Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Анализ и стандартизация производных парагидроксибензойной кислоты

На правах рукописи

СУМЦОВ МИХАИЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ

АНАЛИЗ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ПАРАГИДРОКСИБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ

15 00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2007

Работа выполнена в Институте стандартизации и контроля лекарственных средств Федерального государственного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Росздравнадзора

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук

Титова Анна Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор, ВГУП Центр по химии лекарственных средств - Всероссийский научно-исследовательский химико-фармацевтический институт (ЦХЛС-ВНИХФИ)

Дегтерев Евгений Викторович

доктор фармацевтических наук, профессор, Московская Медицинская Академия имени И М. Сеченова

Карташов Владислав Сергеевич

Ведущая организация:

ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ»

Защита состоится ^¿^XZ/7 2007 г. в Sé ^ на заседании

диссертационного совета Д.208 040 09 в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И М Сеченова по адресу 121019, г Москва, Никитский бульвар, д 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА имени И М Сеченова (117998, г Москва, Нахимовский проспект, 49)

Автореферат разослан « » 20071

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208 040 09 доктор фармацевтических наук, профессор . I) Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Возрастающие требования к безопасности лекарственных препаратов обусловливают необходимость совершенствования методов анализа и стандартизации исходного сырья, используемого для их изготовления.

Долгое время считалось, что безопасность и эффективность лекарственного препарата определяется только качеством субстанции и технологическим процессом, используемым для изготовления лекарственной формы. Однако в последние годы в научной печати появились публикации, свидетельствующие о роли вспомогательных веществ в возникновении побочных реакций у пациентов, принимающих лекарственные препараты (Werner М, Wong Y.L.) В этой связи проблема стандартизации вспомогательных веществ по своей значимости становится на один уровень с проблемой стандартизации фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов.

Одной из важных технологических групп вспомогательных веществ являются консерванты, предназначенные для защиты лекарственных средств от микробной порчи и, как следствие этого, способствующие сохранению фармакологического действия препарата и увеличению срока его годности

В качестве консервантов из группы производных парагидроксибен-зойной кислоты (ПГБК) при производстве лекарственных препаратов в России применяются метилпарагидроксибензоат (МПГБ), пропилпара-гидроксибензоат (11111Ъ), Контроль качества МПГБ осуществляется по ФС 42-1460-89 «Нитагин», а ППГБ - ло ВФС 42-2079-91 «Нипазол», срок

действия которых истек в 1995 и 1997 гг., соответственно В данных документах отсутствует ряд важных показателей качества, предусмотренных зарубежными фармакопеями, для обеспечения эффективности, качества и безопасности субстанций, что свидетельствует о необходимости их гармонизации.

За рубежом в качестве консервантов из группы производных ПГБК кроме выше указанных веществ используются, этилпарагидроксибензоат (ЭПГБ), бутилпарагидроксибензоат (БутПГБ); бензилпарагидроксибензо-ат (БензПГБ), а так же натриевые соли метил- (МПГБКа), пропил-(ППГЪКа), этил- (ЭПГБКа) и бутилпарагидроксибензоата (БутПГБКа). Отсутствие отечественных нормативных документов, регламентирующих их качество, является фактором, препятствующим использование указанных веществ в составе отечественных лекарственных средств.

Таким образом, очевидно, что разработка отечественных фармацевтических стандартов качества на производные ПГБК, гармонизированных с требованиями зарубежных фармакопей, является актуальной проблемой отечественной фармацевтической науки на современном этапе ее развития

Цель работы, основные задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка комплексного подхода к стандартизации производных ПГБК с учетом современных требований фармацевтического анализа Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести сравнительный анализ уровня требований отечественных и зарубежных нормативных документов к качеству производных ПГБК;

- изучить требования к внешнему виду и растворимости производных ПГБК;

- изучить методы и методики анализа, используемые для подтверждения подлинности, определения чистоты и количественного определения производных 111ЪК, и выбрать оптимальные;

- составить проекты фармакопейных статей на исследуемую группу веществ, гармонизированных с требованиями зарубежных фармако-пей.

Научная новизна исследования. Впервые проведено комплексное изучение производных ПГБК с учетом современных требований фармацевтической науки и с использованием нового методологического подхода к гармонизации исследуемых соединений.

Впервые изучены спектральные характеристики производных ПГБК в ближней ИК-области и показана возможность использование данного метода для подтверждения подлинности указанных веществ.

Впервые показана возможность использования НОВО для идентификации производных ПГБК. Предложенная методика является более быстрой, объективной, чем используемая в настоящее время методика ИК-спектроскопии в таблетках КВг или масле.

Найдены оптимальные условия разделения производных ПГБК методами ВЭЖХ и ТСХ, которые можно использовать для подтверждения их подлинности и чистоты.

Изучены условия определения остаточных растворителей в исследуемой группе соединений и проведена их оптимизация.

Впервые изучены термальные характеристики производных ПГБК методом ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия). Установлено, что исследуемые соединения являются стабильными и чистыми, а

различные кристаллические формы 11111Ь и МПГБ имеют одинаковые фазовые переходы.

С помощью процедуры валидадии установлено, что методика количественного определения производных 111ЪК, основанная на бромирова-нии продуктов гидролиза и последующей йодометрическом определении избытка брома содержит систематическую погрешность, связанную с адсорбцией титранта на образующихся конгломератах

Практическая значимость исследования. Разработаны методики определения подлинности и чистоты производных 111БК методом ТСХ и ВЭЖХ

Предложена методика определения остаточных растворителей в исследуемой группе соединений.

На основании проведенных исследований составлены 7 проектов ФС (ФС 42-0172-06 «Метилпарагидроксибензоат», ФС 42-0173-06 «Про-пилпарагидроксибензоат», ФС 42-0199-07 «Бутилпарагидроксибензоат», ФС 42-0200-07 «Этилпарагидроксибензоат», ФС 42-0171-06 «Натрия метилпарагидроксибензоат», ФС 42-0201-07 «Натрия пропилпарагидрокси-бензоат» и ФС 42-0170-06 «Натрия бутилпарагидроксибензоат»).

Положения, выносимые на защиту: комплексный подход к стандартизации производных ПГБК

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научной конференции ПГФА (Пятигорск, 2006г.), научно-практической конференции ФГУ «НЦЭСМП» «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва, 2006г.), научной конференции ИСКЛС ФГУ «НЦ ЭСМП» (Москва 2006 г)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с комплексной темой ИКЛС ФГУ «НЦЭСМП» «Анализ и стандартизация вспомогательных веществ».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста (без приложения), состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментального исследования, общих выводов, списка литературы. Диссертационная работа проиллюстрирована 30 таблицами и 51 рисунками. Список литературы включает 141 источник.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования: БензПГБ, БутПГБ, МПГБ, ППГБ, ЭПГБ, МПГБ1Ча, I ГГГГ'БЫа, БутПГБКа, ЭПГБКа.

Стандартизация производных парагидроксибензойной кислоты

Нами были проанализированы требования отечественных и зарубежных фармакопейных статей к качеству производных ПГБК, на основании которого был сделан вывод о необходимости в гармонизации требований к указанным веществам.

Внешний вид и растворимость производных ПГБК

Анализ внешнего вида имеющихся в нашем распоряжении образов указанных соединений показал, что на фармацевтическом рынке существуют разные кристаллические формы МПГБ и ППГБ (рис.1, 2). Полученные результаты были учтены при формировании раздела «Описание».

Рис.1 Кристаллические формы МПГБ Рис.2 Кристаллические формы ППГБ

Анализ растворимости производных ПГБК в различных растворителях также показал различие между требованиями фармакопейных статей (табл 1,2)

Таблица 1

Фармакопейные требования к растворимости производных ПГБК

Наименование ВВ БензПГБ БутПГБ МПГБ ППГБ ЭПГБ

вода пнр"1 0MPJA6 омр мр5 омр^4'3 OMPW

кипящая вода - - - мр3 -

спирт лр5 лр** р1 лр3« лр^

эфир V лр3 р' лр« лр6

пропиленгликоль - лр5 лр3

ацетон - лр= Р1 лр2 лр3

спирт метиловый - у лр^ V4 ЛРМ

р-р щелочи PJ - - - -

глицерин омр5 омр5 - - омр3

1 - ФС 42-1460-89 «Нипагин», 2 - ВФС 42-2079-91 «Нипазол», 3 - Вг РЬ, 4 -Еиг РЬ , 5 - ОТ, пнр — практически нерастворим; омр - очень мало растворим, мр — мало растворим, лр - легко растворим, р - растворим

Таблица 2

Растворимость натриевых производных ПГБК в различных растворителях

Наименование ВВ БутПГБЫа nnTBNa MIXTENa ЭПГБИа

вода лр' лр"" up'** лр1'"

спирт лр' мр w мр -

метиленхлорид - пнр пнр ПНр""

безводный спирт - - - р1'2

жирные (нелетучие) масла - HPJ омр"1 -

1 - Вг Ph, 2 - Eur Ph, 3 - NF, пнр - практически нерастворим, омр - очень мало растворим, мр - мало растворим; лр - легко растворим, р - растворим

При формировании раздела «Растворимость» в проектах ФС были исключены токсичные и редко используемые растворители.

Для подтверждения подлинности производных ПГБК используются различные методы анализа (таб.3,4). С целью выбора оптимального сочетания методов для указанной цели была изучена их специфичность.

Таблица 3

Фармакопейные методики, используемые для подтверждения _подлинности производных ПГБК _

Методика БензПГБ БутПГБ МПГБ ППГБ ЭПГБ

1 2 3 4 5 6

УФ спектрофотометрия - - 1 2 -

ИК - спектроскопия 3 3,4,5 3,4,5 3,4,5 3,4,5

тех 3 3,4,5 3,4,5 3,4,5 3,4

Р-я с аминопиразолоном и калия феррицианидом " 3,4,5 3,4,5 3,4,5 3,4

Р-я с азотнокислым раствором ртути 3 ■ " "

Температура плавления 3 3,4,5 1,3,4,5 2,3,4,5 3,4,5

Температура плавления бензойной кислоты - - 1 2 -

1 - ФС 42-1460-89 «Нипагин», 2 - ВФС 42-2079-91 «Нипазол», 3 - ВгРИ, 4 -Еиг РЪ , 5 - №

Таблица 4

Фармакопейные методики, используемые для подтвернздения _подлинности натриевых солей производных Ш'БК_

Методика МПГБШ ППГБКа ЭПГБИа БутПГБЫа

ИК - спектроскопия 1,2,3 1,2,3 2 1,2

Р-я с аминопиразолоном и калия феррицианидом 1,2 1,2 2 и

Температура плавления основания 1,2,3 1,2,3 2 1,2

Реакции на натрии (окрашивание пламени) 3 3 - 3

реакция с калия антимонатом 1,2 1,2 2 1,2

тех 1,2,3 1,2,3 2 1,2

1 - Вг.РЬ, 2 - Еиг РЪ , 3 — Ш7

Оптические методы анализа

Производные ПГБК в УФ-области спектра от 220 нм до 350 нм имеют максимум поглощения при длине волны около 258 нм и отличаются интенсивностью поглощения при указанной длине волны (рис.3) Полученные нами данные согласуются с теорией метода и строением исследуемых соединений

Рис.3. УФ-спектры производных ПГБК (0,005 % раствор в спирте 96 %): БензПБК (1), БутПГБ (2), ППГБ (3), ЭПГБ (4) и МПГБ (5).

Специфичность УФ-спектрофотометрического метода в данном случае может быть обеспечена введением диапазона варьирования величины поглощения, как это, например, предложено в Br.Ph для БензПГБ. Однако существующая практика в России исключает нормирования оптической плотности для подтверждения подлинности субстанций, поэтому данный метод анализа не был включен в проекты ФС.

Изучена возможность использования для подтверждения подлинности производных ПГБК разных видов ИК-спектроскопии-

- ближняя область (отражение)

- средняя область: нарушенное полное внутреннее отражение (НПВО), в таблетках калия бромида и масле.

Во всех ИК спектрах производных ПГБК имеются характерные полосы поглощения или, соответственно, отражения, что может быть использовано для подтверждения подлинности исследуемой группы соединений

Недостатком ИК-спектроскопии в ближней области, на наш взгляд, является присутствие в ИК спектре исследуемых соединений достаточно большого количества широких и малоинтенсивных полос отражения, что делает его трудно читаемым

В средней ИК-области наиболее оптимальным является НПВО ИК спектры НПВО производных ПГБК по положению полос практически

и

совпадают с ИК спектрами исследуемых соединений в таблетках калия бромида и масле, но отличаются по интенсивности некоторых из них. Кроме того, две интенсивные полосы в области от 2800 см"1 до 3000 см"1, две полосы средней интенсивности при длинах волн около 1462 см"1 и 1377 см"1, а также малоинтенсивная полоса при длине волны около 722 см"1 в ИК спектрах веществ в масле обусловлены самим маслом.

Преимуществами НПВО являются быстрота и простота выполнения анализа, использование минимального количества испытуемого образца, отсутствие пробоподготовки, искажения спектра исследуемого образца за счет наполнителей (бромид калия, масло и т.д.) или примесей в них (вода, загрязнения) и воздействия на исследуемый образец (формирование таблетки с калия бромидом осуществляется при давлении около 8 т) Тем не менее, учитывая, что этот способ получения ИК спектров только начинает внедряться в фармацевтическую практику, в проекты ФС включен традиционный метод ИК-спеюроскопии в таблетках калия бромида.

Хроматографические методы анализа

Кроме оптических (спектральных) методов для подтверждения подлинности производных ПГБК используется метод ТСХ (Eur Ph, Br Ph, NF) При апробации методики, включенной в зарубежные фармакопеи, установлено, что в описанных условиях отсутствует разделение между БутПГБ и БензПГБ (рис 4)

С целью поиска оптимальных условий разделения всех исследуемых нами соединений нами были изучено их хроматографическое поведение в различных подвижных фазах и с использованием различных сорбентов.

В результате проведенных исследований были найдены условия хроматографирования производных ПГБК, позволяющие полностью их разделить (рис 5)

о о

о о

о о

о о

о о о

МШХ ЗПГБ ППГБ БутПГЪ БсюПГБ ШЬК.' Сжа

Рис 4. Хроматограмма разделения БензПГБ, БутПГБ, МПГБ, ППГБ, ЭПГБ и ПГБК. Условия разделения: ПФ — уксусная кислота ледяная:вода:спирт метиловый (1:30:70), хроматографическая пластинка KC18F 254 «Merk», Германия (№4803 800), наносили по 10 мкл 2,0 % растворов в ацетоне (10 мкг в пятне).

о о

о о

о о

о о

°

о о

МПГБ ЭПГБ ППГБ EytQTb Ь«итЛГБ ПШ Смесь

Рис.5. Хроматограмма разделения БензПГБ, БутПГБ, МПГБ, ППГБ и ЭПГБ. Условия разделения: ПФ — спирт метиловый:вода (35:65), хроматографическая пластинка «DC-FertingpIatten sil G-25 UV-254» фирмы «Macnerey-Nagel+Co», наносили по 10 мкл 2,0 % растворов в ацетоне (10 мкг в пятне).

Кроме метода ТСХ нами была изучена возможность использования метода ВЭЖХ для подтверждения подлинности исследуемой группы веществ. На основании анализа методик, включенных в НД на лекарственные препараты, в состав которых входят производные ПГБК, доступной нам литературы, а также собственных экспериментальных исследований были выбраны следующие условия разделения производных ПГБК- колонка Hypersil ODS, 250x4,6мм, 5мкм, температура колонки - 40°С, скорость потока - 2,5 мл/мин, длина волны детектирования - 254 нм, градиентный режим, подвижная фаза А - ацетонитрил : вода (10 90), подвижная фаза В - ацетонитрил, условия градиента, линейный градиент до 7,5%

фазы В за 15 мин, далее изократический режим. Общее время хромато-графирования указанной группы веществ составляет 30 мин (рис б).

Рис 6. Хроматограмма разделения производных ПГБК методом ВЭЖХ.

Температура плавления

Подтверждение подлинности производных ПГБК по температуре плавления используется в двух вариантах: температура плавления самого вещества и продукта его гидролиза - бензойной кислоты. Второй вариант включен только в отечественные нормативные документы и рассматривается в качестве группового метода подтверждения подлинности производных ПГБК

Температура плавления имеющихся в нашем распоряжении образцов определялась на приборе для определения температуры плавления (ПТП «висш») и методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Результаты представлены в таблице 5

Как видно из представленных результатов температура плавления производных ПГБК, полученная методом ДСК и на приборе для определения температуры плавления, находятся в диапазоне, указанном в соответствующих нормативных документах.

Термограммы производных ПГБК (рис.7) свидетельствуют о том, что исследуемые нами соединения стабильны при нагревании их до температуры 220 °С

Следует отметить, что при анализе различных кристаллических форм ППГБ и МПГБ методом ДСК (рис 8,9) было установлено, что они

имеют одинаковые фазовые переходы.

Таблица 5

Температура плавления производных ПГБК_

Наименование ВВ Температура плавления, °С

Нормируемая величина Полученная величина

ФС 42-1460-89/ ВФС 42-2079-91 Вг.РЬ. Еиг.Р11. № ДСК ПТП

БензПГБ - 112 - 112,12 111,9

БутПГБ - 68-71 68-72 70,35, 70,41 70,0

МПГБ 126-130 125-128 126,6-126,73

ППГБ 95-98 95-98 96-98 97,08 - 97,28 96,5

ЭПГБ - 115-118 116,57

Рис 7. Термограммы производных ПГБК: БутПГБ (1), ППГБ (2), БензПГБ (3), ЭПГБ (4), МПГБ (5) и ПГБК (6), полученные методом ДСК (диапазон 30-300 °С, скорость нагрева — 5 °С/мин, в воздушной среде).

__________ ^

\ . « * < « *•

зтля'етто

Рис.8 Термограммы разных кристаллических форм

Рис. 9 Термограммы разных кристаллических форм ППГБ

Качественные реакции

Для подтверждения подлинности производных ПГБК используются реакции, основанные на реакциях направленные на фенольный гидроксил, сложно-эфирную группу, ионы натрия с применением различных реактивов (табл 6).

Таблица 6

Качественные реакции подтверяедения подлинности производных ПГБК

Наименование ВВ С азотнокислым раствором ртути (Вг.РЬ.) С аминопиразо-лояом и калия феррицианидом (Вг РЬ./ Еиг.РЬ.) С реактивом Миллона (ВФС) Реакции на натрий

С калия анти- монатом (Вг.РЬ./Еиг РЬ.) Окрашивание пламени (N5)

БензПГБ + - - - -

БутПГБ - + - - -

МПГБ - + - - -

ППГБ - + + - -

ЭПГБ - + - - -

БутПГШа - - - + -

ППГБ№ - + - + +

МПГБИа - + - + +

ЭПГБ№ - + - + +

При составлении проектов ФС было рекомендовано не включать качественные реакции с использованием азотнокислого раствора ртути из-за малой доступности высокой токсичности реактива, а также реактива Милона, реакция с которым является не специфичной для производных ПГБК

Показатели чистоты

Известно, что одним из гарантов безопасности применения любого вспомогательного вещества является контроль содержания в нем примесей, которые можно объединить в один общий раздел «Чистота». Проблема гармонизации требований к качеству ВВ состоит в том, что методики определения показателей чистоты, описанные в различных фарма-копеях, не гармонизированы По этой причине нами были экспериментально изучены методики определения тяжелых металлов, сульфатной

золы, хлоридов, сульфатов, величины рН. прозрачности, цветности, описанные в зарубежных и отечественных фармакопеях, и выбраны оптимальные (табл. 7)

Таблица 7

Основные различия методик определения показателей чистоты

Показатели чистоты Фармакопеи

Eur.Ph. Br.Ph. тер ГФ XI

Тяжелые металлы сжигание с магния сульфатом в 9,8 % р-ре серной кислоты, реактив - тиоаце-тамид из сульфатной золы, реактив- натрия сульфид

Сульфатная зола 600 °С 800 °С 500 °С

Сульфаты двухэтапная процедура (на первом этапе реактив прибавляют к спиртовому эталонному раствору калия сульфата), среда - уксусная кислота одноэтапная процедура, среда - хлориствоводоро-ная кислота, эталонное вещество - серная кислота одноэтапная процедура, среда хлористоводородная кислота, эталонное вещество - калия сульфат

Хлориды Эталонное вещество - натрия хлорид, последовательность добавления реактива (реактив- испытуемый раствор), конечный объем - 17 мл Эталонное вещество -хлористоводородная кислота, последовательность добавления реактива (испытуемый раствор-реактив), конечный объем - 50 мл Эталонное вещество — натрия хлорид, последовательность добавления реактива (испытуемый раствор-реактив), конечный объем-11 мл

Прозрачность Сравнение с эталонным раствором I или водой - Сравнение с водой

Цветность Сравнение с эталонным раствором BY6 - Сравнение с эталоном 7а

Кислотность бромкре-золовый зеленый метиловый красный, бромкрезоло-вый зеленый метиловый красный, бромкрезояовый зеленый бромкрезоловый зеленый

Для определения органических примесей в производных ПГБК нами показана возможность использования методик ТСХ и ВЭЖХ в условиях разработанных нами для подтверждения подлинности исследуемых веществ Надежность методик была изучена с использованием высоких концентраций определяемых веществ- для ТСХ - 20 мг/мл (содержание вспомогательного вещества в пятне - 200 мкг), для ВЭЖХ - 10 мг/мл (содержание вспомогательного вещества в пробе 100 мкг).

В результате проведенных исследований установлено, что зона адсорбции исследуемых веществ на хроматографической пластинке не перекрывает зоны близко располагающихся потенциальных примесей. При хроматографировании веществ в количестве, в два раза превышающем заявленную величину, в исследуемых нами образцах примеси веществ не было обнаружено, что свидетельствует об их чистоте

Методом ВЭЖХ только в некоторых образцах обнаружено присутствие ПГБК, в количестве менее 0,001 %. Полученные данные свидетельствуют о коррелируемости результатов определения примесей в производных ПГБК, полученных методами ТСХ и ВЭЖХ

Определение остаточных органических растворителей в производных ПГБК проводилась методом ГЖХ с использованием ПИД и масс-спектрометрических детекторов. Были предложены следующие условия хроматографического системы, колонка- Innowax 30м х 0,53мм х 1 мкм, газ-носитель, гелий; скорость потока газа-носителя. 30 см/сек; температура детектора 250 °С, температура инжектора- 220 °С, температура колонки. 40 °С в течение 10 минут, далее со скоростью 10 °С/мин до 250 °С, выдерживается 25 мин; деление потока: 10 1, объем ввода пробы. 1 мкл

В качестве растворителя испытуемого образца использовался N,N-диметилформамид.

Анализ имеющихся в нашем распоряжении образцов производных ПГБК показал присутствие только метилового спирта в образцах БутПГБ и ЭПГБ в концентрации, не превышающей 0,05%

Количественное определение

Для производных ПГБК используются две фармакопейные методики количественного определения. Одна из них основана на потенциометри-ческом титровании избытка щелочи после гидролиза вещества (методика 1) В основе другой лежит обратное бромато-йодометрическое титрова-

ние (методика 2) С целью выбора оптимальной методики для включения с проект ФС, их необходимо было сравнить.

На первом этапе нами была изучена возможность использования индикатора в методике 1 для определения точки эквивалентности.

Были определены параметры второго скачка и установлено, что из индикаторов, используемых для кислотно-щелочного титрования (фенолфталеин, метиловый красный, метиловый оранжевый), интервал перехода окраски метилового красного находится на участке кривой в районе второго скачка, поэтому он был выбран нами наряду с потенциометриче-ским способом регистрации точки эквивалентности для количественного определении производных ПГБК.

Выбора оптимальной методики количественного определения производных ПГБК осуществлялся с использованием процедуры валидации. С этой целью был построен трехуровневый эксперимент по три опыта на каждом уровне Диапазон измерений был выбран, исходя из возможного варьирования навески исследуемого вещества.

Характер зависимости между навеской вещества и количеством тит-ранта в аналитической области измерения методик был изучен с помощью коэффициента регрессии (г) и установлено, что в обеих методиках зависимость имеет линейный характер (г1 = 0,995856 и г2 = 0,999998, соответственно) и описывается линейными уравнениями: У1=519,96х-11,37, у2=6,56х-0,01;

Полученные результаты были проверены на однородность с помощью О-критерия и установлено, что все они не отягощены грубой погрешностью. Методика 1 дает более сопоставимые результаты на каждом уровне диапазона измерений, а также в целом диапазон, чем методика 2 (табл 8) Сравнение средних результатов содержания веществ, полученных по обеим методикам, показал, что они различаются (100,1 % и 104,6 %) Значимость их расхождений определяли с помощью коэффициента

Стьюдента- вычисленное значение указанного коэффициента (2,784) превышает табличное (195%=2,780), что свидетельствует о том, что одна из методик отягощена систематической погрешностью.

При построении линии тренда по точкам, соответствующим средним значениям результатов, полученных на трех уровнях диапазона измерения, и продлении ее до пересечения осей координат, установлено, что только линия тренда в методике 1 проходит через начало координат, а методики 2 смещена. Полученные данные свидетельствуют о наличии систематической погрешности в методике 2 (рис 10,11).

§ 50,00 £ 40,00 I, 30,00

Э1

£ 20,00 В ю,оо 0,00 — 0,0000

навеска, г

Рис.10. Зависимость между количеством МПГБ и объемом 0,1 и раствора натрия тиосульфата у=519,96х -11,37 (методика 1)

18,71

ч

1 14,97

Л

и

| 11,23 Р 7,48

1 3,74 0,00

0,0000 0,5000 1,0000 1,5000 2,0000 2,5000

навеска, г

0,0200 0,0400 0,0600 0,0800 0,1000 0,1200

Рис.11. Зависимость между количеством Mill Б и объемом 0,5 М раствора серной кислоты у=6,56х - 0,01 (методика 2)

Таблица 8

Результаты количественного определения_

Уровень Методика 1 Методика 2

Навеска, г Объем тит-ранта, мл Найденное количество, % Навеска, г Объем тит-ранта, мл Найденное количество, %

Нижний уровень 1,8002 1,8003 1,8014 11,8 11,8 11,8 100,10 100,09 100,03 0,0913 0,0901 0,0904 35,95 36,10 36,00 101,4 103,18 102,55

Среднее значение уровня 1,8006 11,8 100,07 0,0906 36,02 102,38

Средний уровень 2,0001 2,0003 2,0001 13,06 13,16 13,11 99,75 100,5 100,13 0,0993 0,1033 0,0983 39,40 41,40 39,90 102,18 103,21 104,53

Среднее значение уровня 2,0002 13,11 100,13 0,1003 40,23 103,31

Верхний уровень 2,2000 2,2003 2,2000 14,47 14,32 14,47 100,45 99,39 100,45 0,1115 0,1084 0,1117 46,50 46,00 46,60 107,40 109,28 107,53

Среднее значение уровня 2,2001 14,43 100,10 0,1005 46,37 108,04

Уровень диапазона Метрологические характеристики

х,% в2 в х | вг ±Дх ± Д х ± 6 ± Е

Методика 1

Нижний 100,10 0,001 0,02 0,04 0,16 0,09 0,16 0,09

Средний 100,13 0,14 0,22 0,37 1,61 0,93 1,61 0,93

Верхний 100,07 0,37 0,35 0,61 2,63 1,52 2,63 1,52

Диапазон измерения 100,10 0,13 0,12 0,36 0,85 0,28 0,85 0,28

Методика 2

Нижний 102,38 0,81 0,52 0,88 3,88 2,24 3,79 2,19

Средний 103,31 1,39 0,68 1,14 5,07 2,92 4,90 2,83

Верхний 108,04 1,16 0,62 1,00 4,63 2,67 4,29 2,47

Диапазон измерения 104,57 0,84 0,31 0,88 2,16 0,72 2,07 0,69

В процессе выполнения методики 1 нами отмечено, что при исследовании навесок нижнего диапазона при бромировании продуктов гидролиза вещества образовывались конгломераты белого цвета, которые после титрования становились светло-желтыми, а при исследовании навесок верхнего диапазона конгломераты окрашивались в зеленовато-коричневый цвет Причину погрешности в этой методике, по всей види-

мости, можно объяснить адсорбцией йода, используемого в качестве титрованного раствора, указанными конгломератами, что приводит к завышенным результатам.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1 Установлено, что уровень требований отечественных и зарубежных фармакопейных статей к качеству производных парагидроксибен-зойной кислоты (ПГБК) значительно различается и нуждается в гармонизации

2 Установлено, что методика подтверждения подлинности производных ПГБК методом тонкослойной хроматографии, включенная в Eur Ph и Br Ph, не позволяет идентифицировать БензПГБ и БутПГБ. На основании изучения хроматографического поведения исследуемой группы соединений были предложены новые условия их разделения: пластинка «DC-Fertmgplatten sil G-25 UV-254» фирмы «Macherey-Nagel+Co» в системе спирт метиловый, вода (35.65). Показана возможность использования разработанной методики для определения чистоты исследуемых веществ

3 Изучены спектральные характеристики производных ПГБК в ближней и средней ИК-области. Показано преимущество использования метода нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) для подтверждения подлинности исследуемой группы соединений.

4 Получены УФ спектры производных ПГБК и показано, что данный метод не является специфичным в отношении указанных соединений.

5 Изучены термохарактеристики производных ПГБК методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Установлено, что ис-

следуемые соединения являются стабильными при нагревании и разные кристаллические формы МПГБ и 11111Ь имеют одинаковую температуру плавления (126 °С и 97 °С, соответственно).

6 Найдены оптимальные условия разделение производных ПГБК методом ВЭЖХ колонка Hypersil ODS, 250x4,6 мм, 5 мкм, температура колонки 40 °С, подвижная фаза А - ацетонитрил:вода (10:90), подвижная фаза В - ацетонитрил, условия градиента, линейный до 7,5 % подвижной фазы В (15 мин), далее - изократический режим; детектирование - при длине волны 254 нм. Разработанная методика может быть использована для подтверждения подлинности и определения чистоты указанных вспомогательных веществ.

7. Разработана методика определения остаточных органических растворителей в производных ПГБК, с помощью которой установлено, что исследуемые субстанции в качестве растворителей содержат метиловый спирт

8 С помощью процедуры валидации установлено, что методика количественного определения производных ПГБК, основанная на бромиро-вании продукта гидролиза эфира и последующим йодометрическим определением избытка брома, содержит систематическую ошибку, связанную с адсорбцией титранта на образующихся конгломератах. Для количественного определения производных ПГБК предложено использовать методику кислотного титрования кислотой избытка щелочи, не пошедшего на гидролиз эфира, а их натриевых солей - метод неводного титрования

9 На основании проведенных исследований разработаны и утверждены 7 проектов ФС («Метилпарагидроксибензоат», «Пропилпарагид-роксибензоат», «Этилпарагидроксибензоат», «Бутилпарагидроксибензо-

ат», «Натрия метилпарагидроксибензоат», «Натрия пропилпарагидрокси-бензоат», «Натрия бутилпарагидроксибензоат»).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Титова А.В, Садчикова Н.П., Боковикова Н.П. Сумцов М А / Стандартизация метилгидроксибензоата // Тезисы в сборнике материалов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство», г Москва, 7-11 апреля 2003 г., С.759.

2. Боковикова Т.Н, Титова А.В , Сумцов М.А, Садчикова Н П / Выбор методики количественного определения метилгидроксибензоата // Тезисы в сборнике материалов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 19-23 апреля 2004 г., М., - 2004 г., С.13

3. Сумцов М.А., Титова A.B., Садчикова НП, Кудрявцева МП, Симонова Е.П., Романюк М.Г., Громова H.H. / Гармонизация требований к качеству производных парагидроксибензойной кислоты // Материалы седьмого съезда фармацевтов республики Беларусь «Фармация XXI века», Витебск 22 октября 2004 г., В , 2004 г., С.192-194.

4 Сумцов М А., Титова А В., Садчикова Н.П. / Выбор методики количественного определения метилпарагидроксибензоата с использованием процедуры валидации // Вестник Воронежского государственного университета 2005. - № 1 - С.236-239

5 Титова A.B., Сумцов М.А., Садчикова Н.П. / Разделение производных парагидроксибензойной кислоты методом тонкослойной хроматографии // Вестник Воронежского государственного университета 2005 -№1 -С 240-243

6. Сумцов М.А., Титова A.B., Садчикова Н.П., Кудрявцева М.П., Романюк М Г. / Методологический подход к стандартизации производных парагидроксибензойной кислоты // Тезисы в сборнике материалов

XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 18-22 апреля 2005 г., М., 2005 г., С.36.

7 Сумцов М А., Титова A.B., Садчикова Н П , Рылин А Ф, Пихтарь А В / Гармонизация методик количественного определения метилпара-гидроксибензоата // Тезисы в сборнике материалов XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 18-22 апреля 2005 г.,М,2005 г.,С.36.

8 Титова А В , Пихтарь A.B., Сумцов М А / Использование метода ВЭЖХ в стандартизации производных // Тезисы в сборнике материалов II Всероссийского съезда фармацевтических работников, г. Сочи, 5-7 июня 2005 г., С. 143.

9 Сумцов М.А., Титова A.B., Садчикова Н.П., Сульдин A.B. / Гармонизация требований к качеству производных парагидроксибензойной кислоты на примере пропилпарагидроксибензоата // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», Пятигорск, 2006 г. - вып 61 - С 302-303

Подписано в печать 09^0£ Формат 60 х 90 1/16

Объем /,5л,/ Тираж 100экз.

Заказ №

Отпечатано в ООО КПСФ «Спецстройсервис-92» Отдел оперативной полиграфии 101000, Москва, Мясницкая, 35, стр.2

Актуальность исследования

Возрастающие требования к безопасности лекарственных препаратов обусловливают необходимость совершенствования методов анализа и стандартизации исходного сырья, используемого для их изготовления.

Долгое время считалось, что безопасность и эффективность лекарственного препарата определяется только качеством субстанции и технологическим процессом, используемым для изготовления лекарственной формы. Однако в последние годы в научной печати появились публикации, свидетельствующие о роли вспомогательных веществ в возникновении побочных реакций у пациентов, принимающих лекарственные препараты [139, 140]. В этой связи проблема стандартизации вспомогательных веществ по своей значимости становится на один уровень с проблемой стандартизации фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов.

Одной из важных технологических групп вспомогательных веществ являются консерванты, предназначенные для защиты лекарственных средств от микробной порчи и, как следствие этого, способствующие сохранению фармакологического действия препарата и увеличению срока его годности.

В качестве консервантов из группы производных ПГБК при производстве лекарственных препаратов в России применяются метилпарагидрокси-бензоат (МПГБ), пропилпарагидроксибензоат (ППГБ). Контроль качества МПГБ осуществляется по ФС 42-1460-89 «Нипагин», а ППГБ - по ВФС 422079-91 «Нипазол», срок действия которых истёк в 1995 г. и 1997 г., соответственно. Кроме того, в данных документах отсутствует ряд важных показателей качества, предусмотренных зарубежными фармакопеями для обеспечения эффективности, качества и безопасности, что свидетельствует о необходимости их гармонизации.

За рубежом, кроме указанных веществ, в качестве консервантов из группы производных ПГБК, используются: этилпарагидроксибензоат (ЭПГБ); бутилпарагидроксибензоат (БутПГБ); бензилпарагидроксибензоат (БензПГБ), а так же натриевые соли метил-, пропил-, этил- и бутилпарагид-роксибензоата. Отсутствие нормативных документов на территории России является фактором, препятствующим их использованию в составе отечественных лекарственных средств.

Таким образом, очевидно, что разработка фармацевтических стандартов качества на производные ПГБК, гармонизированных с требованиями зарубежных фармакопей является актуальной проблемой отечественной фармацевтической науки на современном этапе ее развития.

Цель работы, основные задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка комплексного подхода к стандартизации производных ПГБК с учетом современных требований фармацевтического анализа. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: провести сравнительный анализ уровня требований отечественных и зарубежных нормативных документов к качеству производных ПГБК;

- изучить требования к внешнему виду и растворимости производных ПГБК; изучить методы и методики анализа, используемые для подтверждения подлинности, определения чистоты и количественного определения производных ПГБК, и выбрать оптимальные; составить проекты фармакопейных статей на исследуемую группу веществ, гармонизированных с требованиями зарубежных фармакопей.

Научная новизна исследования

Впервые проведено комплексное изучение производных ПГБК с учетом современных требований фармацевтической науки и с использованием нового методологического подхода к гармонизации исследуемых соединений.

Впервые изучены спектральные характеристики производных ПГБК в ближней ИК-области и показана возможность использования данного метода для подтверждения подлинности указанных веществ.

Впервые показана возможность использования НПВО для идентификации производных ПГБК. Предложенная методика является более быстрой, объективной, чем используемая в настоящее время методика ИК-спектроско-пии в таблетках КВг или масле.

Найдены оптимальные условия разделения производных ПГБК методами ВЭЖХ и ТСХ, которые можно использовать для подтверждения их подлинности и чистоты.

Изучены условия определения остаточных растворителей в исследуемой группе соединений и проведена их оптимизация.

Впервые изучены термальные характеристики производных ПГБК методом ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия). Установлено, что исследуемые соединения являются стабильными и чистыми, установлено, что различные кристаллические формы ППГБ и МПГБ имеют одинаковые фазовые переходы.

С помощью процедуры валидации установлено, что методика количественного определения производных ПГБК, основанная на бромировании продуктов гидролиза и последующей йодометрическом определении избытка брома, содержит систематическую погрешность, связанную с адсорбцией титранта на образующихся конгломератах.

Практическая значимость исследования

Разработаны методики определения подлинности и чистоты производных ПГБК методом ТСХ и ВЭЖХ.

Разработана методика определения остаточных растворителей в исследуемой группе соединений.

На основании проведенных исследований составлены 7 проектов ФС: ФС 42-0172-06 «Метилпарагидроксибензоат», ФС 42-0173-06 «Пропилпара-гидроксибензоат», ФС 42-0199-07 «Бутилпарагидроксибензоат», ФС 42-020007 «Этилпарагидроксибензоат», ФС 42-0171-06 «Натрия метилпарагидроксибензоат», ФС 42-0201-07 «Натрия пропилпарагидроксибензоат» и ФС 420170-06 «Натрия бутилпарагидроксибензоат».

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста (без приложения), состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы, приложения. Диссертационная работа проиллюстрирована 30 таблицами и 51 рисунком. Список литературы включает 141 источник.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Установлено, что уровень требований отечественных и зарубежных фармакопейных статей к качеству производных парагидроксибензойной кислоты (ПГБК) значительно различается и нуждается в гармонизации.

2. Установлено, что методика подтверждения подлинности производных ПГБК методом тонкослойной хроматографии, включенная в Eur. Ph. и Br.Ph., не позволяет идентифицировать БензПГБ и БутПГБ. На основании изучения хроматографического поведения исследуемой группы соединений были предложены новые условия их разделения: пластинка «DC-Fertingplatten sil G-25 UV-254» фирмы «Macherey-Nagel+Со» в системе спирт метиловый: вода (35:65). Показана возможность использования разработанной методики для определения чистоты исследуемых веществ.

3. Изучены спектральные характеристики производных ПГБК в ближней и средней ИК- области. Показано преимущество использования метода нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) для подтверждения подлинности исследуемой группы соединений.

4. Получены УФ спектры производных ПГБК и показано, что данный метод не является специфичным в отношении указанных соединений.

5. Изучены термохарактеристики производных ПГБК методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Установлено, что исследуемые соединения являются стабильными при нагревании и разные кристаллические формы МПГБ и 1111ГБ имеют одинаковую температуру плавления (126 °С и 97 °С, соответственно). Показано, что температура плавления может быть использована для подтверждения подлинности указанных вспомогательных веществ.

6. Найдены оптимальные условия разделение производных ПГБК методом ВЭЖХ: колонка Hypersil ODS, 5 мкм (25x4,6), температура колонки 40 °С, ПФ А - ацетонитрил:вода (10:90), ПФ В - ацетонитрил; условия градиента: линейный до 7,5 % ПФ В (15 мин), далее - изократический режим; детектирование - при длине волны 254 нм. Разработанная методика может быть использована для подтверждения подлинности и определения чистоты указанных вспомогательных веществ.

7. Разработана методика определения остаточных органических растворителей в производных ПГБК, с помощью которой показано, что исследуемые субстанции в качестве растворителей могут содержать метиловый спирт.

8. С помощью процедуры валидации установлено, что методика количественного определения производных ПГБК, основанная на бромировании продукта гидролиза эфира и последующим йодометрическим определением избытка брома, содержит систематическую ошибку, связанную с адсорбцией титранта на образующихся конгломератах. Для количественного определения производных ПГБК предложено использовать методику кислотного титрования кислотой избытка щелочи, не пошедшего на гидролиз эфира, а их натриевых солей - метод неводного титрования.

9. На основании проведенных исследований разработаны и утверждены 7 проектов ФС «Метилпарагидроксибензоат», «Пропилпарагидроксибен-зоат», «Этилпарагидроксибензоат», «Бутилпарагидроксибензоат», «Натрия метилпарагидроксибензоат», «Натрия пропилпарагидроксибензоат», «Натрия бутилпарагидроксибензоат».