Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Токсикологическая характеристика и ветеринарно-санитарная оценка метаболитов гриба Fusarium grahirearum schw.

V* \

На правах рукописи

Зотове Елена Владимировна

ТСКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ВЕТЕРШАР!10-САШ1ГАРНЛЯ СГ{ША ЫЕГАБСШИГСВ ШВА УиЗАМШ ОЛАШНЕАШШ ВОНИ.

16.00.06,- ветеринарная санитария и окологая

Автореферат ряссертации иа соискание ученое степени кандидата ветеринарных паук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена во Всероссийской научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиеш и экологии.

Научна»? руководители: аоктор ветеринар»« наук В.А.Долгов, кандидат химических наук Г.П.Кононенко

Официальные оппоненты:

I,Доктор ветеринаршх наук, профессор Г.Н.Коркевенко

¿.Кандидат биологических наук, ведущий научшй сотрудник Л.С.Львова.

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Ковалепко (ВИ2В)

Защита состоится /Ш 1996 г. в *часов ка заседании диссертационного Совета Д. 020.50.01 при Всероссийской научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиеш и экологии ( 1230(22, Москва, Звенигородское гаоссе,5, тел.256-35-81)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВСГЭ.

Автореферат разослан "У" а»Р&/VI 1996 г.

УчешЙ секрегарь и; 1 ас ер! ацио то г э Сонета, кандидат биологически/; нг<ук

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАГОШ

Актуальность там. Изучение продуктов метаболизма гриба ри-оаг1ил цг8га1пеагип ЭсЬя. , образуемых им на зерновых субстратах, тгаеится к числу особо ва*шк иещжо-биологических и ветеринарнс-ганитарных проблем.

Гриб Р.егат1пвагиш является распространен«!« возбудителем фу-5ариоза зерновых кулыур во многих странах мира и э ряде обширных регионов зерносеяния в нашей стрэнэ4 в частности, на Северном Кавказе (Краснодарский и Ставропольский края, Ростовская оо'ласть) и й Белгородской области. Среди метаболитов, продуцируемых указанным видои гриба, известна соединения, обладавшие высокой токсичностью, цутагеншми, тератогенными и канцерогенными свойствами. Контаминация пищевых продуктов и кордов токсичшми метаболитами гриба может оказать отрицательное влияние на состояние здоровья человека и животных, понизить их сопротивляемость к заболеваниям незаразной и инфекционной этнологии, а также явиться причиной значительного экономического ущерба, связанного с изъятием больших партий зерна из продовольственной сфер! и сферы кормопроизводства, снижением продуктивности и воспроизводительна; функций сельскохозяйственных животных.

Исследования изолятоз этого вида гриба из озимой пшеницы, взращенной в хозяйствах Северо-Кавказского региона, показали, что более 90£ из них являются продуцентами микатокенна - 4-деаоксини-валеяола (ДСК), относящегося к группе в-оксотрихота^енов. Большинство изоллтов, продуцирующих ДШ, способ» оОразовквать еще четыре сгруктурьо-родсгпенных мегаболита - 3-ацетил-4-дезоксинуьалеяол(3-ДДСК), 15-ацетил-4-деэоксиниваленол '15-ДДСН), 4,7-дидезоксттза-ленол (7-ДДН) и 3,?)8,15-тотрао1сек-12,13-эпокситршспта<-9"Ы! (7,3-диоксикалонектркн тетрэол, ?, 8-ДОКТ). Доля этих метаболитов может

постигать А% от уровня ДСП. Кроме того, некоторые изолята гриба в экспериментах при оптимальных условиях образуют на г «рае метаболит из группы бутенолидов - 5-ацетамнп<э-2(5Н) -^урамон (5-АДй).

Токсичность мошацетилыкх залетелдах 3-ДДОН и 15-ДДСН и бу-теяолида 5-АА5 изучена крайне недостаточно, а данше «о токсичности двух других метаболитов - 7-ДЦН и 7,8-ДСКГ отсутствует вообще. Прсаваритеяышя оценка показала, что токсичность этих соединений может быть равна..или превышать токсичность ДОН. Действующие в настоящее время методики анализа зерна, принятие в системах ¡¿иясеть-хозпрсда и Минздрава РЬ не предусматривают определение в им вышеназванных контаминаятоз, сопутствующих ДОН. В связи с этим представляет большое научное и практическое значение изучение токсичности метаболитов гриба Р.кгвв1поагив , разработка методов их определения в зернофураже и кордах.

Цель работа. Цепью данной работы являлось изучение параметров токсичности метаболитов гриба ?.£гат1пеагшп , разработка методов их определения в зернофураже и продуктах его переработки.

В задачи исследований сходило:

- оценить токсичность шести метаболитов гриба У.^гвШлеагии по деЛствив па кожше покровы лабораторных животных, ростовую реакцию простейших Те^аЬуюепа руг1Гогш1в (Тетрах имена пнрифодоис), куриные эыбриолн, белых мыле« при пероральгш введении;

- отработать методические приезд извлечения из зерна, ваьслг-нкз из экстракта и количественной оценки токсичных коитаминантов

' яйя разработки метопов их определения в фузариозном зерн».

Научная новизна работа состоит и следувцвл:

- разработана историка определения содержания остротохсичшх трихотеценов в зсрнофуразе и комбикормах по точечной пробе на коже кролика;

- впервые определена показатели острой токсичности чрихотвце-коз 7-ДДН и 7,8-ДОКТ, структурно-родственных ДОН, для белых мышей;

- проведена сравнительная оценка токсичности ДОИ, 3-ДДОН, 15-ДДШ, 7-ДДН и 7,8-ДОКТ по показателям четырех биотестав;

- шш группы токсичшх контаиинантов зерна усовершенствована процедура выпадения из экстракта, найдены способы их направленной зсшической модификации и оптимизирован режии хршатографического разделения и детектирования.

Практическая ценность работа. Результат работа вошли в "Методические рекомендации по количествегпюму определении дезоксини-валепояа в зерне с применении обращенно-фазовой высокоэффективной еядеосткой хроматографии", утвержденные Отделение.) ветеринарной медицины РАСХН а 1995 г., предназначекшв идя научно-исследовательских и производственных лабораторий, осуществляющих контроль санитарного качества зеряа, и "Йеторку экспресс-анализа зеркофурала и 'комбикормов на содераапио остротоксишых трихотеценов", представ-денцуо для утверждения в Дшартшенг ветеринарии Минсельхозпрода

Апгобашш работы. Материалы диссерта!(ии долоаены на мезсяайо-раториш Совецисш яаучияс сотрудников ВНИИВСГЭ 28 февраля 1996г.

Что выносится к защите;

- оценка токсичности шести иетабоггатзв гриба p.grBminsartim по четырем tíнотестам;

- "Методика зкспресс-аяализа зернофуража и комбикормов на со-аараапие остротоксичшх трихотеценов'' по точечкой проб о на sosa кролика;

- "Методические рекомендации по количественному опредеяеная дезой шив ал енола в зерке с пркненсшел обращалка-фазовой шсоко-еффехтивной яшшосткой хроматографии".

Публикации.

По теме диссертации onyÉtoisanaso 4 стазыз, в каторз: содсрза-тся материалы исследований.

Объел работа.

Диссертация п&ясяеш на сгралицах ышплкшскэго текста и состоит из вве?щшя8 обзора литсра-х^ра» собйгвшшх вссяедявешЗ, обсузавшш результатов, шводов, пршшгчесми: прерлсаенпй, шзух приложений. Содервит таблиц, рисунков и 1 cxeiír. Список яи-торатурп включает /£3 источника, в юн чшиш UÓ шгоотраншх.

2. СОБСЯШШНВ 1ШВДВАНШ 2.1. Материала к иетсрн иссяедовавий

Работа проведена в секторе фгшко-яшкчеста методов исследования и сертификации кормов (сектор микотокеикояогии), в лаборатории ветсринарио-санитарной экспертизы мяса ВНИИВСГЭ и на Рязанской бройлерной птицефабрике в период о 1989 по 1995 гг.

Объектом исследования была группа из пести метаболитов, типичных для BHttaF.graatnearum . поражающего вегетирувщув пшеницу в

a» Q тт

Краснодарском крае. Метаболита трихо^еценового ряда ДШ, 3-ДДШ, 15~ДЦ0Н, 7-ДДН и 7,8-ДСКТ бнли получены в секторе физико-химических методов исследования и сертификации кормов из мицелиаяько-эерновой биомассы птаыча 579а ВКИИЗ. Цутенолид 5-ААФ был получен синтетически из фурфурола в Краснодарском политехнической институте (исп. В.Б.Посконин). Эталонный Т-2 токсин для исследования был приобретен через фирму " 8ervan (США).

Опыт по оценке легальной токсичности проводили на коже крыс массой 200-250 г, анестезирован!?« скбазонсм (20 мг/кг, однократно виутрктшпчно) перед депиляцией, и кроликов порода шшшгилла массой 2,5-3,0 кг с непигаентироваииой кожей. По 20 мкл растворов веществ в атилацетате нвлос;ши на поверхность кожи микрошприцом в точку постепенно, порциями по 2 мкл (диаметр 5 ми). Токсическое действие веществ на коау определяли по степени проявления воспалительна реакций на поверхности контакта через 24 , 48 и 72 часа. Токсичность веществ вырадали в показателях пороговых или минимально-действующих дорматоксическюс доз (ВДДД) - нашеньших доз, вызывающих через 48 час реакции слабого покраснения по периферии поверхности коглакта. Для испытания -Готовили три серии растворов вещества № расчета содержания 0,001-0,009, 0,01-0,09, 0,1-1,0 мкг в 20 'икл раствора и, при необходимости, дополнительные аозн от 10,0 до 100,0 мкг. В опытах использовали и серий растворов этанольного Т-2 токсина о содержанием актишюго вещества 0,001-0,009 мкг.

При оценке токсичности метаболитов для простейших использовали культуру роснитчаойх ftHgysopHíl Totrnh;/aenn pyriforsio (Титра-х»шена пириформис) , вцрзценчуп на пептондай среде. Среду ш:-айтчькроаали от посторонней микрофлоры в кипяще'1 воде в течряие 30 мин. В оетавщуп среду вносили еодшо растворы исследуемых'микотоя-аиноя в количествах от 0,5 до 40 мкг/мл, добавляли по 0,0t мл трак-

суточной культур тетрахимеи, инкубировали 24 часа при комнатной температуре. Регистрировали ростовую реаеди» путем подсчета инфузорий в счетной камере %кса-Розенталя, устанавливая концентрации ми-кэтоксинов, вызывающих 50&-ное снижение числа простейоих по сравнению с контроле* (ИК^о).

Сравнительную оценку токсичности для мьппей ДШ, 7-ДДН и 7,8-ДОКТ проводили на 600 белых мышах живой массой 17-21 г. На каждый опыт ф-шировали 10 групп по 10 голов. Растворы испытуемых токсинов вводили в 2СЙ-ном этаноле однократно по 0,5 мл в к еду к.ок через аовд в дозах 20, 30, 40, 50, 60, 70, ВО, 90 и 100 мг/кг веса тела гнвот-иого. За тавотными наблюдали в течение 2-х суток. Павших животных, а также животных, декапитиров&ншх по окончании срока иаблвдеяия, аскрырчхи, отбирали для гистологических исследований сервдо, печень, селезенку, почки, фиксируя их в 10£-нш растворе формалина.

Оценку шбриотоксичностк ДШ, 7-ДДН и 7,8-ДСКГ проводили ва 559 онносуточных куриных эмбрионах в ишубатории птицефабршм. Дкя приготовления испытуемых растворов рассчитанное количество токсина растворяли в 220 мкл 0,9^-иого физиологического раствора, содержащего по 210 ЕД пенициллина и стрептомицина, п вводили по 10 мел раствора на эмбрион. В опытах били испатэш следующие дозы - 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 25,0 и 50,0 ыкг/я11цо. В шшюй опнтвой груше било по 20 эмбрионов. Зыбрпотоксичесдое дсИсгаяа иикоа'окшюв оценивали по смертности эмбрионов, результате! пагояого-анатшического вскрытия погибших шбриоиов, показателям шводшости и физиологического состояния цыплят.

При разработке методов обнаружения и количественного определения компонентов, проявивших токсичность, использовали приемы тонкослойной (ТСХ) и обращайте-фазовой высокоэффективной жинкостиой (С®-

ЗЖ) хроматографии.

ТСХ проводили на пластинках "Силуфол" с толщиной слоя 0,1 мм С Kavalier", ЧСФР). Для детектирования веществ использовали три режима обработки пластинок - 10%-ти раствором хлористого алшиния в этаноле (10 мин, 92,0+0,1°С), 20%-гш раствором серной кислоты а зтаноле (2 мин, 92,0+0,1°С), реактивок Такитани (3$6-жм растворов 4-нитробензилпиридина (30 мин, 150+1°С) и 1С%-ным раствором тетра-этиленпентамина в смеси хлорофорл-четнреххлористай углерод в соотношении (2:3)). Количество токсинов определяли на основании визуальной оценки в УФ при Збб т и путем денситсметрии на сканирующая аенситометре " Caaag TIC Senner II" (" Camag", Швейцария), измеряя флуоресценции пятен при длине волш 315 ш. Интенсивность флуоресценции определяли по высотам пиков хроматограф. В качестве компонентов подвижные фаз (И) испольэоЕали метанол, изопроаанол , ацетон, хлороформ, этил ацетат, бензол, гексан.

ОФ-ВШОС выполняли на хроматографе "41илихром-1й", снабженном микроколонхой размером 62 х 2 им, заполненной сорбентом Huclecoll Cjg (5 нкм) при скорости потока элаента 50 ккл/мин. Вещества детектировали У4-спектрзфотометрически при длине волил 224 ш, В качестве органических модификаторов 03 использовали зтано», метанол, 'ацетонитрил и теграгидрофуран.

Запись УФ-спектров анаиизируа. х веществ проводили на спектрофотометре " Hitachi 557" (Япония).

Для модификации трихотеценов использовали растворы аммиака и едкого кали в смеси метанол-вода в соотнолении 9:1 в диапазоне концентраций 0,01-0,1 н., и активную двуокись марганца.

Результат экспериментов обрабатывали с использование* метопов вариационной статистики по Керберу, Стадеиту, Доспехову.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Оценка токсичности метаболитов F.graninearum.

Точечная аппликация растворов ДШ, 3-АДСН и 15-АД0Н на кояу крыс в дозах от 0,4 до 10000,0 мкг и Т-2 токсина е дозах 0,01-1,0 мкг показала, что минимально-действующие дерматоксические дозы (МДПД) изученных З-оксотрихотеценов находятся в достаточно узком диапазоне 0,5-2,7 мкг И оказываются существенно выше, чал лЩДД Т-2 токсина в этом биотесте, равная,по нашим данным,0,02 мкг {табл.1).

Большая чувствительность этой биопробы достигалась на коже кроликов. ЦОД для ДШ, 15-ДЦ0Н, 7-ДДН составила ОД мкг и для 3-АДШ « 0,5 мкг. Эти 8-оксотрнхотецены, имеющие близки? ВДОД 0,10,5 мкг, уступаю1;? по степени токсичности в этом биотесте Т-2 токсину и ди ацетоксис.цирпенолу (ЦДЦД » 0,005 мкг), и 4-ацетилнивале-ноду (фузареноцу X) (ОДДД » 0,01 мкг), но превосходят по этому показателю другие трихотецеет, в частности, ацетнл-Т-2-токсин (Ц!ЗДЦ= 1,0 мкг). Установленная нами высокая tgra отвит ельность этой биопробы для Т-2 токсина и диацетоксисцирпенола использована при разработке "Методики Бкспресс-анализа зерна на содержание остротоксичных трихотеценов". 7,3-ДШТ и 5-ААФ практически не оказывали токсического действия, ВДД для них оказались равными 20,0 и 60,0 соответственно.

Вое исслепованше метаболиты оказывали ингибирующее действие на ростовую (гедеративнуп) реакция простейших Тетрахимена пирифор-мис и по степени ингибировакия располагались в спедуищем порядке: 15-АЦ0Н»ДШ 7-ДДН »7,8-ДСКТ > б-AAS > 3-АДЖ. Ет:зт показатели токсичности для 15-ДЦШ и ДШ (Шэд соответственно 1,8 и 2,4 мкг/

Таблица I

ПОКАЗАТЕЛИ ТОКСИЧНОСТИ МЕТАБОЛИТ® ишнил! (ша1сшеал1ш для 4-х Ш0ГЕСТСВ.

1 ! Метаболиты | I то (миг) кролик | крыш ' 1 1 1 —! ! ®50 (ыкг/мл) Тетрах.пириф. 1 1 I %0 | } (мкг/яйцо)( | пурин. амбр| ^50 (мг/кг тши

дш 0,1 1,7 2,4 7,3 51,0

7-ДДН ОД 6,5 97,3 89,7

15-АДСН ОД 1,0 1,8 34,0х

7,а-дскт 20,0 7,2 ЗИ.О 7г,о

3-АДОН 0,5 2,7 27,5 31,0х

5~Ш 60,0 12,5 >8000, 275,0

х - по лит арату р1Ш наши.

ил), а такзо для 7-ДДН и 7,8-Д(Ж (ИК50, соответственно, 6,5 и 7,2 ыкг/нд). Наш ом ее токсичи^и являлись 5-МЭ (ИК§д>12(5 м кг/и л) и 3-ДДШ (ИКб0»27,5инг/ЙЛ).

Значения ДДзд пяя кюринах шб} подав, составившие для ДСЙ - 7,3 мкг/яйцо, для 7-ДДН - 97,3 мкг/яйцо н для 7,&-Д(ЖТ - 301,0 мкг/яйцо показываот, что а этой биотесте 7-ДДН я 7,В-ДОГГ были гораздо иенсз токсичшаи, ч«м ДСП. Характер действия веществ а I и 2 период инкубации такае оказался раэличнш. 1..4еяь шбрионоз в опыте с ДОН наступала преимущественно в 1-ой половияо инкубации. 7-ДДН и 7,8-Д(КГ вызывали гибель ембряонов в равной мер о в I и ?. полочине инкубации.

По-видимому, эти структурно близкие метаболита имеют различные механизмы действия на эмбриона, и биотест и сьевь-х" не может быть использован для сравнительной оценки токсичности подобных метаболитов.

При определении острой токсичности трихотецеяов на белых мышах п-ч введении внутрь значения ЗД^ составили для ДСН - 51,0 ыг/ кг нивой массы, 7-ДЦН - 89,7 мг/кг, 7,8-ДОКГ - 72,0 мг/кг. Позучвн-ше значения ДЦзд и однотипные дозазазисюдае изменения в печекн, почках, селезенке и сердце в виде застойная явлений на фоне дистрофии очагового типаэвыявленше при патолого-ояатошмескои вскрытии и гистологической исследовании, показыветт, что зги трихотецеда имао? близкую токсичность при оральном одноразовом введении остра доз в организм мшеЯ.

Сравнительная оценка результатов, получеяшх в 3-х биотестах позволяет отнести к чиоцу токсичных метаболитов пять из шести.исследованиях соединений - ДСН, 15-АД0Н, 3-АДОН, ?-ДДН и 7,8-ДСКГ.

2.2.2. Разработка методических подходов для определения токсичдах метаболитов гриба?иеаП\ш вррв»1пввгит в зерне.

2.2.2.1. Направленная химическая модификация трихотеценов.

Оправление ДОН и сопутствуюфпс ту токсичшх трихотеценов [5-АД011, 3-ДЦОН, 7-ДДН и 7,8-ДОКТ в яернч «ожег быть выполнено и ^я.чпвяьно, в частности, при сбраценно-^азовоР васокоэффект/вной г.(1пк'»«п»й )гс'1Иг<гог1-.-|фий (ЗМХ) >Ш1 при свукря-пгой '•(.п'-юло:'*»'!^

хроматографии (ТСХ) на силикат ел а при посл.^оаатеяьпом примемеяин двух порвижгш фаз толуол-метанор (6:1) и этилацетат-гексан (3:1) с последующим детектированием веществ спектро- или фдуориметричос-ки. При выполнении серийных исследований раздельное определение достаточно трудоемко. На практике пля анализа зерна па содержалие контаминантов, гелаощих близкие показатели токсичности, достаточно определить их суммарное количество. Такое определение мопет быть наполнено после модификации «ногскоыпонентной группы трихотецеиов таким образом, чтобы упростить ее состав, а следовательно, и заключительную стадию анализа.

3 группе токсична трихотецеиов, сопутствующих ДОН, три метаболита - 15-АДОН, З-АДОН и ?,8-Д0йТ имеют одинаковое с ДШ расположение замечаюсь« групп при Сд, С^ л Различия со структурой ДШ состоят в о слой ацетильной группе при Сд и С^ у 3-АДОН и 15-АДОВ и одной оксигруппв пр| Сд у 7,8-ДШТ.

15-ДД0Н ( ^»Н, Я2»Ас)

Эта идентичность в расположении заместителей в структурах трех перечислен«« метаболитов и была использована нами пля разработки приемов их направленной модификации в ДОН.

Для превращения 3-ДДШ и 15-АДСН в ДШ нами была использована реакция гидролиза. Учитывая присутствие в молекуле* 15~АДШ Ш-груп-пы при С7, сближенной с ацетильной группой при "'»»но бктю предположить, чти гидролиз 15-АДШ будет про ист о пить л'-.гче, агм гидролиз 3

ОН

»0 НО ^

3-ДДОВ (К^Ас, н2«Н) . ДОН

НО ОН 7,8-ДСКТ

Рисушк I.

ЗАВИСИМОСТЬ ОТШЕНИ ГВДРОЛИЗА З-ДДОЙ (I) И 15-АДСН (2) В ОЕСИ /ЛТАНОЛ-ВОДА (9:1) ОТ НОРдШЕШОСТИ РАЙВОРА А4ЫИАКА ЧЕРЕЗ 16 Ч РЕАКЦИИ (А) И ОТ ВЫМЕНИ РЕАКЦИИ С О,И н. РАШСРШ КСН (Б).

А В

Действительно, при гинролизе как амаиаком, так и КСН, сцыденме 1Б-АДСН происходило значительно легче, чеы 3-ДДСН. Степень гидролд-ва 15-АД СН Он ни. существенно шие нал всех иаученшх концентраций раствора ашиака (рис, IA). Большая степень гидролиза 15-ЩИ api обработке 0,01 и. растворов КШ хорошо прослеживается для интервала времени реакции 10-30 иин С рис. 1Б). Поскольку 3-АДОН гидрояизуется труднее, именно для него ш исследовали степень гидролиза растворами оимидка и К0Н возрастающей кор1&«ыюсти от 0,1 до 0,1 и. для выявления минииальдах концентраций реагентов, обеспечиваш&ос полдай гидролиз ацетата. Полученнле результата показали, что при аддорки-вании вещества с 0,05 н. раствором КОН в течение 10 иин происходит полшй его гидролиз.

Для превращения 7,ВтДСКТ в ДОН нами была изучена возможность применения реакции окисления Сд-гилроксильной группы в леку л в

7,8-ДСКТ в карб01ильнуз группу. Результата показали, что при растворении 7,8-ДСКТ е ацптокнтриле и добавлении активной двуокиси марганца реакция превращения 7,8-ДаКТ в ДСН начинается через 10 мил и практически годности завершается через 30 млн.

Таким образом, проведение последовательно 2-х реакций - окисления активной двуокисью маргониа и гидролиза вэдно-мэтанэльшм раствором КОН позволяют быстро и количеств еннэ превратить три тркхо-тецена 3-ОДОН, 15-ДЦСН и 7,0-ДдаТ в ДШ. В рэзультате группа соеаи-пепий из пяти компонентов оказывается ДБухшшонентяой (ДШ и 7-

да.

2.2.2.2. Усовершенствованна процедуры

очистки экстрактов.

Результат« провсдекшх экспериментов показали, что экстракция зерна елесьп ацетонитрила и воды, использованная в базовой методике анализа на содержание ДШ, обеспечивает полное извлзченне всах пяти определяемых трихотеценов. Однако при выполнении адсорбционной очистки на колоше степень их извлечения оказалась продинако-воа. Необходимый процент извгечэния всех соединений достигается при элвировании наполнителя: колонки 20 мл экстракта и еще одним таким кз оЗьваон смеси вцетонитрила и воды (5:1).

2.2.2.3. Выбор режима хроматографии к детектирования для определения ДОН и 7-ДЦН.

В бзиовой методике анализа зерна на сокераалие ДШ для хрома-то графического разделения очищенной йтракции экстракта была и.лоль-зовопа ТСХ на пластинках "Силуфол" и детектирование токсина через измерение интенсивности флуоресценции его комплексного соединишя

с хлористш &шшшш, образуемого па. оластинхе при нагревании (8К°С, 10 мин). 7-ДДН, не имстэщий 7-Ш гцупш, необходимой для образования такого комплексного соединения с хлоримым алшиниы, не может быть детектирован ташм методом. Более того, при ТСХ на силу фоде в lit, составленшх из кевотах растворителе!, хромато графические подвижности ДОН и 7-ДДК оказались одинаковыми.

Таблица 2. ПАРШГШ ВЯХ РАЗДЕЛЕНИЯ ДСН И 7-ДДН В ® ВСР-АЦИСКИГРИИ И ВОДА-ТИРАГВДРОИПРАН.

Сопер.орг. { Объем уаерк., ! ¿,с&-уоа'шкат. 1 мкя 1 лскти- -......-.....1 ..... ! Соаер.орг. IОвьем удер. мз&изнкат. 1 ш ! лекти

оо./ь J дда 7-да } внос-ь 17-ДДН } ДОН { икость

Аце-токитр'дл Тетрагидрофуран

зя 3SI 364 1,09 16 313 356 1.1«

36 303 321 1,0В 18 254 267 1,20

40 260 274 1,06 20 250 281 1,19

50 221 233 1,09 24 225 256 хда

30 216 240 I.I9

Для разаелекия пары ДОН и 7-ДДН в режиме (Ф-В32Х мы опробовали бинарные подвихшв фазв, содержание в качестве органических модификаторов ацетонитрил и тетрагидрофуран (ТГЙ) (табл. 2). В Г® во-аа-ацетонитрил, содержащих 33, 36, 40 и 5<Й ацотонитрила, аостига-лось разделение этих компонентой, но с низкой селективностью. Необходимая для эффективного р&зпеления компонентов смеси селективность постигалась в 1Э аодя-ТГ®. Найдучасе раз леденив обоис компонентов и приамеиов прэ*я анализа, равное 14 лин, достигалось в П4, содержащей Ы% ТГв.

Максимум спектра Уй-погаощешя 7-ДЦН в Ш) ?А% ТГ'Э в воде находился яри 228 m (£ 5981), тогда кая для ДШ - при 217 m (<? 5018). Оба вещества имели равную способность к поглощению при 224 IM. ' '

Найдегшнэ нами оптшальнас ретом В<Щ я детектирования исподь-зоваш для разработки " Методических рекомендаций по определении ДОН п зерно с примоиишш обращенно-фазовой высокоэффективной длд-костной хроматографии".

ШВОДН

АЛровеясна сравнительная токсикологическая оценка метаболитов rpiîia. ïusarilon gpaiilBearum на различных тест-организмах (кроликах» ajHcax, шагах» еибрионек» простсГшнх) к определен параметра

'-■х юхатюсги (кЩЛД, ДЦдд, ISKgg).

2. Для яршеотецеков ДШ, 7-ДЩ1 и 15-ЛДСН мидамальш-действую-■ щзд д.(?таат-окс'№сиая доза бета сшой гшкоа а ряду нсслеаовмпглс

метаболитов и равнялась 0,1 «кг| для 3-.ЛДСН ока составляла 0,5 мкг, а для 7,8-ДСКТ я б-Ш - соответстзегш 20,0 и 60,0 мкг.

3. По !5нгиб!фупщэ0 действии ка генеративную реактуш инфузорий Теграсшена пирифортис метаболита располагались в следующая порядке (по мере убывания эффекта): 15-/Щ0Н, ДОН, 7-ДЦН, 7,8-ДОКТ, 5-АМ, З-ДДОЯ; при этом для первых петарех соединений значения Ш50 находились в пределах 1,8-7,2 икг/мл» а для 5-ААФ и З-АДОН они составили, соответственно, 12,5 н 27,5 мкг/мл.. Показана позмоотость использования результатов биотестирования на шгфузориях: аля ориентировочного определения параметров токсичности трихотецеиоч лля высших ЖИВОТНЫХ.

4. В опытах на одкосуточшх куришх шбрионах значения ВДдд ыя ДОН, 7-ДДН и 7,8-ДСШ составили, соответственно, 7,3; 97,3 и 301,0 ыкг/яйцо; при сравнительное оценке трпхотеценов на этом биотесте показана целесообразность учета смертности шбрионоз по полному сроку инкубирования.

5. При оценке остро* токсичности метаболитов на мышах у стада златые значения ДД50 иг. 7-ДДН (89,7.иг/кг) и 7,8-ДСКГ ('/2,0 иг/кг) были близки аналогичному показатели ик ДШ (51,0 ыт/кг): гистологические исследования органов животных выявили опиотинше доаа-зависимнв патологические изменения в печени, почках, серпця и селезенке,

6. На основании проведенной нами токсикологической оценки сопутствуйте ДОН трихотецени 3-АДШ, 15-АДОН, 7-/ЩК и'7,8-Д0КГ ог-несеад к категории токсичных контаминонтса зсча, пораненного Ри-

eari.ua &г»Е1пеегиш .

7. Разработаш ыетоднчаскке подходы, необхоашие для контроля фузариозного а ери а на союрзМние всего комплекса токсичшх канта-иинангйв: усовершенствована процедура очистки экстракта; опрсасло» ш условия направленной химической модификации группы трихотсцезгав, упрощающей ее состав; выбран опткаальшй реши хроматографического разкелекия и аетектировапия тркхотеценов.

8. Установлено, что окмслгоше активной двуокисью марганца и гидролиз воано-метанольшм раствором КС11 обеспечивает быстрое превращение трек трпхотеценов 3-ДДОН, 15-дДШ и 7,8-ДШТ а ДСН, зеле-кствие чего запача определения всей уппы коитачинантоЕ сводится к опреагантип квух компонентой - ДШ и 7-ДДН.

- Г8 -

9. Решы высокоэффективной эшакосгозЬ .роматографин (ВЗЗОО в обращ&то-фаэовои режиме в подвияной фазе (Ш5), содержали тот-рагидрсфураш в воае, обеспечивает аффективное и быстрое раапояение ДШ и 7-ДДН; оптимальной для У&-аетектироаания обоих соединений является длина волна 224 юи

10. По результатам проведешт исследований разработана "Методика окспресс-гшзлиэа зернофурааа и комбикормов па содержание ос-трзтсксичшх трихотецшов" и "йетояически^ рекомендации по колнчес-твегяяиу определенна ДСН в зерне с пргслашшет обраченио-фшовой Вй2Х% предиазначешш для научно-«..«! еаовательсккх учреждений н производств етах лабораторий.

ПРЛШЯ1Ш1Б ПРЁДЛаШШ

1. Разработана "Методика акспресс-апалпза зериофураза и комбикормов яа содерзаияа остротозсичшх трихотецешв", направленная для утверждения в Дсаартааотг ветеринарии Йшсезьхозпрода К2.

2. Разработан* "¿етоЕИЧсышо рекомендации по количественному оиреаеденка дезоксинивалсшола в зерне с применением обращенно-фазо-вой шгокезффектиякой шшсоетгай хроматографии", утверахенше Отделение! ветеринарной медициет РАСХН в 1995 году.

СПИСОК (ЯУВШКСВАНШХ РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИЙ

I. Е.В.Маланина. Выделение и оценка токсического 4-л.езоксини-валекола, вторичного метаболита Рввагйит егаа1п8апиз .// Материалы конференции молошх учешх химического факультета МГУ. 1988. Рукопись депонирована в ВИНИТИ,ТООВ-ВШ.

2. ¿LH.Леонов, Е.В.Зотова, H.A.Соболева, Г.П.Кононешсо. Дер-ыатоксическое действие структурно-близких трихотецекза грибов Fu-oariun .//Докяали ВАСХНИЛ. 1990. Ш. С.52-&5.

3. Б.В.Зотова, Н. А.Соболвва, Г.П.Кононенко, А.К.Леонов. Токсическое действие ниваденола, 4-дезо»синивадеиода и их ыоноацета-тов в локальной биопроб о на козе крыс.// Лабораторше амвотше. I992.T.1Ü. Н. С.211-216.

4. Е.В.Зотова, А.Н.Леонов, Г.П.Кононенко, Н.А.Соболева. Пороговая уровень токсического действия бутеколиаа 5-ацетааидо-2<й0-фуранона при аппликации на кояу кролика,// Лабораторные шшотше. 1994, Т.1У. №3. С. 154-157.

ВНИИЗСГЭ, 1995 г., Москва, Звенигородское иойсе, 5. Тираж ¿Оэкэ., аак.