алкалоидов зрготоксиновой группы" // Всесоюзная конференция "Экологическая патология и ее фариакокоррек-ция" ч.2: Тез.докл. - Чита. 1991.

2. Патент Н 1801006 "Коапоэиция. обладающая нейрогорыональной активностью" / С.Я.Соколов, Т.Е.Труипв, П.О.Омелышцкий, В.Г.Куче-ран, Г.Н.Крняановский. В.П.Федотов. И.С.Конояов. В.В.Абрамова. 0,Н.Толкачев, Т.Е.Монахова, Е.Л.Комарова, В.В.Ануфриева, С.С.Саян, В.Б.Кузнецов, В.К.Колхир и В.Й.Зюзин.

3. ВФС 42-2244-93 на лекарственное вещество Абергин.

4. ВФС 42-2245-93 на таблетки Абергина.

3. Комарова Е.Л.. Пинеев С.А. "Применение миироколокочного хроматографа Иидихрои для определения соотновения 2-брои-«<.-эргокрип-тина мезилата и 2-броы-/Э-зргокриптина мезилата в лекарственном веществе и таблетках Абергина" / Хим.-фарм.журнал, - М:1995 г.

I