Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Вакцина против лептоспироза животных концентрированная

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И

а ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ' <£>

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

>

Всероссийский государственный научно исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ)

На правах рукописи УДК 619:616:98:579:834.1151:615.372

Сусский Евгений Владимирович

Вакцина против лепшоспироза животных концентрированная

(изготовление, контроль и применение).

16.00.03 - Ветеринарная микробиология,вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

Москва 1997 г.

Работа выполнена на Армавирской биофабрике I во Всероссийском государственном научно исследовательском институте контроля, стандартизацш и сертификации ветеринарных препаратов.

Научный руководитель: - доктор ветеринарных наук,

профессор, Заслуженный деятель науки РСФСР Ю. А. Малахов

Оппоненты: - заведующая центром референции

по лептоспирозу ВОЗ, доктор медицинских наук Ю. В. Ананьина - кандидат биологических наук, доцент

И. А. Логинов

Ведущэе учреждение:

- Всероссийский научно -исследовательский и технологический институт биологической промышленности (г. Щелково).

Зйията диссертации состоится 1997 г

в -^^¿асов на заседании Диссертационного Совета Д 120:85:01- при Всероссийском государственном научно • исследовательском институте контроля, стандартизаци! и сертификации ветеринарных препаратов (123022, г Москва, Звенигородское шоссе,5, ВГНКИ)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ.

Автореферат

разослан " " ^¿¿¿¿Л 1997 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Ю УЪ/. Козыре:

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Успешное развитие животноводства невозможно без ветеринарных мероприятий, обеспечивающих профилактику и ликвидацию инфекционных болезней животных, в том числе лептоспироза.

Лептоспироз является одним из широко распространённых зоонозов. Болезнь регистрируют у домашних и диких животных различных видов, а также у людей на пяти континентах.

В изучение лептоспироза животных и человека определённый вклад внесли отечественные и зарубежные учёные: С.И.Тарасов, В.И.Терских, М.В.Земсков, В.В.Ананьин, В.С.Киктенко, С.Я.Любашенко, Ю.А.Малахов, Г.Л. Соболева, Ю.В.Ананьина, Inado, Babudieri, Wolff, Galton, Stalheim, Kmety, Ellis, Marshall и другие.

В основе борьбы с лептоспирозом животных помимо лабораторной диагностики и других ветеринарных мероприятий лежит вакцинопрофилактика. Вакцинация профилактирует клинические проявления лептоспироза, включая аборты лептоспирозной этиологии, массовое перезаражение животных, лептоспироноси-тельство, исключает формирование интенсивного очага лептоспироза.

В России - для профилактики лептоспироза широко-пртгеняют поливалентную вакцину "ВГНКИ" против лептоспироза животных, ассоциированную вакцину против лептоспироза и парвовирусной инфекции свиней, ассоциированную вакцину против лептоспироза и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота, гексаканивак - ассоциированную вакцину против лептоспироза и вирусных болезней собак, внедряется вакцина против лептоспироза лиофилизированная.

Однако проблемы совершенствования технологии изготовления вакцин их стандартизация, повышение

иммуногенности, остаются актуальными.

Цель и задали исследований.

Целью наших исследований была разработк промышленной технологии изготовления вакцин концентрированной против лептоспироза животных, способ её изготовления, методов контроля, рационально схемы применения и оптимального режима хранения.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи

1. Разработать метод концентрирования лептоспир

2. Разработать промышленную технологию изготовлени концентрированной вакцины.

3. Стандартизировать вакцину по концентраци лептоспирозных антигенов.

4. Провести сравнительную оценку иммуногенной активности применяемой поливалентной и предлагаемо концентрированной вакцины против лептоспироза животных

5. Разработать оптимальную схему иммунизаци животных различных видов концентрированной вакциной

6. Разработать нормативную документацию на изго товление, контроль и применение концентрированно вакцины.

7. Внедрить разработанную промышленную технологи изготовления вакцины концентрированной проти лептоспироза животных на биопредприятиях.

Научная новизна

Создана концентрированная вакцина против лептоспиро за животных (Патент №2030915 с приоритетом от 31октябр 1990 г.)

Разработан метод концентрирования культур лептоспир путём ультрафильтрации на полых волокнах 2-30 и более раз, при этом накопление лептоспи превышает 2 млрд. микробных клеток в 1 см

питательной среды.

Установлено, что сконцентрированная на полых волокнах бактериальная масса лептоспир полностью сохраняет свою иммуногенность.

Установлен коэффициент лизиса при определении количества микробных клеток в концентрированной бактериальной массе лептоспир.

Стандартизирована иммуногенность вакцины по степени концентрации лептоспирозных антигенов.

Установлена иммуногенность концентрированной вакцины для лабораторных и сельскохозяйственных животных различных видов.

Практическая значимость.

Разработана нормативная документация на изготовление, контроль и применение концентрированной вакцины против лептоспироза животных.

Промышленная технология изготовления вакцины внедрена на Армавирской и Ставропольской биофабриках.

Концентрирование лептоспир методом ультрафильтрации позволяет использовать культуры лептоспир с любым накоплением.

Вакцина концентрированная против лептоспироза животных, в отличии от поливалентной вакцины ВГНКИ, вводится в 4-5 раз меньших объёмах и обеспечивает формирование иммунитета большей напряжённости и лродолжительности.

Апробация

Материалы диссертации доложены и получили положительную оценку:

- на научно - практических конференциях и НТС Армавирской биофабрики (1991, 1994);

- на научной конференции межвузовского НПО "Биомедицинские технологии" (Москва, 1996);

- на научной конференции Краснодарской НИВ1

(1996) ;

- на межлабораторном совещании научных сотруднико: ВГНКИ ветпрепаратов Департамента ветеринарии Р<

(1997).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 3 статы и получен патент № 2030915 с приоритетом от 3! октября 1990 г.

Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 124 страница: машинописного текста и включает: введение, обзо| литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 5 рисунками.

Список литературы включает 283 источника, и: них 116 зарубежных авторов.

Материалы и методы исследований

Работа проведена в 1991 - 199 6 гг. на Армавирской биофабрике и в лаборатории контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов против сальмонеллёза, лептоспироза и эшерихиоза ВГНКИ. Работа по концентрированию лептоспир выполнена нг Армавирской и Ставропольской биофабриках совместнс с Ситьковым В. И., Сурмило А. П., Ярцевым С. Н.

Исследования по определению оптимальны* иммунизирующих доз вакцины проводили в хозяйства* Курской и Белгородской областей, а также на свинопоголовье Армавирской биофабрики.

В работе использовали диагностические штаммь лептоспир 15 серогрупп, вакцинные штаммы лептоспир шести серогрупп 6г1рро1урЬоза ( ВГНКИ-1 ),

Icterohaemorrhagiae(ВГНКИ-2) ,Canicola (ВГНКИ-З) , Tarassovi (ВГНКИ-4),Pomona (ВГНКИ-6), Sejro (Hardjo).

Питательные среды: сывороточная среда ВГНКИ на фосфатном буфере; среда с овечьим альбумином, солевым компонентом и фактором роста - среда ГНКИ; бульон и агар Хоттингера, МПА, МПВ, среды Китт - Тароцци и Сабуро.

Растворы, реактивы, химические вещества: трихлоруксусная кислота; однозамещённый фосфорнокислый калий; двузамещённый фосфорнокислый натрий; хлористый натрий; раствор аммиака; едкий натрий; мертиолят; формалин; перекись водорода, гидроокись алюминия; соляная кислота; вода деминерализованная.

Оборудование лабораторное и производственное, необходимое для культивирования лептоспир: реакторы ёмкостью 630, 1000 и 2000 литров; сепаратор АСГ - ЗМ; термостаты "Брувэ"; холодильники бытовые, шкафные, низкотемпературные НС 280/50; "Planer"; ZA; автоклавы АГП - 7; ионообменные колонки УЦ -10; фильтры ФС - 7, Рф - 39, Усф - 293, - 7; фильтры фирмы "Pall", "Millipor";

ультрафильтрационная установка УПВ - 6; колонки полых волокон; РН - метр - 3 4 0; микроскоп биологический МБИ - 3; конденсор тёмного поля ОИ -7, ОИ - 13;

Лабораторные и сельскохозяйственные животные: кролики порода шиншила массой 3,0 - 3,5 кг - 700 голов; золотистые хомячки массой 40 - 50 г - 1100 голов; белые мыши массой 15 - 13 г - 340 голов; морские свинки массой 350 - 4 00 г - 256 голов; овцы массой не менее 40 кг - 1500 голов; подсвинки возрастом 2,5-3 мес. - 150 голов; телята возрастом 5-6 мес - 120 кг - 120 голов, свиньи и крупный рогатый скот разных возрастных групп.

Штаммы лептоспир пересевали каждые 10 дней. Лептоспиры культивировали на сывороточной среде при температуре 28°С в течение 5-7 дней. Наличие роста определяли просмотром пробирок в

проходящем свете и микроскопией капель культур - в тёмном поле микроскопа. Чистоту культур проверял* высевом на МПБ, МПА, МППБ и среду Сабуро, а также просмотром культур в проходящем свете и микроскопией.

Серогрупповую принадлежность штаммов лептоспир контролировали в перекрестной РМА с групповыми агглютинирующими лептоспирозными сыворотками согласно "Методических указаний по лабораторной диагностике лептоспироза животных" (1976) и Стандарту Союза ССЕ "Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики лептоспироза" (1992).

Иммуногенную активность концентрированной вакцинн против лептоспироза изучили на крупном рогатое скоте, свиньях разных возрастных групп, которых иммунизировали разными дозами вакцины.

Определение титра антител в сыворотке крови исследуемых животных проводили согласно того же стандарта.

Превентивные свойства сыворотки крови исследовали на золотистых хомячках, используя по 10 зверьков в группе. Хомячкам внутримышечно вводили по 0.5 см3 сыворотки и через 2 часа заражали смертельной дозой лептоспир (ЮЬО50) . Обязательным условием опытов был 100% - ный падёж заражённых хомячков в контрольных группах.

Разработка метода концентрирования

антигенов лептоспир.

Скудный рост лептоспир в сывороточных питательных средах обязывает вводить существующие вакцинные препараты для формирования иммунитета достаточной напряжённости в больших дозах (до 10 см3) , в этой связи мы сделали попытку концентрировать культуру лептоспир тремя разными методами.

Первый из них - традиционный метод, который используется для получения поливалентной вакцины ВГНКИ, заключается в добавлении к культуре лептоспир до 3%-ной концентрации трихлоруксусной кислоты,

отстаиванием в течение 3-4 часов, с последующим удалением 60%-тов надосадочной жидкости и растворением осадка аммиаком. Данный метод мы использовали в качестве контроля.

Второй метод заключается в добавлении 4 0% -ного раствора ПЭГ и 15 %-ного раствора хлорида натрия с последующим центрифугированием. Использование этого метода мы признали нерациональным и в дальнейшей работе не использовали, так как методика получения 40%-ного раствора ПЭГ является трудоёмкой, сам метод требует добавления электролита и центрифугирования для отделения осадка.

Третий метод заключается в концентрировании лептоспир путём ультрафильтрации на полых волокнах на установке УПВ -б. Промышленная ультрафильтрационная установка на полых волокнах предназначена для проведения работ по ультрафильтрации с целью разделения, концентрирования высокомолекулярных соединений с помощью полупроницаемых мембран в виде полого волокна из ароматического полиамида.

Метод ультрафильтрации позволяет получить культуру лептоспир, сконцентрированную от 2 до 30 и более раз, при этом накопление лептоспир может превышать 2 млрд. микробных клеток в 1 см3 питательной среды.

Подача культуры лептоспир в установку осуществляется насосами, бактериальная масса циркулирует по замкнутому контуру ( из ёмкости исходного реактора) через разделительные колонки в ёмкость исходного реактора, до достижения требуемой концентрации лептоспир.

Для определения концентрации мы подсчитываем количество микробных клеток в бактериальной массе, сгущенной в 5, 10, 15 и 20 раз. Подсчёт количества лептоспир в 1 смЗ питательной среды проводили в исходной смеси культур до начала и

в процессе концентрирования.

Изготовлено 6 серий антигенов лептоспир серогруп! Pomona, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae, Canicola и серий из лептоспир Pomona, Tarassovi, Grippotyphosa Sejroe. Результаты работы представлены в таблице 1

Таблица

Количество лептоспир в культуре в зависимости от степени концентрации

Содержание лептоспир в культуре сконцентрированной в

Вари- ИСХОД

ант ное 5 раз 10 раз 15 раз 20 раз

вак- накоп. эбна рас коэффи обна рас соэффи эбна рас :оэффи обна рас шэффу

цины лепто руже чёт циент руже чёт (иент руже чет циент руже чет циент

спир но ное лизиса но ное пизиса но ное лизиса но ное лизиса

I 65 130 325 2,5 220 650 3,0 4L0 975 2,4 550 1300 2,4

I 42 119 210 1,8 270 420 1,6 332 630 1,9 400 840 2,1

I 50 170 250 1,5 310 500 1,6 520 750 1,4 750 1000 1,3

I 28 160 190 1,2 271 380 1,4 302 570 1,9 334 760 2,3

55 210 275 1,3 340 550 1,6 570 825 1,5 780 1100 1,4

II 60 300 300 1,0 360 600 1,7 300 900 3,0 400 1200 3,0

60 - - - 368 600 1,6 606 900 1,5 750 120С 1,6

I 60 300 300 1,0 410 600 1,5 - - - 580 1200 2,1

62 217 310 1,4 362 620 1,7 495 930 1,9 751 1240 1,7

II 63 194 315 1,6 305 630 2,1 341 945 2,8 483 1260 2,6

65 125 325 2,6 341 650 2,8 483 126С 1,9 709 1300 1,8

II 70 163 350 2,2 267 700 2,6 336 105( 3,1 494 1400 2,8

II 55 100 275 2,8 203 550 2,7 . L54 825 3,3 - - -

II 55 108 275 2,6 204 550 2,7 »54 825 3,3 - - -

I 40 120 200 1,7 180 400 2,2 540 600 1,8 - - -

I 60 140 300 2,1 200 600 2,0 ПО 900 2,9 - - -

II 50 140 >50 1,8 230 500 2,2 : 150 750 2,1 - - -

II 55 150 >75 1,8 250 550 2,2 : S40 825 2,4 - - -

Коэффициент

лизиса 1,8 2,02 2,3 2,1

Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что количество микробных клеток в концентрированной бактериальной массе лептоспир не пропорционально кратности сгущения и видимое количество лептоспир меньше расчётного. В связи с этим вывели коэффицент между расчётным, и накоплением лептоспир в концентрированной культуре, который мы назвали коэффицентом лизиса.

Так, для культуры лептоспир, сконцентрированной в 5 раз составил 1,8; в 10 раз - 2,02; в 15 раз - 2,3; в 20 раз - 2,1.

По нашему мнению несоответствие между расчётным и действительным количеством лептоспир обусловлено лизисом значительного количества микробных клеток в процессе концентрирования и следовательно отсутствием возможности учесть их.

Для установления полноты осаждения лептоспир на полых волокнах проводили микроскопию фильтрата и кроме того, его вводили кроликам внутривенно трёхкратно в объёме 1, 2 и 3 см3 с интервалом 3 дня. В дальнейшем сыворотку кролика исследовали в РМА, результаты исследований отрицательные, то есть концентрирование на полых волокнах приводит к полному осаждению цельных и лизированных клеток лептоспир.

Определение степени концентрирования антигенов лептоспир.

Следующим этапом нашей работы была оценка необходимой оптимальной кратности концентрирования культуры лептоспир при производстве вакцины.

С этой целью из одной расплодки приготовлены вакцины двух вариантов с концентрацией лептоспир в 5, 10, 15 и 20 раз и в качестве контроля -вакцина, приготовленная традиционным методом.

Активность вакцин, проверяли на кроликах массой 3.0 - 3.5 кг, которых иммунизировали однократно внутривенно в дозе 50 млн. микробных

клеток. Сыворотку крови кроликов исследовали РМА через 25 дней после иммунизации. Результа1 работы приведены в таблице 2.

Таблица

Зависимость антигенной активности вакцины оз степени концентрирования лептоспир

Кратность :1азвдение Титр антител к лептоспирам

концешри Антигены Доза Серия №4 Серия №2 Доза Антигены Серия №3

рования в млн з шш

микробн ■шкробн

клеток клеток

Контроль 'omona 1: 305 1: 2785 Pomona 1:2265

Tarassovi 50 1: 1395 1: 3200 50 Tarassovi 1:4525

Icterohaemorrhagiae I: 490 1:800 Grippotyphosa 1:50

Canícola 1: 690 1: 800 Sejroe 1:565

Средний 1:720 1: 1896 Средний 1:1851

Pomona 1: ИЗО 1:12800 Pomona 1:1970

5 1:5 Tarassovi 50 1:1395 1:12800 50 Tarassovi 1:2785

Icterohaemorrhagiae 1:1300 1:18100 Grippotyphosi 1:565

Canicola 1:1130 1:13100 Sejroe 1:350

Средний 1:1239 1:14200 Средний 1:1418

Pomona 1:1130 1:800 Pomona 1:2110

10 1:10 Tarassovi 50 1:2785 1:6400 50 Tarassovi 1:1970

Icterohaemorrhagiae 1:2110 1:12800 Grippotyphosa 1:360

Canicola 1:1300 1:3400 Sejroe 1:400

Средний 1:1831 1:6600 Средний 1:1228

Pomona 1:2425 1:1970 Pomona 1:1130

15 1:15 Tarassovi 50 1:1600 1:12800 50 Tarassovi 1:1840

Icterohaemorrhagiae 1:1600 1:3940 Grippotyphosi 1:350

Canicola 1:1600 1:1600 Sejroe 1:400

Средний 1:1800 1:5078 Средний 1:1875

Pomona 1:1055 1:3200 Pomona 1:600

20 1:20 Tarassovi 50 1:600 1:6400 50 Tarassovi 1:350

icterohaemorrhagiae 1:800 1:6400 Grippotyphosa 1:85

Canicola 1:800 1:1600 Sejroe 1:80

Средний 1:1064 1:4400 Средний 1:303

Результаты контроля показывают, что методе ультрафильтрации на полых .волокнах, позволяет получи1] полноценную в антигенном отношении культуру лептост независимо от кратности сгущения.

Для практического применения мы остановились I 10-ти кратном сгущении культуры лептосп^ руководствуясь тем, что уменьшение кратности

концентрирования обязывает увеличивать дозы вакцины, а повышение кратности концентрирования создаёт неудобства при вакцинации молодняка, которому вакцину пришлось бы вводить в десятых долях см3.

Разработка метода контроля активности вакцины концентрированной против лептоспироза

В качестве базового мы использовали метод, применяемый для контроля активности поливалентной вакцины ВГНКИ против лептоспироза животных (Ю. А. Малахов,Г.Л.Соболева, А. П.Самохвалов,В. С.Соловьёва ) -

Лабораторной моделью при контроле активности вакцины служили взрослые кролики массой 3,0 - 3,5 кг, не содержащих специфических антител к лептоспирам.

Вакцины с разной степенью концентрации антигенов разводили до исходной концентрации и проверяли по активности в опыте на кроликах. Кроликам вводили вакцину первого и второго вариантов, внутривенно в дозе - 50 млн./см3 микробных клеток. Через 25 дней брали кровь и сыворотку исследовали в РМА на наличие специфических антител. В опыте использованы три серии вакцины. Установили, что титр антител в сыворотке крови кроликов колебался от 1:800 до 1:12800.

Аналогичным образом проверена активность 5 опытно - промышленных серий концентрированной вакцины, изготовленной на Армавирской и

Ставропольской биофабриках

Результаты контроля приведены в таблице 3.

Таблица

Результаты контроля активности опытнопромышленнь серий концентрированной вакцины против лептоспироза животных

Изготовитель № серии Средний титр антител к лептоспироза,м

Ротопа Тагашт ШегоЬае-morrhagiae Спрро1у-рИоэа 8е]гое Средние данные

Ставропольская биофабрика 1 2 3 1 :2000 1 : 2600 1 :1680 1:2400 1 :1600 1:2400 1 : 2800 1:900 1 : 1375 1 :466 1 : 2400 1 : 1700 1 : 1480

Армавирская биофабрика 1 1 1: 1920 1:3840 1 :1600 1:2560 : 1440 1:2560 1 :1280 1:1653 1 :2560

Средние данные 1 :2408 1 :2112 1 : 1713 1 : 1968 1 : 873 1 : 1959

Данные, приведённые в таблице свидетельствук о том, что концентрированная вакцина являете высокоактивным препаратом и вызывает формирована антител у кроликов при однократном внутривеннс введении в титре от 1:800 до 1:2400, что значителы-превышает титры при контроле поливалентной вакцин ВГНКИ против лептоспироза животных.

Определение иммунизирующих доз вакцины, напряжённости и продолжительности иммунитета у крупного рогатого скота и свиней.

Крупный рогатый скот разных возрастных труп вакцинировали в совхозах "Разуменский" Белгородскс области и "Железногорский" Курской области.

Напряжённость иммунитета изучали у крупног рогатого скота, вакцинированного разными дозаь: концентрированной вакцины, по титру антител и п превентивной активности сыворотки крови вакцинировании

животных для золотистых хомячков. Сыворотку крови животных исследован в РМА на наличие титра антител и по превентивной активности до вакцинации и через 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 дней после вакцинации.

Результаты работы приведены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4

Титр антител в сыворотке крови крупного рогатого скота после вакцинации концентрированной и коммерческой (контроль)

вакциной

Возраст животного Доза вакц. смЗ Титр антител в сыворотке крови животных на день исследования

10 20 30 60 90 120 180

1,5-6 мес 0,5 1:75 1:150 1:250 1: 100 1:70 1:40 1:20

контроль 1:50 1:100 1:200 1:100 1:50 1:20 1:10

6-12 мес 0,5 1:75 1:160 1:300 1:100 1:80 1:50 1:10

контроль 1:55 1:150 1:250 1:80 1:80 1:40 1:10

1 - 2 года 1,0 1:80 1:230 1:285 1:160 1:80 1:50 1:25

контроль 1:75 1:160 1:200 1:100 1:70 1:30 1:15

Таблица

Превентивная активность сыворотки крови крупного рогатого скота, вакцинированного концентрированной вакциной против лептоспироза

Возраст животных (месяцы) Доза вакцины (см3) Превентивная активность сыворотки крови крупного рогатого скота для хомячков по дням (% защиты)

10 20 30 60 90 120 180

1.5-6 0.5 20 70 80 90 100 90 70

6- 12 0.5 20 20 80 100 100 90 60

12-18 1.0 30 40 90 100 100 90 100

взрослые 1.5 20 50 60 90 90 100 90

Из материалов таблицы 4 видно, что крупны) рогатый скот различных возрастных групп от 1,5 ме< до 2 лет на введение вакцины отвечает образование! антител примерно в таких же титрах, что и н; введение контрольной вакцины. Антитела выявляются н; 10 день в титре 1:50 - 1:80, достигают максимальное уровня на 30 день - 1:200 - 1:300, а через 120 дне* титр составляет 1:20 - 1:150; а через 180 дней 1:10 - 1:20.

Превентивная активность сыворотки крови выявляете; не зависимо от дозы вакцины 0,5 - 1,5 см3 у все: возрастных групп животных. Сыворотка крови на 1( день после вакцинации предохраняет от гибели 20 -30%, хомячков через 20 дней - 20 - 70% хомячков, через 30 дней - 60- 90% хомячков, на 60 - 120 деш - 90 - 100% хомячков, через 180 дней превентивна? активность начинает ослабевать.

Аналогичные результаты получены при вакцинации

. и-

подсвинков и свиней.

Опытно - промышленную серию концентрированной вакцины первого варианта изготовили на Армавирской биофабрике. Дозами от 0,5 до 2,0 см3 вакцины концентрированной вакцинировали внутримышечно 48 подсвинков массой 50 - 60 кг.

Сыворотка крови поросят до вакцинации не содержала специфических антител к лептоспирам, выявленных в РМА и не защищала от гибели хомячков, заражённых вирулентной культурой лептоспир.

В динамике у животных брали кровь, определяли титр антител в PMA. ^

Результаты работы показаны в таблицах 6 и 7.

Из данных таблицы следует, что все подсвинки отвечают образованием антител на введение концентрированной вакцины, однако о наличии иммунитета можно судить только по превентивной активности сыворотки вакцинированных животных. Так установлено, что доза концентрированной вакцины 0,5 см3 не вызывает формирование иммунитета достаточной напряжённости. Доза в 1,0 см3 вызывает не полный иммунный ответ, но иммунитет в данном случае достаточной напряжённости и продолжительности ( 90 дней срок наблюдения } . Дозы вакцины 1,5 и 2,0 см3 вызывают формирование иммунитета высокой напряжённости, превышающей таковой в контроле, то есть при введении обычной коммерческой вакцины в дозе 6,0 см3.

Таблиц

Агглютинирующая и превентивная активность сыворотки крови свиней, вакцинированных концентрированной вакциной против лептоспироза Армавирской биофабрике

ш Доза Штаммы Цо вакци- Титр антител по дням

груп вакц лептоспир tamm 15 20 25 30 40 50 60 90

пы (см1)

Pomona 1:16 1:11 1:14 1:10 1:20 1:25 1:14 1:14

Tarassovi 1:15 1:15 1:35 1:10 1:20 - 1:10 -

I 0,5 Icterohaemorrhagiae 1:12 1:53 1:57 1:98 1:35 1:35 1:20 1:13 1:10

Canicola 1:19 1:28 1:30 1:16 1:28 1:14 1:10 1:5

Общий титр 1:23 1:23 1:35 1:15 1:25 1:19 1:11 1:14

% выживания 20 30 30 20 30 30 30 20

Pomona 1:20 1:20 1:30 1:640 1:130 1:80 1:320 1:35

Tarassovi 1:15 1:35 1.70 1:12 1:14 1:10 1:15 1:13

II 1,0 Icterohaemorrhagiae 1:12 1:75 1:121 1:557 1:75 1:43 1:40 1:70 1:32

Canicola 1:14 1:30 1:30 1:40 1:12 1:14 1:20 1:10

Общий титр 1:25 1:40 1:75 1:75 1:32 1:26 1:53 1:20

% выживания 70 50 70 60 60 60 70 90

Pomona 1:25 1:49 1:320 1:970 1:171 1:61 1:92 1:80

Tarassovi 1:30 1:25 1:30 1:20 1:20 1:20 1:10 1:32

ш 1,5 Icterohaemorrhagiae 1:14 1:75 1:43 1:299 1:75 1:49 1:35 1:80 1:30

Canicola 1:26 1:30 1:40 1:35 1:28 1:10 1:14 1:10

Общий титр 1:35 1:46 1:106 1:86 1:46 1:21 1:43 1:37

% выживания 100 100 100 100 90 90 90 100

Pomona 1:25 1:92 U52i 1:139 1:27! 1:39* 1:160 1:28

Tarassovi 1:40 1:49 1:260 1:57 1:16 1:10 1:30 -

IV 2,0 Icterohaemorrhagiae 1:11 1:53 1:106 1:520 1:57 1:57 1:32 1:57 1:20

Canicola 1:46 1:49 1:57 1:16 1:17 1:13 1:10 1:12

Общий титр 1:40 1:70 1:260 1:53 1:46 1:37 1:40 1:19

% выживания 100 100 100 90 100 100 100 60

Pomona 1:37 1:61 1:394 1:53 1:226 1:36! 1:86 1:53

Tarassovi 1:40 1:30 1:113 1:10 1:17 1:26 1:17 1:12

V 6,0 Icterohaemorrhagiae 1:10 1:49 1:70 1:394 1:43 1:86 1:75 1:61 1:43

(конт- Canicola J:61 1:53 1:171 1:35 1:43 Л:61 1:40 1:20

роль) Общий титр 1:46 1:53 1:243 1:30 1:61 1:80 1:543 1:28

% выживания 80 80 90 80 не исследовали

-it'

та блица 7

Превентивная активность сыворотки крови свиней,вакцинированных концентрированной вакциной в совхозе "Железногорский"

Возраст животн. (месяцы) Доза вакцины (см3) Превентивная активность сыворотки крови свиней для золотистых хомячков по дням

0 10 20 30 60 90 120

1.5 0.5 0 0 30 70 70 60 40

3 0.5 0 20 40 70 80 80 50

свиноматки 1.0 10 60 100 100 100 100 80

Из данных таблицы 7 'следует, что сыворотка крови на 10 день после вакцинации предохраняет от гибели 20 - 60% хомячков, через 30 дней 70 - 100 % хомячков, а к 90 дню 60 - 100% хомячков, через 120 дней превентивная активность начинает ослабевать.

Из результатов видно, что для поросят 1.5-3 месячного возраста доза концентрированной вакцины 0.5 см3 создаёт иммунитет достаточной напряжённости. У свиноматок, вакцинированных вакциной в дозе 1.0 см3, иммунитет высокой напряжённости.

Таким образом, концентрированная вакцина является высокоактивным препаратом, обуславливающим формирование иммунитета.

Определение срока годности вакцины

Дальнейшим этапом нашей работы было определение срока годности вакцины.

Концентрированную вакцину против лептоспироза животных и поливалентную вакцину ВГНКИ против лептоспироза (контроль), предварительно проверенные

по антигеной активности на кроликах, хранил! при температуре 4°С, 18 - 22°С и 37°С.

Препараты по антигенной активности проверяли i опыте на кроликах массой 3,0-3,5 кг путёд однократного внутривенного введения. Кровь браль на 24-25 день и исследовали в РМА на наличие титра антител.

Режим хранения концентрированной вакцины npi 20°С и 37°С существенно не снижает активность вакцины в течении 6 месяцев хранения. Увеличение срока хранения препарата при этих режимах приводи1] к резкому снижению его активности.

Изучение срока годности вакцины показало, чтс при температуре бытового холодильник; концентрированная вакцина сохраняет свою активность до двух лет (срок наблюдения).

Технологическая схема производства концентрированной вакцины против лептоспироза

животных.

Технологическую схему производства концентрированной вакцины мы представляем следующим образом:

I этап. Приготовление питательной среды.

II этап. Приготовление матровых, производственны* расплодок и культивирование лептоспир.

III этап. Составление серии вакцины.

IV этап. Концентрирование антигенов лептоспир v цеховой контроль.

V этап. Контроль вакцины.

Таким образом, разработана концентрированная вакцина против лептоспироза животных, которая положительно зарекомендовала себя при лабораторных и практических испытаниях.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан способ изготовления, контроля и применения вакцины концентрированной протиг

применения вакцины концентрированной против лептоспироза животных.

2. Предложенная технология обеспечивает повышение иммуногенности концентрированной вакцины, по сравнению, с коммерческой { поливалентная вакцина ВГНКИ) на 12-15 % за счёт исключения из технологического процесса трихлоруксусной кислоты и щёлочи, частично разрушающих антигены лептоспир.

3. Фильтрация культуры лептоспир через УПВ -б задерживает, как цельные, так и лизированные антигены лептоспир. Иммуногенность антигенов лептоспир в процессе фильтрации не изменяется, фильтрат не содержит следов антигенов лептоспир.

4. Концентрирование лептоспир путём ультрафильтрации сопровождается частичным их лизисом, что позволило нам вывести коэффициент лизиса лептоспир в процессе концентрирования. При определении концентрации, лептоспир сгущенных в 5 раз, коэффициент лизиса составляет 1,8; при концентрации в 10 раз - 2,02; при концентрации в 15 раз - 2,3.

5. Определены оптимальные иммунизирующие дозы препарата, напряжённость и продолжительность иммунитета у крупного рогатого скота и свиней. Иммунитет достаточной напряжённости и продолжительности формируется после однократного введения вакцины молодняку сельскохозяйственных животных в дозе 1,0 см3, взрослым животным - в дозе 2, 0 см3.

6. Вакцина концентрированная характеризуется высокой устойчивостью при хранении и не утрачивает иммуногенности при температуре 20°С и 37°С в течении б месяцев, при температуре 4°С более двух лет ( срок наблюдения).

Практические предложения

1. Изготавливать и применять в животноводстве вакцину концентрированную против лептоспироза животных в соответствии со следующей нормативной

- инструкцией по изготовлению и контролю вакцш концентрированной против лептоспироза животны; утверждённой Департаментом ветеринарии МСХ РФ от февраля 1994 г.;

техническими условиями ТУ 93 - 84 - 046 - 00' -41-85-94 "Вакцина концентрированная прот! лептоспироза животных", утверждёнными Департаменте ветеринарии МСХ от 7 февраля 1994 г.;

наставлением по применению вакциь концентрированной против лептоспироза, утверждённо> Департаментом ветеринарии РФ от 22 июля 1996 г.

2. Использовать концентрированную вакцину дл вакцинации животных против лептоспироза вмес: поливалентной вакцины ВГНКИ, как более иммуногенну*

3. Для стандартизации концентрированной вакцин по иммуногенности проводить цеховой контроль учетом степени лизиса лептоспир в процесс концентрирования.

Список

работ опубликованных по теме диссертации:

1. В. И. Белоусов, Э. Я. Сазанова, Т. Я. Шквару> А. К. Елисеев, Г. Л. Соболева, Е. В. Сусский, В. Г> Усольцев. Испытание безбелковой среды д у. культивирования лептоспир.//Научные основы технолог!' промышленного производства ветеринарных биологически препаратов г. Москва - 1991 г. - с.143

2. Г. Л. Соболева, Ю. А. Малахов, Е. I Тетерникова, Е. В. Сусский, А. П. Сурмило. Разработав и стандартизировать -методы контроля концентрирование вакцины против лептоспироза животных.// Заключительнь отчёт. - 1995. - УДК 619:616.98:579.843.115:615.371. № гос. регистрации 0190033574.

3. Патент К' 2030915 "Вакцина против лептоспир о; животных" от 31 октября 1990 года.// Ю. А. МалахоЕ Г. Л. Соболева, В. И. Белоусов, Е. В. Сусский, Е И. Ситьков, В. И. Заерко, А. П. Сурмило, Н. Р. Орёх