Анализ и стандартизация хондроитинсульфата натрия

Шкарина, Татьяна Николаевна

Диссертации по фармакологии → Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Анализ и стандартизация хондроитинсульфата натрия

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Шкарина, Татьяна Николаевна Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 15.00.02

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Анализ и стандартизация хондроитинсульфата натрия

На правах рукописи

ШКАРИНА Татьяна Николаевна

АНАЛИЗ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТА НАТРИЯ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Институте стандартизации и контроля лекарственных средств Федерального государственного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Росздравнадзора

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук

Доктор химических наук, член-корр. РАН, профессор

Багирова Валерия Леонидовна

Каухова Ирина Евгеньевна

Дюмаев Кирилл Михайлович

Ведущая организация:

ФГУ «Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов»

Защита состоится <Л40(1Л- 2009 г. в № на заседании

диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216 г. Москва, ул. Грина, 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР РАСХН по адресу: 117216 г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан « IV » МДА. 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 006.070.01 доктор фарм. наук

Громакова А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Создание качественных, эффективных и безопасных лекарственных средств - основная задача фармации, и в условиях современного развития мировой экономики одним из направлений решения указанной задачи является гармонизация требований фарма-копей к качеству субстанций и лекарственных препаратов.

Хондроитинсульфат натрия (ХСН), представитель группы гликоза-миногликанов, широко используется для лечения различных видов остео-артроза и остеохондрозов. Его источником являются хрящевая ткань крупного рогатого скота (КРС), свиней, а также куриный и акулий хрящи. В медицинской практике ХСН применяют в виде таблеток, капсул, мазей, линиментов, растворов и лиофилизированных форм. На территории Российской Федерации зарегистрировано около 65 наименований препаратов на его основе.

Монографии на ХСН включены в ведущие зарубежные фармакопеи (с 2002 г. в ШР и с 2006 г. в Еиг.РЬ., Вг.РЬ.). В России с 1996 г. осуществляется выпуск ХСН из трахей КРС, контроль его качества проводился по ФС 42-3741-99, срок действия которой истёк, и согласно частным НД фирм-производителей.

Сравнительный анализ отечественных и зарубежных фармакопейных статей показал, что в них указаны разные источники получения ХСН, и они различаются по показателям качества, методикам анализа, нормам допустимых отклонений и нуждаются в гармонизации.

Таким образом, разработка фармакопейного стандарта качества на субстанцию ХСН, гармонизированного с требованиями зарубежных фар-макопей, является актуальной проблемой отечественной фармацевтической науки на современном этапе ее развития.

Цель работы, основные задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка стандарта качества на субстанцию ХСН, гармонизированного с требованиями зарубежных фармакопей. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести сравнительный анализ уровня требований отечественных и зарубежных нормативных документов к качеству субстанций ХСН;

- изучить требования фармакопей и фактические данные по внешнему виду и растворимости ХСН;

- изучить методы и методики анализа, используемые для подтверждения подлинности, определения чистоты и выбрать оптимальные;

- провести сравнительный анализ фармакопейных методик количественного определения ХСН с помощью процедуры валидации;

- изучить возможность использования ИК спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) в анализе субстанций ХСН и его лекарственных форм.

Научная новизна исследования

Проведено изучение ХСН из разных источников - хрящевой ткани наземных животных и акул с учетом современных требований фармацевтической науки.

Изучены спектральные характеристики ХСН из хрящей КРС, свиней, птиц и акул в ближней ИК-области.

На основе анализа свойств ХСН было предложено для подтверждения его подлинности использовать комплекс методов: анализ функциональных групп и связанных сульфатов (ИК-спектроскопия), натрия (реакция с калия антимонатом), определение молекулярной массы (вискозиметрия), электрофоретической подвижности (электрофорез в агарозном геле), оптического вращения (поляриметрия).

В проект ФС для характеристики чистоты субстанций ХСН введены новые показатели: свободные сульфаты и хлориды, содержание белка и примеси родственных соединений.

С помощью процедуры валидации установлено, что спектрофото-метрическая методика количественного определения ХСН по методу Ди-ше (ФС), и турбидиметрическая методика титрования раствором цетилпи-ридиния хлорида (Вг.РЬ., Еиг.РЬ., ШР) не являются гармонизированными.

Показана применимость отечественного государственного стандартного образца (ГСО) для количественного определения ХСН методом тур-бидиметрического титрования.

Практическая значимость исследования

Показана возможность применения метода ИК-спектроскопии НПВО для подтверждения подлинности ХСН из различных источников и в его лекарственных формах - капсулах и лиофилизатах для приготовления растворов для внутримышечного введения. Разработанные на основе НПВО методики анализа ХСН являются экспрессными, объективными и экономичными по сравнению с используемой в настоящее время методикой ИК-спектроскопии пропускания в дисках калия бромида.

С помощью процедуры валидации проведён выбор метода количественного определения ХСН и установлена применимость отечественного стандартного образца для количественного определения методом турби-диметрического титрования раствором цетилпиридиния хлорида.

На основании проведенных исследований составлен проект ФС «Хондроитинсульфат натрия» для ГФ XII изд., гармонизированный с требованиями зарубежных фармакопей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований ХСН из различных источников по внешнему виду и растворимости.

2. Выбор методик подтверждения подлинности ХСН.

3. Результаты исследований по использованию метода НПВО для подтверждения подлинности ХСН в субстанциях и в ряде лекарственных форм на его основе.

4. Результаты сравнения и выбора методик определения чистоты субстанций ХСН, в том числе, результаты исследования примесей родственных гликозаминогликанов в субстанциях ХСН с помощью электрофо-ретических методов (электрофорез в агарозном геле, на плёнках из ацетата целлюлозы, капиллярный электрофорез) и определения содержания белка в образцах ХСН.

5. Результаты сравнения методик количественного определения ХСН с использованием процедуры валидации.

6. Результаты исследований применимости отечественного ГСО ХСН для количественного определения методом турбидиметрического титрования.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на научной конференции ПГФА (Пятигорск, 2007 г.), научно-практической конференции ФГУ «НЦЭСМП» «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва, 2006г.), научной конференции ИСКЛС ФГУ «НЦЭСМП» (Москва, 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 1 - в журнале, рекомендованном ВАК.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с темой ИСКЛС ФГУ «НЦЭСМП» «Разработка принципов и методов контроля различных групп биотехнологических препаратов».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста (без приложения), состоит из введения, обзора литературы, 7 глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы, приложения. Диссертационная работа проиллюстрирована 10 таблицами, 1 схемой и 44 рисунками. Список литературы включает 178 источник, в том числе 44 отечественных и 134 на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектами настоящего исследования являлись образцы ХСН из хрящей КРС, свиного, куриного и акульего хрящей отечественных и зарубежных производителей, а также лекарственные формы ХСН в виде таблеток, капсул, растворов, мазей, гелей и лиофилизатов для приготовления растворов для внутримышечного введения.

В работе использованы стандартные образцы: Государственный стандартный образец (ГСО) ХСН; стандартный образец USP CSS RS; образцы фирмы Sigma: натриевая соль хондроитинсульфата С (хондроитин 6-сульфат;ХСН-6) из хряща акулы (С4384); натриевая соль хондроитинсульфата А из трахеи быка (С9819); ХСН из хряща быка (С6737).

Поглощение образцов в дисках калия бромида (1:100) в средней ИК-области (4000-400 см"1) снимали на однолучевом ИК-Фурье спектрометре Digilab Со Pharmalyzir, США. ИК-спектры однократного нарушенного полного отражения (НПВО) в средней области снимали на том же приборе, но с использованием приставки MIRacle с кристаллом из алмаза под углом 45°. Разрешение 4 см"1, количество сканирований 32, область измерения от 650 до 4000 см"1, базовая линия проводилась по воздуху.

ИК-спектры поглощения в ближней ИК-области снимали на Nicolet Antaris Near - IR Analyser (Termo Electron Corporation, США) с детектором YnGaAs и с пробником (щупом)., сканирование — 16, усиление - 4, разрешение 4 см"1, диапазон измерения от 4000 до 10000 см"1.

Угол вращения плоскости поляризации измеряли на поляриметре Ро-latronic NHZ фирмы Schmidt +Haensch, Германия). ,

Электрофорез на пленках из ацетата целлюлозы и в агарозном гелео-существляли на приборе Fiat bed apparatus FBE-3000 фирмы «Pharmacia Fine Chemicals», Швеция в 0,1 M и 1,0 M буферных растворах бария ацетата, рН 5,0, соответственно. Окрашивание проводили 0,1 % раствором толуидинового синего.

Исследования методом капиллярного электрофореза проводили на приборе Agilent 3DCE в полом кварцевом капилляре (внутренний диаметр - 50,0 мкм; длина - 64,5 см; эффективная длина - 56,0 см) в 36 мМ фосфатном буфере (рН 3,5). Условия проведения: полярность - отрицательная; приложенное напряжение 30 кВ или 20 кВ; время ввода-10 сек или 20 сек при давлении 50 мбар; длина волны детектирования 192 нм; температура- 30 °С.

. Характеристическую вязкость 2,5 % растворов образцов в 0,2 M растворе натрия хлорида измеряли при 25 °С на капиллярном вискозиметре Оствальда с временем истечения воды от 80 до 120 с.

Количество азота определяли методом Кьельдаля [ОФС 42-0052-07] на автоматической установке для перегонки и титрования Vapodest 50 фирмы «Gerhardt», Германия, содержание белка - по методу Лоури [ОФС 42-0053-07].

Количественное определение хондроитинсульфата натрия проводили спектрофотометрическим по методу Дише (ФС) и титриметрическим (титрование 0,4 % раствором цетилпиридиния хлорида) методами (Br.Ph., Eur.Ph.).

Все спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре Agilent 8453 фирмы Agilent Technologies.

Хроматографические исследования (Гель-эксклюзионная ВЭЖХ) проводили на Жидкостном хроматографе высокого давления фирмы Agilent Technologies модель 1200, оборудованном спектрофотометрическим и рефрактометрическим детекторами с использованием колонки TSK-Gel G3000SW 7,5x600 мм в 0,9 % растворе натрия хлорида с добавлением 0,1 % раствора натрия азида. Температура детектора: 30 °С. Скорость потока: 1,0 мл/мин.

Определение остаточных органических растворителей проводили методом ГЖХ по ОФС 42-0057-07 на приборе Agilent 6890 (США), оборудованном пламенно-ионизационным детектором.

Стандартизация ХСН

Сравнительный анализ требований отечественной и зарубежных фармакопей к качеству ХСН показал, что они различаются по методикам анализа, используемым для подтверждения подлинности ХСН, определения его чистоты и методам его количественного определения, на основании чего был сделан вывод о необходимости проведения экспериментальных исследований для гармонизации требований.

Внешний вид и растворимость ХСН

Визуальный анализ внешнего вида субстанций ХСН из разных источников и их микроскопическое исследование показало, что существующие на фармацевтическом рынке субстанции различаются по оттенку цвета, форме и размерам частиц порошка. Все образцы ХСН оказались гигроскопичными. Полученные результаты были учтены при формировании раздела «Описание».

Актуализированы требования к растворимости субстанций ХСН. В проект ФС включена двойная градация растворимости в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида, а также растворимость в ацетоне, спирте этиловом 96 %. Хлороформ как наиболее токсичный растворитель исключен.

Подтверждение подлинности хондроитинсульфата натрия

Подлинность ХСН (табл.1) подтверждается с помощью качественных реакций и физико-химических методов анализа (ИК-спектроскопия, электрофорез, поляриметрия, вискозиметрия, гравиметрия).

Для подтверждения присутствия натрия в субстанции ХСН включена методика с калия антимонатом, как простая в выполнении и не требующая дорогого реактива и специального оборудования.

Описанная в ФС цветная реакция на уроновые кислоты (компонент дисахаридной единицы ХСН) исключена, т.к. почти все типы гликозами-ногликанов содержат в своём составе уроновые кислоты.

Таблица 1

Фармакопейные методики подтверждения подлинности ХСН

Показатель качества ФС 42-3741-99 «Хондроитин сульфат» USP30-NF25 «Chondroitin sulphate sodium» Eur.Ph. / Br.Ph. «Chondroitin sulphate sodium»

Подлинность реакция на уроновые кислоты с раствором карбазола (розовое окрашивание, переходящее в фиолетовое). l.IIK-спсктроскопия поглощения в таблетках калия бромида 2. Реакция на натрий с калия антимонатом и по окрашиванию пламени в желтый цвет. 3. Электрофорез на пленках из ацетата целлюлозы 1. ИК-спекгроскопия поглощения в таблетках калия бромида 2. Реакция на натрий с метоксифенилуксус-ным реактивом 3. Электрофорез в ага-розном геле

Сера, % не более 7,5 %

Специфическое оптическое вращепие, град. от -18 до -28 в пересчете на сухое вещество (1% раствор) от -20,0 до-30,0 (3% раствор) для ХСН из наземных животных: от -20 до -30 в пересчете на сухое вещество (5% раствор); для ХСН из морских животных: от -12 до -19 в пересчете на сухое вещество)

Характеристическая вязкость не менее 0,2 и не более 0,3 от 0,01 до 0,15 м7кг

При исследовании возможности использования ИК-спектроскопии для подтверждения подлинности ХСН установлено, что ИК спектры НПВО и ИК спектры пропускания в дисках калия бромида гликозаминог-ликанов практически не различаются.

Показана специфичность ИК-спектров пропускания в дисках калия бромида и спектров НПВО в средней области, а также спектров отражения в ближней ИК-области (БИК) ХСН по отношению к близкородственным

по структуре соединениям (гепарин, дерматансульфат, гиалуроновая кислота и сульфатированные гликозаминогликаны роговицы (рис. 1).

Рис. 1. ИК спектры в дисках калия бромида (А) и спектры НПВО (Б) гли-козамипогликанов: 1- ХСН; 2 - гепарин; 3- гиалуроновая кислота; 4 - дерматансульфат; 5- сульфатированные гликозамнногликаны роговицы глаз свиней

Особенностью применения ИК-спектроскопии в анализе ХСН является возможность идентификации источника получения ХСН из-за наличия в его структуре сульфогрупп. В ХСН сульфогруппы обнаруживают себя в виде полос поглощения при 850 см"1 (хоцдроитин-4-сульфат, ХСН-4) или 820 см"1 (хондроитин-6-сульфат, ХСН-б). Согласно полученным спектрам НПВО и Ж спектрам пропускания ХСН из трахей КРС, куриного и свиного хрящей, также как и ГСО ХСН, преимущественно, содержат ХСН-4 (рис. 2), а ХСН из хрящей акул - ХСН-6.

j Б У"»

4000 3000 2000

Волновое число.см"1

Рис. 2. ИК спектры пропускания в дисках калия бромида (А) и спектры НПВО (Б) хондроитинсульфата натрия из различных источников: из хрящей крупного рогатого скота (1); свиньи (2); кур (3); акул (4).

При визуальном сравнении спектров ХСН, полученных из разных источников, в ближней области между ними не было выявлено каких-либо различий (рис. 3).

10000 9000 8000 7000 6000 5000 Волновое число, см"1

9000 8000 7000 6000 5000 Волновое число, см'1

Рис. 3. ПК спектры в ближней области (БИК) образцов ХСН (А) из хрящей: КРС (1); свиней (2); кур (3); акул (4) и разных гликозаминогликанов (Б): ХСН (1);дерматансульфата (2); гепарина (3); гиалуроновой кислоты (4); сульфатированных гликозаминогликанов из роговицы глаз КРС (5)

При визуальном сравнении БИК спектров ХСН и других типов гликозаминогликанов между ними наблюдаются незначительные различия (рис.3), но менее выраженные, чем наблюдаемые в средней области ИК-диапазона.

Поэтому для подтверждения подлинности ХСН следует использовать оба метода ИК-спектроскопии в средней области (пропускания в дисках калия бромида и НПВО).

Специфической характеристикой ХСН как сульфатированного гли-козаминогликана является наличие и количество связанных с его молекулой сульфатов (серы). Во всех образцах содержание серы, определённое гравиметрическим методом, основанным на осаждении сульфат-ионов в виде сульфата бария после разрушения органического вещества, укладывалось в нормы ФС и составляло для ХСН: из хрящей акулы - 6,6; из трахей КРС - 5,5-6,5; из хряща свиньи - 5,7; из куриного хряща - 5,1.

О присутствии сульфатных групп в молекулах ХСН можно судить по ИК спектрам, а об их количестве - по содержанию сульфатной золы. Поэтому определение содержания серы (связанных сульфатов), как дублирующий показатель не включено в проект ФС.

ХСН является оптически активным веществом и подтверждение его оптических свойств проводится с помощью поляриметрии. Сравнение с другими типами ГАГ показало различие, как по величине удельного оптического вращения, так и по направлению вращения плоскости поляризации. Гепарин вращает плоскость поляризации вправо (от +32 0 до +55 °), ХСН - влево (от -10 ° до -30 °). Сульфатированные гликозаминогликаны

из роговицы глаз КРС и свиней имеют более низкие значения показателя (от -10 ° до -20 °) за счет присутствия в них правовращающего кератан-сульфата.

Экспериментальное исследование ХСН из хрящей разных животных показало, что величина удельного оптического вращения исследуемых образцов зависит от источника его выделения и варьирует в пределах от -20,0 ° до -28,0 ° для ХСН из свиней, КРС и птиц, отличаясь от значений, определенных для ХСН из хрящей акулы (около -19,0

Специфической характеристикой ХСН является также его молекулярная масса, которую косвенно нормируют через характеристическую вязкость. Более вязкие растворы были получены с использованием ХСН из куриного хряща (0,59), менее вязкие - ХСН из трахеи КРС (0,2-0,4) и свиньи (0,34).

Параллельно была изучена возможность определения молекулярной массы ХСН с помощью гель-эксклюзионной хроматографии. В качестве маркеров при построении калибровочной кривой использованы образцы ХСН производства «Нью Зеланд Фармасьютикалс» с известной молекулярной массой (от 14,6 кДа до 26,7 кДа).

Ширина пика на хроматограммах, полученных с помощью рефрактометрического детектора, свидетельствует о большом разбросе молекулярной массы ХСН (рис. 4Б), что связано с тем, что ХСН представляет собой смесь молекул с разной длиной цепи.

Рис. 4. Хроматограммы ГСО ХСН (1) и ХСН из свиного хряща (2). Регистрация с помощью спектрофотометрического (А) и рефрактометрического (Б) детекторов.

Получены следующие значения молекулярных масс ХСН: от 15,1 до 29,0 кДа (фирма «Биоиберика»), от 14,6 до 26,7 кДа (фирма «Нью Зеланд Фармасьютикалс»), от 19,5 до 33,1 кДа (ОАО «Синтез»), 31,9 кДа (ХСН из хряща свиньи), 27,5 кДа (USP CSS RS). Метод может дать много интерес-

ной информации о молекулярной массе ХСН и наличии высокомолекулярных примесей в нем, но необходимость использования набора стандартов ХСН с известными молекулярными массами делает его малопригодным для контроля качества субстанций.

Изучение дополнительных спектральных характеристик показало, что ГСО ХСН не содержал примесей, в отличие от других исследуемых образцов ХСН (рис. 5).

Для этого область пика на хроматограмме, полученной со спектро-фотометрическим детектором (регистрация при 210,4 нм), была поделена на несколько фракций, для каждой из которых был получен спектр в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм.

320 360

Длина волны, нм

300 340 380

Длина волны, нм

Рис. 5. Спектры ГСО ХСН (А) и ХСН из свиного хряща (Б) в разных фракциях пика.

Для подтверждения подлинности ХСН, а также определения примесей родственных соединений в нем используется метод электрофореза.

Хондроитинсульфат

Дерматансульфат

Гепарин, быстро движущаяся фракция

Гепарин, медленно движущаяся фракция

Рис. 6. Электрофорез в 0,5 % агарозном геле в 1 М растворе бария ацетата, рН 5,0: ХСН из трахей КРС (1, 2), смесь ХСН, гепарина и дерматансульфа-та (3, 4), гепарин (5, 6,); дерматансульфат (7).

Установлено, что электрофорез в агарозном геле (Вг.РЬ., Еиг.РЬ.) является более чувствительным методом по сравнению с электрофорезом на плёнках из ацетата целлюлозы (ШР).

Увеличение времени проведения испытания (до 3,5 часов), использование малой толщины пластины геля (около 3 мм) и выбранной согласно данным литературы концентрации агарозы (0,5 %) позволило провести более полное разделение ХСН, гепарина (его быстро- и медленно-движущихся фракций) и дерматансульфата (рис. 6, 7).

Хондроитинсульфат Дерматансульфат Гепарин Я

1 2 3 4 5 6

Рис. 7. Электрофорез на плёнках из ацетата целлюлозы в 0,1 М растворе бария ацетата, рН 5,0: ХСН, концентрация 30 мг/мл (1); гепарин (2); ХСН, концентрация 0,6 мг/мл (3); дерматансульфат (4); смесь гепарина, ХСН и дерматансульфата (5,6).

Было также проведено изучение образцов ХСН из разных источников, дерматансульфата и гепарина методом капиллярного электрофореза в полом немодифицированном капилляре в условиях, предложенных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарств США (FDA) для выявления примесей гиперсульфатированного ХСН в гепарине, и установлено, что указанный метод не имеет явного преимущества перед другими электрофоретическими методиками анализа ХСН.

: ■ ■■■ А

1 fefl .: ir . М, __________1

Рис. 8. Электрофореграмма смеси ХСН и гепарина.

На электрофореграммах образцов гепарина, дерматансульфата, ХСН из разных источников, смеси дерматансульфата и ХСН наблюдался один пик. Получить электрофореграмму ГЛК в указанных условиях не удалось.

В указанных условиях удаётся получить разделение только ХСН и гепарина (рис. 8).

После проведенного сравнения электрофоретических методов в проект ФС включен метод электрофореза в агарозном геле, как обладающий большей чувствительностью.

Характеристики чистоты хондроитинсульфата натрия

Наибольшее количество различий было выявлено при анализе показателей чистоты ХСН (табл. 2).

При рассмотрении требований к прозрачности и цветности растворов ХСН установлено, что требования ФС являются более жесткими в силу того, что в ФС используются растворы более высокой концентрации и измеренные нами при длине волны 420 нм оптические плотности описанных эталонов цветности оказались гораздо ниже нормируемого в USP значения (0,35 %). Следует отметить, что в USP описаны требования к ХСН, используемому при производстве пищевых добавок.

Экспериментально установлено, что оптические плотности 5 % водных растворов ХСН, полученных из трахей КРС разных фирм-производителей, хрящей свиней и кур, при длине волны 420 нм не превышали установленную фармакопеей норму (0,35) [USP] и лежали в интервале от 0,04 до 0,15.

ХСН в организме обычно присутствует в составе протеогликанов. Поэтому содержание белка, как возможного источника аллергических и прочих нежелательных реакций, обязательно должно быть нормировано.

При определении содержания белка, проведенного по методу Лоури, установлено, что исследуемые образцы ХСН содержали от 0,6 до 3,0 % белка, независимо источника получения ХСН, что позволило рекомендовать допустимую норму его содержания - 3 %.

Содержание азота в субстанциях ХСН также является показателем их чистоты, т.к. оно определяется не только азотом дисахаридной структурной единицы молекулы ХСН, но и присутствием примесного белка и, возможно, низкомолекулярных пептидов и аминокислот.

Количество азота в образцах ХСН из хрящей КРС, свиней и кур составляло от 2,0 % до 3,6 %. Поэтому для субстанций, предназначенных для изготовления твердых дозированных лекарственных форм и мазей, нормы его содержания расширены до 4,0 %.

На основании экспериментальных исследований увеличена также норма допустимого содержания воды в субстанциях ХСН до 12 % (при высушивании в течение 4 часов при 105 °С).

При исследовании остаточных органических растворителей установлено, что во всех образцах ХСН их содержание не превышало установленных фар-макопеями норм.

Исследуемые образцы по содержанию свободных сульфатов, хлоридов, сульфатной золы, тяжелых металлов, значениям потери в массе при высушивании и рН растворов укладывались в нормы, предложенные в проекте ФС и указанные в табл.2.

Таблица 2

Фармакопейные методики определения чистоты ХСН_

Показатель качества Проект ФС ФС42- 3741-99 «Хоидроитин сульфат» USP30-NF25 «Chondroitin sulphate sodium» Eur.Ph. / Br.Ph. «Chondroitin sulphate sodium»

Прозрачность раствора Опалесценция 10 % раствора не должна превышать опалес-ценцию эталона I -для субстанции, предназначенной для приготовления растворов и эталона III - для субстанции, предназначенной для приготовления твёрдых дозированных форм для перо-рального применения и мазей. степень мутности 10 % раствора для субстанций, используемых для производства парентеральных лекарственных форм, - не интенсивнее эталона I; для приготовления мази - не более эталона 3. оптическая плотность 5 % раствора при длине волны 420 нм должна быть не более 0,35

Цветность раствора окраска раствора, полученного в испытании на Прозрачность раствора, должна быть не интенсивнее окраски эталона Y4. окраска 10 % раствора для субстанций, используемых для производства парентеральных лекарственных форм, - не интенсивнее эталона 66; для субстанции, используемой для приготовления мази -не интенсивнее эт. 56 оптическая плотность 5 % раствора при длине волны 420 нм должна быть не более 0,35

Продолжение Таблицы 2

Потеря в массе при высушивании не более 10 % (1,0 г; при 105 "С до постоянной массы) не более 10,0 % (0,2 г; при 105 °С до постоянной массы) не более 10 % (1,0 г; при 105 "С в течение 4 час) не более 12,0 % (1 г; при 105 °С в течение 4 час)

Хлориды не более 0,50 % - не более 0,50 % не более 0,50 %

Сульфаты не более 0,24 % - не более 0,24 % -

Белок, % Не более 3,0 в пересчете на сухое вещество Не более 6,0 Не более 3,0

Азот,% От 2,0 % до 3,0 % в пересчете на сухое вещество - для субстанции, предназначенной для приготовления инъекционных растворов, от 2,0 % до 4,0 % - для субстанции, предназначенной для приготовления твёрдых дозированных форм для перорального применения и мазей 2,0 - 3,0 в пересчёте на сухое вещество

Сульфатная зола от 20 до 30 % в пересчете на сухое вещество не более 30,0% (из 0,5 г) от 20 до 30 % в пересчете на сухое вещество

Тяжелые металлы, % не более 0,002% - не более 0,002% (тио-ацетамидный метод) не более 20 ррт (тно-ацетамидный метод)

Остаточные органические растворители выдерживает требования ОФС «Остаточные органические растворители» спирт этиловый -не более 2,0 % выдерживает требования статьи <467>

После проведения теоретического и экспериментального исследования в проект ФС введены новые показатели чистоты субстанций ХСН: свободные сульфаты и хлориды (показатели, свидетельствующие о полноте отмывки от используемых в процессе выделения ХСН кислот, щелочей), содержание белка (характеристика отделения от связанного с ХСН в составе протеогликанов белка) и родственные вещества (примеси глико-заминогликанов).

Количественное определение ХСН

Существуют две фармакопейные методики количественного определения ХСН.

Методика 1 основана на кислотном гидролизе ХСН и последующем спектрофотометрическом определении его по уроновым кислотам, входящим в состав дисахаридной единицы ХСН (метод Дише).

В методике 2 используется турбидиметрическое титрование, основанное на способности ХСН образовывать с цетилпиридиния хлоридом нерастворимую в воде ионную пару.

В обеих методиках используются стандартные образцы ХСН.

Для сравнения методик была использована процедура валидации. С этой целью был проведен трёхуровневый эксперимент по три опыта на каждом уровне. Диапазон измерений был выбран, исходя из варьирования навески вещества (табл. 5). Перед началом анализа все образцы высушивались при температуре 105 °С до постоянной массы.

При проведении методики 2 использовали визуальную регистрацию точки эквивалентности, титрование проводили 0,4 % раствором цетилпиридиния хлорида при интенсивном перемешивании до образования крупных белых хлопьев (при этом раствор становился прозрачным).

В обеих методиках в качестве стандартного образца использовался ГСО ХСН.

Статистическая обработка результатов эксперимента (табл.3) проводилась по ГФ XI. Полученные результаты были проверены на однородность выборки с помощью (^-критерия и установлено, что они не отягощены грубой погрешностью.

Установлено, что зависимости между навеской субстанции и оптической плотностью (методика 1) и объемом титранта (методика 2) имеют линейный характер (г! = 0,999806; г2 = 0,999988) и описываются уравнениями:

у,= 5,1681х-0,002 (Методика 1); у2= 128,14х + 0,1874 (Методика 2).

Методика 1

0,020

0,040 навеска, г

Рис. 9. Зависимость оптической плотности испытуемых растворов от количества ХСН (Методика 1).

Методика 2

¿0.00 Е

J ? 5,00

о "

|"о,оо

0,0000 0,0100 0,0200 0,0300 0,0400 0,0500 0,0600 0,0700 навеска, г

Рис. 10. Зависимость объема титранта от количества ХСН (Методика 2).

Методики сравнивали по средним значениям и дисперсиям. Величина критерия Стьюдента (1,55) была меньше табличной (t 95 %д6= 2,12), а значение критерия Фишера (9,26) превосходило табличное значение (F99 %, 8,g.= 6,03), что обусловлено большой погрешностью методики 1 (6 %). Поэтому методики не могут считаться гармонизированными.

Следует отметить, что при анализе результатов количественного определения ХСН по методике 2 выявлена тенденция к незначительному их увеличению в области низких концентраций ХСН.

Особенно это различие было видно при выполнении титрования с обычной для этого метода скоростью. Линия тренда методики 2, построенная по точкам, соответствующим средним значениям результатов, полученных на трех уровнях диапазона измерения, не проходит через начало координат (рис. 10).

Наряду с визуальным способом регистрации точки эквивалентности в фармакопеях предусмотрено фотометрическое определение с использованием специального датчика, фототрода. Исследования, полученные с использованием фототрода фирмы Mettler Toledo, продемонстрировали сохранение той же тенденции.

Использование калибровочной кривой и ограничение скорости титрования вблизи точки эквивалентности до 0,04 мл/мин, позволило уменьшить ошибку определения содержания ХСН методом турбидиметрическо-го титрования с 4 % до 2 %.

На основании проведенного исследования в проект ФС включена методика 2 количественного определения ХСН в субстанциях с двумя альтернативными способами регистрации точки эквивалентности - визуальным и фотометрическим с использованием фототрода.

Актуальным является вопрос об использовании стандартного образца ХСН в методике количественного определения. В зарубежных фармакопеях с этой целью используется USP Chondroitin Sulfate Sodium RS (USP CSS RS) и BP Chondroitin Sulfate Sodium CRS.

Таблица 3.

Результаты количественного определения ХСН_

Уровень Методика 1 Методика 2

Навеска, г Оптическая плотность * Найденное количество, % Навеска, г Объем тит-ранта, мл ** Найденное количество, %

Нижний уровень 0,0360 0,0405 0,0444 0,1814 0,2117 0,2275 96,97 100,59 98,61 0,0380 0,0409 0,0429 5,02 5,40 5,74 97,78 97,73 99,04

Среднее значение уровня 0,0403 0,2069 98,72 0,0406 5,39 98,18

Средний уровень 0,0457 0,0494 0,0542 0,2326 0,2465 0,2830 97,94 96,03 100,49 0,0477 0,0512 0,0528 6,32 6,70 7,00 98,07 96,86 98,13

Среднее значение уровня 0,0498 0,2540 98,15 0,0506 6,67 97,69

Верхний уровень 0,0555 0,0602 0,0642 0,2825 0,3060 0,3369 97,96 97,81 100,99 0,0594 0,0572 0,0600 7,80 7,54 7,84 97,20 97,57 96,72

Среднее значение уровня 0,0600 0,3085 98,92 0,0589 7,73 97,16

Уровень диапазона Метрологические характеристики

х,% S2 S х I Sr ±Дх ±Д х ± е ± Е

Методика 1

Нижний 98,72 3,27 1,04 1,83 7,78 4,49 7,88 4,55

Средний 98,15 5,00 1,29 2,28 9,61 5,55 9,79 5,65

Верхний 98,92 3,23 1,04 1,82 7,73 4,46 7.81 4,51

Диапазон измерения 98,60 2,88 0,57 1,72 4,00 1,33 4,06 1,37

Методика 2

Нижний 98,18 0,549 0,43 0,75 3,19 1,84 3,24 1,87

Средний 97,69 0,514 041 0,73 3,08 1,78 3,16 1,82

Верхний 97,16 0,183 0,25 0,44 1,84 1,06 1,89 1,09

Диапазон измерения 97,68 0,311 0,19 0,57 1,32 0,44 1,35 0,45

* - Средний результат трёх определений. ** - Средний результат двух определений.

С 2003 г. фирмой «Sigma» выпускается коммерческий образец ХСН (С6737), предназначенный для количественного определения методом турбидиметрического титрования.

В России выпускается ГСО ХСН. Для решения вопроса о его применимости для количественного определения ХСН методом турбидиметри-ческого титрования методика 2 была выполнена по ранее указанной схеме, но с использованием двух стандартных образцов (ГСО ХСН и USP CSS RS). Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Результаты количественного определения ХСН с использованием

разных стандартов по методике 2.

Уровень ГСО ХСН USP CSS us

Навеска, г Объем тит-ранта, мл * Найденное количество, % Навеска, г Объем тит-ранта, мл * Найденное количество, %

Нижний уровень 0,0380 0,0409 0,4290 5,02 5,40 5,74 97,78 97,73 99,04 0,0356 0,0427 0,0432 4,74 5,64 5,78 98,26 97,48 98,74

Среднее значение уровня 0,0406 5,390 99,04 0,0405 5,39 98,16

Средний уровень 0,0477 0,0512 0,0528 6,32 6,70 7,00 98,07 96,86 98,13 0,0452 0,0507 0,0541 5,98 6.78 7,12 97,64 98,69 97,13

Среднее значение уровня 0,0506 6,67 97,69 0,0500 6,63 97,82

Верхний уровень 0,0594 0,0572 0,0600 7,80 7,54 7,84 97,20 97,57 96.72 0,0565 0,0608 0,0639 7,56 8,02 8,42 98,75 97,35 97,25

Среднее значение уровня 0,0589 7,73 97,16 0,0604 8,00 97,78

Уровень диапазона Метрологические характеристики

х,% S2 S х Sr ±Дх ±Д х ± Е ± е

ГСО ХСН

Нижний 98,18 0,549 0,43 0,75 3,19 1,84 3,24 1,87

Средний 97,69 0,514 0,41 0,73 3,08 1,78 3,16 1,82

Верхний 97,16 0,183 0,25 0,44 1,84 1,06 1,89 1,09

Диапазон измерения 97,68 0,311 0,19 0,57 1,32 0,44 1,35 0,45

USPCSSRS

Нижний 98,16 0,407 0,37 0,65 2,74 1,58 2,79 1,61

Средний 97,82 0,636 0,46 0,82 3,43 1,98 3,51 2,02

Верхний 97,78 0,705 0,48 0,86 3.61 2,08 3,69 2,13

Диапазон изме-1 рения 97,92 0,437 0,22 0,68 1,56 0,52 1,59 0,53

* - Средний результат двух определений.

Вычисленные значения критерия Фишера (1,41) и критерия Стью-дента (0,90) были меньше табличных, что позволяет сделать вывод о возможности применения ГСО ХСН для количественного определения ХСН по методике 2.

Анализ лекарственных форм ХСН методом НПВО. Вопрос об идентификации ХСН в его лекарственных формах достаточно актуален, т. к., в основном, для этого используют неспецифическую реакцию с карба-золом. В настоящем исследовании проведено исследование методом НПВО лекарственных средств на основе ХСН: таблеток, капсул, растворов, мазей, гелей, лиофилизированных форм и установлена возможность его использования для подтверждения подлинности ХСН в лиофилизатах для приготовления растворов для внутримышечного введения и капсулах (рис.11 и 12).

Волновое число, см"1

Рис. 11. Спектры НПВО ХСН из хряща КРС (1) и лиофилизированных форм ХСН: препаратов «Хондролон» (2) и Хондростим (3).

Рис. 12. Спектры НПВО ГСО ХСН (1) и содержимого капсул препаратов: Хондрекс, капсулы (2); Структум, капсулы 250 мг (3); Артра хоцдронтин, капсулы 250 мг (4); Хондроитин-АКОС, капсулы (5).

При проведении анализа содержимого капсул (рис. 12) обнаружено, что входящие в состав капсул вспомогательные вещества: тальк (Структум); рисовая мука, кремния диоксид, магния стеарат (Артра хондроитин); сахар молочный, кальций стеариновокислый или стеариновая кислота (Хондроитин-АКОС, капсулы) не мешают данному определению.

При этом отмечено, что метод ИК-спектроскопии НПВО в некоторых случаях (Хондроитин-АКОС, капсулы) позволяет идентифицировать содержащиеся в их составе стеариновую кислоту или кальций стеарино-вокислый (область 2850-2980 см"1).

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Установлена необходимость в разработке отечественного стандарта качества ХСН, гармонизированного с требованиями зарубежных фармакопеи.

2. Выявлено наличие на фармацевтическом рынке субстанций ХСН, различающихся по оттенку цвета, форме и размерам частиц порошка.

3. Установлено, что для подтверждения подлинности хондроитин-сульфата натрия следует использовать комплексный подход, учитывающий его сложную структуру: анализ функциональных групп и связанных сульфатов (ИК-спектроскопия), натрия (реакция с калия антимонатом), определение молекулярной массы (вискозиметрия), электрофоретической подвижности (электрофорез в агарозном геле), оптического вращения (по-ляриметрия).

4. Показана возможность использования метода НПВО для подтверждения подлинности гликозаминогликанов, в том числе ХСН, выделенного из разных источников и в ряде его лекарственных форм.

6. С помощью процедуры валидации установлено, что спектрофо-тометрическая методика количественного определения ХСН по методу Дише (ФС), и турбидиметрическая методика титрования раствором це-тилпиридиния хлорида (ВЯ.РЬ., Еиг.РЬ., иЭР) не являются гармонизированными. Для количественного определения содержания ХСН предложено использовать методику турбидиметрического титрования раствором цетилпиридиния хлорида с двумя альтернативными способами регистрации точки эквивалентности: фотометрическим и визуальным. Показана целесообразность использования калибровочной кривой и ограничения скорости титрования при выполнении методики турбидиметрического титрования.

7. Установлена применимость отечественного ГСО ХСН для количественного определения методом турбидиметрического титрования.

8. На основании проведенных исследований составлен проект ФС «Хондроитинсульфат натрия» для ГФ XII изд., гармонизированный с требованиями зарубежных фармакопей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исаева И.В., Шкарина Т.Н., Пешая Т.В. Стандартизация лекарственных препаратов гликозаминогликанов // Тезисы докладов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2003. - С. 718.

2. Шкарина Т.Н., Исаева И.В. Некоторые аспекты стандартизации хондроитин сульфата в составе лекарственных форм // Тезисы докладов XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2005.-С. 814.

3. Шкарина Т.Н., Исаева И.В. Установление подлинности гликозаминогликанов в составе лекарственных средств с использованием ИК-спектроскопии // Сборник материалов II Всероссийского съезда фармацевтических работников - Сочи, 2005. - С. 164-165.

4. Шкарина Т.Н., Ковалева C.B., Лутцева А.И. Идентификация гликозаминогликанов. Использование метода ИК-спектроскопии горизонтального нарушенного внутреннего полного отражения. // Тезисы докладов XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007.-С. 334.

5. Шкарина Т.Н., Ковалева C.B.,Павловская Л.П., Лутцева А.И. Идентификация натриевых солей хондроитин сульфата из различных источников. // Тезисы докладов XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007. - С. 39.

6. Шкарина Т.Н., Исаева И.В., Ковалева C.B., Пешая Т.В., Лутцева А.И. «Лекарственные средства, содержащие хондроитин сульфат» // Фармация. - 2007. - № 3. - С. 42-48.

7. Шкарина Т.Н., Исаева И.В. ИК-спектроскопия гликозаминогликанов // 62-я региональная конференция по фармации и фармакологии - Пятигорск, 2007. - Вып. 62. - С. 421-423.

8. Шкарина Т.Н. Натриевые соли хондроитин сульфата из различных источников. Содержание белка. // Тезисы докладов XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 570.

9. Шкарина Т.Н., Титова A.B., Багирова В.Л. Метод нарушенного полного внутреннего отражения в анализе хондроитинсульфата натрия в субстанциях и некоторых лекарственных формах // Тезисы докладов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2009. -С. 776.

10. Шкарина Т.Н., Титова A.B., Багирова B.JI. Сравнительный анализ фармакопейных методик количественного определения хондроитинсуль-фата натрия // Тезисы докладов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2009. - С. 776.

Подписано в печать: 20.05.2009

Заказ № 2094 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Оглавление диссертации Шкарина, Татьяна Николаевна :: 2009 :: Москва

Сокращения и обозначения.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.10

1.1. Гликозаминогликаны, их строение и использование в меди- 10-20 цинской практике.

1.2. Хондроитинсульфат натрия. Методы его анализа.21

Выводы из главы 1.48

Глава II. Объекты исследования, используемое в работе оборудование и анализ требований фармакопей к качеству хондроитин- 50-65 сульфата натрия.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Используемое оборудование и методики анализа.

2.2.1. Используемое оборудование.

2.2.2. Используемые методики анализа.

2.3. Сравнительные требования фармакопейных статей к качеству хондроитинсульфата натрия.

Выводы из главы II.

Глава III. Оценка качества хондроитинсульфата натрия по внешнему виду и растворимости.66

Выводы из главы III.

Глава IV. Подтверждение подлинности хондроитинсульфата на- 70трия.

4.1.ИК-спектроскопи я.

4.2. Поляриметрия.

4.3. Вискозиметрия.

4.4. Гравиметрический метод (Определение серы).

4.5. Электрофорез.

4.6. Качественные реакции.

4.6.1. Уроновые кислоты.

4.6.2. Натрий.

Выводы из главы IV.97

Глава V. Показатели чистоты.99

5.1. Азотсодержащие примеси (белок, азот).

5.2. Сульфатная зола.

5.3. Тяжелые металлы.

5.4. рН растворов, Сульфаты, Хлориды.

5.5. Прозрачность и цветность растворов.

5.6. Потеря в массе при высушивании.

5.7. Остаточные органические растворители.

5.8. Посторонние примеси.

Выводы из главы V.

VI. Количественное определение хондроитинсульфата натрия.112

Выводы из главы VI.119

VII. ИК-спектроскопия НПВО в лекарственных формах на 121 основе хондроитинсульфата натрия.

Выводы из главы VII.

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Шкарина, Татьяна Николаевна, автореферат

Актуальность исследования

Создание качественных, эффективных и безопасных лекарственных средств - основная задача фармации, и в условиях современного развития мировой экономики одним из направлений решения указанной задачи является гармонизация требований фармакопей к качеству субстанций и лекарственных препаратов.

Хондроитинсульфат натрия (ХСН), представитель группы гликозами-ногликанов, широко используется для лечения различных видов остеоартроза и остеохондрозов позвоночника. Его источником являются, хрящевая ткань крупного рогатого^ скота (КРС), свиней, а также куриный и акулий хрящи. В медицинской практике ХСН применяют в виде таблеток, капсул, мазей, линиментов, растворов .и лиофилизированных форм. На территории Российской Федерации зарегистрировано около 65 наименований препаратов на его основе.

Монографии на ХСН включены в ведущие зарубежные фармакопеи (с 2002 г. в USP и с 2006 г. в Eur.Ph., Br.Ph.). В России с 1996-г. осуществляется выпуск ХСН из трахей КРС, контроль его качества проводился по ФС 423741-99, срок действия' которой истёк, и согласно частным НД фирм-производителей. Сравнительный анализ отечественных и зарубежных фармакопейных статей показал, что в них указаны разные источники получения ХСН, и они различаются по показателям качества, методикам анализа, нормам допустимых отклонений и нуждаются в гармонизации.

Таким образом, разработка фармакопейного стандарта качества на субстанцию ХСН, гармонизированного с требованиями зарубежных фармакопей, является актуальной проблемой отечественной фармацевтической науки на современном этапе ее развития.

Цель работы, основные задачи исследования

- изучить требования фармакопей и фактические данные по внешнему виду и растворимости ХСН;

Научная новизна исследования

Впервые использована ИК-спектроскопия НПВО для идентификации разных типов гликозаминогликанов, в том числе ХСН из разных источников, а также ХСН в ряде его лекарственных форм. Изучены спектральные характеристики ХСН из хрящей КРС, свиней, птиц и акул в ближней ИК-области.

На основе анализа свойств ХСН было предложено для подтверждения его подлинности использовать комплекс методов: анализ функциональных групп и связанных сульфатов (ИК-спектроскопия), натрия (реакция с калия антимонатом), определение молекулярной массы (вискозиметрия), электро-форетической подвижности (электрофорез в геле), оптического вращения (поляриметр ия).

С помощью процедуры валидации установлено, что спектрофотомет-рическая методика количественного определения ХСН по методу Дише (ФС), и турбидиметрическая методика титрования раствором цетилпириди-ния хлорида (Br.Ph., Eur.Ph., USP) не являются гармонизированными.

Показана применимость отечественного государственного стандартного образца (ГСО) для количественного определения ХСН методом турбиди-метрического титрования.

Практическая значимость исследования

Показана возможность применения метода ИК-спектроскопии НПВО для подтверждения подлинности ХСН из различных источников и в его лекарственных формах — капсулах и лиофилизатах для приготовления растворов для внутримышечного введения. Разработанные на основе НПВО методики анализа ХСН являются экспрессными, объективными и экономичными по сравнению с используемой в настоящее время методикой ИК-спектроскопии пропускания в дисках калия бромида.

С помощью процедуры валидации проведён выбор метода количественного определения ХСН и установлена применимость отечественного стандартного образца для количественного определения методом турбиди-метрического титрования раствором цетилпиридиния хлорида.

На основании проведенных исследований составлен проект ФС «Хон-дроитинсульфат натрия» для ГФ XII изд., гармонизированный с требованиями зарубежных фармакопей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований ХСН из различных источников по внешнему виду и растворимости.

2. Выбор методик подтверждения подлинности ХСН.

-94. Результаты сравнения и выбора* методик определения» чистоты субстанций ХСН, в том числе, результаты исследования примесей родственных гликозаминогликанов в субстанциях ХСН с помощью электрофоретических методов (электрофорез в агарозном геле, на плёнках из ацетата целлюлозы, капиллярный электрофорез) и определения содержания белка в образцах ХСН.

5. Результаты сравнения методик количественного определения ХСН с использованием процедуры валидации.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на научной конференции ПГФА (Пятигорск, 2007 г.), научно-практической' конференции ФГУ «НЦЭСМП» «Современные методы стандартизации и<контроля качества лекарственных средств» (Москва, 2006г.), научной конференции'ИСКЛС ФГУ «НЦЭСМП» (Москва, 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 1 - в журнале, рекомендованном ВАК.

Связь исследований с проблемным планом'фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с комплексной темой ИКЛС ФГУ «НЦЭСМП» «Разработка принципов и методов контроля* различных групп биотехнологических препаратов».

Заключение диссертационного исследования на тему "Анализ и стандартизация хондроитинсульфата натрия"

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Установлена необходимость в разработке отечественного фармакопейного стандарта качества на хондроитинсульфат натрия, гармонизированного с требованиями зарубежных фармакопей.

2. Выявлено наличие на фармацевтическом рынке субстанций хондроитинсульфата натрия, различающихся по оттенку цвета, форме и размерам частиц порошка.

3. Установлено, что для подтверждения подлинности хондроитинсульфата натрия следует использовать комплексный подход, учитывающий его сложную структуру: анализ функциональных групп и связанных сульфатов (ИК-спектроскопия), натрия (реакция с калия антимонатом), определение молекулярной массы (вискозиметрия), электрофоретической подвижности (электрофорез в агарозном геле), оптического вращения (поляриметрия).

4. Показана возможность использования метода НПВО для подтверждения подлинности гликозаминогликанов, в том числе хондроитинсульфата натрия, выделенного из разных источников и в ряде его лекарственных форм.

5. Сравнительный анализ требований зарубежных фармакопейных статей и экспериментальные исследования показали необходимость введения в проект ФС дополнительных показателей чистоты хондроитинсульфата натрия: свободные сульфаты и хлориды, содержание белка и родственных соединений. Определено содержание белка методом Лоури в субстанциях хондроитинсульфата натрия и установлены допустимые нормы.

6. С помощью процедуры валидации установлено, что спектрофото-метрическая методика количественного определения хондроитинсульфата натрия по методу Дише (ФС), и турбидиметрическая методика титрования раствором цетилпиридиния хлорида (BR.Ph., Eur.Ph., USP) не являются гармонизированными. Для количественного определения содержания хондроитинсульфата натрия предложено использовать методику турбидиметрическо-го титрования раствором цетилпиридиния хлорида с двумя альтернативными способами регистрации точки эквивалентности: фотометрическим и визуальным. Показана целесообразность использования калибровочной кривой и ограничения скорости титрования при выполнении методики турбидиметриче-ского титрования.

7. Установлена применимость отечественного государственного стандартного образца хондроитинсульфата натрия для количественного определения методом турбидиметрического титрования.

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2009 года, Шкарина, Татьяна Николаевна

1. Алексеева Л.И., Чичасова Н.В., Мендель О.И. / Результаты применения препарата Артра при гонартрозе. // Научно-практическая ревматология. 2004. - № 2. - С. 45-47.

2. Арзамасцев А. П., Садчикова Н. П., Харитонов Ю. Я. / Валидация аналитических методов // Фармация. — 2006. — № 4 . — С. 8-12.

3. Арзамасцев А. П., Садчикова Н. П., Титова А.В. / Современное состояние проблемы применения ИК-спектроскопии в фармацевтическом анализе лекарственных средств // Химико-фармацевтический журнал 2008. — Т. 42.-№ 8.-С. 26-30.

4. Баграташвили Н.В., Игнатьева Н.Ю., Лунин В. В., Свиридов А. П., Харланов А. Н. / Исследование системы хондроитинсульфат-вода методом ИК-фурье-спектроскопии // Вестник Московского Университета. Химия. -2001. Т.42. - № 6. - С. 373-375.

5. Багров С.Н., Ларионов Е.В., Панасюк А.Ф. / Способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из роговицы. // Патент RU 2056851 от 27.03.1996.

6. Беленький А.А., Кузин А.В. / Локальная инъекционная терапия при остеоартрозе // Consilium Medicum 2003. - Т. 5 - № 2. - С. 106-108.

7. Бычков С.М., Кузьмина С.А. / Биологическая роль гиалуроновой кислоты.//Вопросы медицинской химии. — 1986. — Т.32. № 1.— С. 19-32.

8. Васюков С.Е., Кирьянов Н.А., Донецкий И.А., Животова Г.П. / Средство для лечения болезней суставов, обладающее противовоспалительным и обезболивающим действием. // Патент RU 2021811 от 30.10.20041.

9. Васюков С.Е., Нестерова Е.И., Александрова Т.Ю., Маслова О.Ю., Есенкова Н.Е. / Средство для лечения болезней^ суставов. // Патент RU 2282437 от 27/08/2006.

10. Гааль Э:, Медьеши Г., Верецкеи JI. / Электрофорез в разделении биологических макромолекул. // Ml: Мир. 1982. - С. 395-397

11. Голубев Г., Кригштейн О. / Оценка доказательств эффективности средств, претендующих называться структурно-модифицирующими'препаратами. // Международный журнал медицинской практики. 2005. - № 2.- С. 3852.

12. Государственный реестр лекарственных средств. Научный центр экспертизы средств медицинского применения Минздрава России. // 8-е изд. -М. -2004. Т.Н. - С. 1615-1617.

13. Иванкин А.Н., Васюков С.Е., Панов В.П. / Получение, свойства и применение хондроитинсульфатов. // Химико-фармацевтический журнал. — 1985.- №3.- С. 192-202.

14. Младенцев А.Л., Иксанов P.M., Рудько А.И., Ерёмкина С.А. /Твёрдая лекарственная форма хондроитин сульфата. // Патент 2254862 от 24.05.2004.

15. Оганесян О.В., Семёнова Л.А., Хапилин А.П., Косов И.С., Салтыкова В.Г. / Применение препаратов гиалуроновой кислоты для лечения остеоартроза.// Вестник травматологии и ортопедии 2007. - № 2. - С. 41-46.

16. Панасюк А.Ф., Ларионов Е.В. / Хондроитинсульфатьг и их роль в обмене хондроцитов и межклеточного матрикса хрящевой ткани. // Научно-практическая ревматология. 2000. - № 2. - С.46-55.

17. Панасюк А.Ф., Ларионов Е.В. / Способ выделения сульфатирован-ных гликозаминогликанов из биологических тканей. // Патент RU 2273486 от1004.2006.

18. Петренко А.Е., Багров; С.Н.,,Ронкина Т.И., Малышев В.Б. / Ирригационный раствор для офтальмологии;// Патент RU 2 288 702 от 13.07.2005.

19. Полунина Е.Е:, Знаменский Ю.В., Касаткин С.А. / «Способ выделения хондроитин сульфата из животных тканей» // Патент RU 2004104617 от 18.02.2004.

20. Титова A.B*. / Вспомогательные вещества, используемые в производстве лекарственных препаратов^ Стандартизация и методы контроля. // Дис. на соиск. учёной степени доктора фарм.наук. — М. — 2006. 312с.

21. Федоров С.Н.; Багров С.Н.; Ронкина Т.И.; Маклакова И.А.; Золото-ревский А.В./ Способ активации пролиферации эндотелия роговицы с помощью раствора «Глекомен» // Патент RU 2151580 от 28.10.1999.

22. Чичасова Н.В. / Место медленнодействующих препаратов в рациональной терапии деформирующего остеоартроза. // Consilium Medicum. -2005. Т. 7. - № 8 - С. 634-638.

23. Чичасова Н.В'. / Патогенетическое лечение остеоартроза // Consilium Medicum. 2007. - Т. 9. - № 8 - С. 112-117.

24. Шостак Н.А. / Остеоартроз: основы терапии // Consilium Medicum. — 2007-Т. 9.- №8 С. 108-111.

25. Юсупов В.Г., Пушкарев М.А., Зинова М.Д., Петухов В.В., Еремеева Л.И. / Способ получения инъекционной формы препарата хондроитинсульфата "хондролон" // Патент РФ 2080857 от 07.10.1997

26. Adebowale А.О., Сох D.S., Liang Z., Eddington N.D. /Analysis of glucosamine and chondroitin sulfate content in marketed products and the Caco-2 permeability of chondroitin sulfate raw materials. // J. Amer. Nutr. Assoc. 2000. -Vol. 3.-No 1.-P. 37-44.

27. Akiyama H., Sakai S., Linhardt R.J., Goda Y., Toshihiko Toida Т., Mai-tani T. / Chondroitin sulphate structure affects its immunological activities on murine splenocytes sensitized with ovalbumin. // Biochem. J. 2004. - Vol. 382. — P. 269-278.

28. Analysis of chondroitin in supplements/ Statutory analysis government chemist programme Ad Hoc Project 3. 2006. Prepared by B. Stuart. Approved by M. Walker. www.governmentchemist.org.uk/docGallery/69.PDF.

29. Bali J.P., Cousse H, Neuzil E. / Biochemical basis of the pharmacologic action of chondroitin sulfates on the1 osteoarticular system. // Semin Arthritis Rheum.-2001,-Vol. 1. P. 58-68.

30. Barnhill J.G., Fye C.L., Williams D.W., Reda D.J., Harris C.L., Clegg D.O. / Chondroitin product selection' for the glucosamine/chondroitin arthritis intervention trial. J. American Pharmfcists Assoc. - 2006. - Vol. 46. - No 1 - P. 14-24.

31. Barroso В., Didraga M., Bischoff R. / Analysis of proteoglycans derived sulphated disaccharides by liquid chromatography/mass spectrometry // Journal of Chromatography A. 2005. - Vol. 1080. - No 1. - P. 43-48.

32. British Pharmacopoeia 2007. Электронный ресурс. London: 2007. -Электронный оптический диск (CD-ROM).

33. Cappeletti R., Del Rosso M., Chiarugi V.P. A new electrophoretic method for the complete separation of all known animal glycoaminoglicans in a mo-nodimensional run // Anal. Biochemistry. 1979. - Vol. 99 - P. 311-315/

34. Carney S.L. Proteoglycans: / In Carbohydrate analysis. A practical approach. Chaplin M. F., Kennedy J. F. Eds. 1994 - Oxford. Washington. - I.R.L . Press- P. 97-141

35. Cho S.Y., Sim J-S., Jeong C. S., Chang S.Y., Choi D.W.,Toida Т., Kim Y.S. / Effects of low molecular weight chondroitin sulfate on type II collagen-induced arthritis in DBA/1 J Mice // Biol. Phann. Bull. 2004. - Vol. 27. - No 1. -P. 47-51.

36. Choi D.W., Kim M.J., Kim H.S., Chang S.H., Jung G.S., Shin K.Y., Chang S.Y. / A size-exclusion HPLC method for the determination of sodium chondroitin sulfate in pharmaceutical preparations. // J. Pharm. Biomed. Anal. — 2003.-V. 31.-P. 1229-1236.

37. Chondroitin sulfate: structure, role and pharmacological activity. Volpi N. Eds. 2006. - San Diego.: Elsevier. - P.

38. Conte A, de Bernardi M, Palmieri L, Lualdi P, Mautone G, Ronca G. / Metabolic fate of exogenous chondroitin sulfate in man. // Arzneimittelforschung. 1991С-Vol. 41. -No>7. -P. 768-772!

39. Deakin J.A., Lyon M. / A simplified and sensitive fluorescent method for disaccharideanalysis of both heparan sulphate;and chondroitin/dermatan sulphates from biological samples // Glycobiology. 2008. - Vol.18. - No 6. - P.483-491.

40. Dische Z. / A specific color reaction for glucuronic acid. // J.Biol Chemistry. 1947.-Vol. 171.-No 2.-P. 725-730.

41. Dische Z. / A new specific color reaction of hexuronic acids. // J.Biol Chemistry. 1946.-Vol. 167.-P. 189-198.

42. Farndale R.W., Sayers C.A., Barret AJ. / A direct spectrophotometric microassay for sulfated glycosaminoglicans in cartilage cultures .// Connect Tissue Res. 1982. - Vol. 9. - No 6. - P. 247-248.

43. Foot M, Mulholland M. / Classification of chondroitin sulfate A, chon-droitin sulfate C, glucosamine hydrochloride and glucosamine 6 sulfate using chemometric techniques. // J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. — 2005. — Vol. 38.-P. 397-407.

44. Funderburgh J.L. / MINI REVIEW. Keratan sulfate: structure, biosynthesis, and function. // Glycobiology. -2000:- Vol.10. No 10. - P. 951-958.

45. Hamer G.K., Perlin A.S. / A 13C-n.m.r. spectral* study of chondroitin'sulfates А, В and C: evidence of heterogeneity. // Carbohydrate Research 1976 -Vol. 49.-P. 37-48.

46. Glycoprotein and Proteoglycan Techniques. / Beeley J.G. Eds -Amsterdam-N.Y.-Oxford.: Elsevier. 1985. - 462p.

47. Gohel M.D.I., Shumb D.'K.Y., Tame P.C: / Electrophoretic separation and characterization of urinary glycosaminoglycans and their roles in urolithiasis. // Carbohydrate Research. 2007. - Vol. 342. - P. 79-86.

48. Imanari Т., Washio Y., Huang Y., Toyoda H., Suzuki A., Toida T. / Oral absorption and- clearance of partially depolymerized. fucosyl chondroitin sulfate from sea cucumber. // Thromb Res: 1999. - Vol. 93. — P: 129-135.

49. Ishidate Jr.M., Sofuni Т., Yoshikawa K., Hayashi M., Nohmi T, Sawada M. and Matsuoka A. / Primary mutagenicity screening-of food additives currently used in Japan. // Food. Chem. Toxicol. 1984. - Vol. 22. - P. 623-636.

50. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) Nomenclature of glycoproteins, glycopeptides and peptidoglycans. // Eur. J. Bio-chem. 1986. - Vol. 159. - P. 1-6.

51. Iwafune M., Kakizaki I., Nakazawa H:, Nukatsuka I., Endo M., Takagaki K. / A glycomic approarch to proteoglycan with a two-dimentional polysaccharide chain map. // Analytical Biochemistry. 2004. - Vol. 325. - P. 35-40.

52. Ji D:, Roman M., Zhou J., Hildreth J./ Determination of chondroitin sulfate content in raw materials and dietary supplements by high-performance liquidchromatography with ultraviolet detection after enzymatic hydrolysis: single>

53. Karousou E.G., Viola M., Vigetti D., Genasetti A., Rizzi M., Clerici M., Bartolini В., De Luca G., Passi A. / Analysis of glycosaminoglycans by electro-phoretic approach // Current Pharmaceutical Analysis. — 2008. Vol. 4. — No 2. -P. 78-89.

54. Kelly G.S. / The role of glucosamine sulfate and chondroitin sulfates in the treatment of degenerative joint disease. // Alternative Medicine Review.-1998. -Vol.3. -No 1.-P. 27-39.

55. Lee G.J., Evans J.E., Tieckelmann H. / Rapid and sensitive determination of enzymatic degradation products of isomeric; chondroitin sulfates by high-performance liquid; chromatography. // J. Chromatography. 1978'; - Vol; 146. -No 3. — P. 439-448.

56. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A,L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // Journal of Biological Chemistry. 1951. -Vol. 193.-P. 267-275.

57. Luo X.M., Fosmire G.J., Leach R.M. / Chichen keel cartilage as a source of chondroitin sulfate //Poultry Science 20021 - Vol. 81.-No 7.-P. 1086-1089.

58. Mao W., Thanawiroon C., Linhardt R.J. / Capillary electrophoresis for the analysis of glycosaminoglycans and glycosaminoglycan-derived oligosaccharides // Biomedical Chromatography. 2002. - Vol. 16. - P. 77-94.

59. Mathews M.B. / The molecular* weight of sodium chondroitin sulfate by light scattering // Archives of Biochemistry and Biophysics. — 1956. — V.61. — No 2.-P. 367-377

60. McAlindon Т.Е., LaValley M.P., Gulin J.P., Felson D.T . / Glucosamine and chondroitin for treatment of osteoarthritis: a systematic quality assessment and meta-analysis. // J. Amer. Nutr. Assoc. 2000. - Vol. 283: - P. 1469-1475.

61. Miller M.J., Costello C.E., Malmstrom A., Zaia J. / A tandem mass spectrometry approach to determination of chondroitin/dermatan-sulfate oligosaccharide glycoforms. // Glycobiology. 2006. - V.16. -No.6. -P.502-513.

62. Mucci A., Schenetti L., Volpi N. / lH- and l3C-nuclear magnetic resonance identification and characterization of components of chondroitin sulfates of various origin. // Carbohydrate Polym. 2000. - Vol. 41. - P. 37^5.

63. Murata K, Yokoyama Y. / A high-performance liquid chromatography for constituent disaccharides of chondroitin sulfate and dermatan sulfate isomers. Anal. Biochem.- 1985.-Vol. 146.-No 2.- P. 327-335.

64. Nakano Т., Ikawa N., Ozimek L. / An economical method to extract chondroitin sulphate-peptide from bovine nasal cartilage // Canadian Agricultural Engineering. 2000. - Vol. 42. - No 4. - P. 205-207.

65. NSF International. Methods. Total Chondroitin Sulfate Sodium by Cetyl-pyridinium Chloride Method. INA Method 120.002. http ://www.nsf. org/business/ina/cs. asp?program=INA.

66. Okamoto H., Nakajima Т., Ito Y., Shimada K., Yamato S. / Development of a novel analytical method for determination of chondroitin sulfate using an in-capillary enzyme reaction. // Journal of Chromatography A. 2004. - Vol. 1035 — P. 137-144.

67. Omata Т., Itokazu Y., Inoue N., Segawa Y. / Effects of chondroitin sul-fate-C on articular cartilage destruction in murine collagen-induced arthritis. // Arzneim-Forschung. 2000. - Vol. 50. - P. 148-153.

68. Palmieri L., Conte A., Giovanni L., Lualdi, P. and Ronca, G. / Metabolic fate of exogenous chondroitin sulfate in the experimental animal. // Arzneim-Fosch/Drug. Res. 1990. - Vol. 40. - P. 319-323.

69. Partridge S. M., Davis H. F., Adair G.S. / The chemistry of connective tissues. 6. The constitution of the chondroitin sulphate-protein complex in cartilage. // Biochem. J. 1961. - Vol.79. - No 1. - P. 15-26.

70. Plaas A. H. K., Hascall V.C.,.Midura R.J. / Ion exchange HPLC microanalysis of chondroitin sulfate: quantitative derivatization of chondroitin lyase digestion products with 2-aminopyridine. // Glycobiology — 1996. V.6. - No 8. -P. 823-829.

71. Pospichalt R-., Nesmerak K., Rychlovsl^ P:;, Nemkova I.,/ Determinationt-. of Chondroitin Sulfate by ThiazineDyes using Flow Injection Analysis with Spec-trophotometric Detection. // Analytical Letters. 2007. - Vol. 40. - No 6. - P. 1167-1175.

72. Sandya S., Sudhakaran P.R. / Effect of glycosaminogly cans on matrix metalloproteinases in type II collagen-induced experimental arthritis. // Experimental Biology andMedicine. 2007. - Vol. 232. - P. 629-637.

73. Sarzi-Puttini P., Cimmino MA, Scarpa R, Caporali R, ParazziniF, Zani-nelli A, Atzeni F, Canesi B. / Osteoarthritis: an overview of the disease and its treatment strategies. / Seminars in Arthritis and Rheumatism. 2005. - Vol. 35. -No l.-P. 1-10.

74. Setnicar I., Rovati L.C. / Absorption, distribution, metabolism and excretion of glucosamine sulfate. A review. // Arzneimittel-Forsch. — 2001. — Vol. 51 -P. 699-672.

75. Shinomiya K., Kabasawa Y., Toida Т., ImanariT., Ito Y. /Separation of chondroitin sulfate and hyaluronic acid* fragments by centrifugal precipitation chromatography. // Journal of Chromatography A. 200L - Vol. 922. - P. 365369.

76. Sigma-Aldrich. Sodium chondroitin sulfate. Material Data Sheet. 2004. -Электронный ресурс: http://www. sigma-aldrich/com:.

77. Tanford C., Marler E., Jury E., Davidson E.A. / Determination of the molecular weight distribution of chondroitin sulfate В by sedimentation equilibrium. //J. of Biol. Chemistiy.- 1964.-V. 239. No 12. - P. 4034-4040.

78. Toida Т., Shima M., Azumaya S., Maruyama Т., Toyoda H., Imanari Т., Linhardt J. / Detection-of glycosaminoglycans as a copper(II) complex in high-performance liquid'chromatography // Journal of Chromatography A. — 1997 — Vol. 787. No 1-2.-P. 266-270.

79. Toida Т., Toyoda H., Imanari T. / High-Resolution proton nuclear magnetic resonance studies on chondroitin sulfates. // Analytical Sciences. — 1993 -Vol. 9-P.53-58.

80. Tyler Т., Khandelwal В., Norden D., Rolle F.R. / Determination of chondroitin sulfate in raw materials by liquid chromatography. // J. of AOAC International. 2002. - Vol. 85. - No 3. - P. 567-571.

81. Uebelhart D., Thonar E.J., Delmas P.D., Chantraine A., Vignon E. / Effects of oral chondroitin sulfate on the progression of knee osteoarthritis: a pilot study. // Osteoarthritis Cartilage. 1998. - Vol. 6., Suppl. A. - P. 9-46.-147- ■ i ■ . V ■ : . <

82. Uebelhart D; / Clinical review of chondroitin sulfate in?osteoarthritis.// Osteoarthritis and Cartilage. 2008. - Vol. 16., Suppl. 3. - P. S19-S21. ;

83. United' States Pharmacopeia 30 and National Formulary 25. Электронный ресурс. — Электронный оптический диск (CD-ROM).

84. Validation of analytical procedures: methodology. Q2B. Recommended for Adoption at Step 4 of the ICH Process on 6 November 1996 by the ICH Steering Committee

85. Volpi N. / Disaccharide analysis and; molecular mass determination to microgram level of single sulfated glycosaminoglycan species in mixtures following agarose-gel electrophoresis. // AnaUBiochem; — 19991- Vol: 273. P. 229239. ' '

86. Volpi N. / Oral bioavailability of chondroitin sulfate (Condrosulf®) and its constituents in healthy male volunteers; // Osteoarth. Cartilage. 2002. - Vol. 10.-P. 768-777.

87. Volpi N. / Oral absorption and bioavailability of ichthyic origin chondroitin sulfate in healthy male volunteers. // Osteoarth. Cartilage. 2003. — Vol. 11. -P: 433-441.

88. Volpi N. / Disaccharide mapping'of chondroitin sulfate of different origins by high-performance capillary electrophoresis and high-performance liquid chromatography. // Carbohydr. Polym. 2004. - Vol. 55. - P. 273-281.

89. Volpi N. / Therapeutic applications of glycosaminoglycans. // Curr. Med. Chem. 2006. - Vol. 13.-P. 1799-1810.

90. Volpi N. / Advances in chondroitin sulfate analysis: application in physiological and pathological states of connective tissue and during pharmacological treatment of osteoarthritis. // Curr. Pharm. Des. 2006. - Vol. 12. P. 639-658.

91. Volpi N. / Analytical aspects of pharmaceutical grade chondroitin sulfates. // J. Pharm. Sci. 2007. - Vol. 96. - P. 3168-3180.

92. Volpi N., BolognanLL. / Glycosaminoglycans and proteins: different behaviour in size exclusion-high performance liquid chromatography. // J. Chromatography. 1993. - Vol. 630 - P. 390-396.

93. Volpi N., Maccari F. / Detection of submicrogram quantities of glycosaminoglycans on agarose-gels by sequential staining with toluidine blue and Stains-All. // Electrophoresis. 2002. - Vol. 23. - P. 4060-4066.

94. Volpi N, Maccari F. / Electrophoretic approaches to the analysis of complex polysaccharides. // J. Chromatography B. 2006 - Vol. 834. - P. 1-13.

95. Volpi N., Mucci A. / Stability studies of chondroitin sulfate. // Carbohydrate Res. 1999 - Vol. 315. - P. 345-349.

96. Volpi N, Maccari F., Titze J. / Simultaneous detection of submicrogram quantities of hyaluronic acid and dermatan sulfate on agarose-gel by sequential staining with toluidine blue and Stains-All. // J. Chromatography B. 2005. - Vol. 820.-P. 131-135.

97. Volpi N., Maccari F. / Quantitative and Qualitative Evaluation of Chondroitin Sulfate in Dietary Supplements// Food Anal.Methods, 2008. - Vol. 1-. -No 3. - P. 195-204.

98. Zaia J. / Mass spectrometry of oligosaccharides. // Mass Spectrometry Reviews. 2004. - Vol. 23.-No 3. - P. 161-227.

99. Zaia J. / Principles of Mass Spectrometry of Glycosaminoglycans. // Journal of Biomacromolecular Mass Spectrometry. 2005. - Vol. 1. - P. 3-36.

100. Zebrower M., Kieras F.J., Heaney-Kieras J. / High pressure liquid chromatographic identification of hyaluronic acid and chondroitin sulphate disaccha-rides // Glycobiology. -1991. Vol. 1. - No 3. - . 271-276.

101. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ1. РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

102. ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И1. СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ1. ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

103. Хондроитинсульфат натрия ФС 421. Взамен ФС 42-3741-991. C02Na

104. Хондроитинсульфат А Хондроитинсульфат С1. R1 = SO;jNa R2=Hr!=h1. R = SC>3Na1. C14 Hj9 NO14 SNa2 )„m.m. (503,4) n1. ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ1. ПЕРЕПЕЧАТКА ВОСПРЕЩЕНА

105. Настоящая Фармакопейная статья распространяется на Хондроитинсульфат натрия, получаемый из хрящей крупного рогатого скота, свиней и птиц, применяемый для приготовления лекарственных форм.

106. Используют сырьё от животных из хозяйств, у которых отсутствуют заболевания вирусной и прионовой этиологии, патогенные для человека.

107. Содержит не менее 90,0 % и не более 115,0 % хондроитинсульфата натрия в пересчете на сухое вещество.

108. Описание. Белый или белый со слегка желтоватым оттенком порошок. Гигроскопичен.

109. Растворимость. Легко растворим или растворим в воде, 0,9 % растворе натрия хлорида, практически нерастворим в ацетоне и спирте 96 %.

110. Подлинность. Инфракрасный спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом в области от 4000 см"1 до 400 см"1 по положению полос поглощения должен соответствовать спектру государственного стандартного образца хондроитинсульфата натрия (ФС 42-0180-06).

111. Цветность раствора. Окраска раствора, полученного в испытании на Прозрачность раствора, должна быть не интенсивнее окраски эталонаy4.рН. От 5,5 до 7,5 (раствор, приготовленный в испытании на Прозрачность раствора, потенциометрически).

112. Удельное вращение. 1,0 г субстанции растворяют в свежепрокипя-ченной и охлажденной воде и разбавляют водой до 100 мл.

113. Характеристическая вязкость. Определение проводят одним из нижеописанных методов.

114. Исходный раствор препарата. 2,500 г (точная навеска в пересчёте на сухое вещество) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50-70 мл 0,2 М раствора натрия хлорида и доводят объем раствора до метки тем же растворителем.

115. При экстраполяции приведённой вязкости к нулевой концентрации находят величину характеристической вязкости.

116. Капиллярный вискозиметр Уббелоде с висячим уровнем.

117. Раствор В. К 15,0 мл раствора А прибавляют 5,0 мл 0,2 М раствора натрия хлорида

118. Раствор С. К 10,0 мл раствора А прибавляют 10,0 мл 0,2 М раствора натрия хлорида

119. Раствор Д. К 5,0 мл раствора А прибавляют 15,0 мл 0,2 М раствора натрия хлорида.

120. Характеристическая вязкость должна быть от 0,01 до 0,15 м /кг.

121. Белок. Не более 3 % в пересчёте на сухое вещество (ОФС 42-001403. Метод Лоури (Метод А.).

122. Потеря в массе при высушивании. Около 0,2 г (точная навеска) субстанции сушат при температуре (100-105) °С в течение 4 часов. Потеря в массе не должна превышать 12,0 %.

123. Сульфатная зола и тяжелые металлы. Сульфатная зола из 1,0 г субстанции (точная навеска) должна быть от 20 % до 30,0 % и выдерживать испытание на тяжелые металлы (не более 0,002 % в субстанции).

124. Посторонние примеси. Испытуемый раствор. 150 мг субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 5 мл, растворяют в воде, доводят водой до метки и перемешивают.

125. Стандартный раствор А. 150 мг стандартного образца хондроитинсульфата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 5 мл, растворяют в воде, доводят водой до метки и перемешивают.

126. М буферный раствор бария ацетата, рН 5,0. 255,4 г бария ацетата растворяют в 900 мл воды. Доводят рН до 5,0 с помощью ледяной уксусной кислоты и доводят объём раствора водой до 1000 мл.

127. Окрашивающий раствор. 1,0 г толуидинового синего и 2,0 г натрия хлорида растворяют в 1000 мл раствора 0,01 М хлористоводородной кислоты. Фильтруют.

128. Интенсивность любой другой полосы на электрофореграмме испытуемого раствора не должна превышать интенсивность основной полосы стандартного раствора В. Содержание индивидуальной примеси не должно превышать 2 %.

129. Остаточные органические растворители. В соответствии с требованиями ОФС «Остаточные органические растворители».

130. Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями ОФС «Микробиологическая чистота».

131. Количественное определение. Испытуемый раствор. Около 0,100 г (точная навеска) предварительно высушенной до постоянной массы субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде и доводят объем раствора до метки.

132. Стандартный раствор 5 мл исходного стандартного раствора хондроитинсульфата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объём до метки водой.

133. Стандартный раствор В. 10 мл исходного стандартного раствора хондроитинсульфата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объём до метки водой.

134. Стандартный раствор С. 15 мл исходного стандартного раствора хондроитинсульфата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объём до метки водой.

135. Количественное определение хондроитинсульфата натрия проводят одним из нижеописанных методов.

136. При приближении к точке эквивалентности скорость титрования должна составлять не более 0,05 мл/мин.

137. Параллельно проводят титрование 20 мл каждого из стандартных растворов А, В и С хондроитинсульфата натрия.

138. Содержание хондроитинсульфата натрия в субстанции в пересчете на сухое вещество определяют, используя калибровочный график, построенный по стандартным растворам хондроитинсульфата натрия.

139. Фотометрический способ регистрации точки эквивалентности.

140. Содержание хондроитинсульфата натрия в субстанции в пересчете на сухое вещество определяют, используя калибровочный график, построенный по стандартным растворам хондроитинсульфата натрия.

141. Пирогенность. Должен быть апирогенным. Тест-доза 20 мг препарата в 1 мл раствора натрия хлорида изотонического 0,9 % для инъекций на 1 кг массы животного.

142. Испытание проводят для субстанции, предназначенной для приготовления растворов для инъекций.

143. Токсичность. Должен быть нетоксичным. Тест-доза 30 мг препарата в 0,5 мл воды для инъекций на мышь.

144. Хранение. В сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 20 °С.

145. Руководитель Центра Стандартизации лекарственных средств ФГУ «НЦЭСМП»профессор Багирова B.JI.»200 г.