Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Структурная и функциональная организация репаративного остеогенеза у животных

На правах рукописи

Ватников Юрий Анатольевич

СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА У ЖИВОТНЫХ (экспериментальные и клинические исследования)

16.00.02 - Патология, онкология и морфология животных

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена на кафедре незаразных болезней Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Б.В. Уша, член-корреспондент РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор (МГУПБ)

Г.И. Брагин, доктор ветеринарных наук, профессор (МГУПБ)

В.А Лукьяновский, доктор ветеринарных наук, профессор (МГАВМиБ)

В.Е. Никитченко, доктор ветеринарных наук, профессор (РУДН)

Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины.

Зашита диссертации состоится

Л?

июня 2004 г. в

/Г....

часов на

заседании Диссертационного совета Д 212.149.03 в Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ.

Автореферат разослан ^мая 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук

Смирнова И.Р.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Структурная и функциональная организация посттравматического восстановления органов и тканей это «... саморазвивающийся процесс, не зависящий от участия этиологического фактора» (Давыдовский И.В.). В этой связи выявление закономерностей развития репаративного остеогенеза, вопросов активизации его составляющих заслуживает самого пристального внимания, так как количество травм с каждым годом увеличивается. К.А. Петраков с соавт. (1994), А.С. Кашин с соавт. (1995) констатируют, что травматизм у собак составляет от 10-12 до 14,4 % по отношению к другим хирургическим заболеваниям. По данным Объединения ветеринарии г. Москвы количество травм в 1999 г. составило 17-19 %; в 2000-2003 г. - от 18 до 26 % от всей хирургической патологии.

По информации Государственного центра травматологии г. Москвы костный травматизм составляет 80 % от общего числа пациентов (Слеса-ренко Н.А., Самошкин И.Б. с соавт, 2002). Статистические показатели находят свое яркое подтверждение в работах С.А. Ягникова, 2001; Н.А. Сле-саренко с соавт, 2001; В.А. Лукьяновского с соавт,, 2002; И.Б. Самошкина с соавт, 2002; М. Dudley et al., 1997; К.Н. Kraus et al., 1998; W. McCartney, 1998;P.Muiretal., 1999.

Лечение травматических переломов направлено, главным образом, на выполнение механических подходов к стабилизации кости, которые, достигнув совершенства, исчерпали свои возможности. Свидетельством этому является обилие технических средств и неудовлетворительные результаты лечения (Лаврищева Г.И. с соавт., 1981), зачастую приводящие к образованию псевдоартрозов (Слесаренко Н.А., Самошкин И.Б. с соавт., 2002). Причины - отсутствие идеальной конструкции для функционально-стабильного остеосинтеза (Rahn B.A. et al., 1971, 1975; Matter P. et al., 1974; Perren S.M. et al., 1980; Muller M. et al., 1984; Heitemeyer U. et al., 1985; Brunner U. et al., 1990; Мюллер М.Е. с соавт., 1996). Несостоятельность металлоконструкций и ряд других осложнений (Шапошников Ю.Г., 1997; Ра-гимов А.А., 1999; Parfit A.M., 1989) заставляет искать пути преодоления несовершенного костеобразования.

Необходим системный, научно обоснованный подход к вопросам организации репаративного остеогенеза на основе анализа структурных и функциональных механизмов иммуноморфологической обеспеченности репаративного процесса, а также решения вопросов регулирования процессов репарации. В этой связи представляется весьма актуальным раскрытие закономерности механизмов репаративной регенерации костных структур, контроля над их на восстановительный остеогенез.

Цель исследования» Выявить закономерность структурной и функциональной организации репаративного остеогенеза. Разработать научно обоснованную систему коррекции посттравматического восстановления костной ткани животных.

Задачи исследования:

• Провести анализ структурных и функциональных изменений центральных и периферических органов иммуногенеза и периферической крови в период репаративной регенерации костной ткани в условиях эксперимента.

• Обосновать целесообразность использования иммунокорректоров в репаративном остеогенезе и экспериментально доказать целесообразность их применения.

• Проанализировать изменения лимфоидных органов и периферической крови экспериментальных животных под воздействием иммунокор-ректоров различных классов.

• Изучить морфофункциональные аспекты репаративного остеоге-неза в условиях эксперимента под воздействием иммунотерапии.

• Изучить структурные и функциональные изменения организации репаративного остеогенеза под воздействием иммунотерапии у спонтанно травмированных собак.

• Предложить способы контроля состояния периферической крови и органов иммуногенеза у спонтанно травмированных собак в период репарации костной ткани на основе экспериментальных и клинических исследований.

• Разработать и внедрить в клиническую практику схему иммуно-коррегирующей терапии в период репаративной регенерации костной ткани у спонтанно травмированных животных.

Научная новизна. Впервые на основе комплексной оценки структурных и функциональных изменений центральных и периферических органов иммуногенеза и системы крови представлена закономерность репарации костной ткани. Установлена взаимосвязь восстановления материального субстрата костной ткани и активности иммунокомпетентных клеток в процессе организации репаративного остеогенеза, коррелирующая с изменением иммунозависимых зон лимфоидных органов.

Впервые дано теоретическое обоснование проведения иммунокор-рекции в репаративном остеогенезе, основанное на экспериментальных данных, клинических наблюдениях и анализе специальной литературы. Доказана целесообразность коррекции восстановительного процесса костной ткани и установлены основные закономерности развития стимулированного остеогенеза. На основе системного исследования, разработанных теоретических положений и экспериментальных данных проведен сравни-

тельный анализ эффективности применения иммунокорректоров различных классов в процессе заживления костной ткани, подтвержденный им-муноморфологическими, гистологическими и рентгенологическими методами. Разработана и внедрена в клиническую практику система коррекции репаративного остеогенеза спонтанно травмированных животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе разработанных теоретических положений и экспериментальных исследований, подтвержденных морфологическими материалами, представлена система коррекции репаративной регенерации костной ткани спонтанно травмированных животных. Для осуществления контроля над процессом репарации костной ткани отработана и предложена методика оценки структурно-функционального состояния центральных и периферических лимфоидных органов путем аспирационной биопсии. Разработан препарат нового поколения — синтетический иммуномодулятор полиоксидоний, утвержденный Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России, созданный совместно с коллективом ГНЦ Института иммунологии Минздрава РФ. Препарат внедрен в клиническую практику. Представлена схема его применения в период репаративной регенерации костной ткани у экспериментальных и спонтанно травмированных животных. Внедрение полиок-сидония в ветеринарную практику позволило, не нарушая биологических законов репарации тканей, существенно сократить сроки заживления переломов длинных трубчатых костей животных. Основные положения теоретического обоснования иммунокоррекции используются при комплекс -ном изучении патогенетических аспектов костной патологии животных.

Научные разработки, положения и выводы вошли в Наставление по применению полиоксидония, утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 01.08.95 г., № 13-4-2/367; Методические рекомендации «Иммунокоррегирующая терапия при лечении переломов трубчатых костей у собак», одобренные Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 23.10.03 г.

Исследования по структурно-функциональному остеогенезу в посттравматический период представлены в монографии «Организация репара-тивного остеогенеза животных. Экспериментальные и клинические исследования». - М.: ООО «Франтера», 2004. - 144с. и учебном пособии «Реиа-ративная регенерация костной ткани у собак». - М.: МГУПБ, 2003. - 60с. Материалы диссертации используются в цикле лекций по курсу «Ветеринарная хирургия». Изданы и внедрены в учебный процесс и клиническую практику методические рекомендации «Хирургия и иммунокоррекция при переломах трубчатых костей у собак». - М.: МГУПБ, 2003. -17с.

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в рамках научно-исследовательской работы в соответствии с пла-

иом НИР МГУПБ, регистрационный номер 7-3-01В. «Травматизм и репа-ративная регенерация костной ткани» - код темы по ГРНТИ 68.41.33; 68.41.47.

Апробация работы. Результаты научных и клинических исследований были доложены на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветсанконтроля с.-х. продукции». — М., 1997; Международной научно-практической конференции «Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях». - Воронеж, 2000; IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных». - Троицк, 2001; Научно-практической конференции «Новые фармакологические средства для животных и ветеринарии». - Краснодар, 2001; IV Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек».- М., 2002; V Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек». - М., 2003; IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветсанконтроля с.-х. продукции». - М., 2002; VIII Московском международном ветеринарном конгрессе. - М., 2000; IX Московском международном ветеринарном конгрессе. - М., 2001; X Московском международном ветеринарном конгрессе. — М., 2002; XI Московском международном ветеринарном конгрессе. -М., 2003.

Публикации результатов исследований. По материалам собственных исследований опубликовано 29 печатных работ, в которых отражено основное содержание диссертации.

Объем работы. Диссертация изложена на 365 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и практических предложений. Содержит 20 таблиц, 109 рисунков. Список литературы включает 560 источников, из них отечественных 392 и 168 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Аспекты закономерности организации репаративного остеогенеза.

• Теоретическое обоснование иммунокоррекции в процессе репара-тивного остеогенеза.

• Состояние периферической крови и органов иммуногенеза в процессе репаративной регенерации костной ткани под воздействием иммуно-корректоров в эксперименте.

• Морфофункциональный анализ органов иммуногенеза и влияние иммунотерапии в период реконструктивно-восстановителыюго остеогенеза спонтанно травмированных собак.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Работа выполнена в 1994-2004 гг. на кафедре незаразных болезней ветеринарно-санитарного факультета Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Экспериментальная работа выполнена на 1350 клинически здоровых белых крысах-самцах гибридных линий в возрасте 3 мес, живой массой 230-240 г, подобранных по принципу аналогов и содержащихся в условиях вивария. Клиническую часть работы выполняли на кафедре незаразных болезней МГУ 11В и в ветеринарных клиниках г. Москвы на 370 собаках живой массой от 18 до 32-х кг в возрасте от 8-ми мес. до 3,6 лет, принадлежащих частным лицам и содержащихся на сухом сбалансированном рационе кормления.

Статистический анализ показателей крови, лимфоидных органов и костного регенерата проводили на 835 крысах на 1, 2, 7, 14, 28, 42 и 56-е сутки репаративного остеогенеза. Экспериментальное исследование состояло из пяти этапов:

1. Изучение динамики показателей гемо- и миелограмм в процессе репарации костной ткани. Исследования проводили на крысах (п=114), которым под общей анестезией наносили травму голени путем полного диа-физарного перелома (912 проб крови и КМ).

2. Теоретическое обоснование и экспериментальная разработка схемы иммунотерапии на крысах (п=317,2536 проб крови).

3. Изучение влияния иммунокорректоров (ИК) по разработанной схеме на процессы репарации костной ткани крыс (п=126, 1008 проб крови).

4. Анализ структурно-функциональных изменений центральных и периферических органов иммуногенеза в период репаративной регенерации репарации костной ткани у крыс (п=180, 1260 образцов органов).

5. Рентгенографию и структурный анализ костного регенерата в динамике изучали на крысах (п=89, 267 образцов тканей), травмированных по Г.И. Лаврищевой, Г.А. Оноприенко (1996). Иммунокорректоры лабораторным животным инъецировали в дозе 0,1 мл 0,3%-го раствора- Исследования костного мозга и периферической крови проводили по В.В. Меньшикову (1987), определение сывороточных факторов естественной ргзи-стентности - по П.А Емельяненко (1980).

Идентификацию В-клеток (ЕАС-рок) - по N.S. Mendes et al. (1973); определение количества Т-лимфоцитов (Е-рок) - в реакции спонтанного розеткообразования по М. Jondal (1972), Т-хелперы и супрсссоры - в тео-филлиновом тесте по S. Limatibul et al. (1978). Фагоцитарную активность мононуклеаров определяли по методу A.W. Segal (1974) в модификации В.Я. Шатрова с соавт. (1985). Для проведения статистической обработки

данных отбирали по 6-8 проб из каждой группы на каждый день исследований.

Для разработки схемы иммунокоррекции в эксперименте были использованы иммунокорректоры различных классов: байпамун, иммунофан, левомизол, миелопид (В-активин), полиоксидоний, продигиозан, Т-активин в дозах, согласно наставлениям по применению (В.П. Лесков с со-авт., 1997; М.Д. Машковский, 1997; Д.К. Новиков с соавт., 1998; Е.С. Воронин с соавт., 2002).

Морфологический анализ костного мозга, тимуса, лимфатических узлов, селезенки и костного регенерата проводили по Г.А. Меркулову (1969). Гистологические срезы тканей готовили на микротоме НМ-360 фирмы «Microm» (Германия), окрашивали гематоксилином и эозином; пикро-сириусом, реактивом Шиффа и по Ван-Гизон. Изучение морфомет-рических показателей структур органов иммуногенеза осуществляли на гистологических срезах по А.А. Глаголеву (1941) в модификации СБ. Стефанова (1974), ГГ. Автандилова (1990).

Изучение и микрофотосъемку гистологической картины проводили на микроскопе Jenamed-2 (Karl-Zeys Jena, Германия). Пунктаты и мазки костного мозга, лимфатических узлов и селезенки окрашивали по Рома-новскому-Гимза. Перед началом эксперимента определяли физиологические значения, представляемые как исходные данные (ИД) (286 проб).

В клинической части работы репаративный остеогенез под воздействием иммунокорректоров изучали на спонтанно травмированных собаках с переломами длинных трубчатых костей в средней трети диафиза. Остео-синтез проводили с использованием методик И.Б. Самошкина, 1986; М.Е. Мюллера с соавт., 1996; W.O. Brinker et al., 1991. Статистический анализ показателей крови осуществляли у 188-ми собак. В качестве исходных данных использовали показатели крови клинически здоровых (15 исследований) собак-аналогов, а также количественные показатели гемопоэза на основе литературных данных (Г.А. Симонян с соавт., 1995; Х.Г. Ниманд с соавт., 1998; В. Риган с соавт., 2000). Все животные были разделены на 4 группы.

Иммунотерапию осуществляли на 3; 4; 5 и 9; 10; 11-й дни. Первая группа (п=28) составляла контроль. Второй группе животных (п=78) вводили полиоксидоний, согласно наставлению по применению - в дозе 0,1 мг/кг. Третьей группе (п=40) инъецировали продигиозан в дозе - 0,5 мг/кг. Четвертой (п=42) инъецировали миелопид в дозе 0,1 мг/кг. Контроль над состоянием травмированных животных осуществляли по клиническим признакам, принятым в ветеринарной ортопедии и травматологии.

Исследование крови (1680 проб) и пунктаты органов иммуногенеза (1120 проб) проводили у всех оперированных животных на 1,2, 7, 14, 28, 42, 56, 100, 130,160-й дни постоперационного периода. Статистический анализ показателей пунктатов лимфоидных органов от спонтанно травми-

рованных животных проводили на 28-и головах от каждой группы, живой массой 22-25 кг в возрасте от 18-ти мес. до 2,5 лет.

Электронное сканирование образцов гистологических и гематологических препаратов осуществляли на аппарате Camscan S-2 (Великобритания). Обработку видеоизображения проводили на персональном компьютере при помощи программного обеспечения Mikrocapture 2.2 (Системы для микроскопии и анализа, Россия). Полученные данные обработаны методом вариационной статистики по Стьюденту (Урбах В.Ю., 1975).

Фрагменты лабораторных и клинических исследований проведены в ГНЦ Института иммунологии Минздрава России; ВНИИ мясной промышленности; Башкирском государственном аграрном университете; ветеринарных клиниках г. Москвы, а также в лабораториях ветеринарных и медицинских учреждений.

Результаты исследований получены лично автором. Участие соисполнителей отражено в списке опубликованных работ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ состояния факторов естественной резистентности в период экспериментального репаративного остеогенеза. Результаты экспериментальных исследований, проведенных на лабораторных животных (гг=114), позволили установить, что репаративный остеогенез сопровождается характерными сдвигами в системе крови. Развитие посттравматического состояния в 1-7-е сутки проявляется снижением уровня лейкоцитов и эритроцитов в 1,3 и 1,2 раза, соответственно. В этот период снижаются и сывороточные факторы естественной резистентности - бактериальная активность - в 2,5 раза, лизоцимная - в 3,4 раза, что составляет 18,8±2,1 % и 7,6±1,2 %, соответственно. Фагоцитарная активность снижается в 1,3 раза по сравнению с исходными данными. Отмечено изменение клеточных факторов иммунитета: угнетение Т-клеточного звена, сопровождающееся снижением рецепторной активности Т-лимфоцитов в 1,5 раза, снижение уровня макрофагальных клеток в 1,6 раза, до 64,5±4,3 (тыс/мл), В-лимфоцитов в 1,5 раза. (0,21 ±0,08 хЮ9/л) по сравнению с ИД. Общее количество клеток костного мозга увеличивается в 1-2-е сутки (226,6±8,7 тыс/мл) после повреждения костной ткани в 1,2 раза по сравнению с исходными данными (186,8±6,1 тыс/мл), к 7-му дню уровень миелокариоци-тов снижается в 1,5 раза до 149,2±7,7 (тыс/мл).

Данный период характеризуется дисбалансом иммунной системы и проявляется снижением факторов естественной резистентности, задержанным выходом клеток миелоидного и эритроидного ростков КМ в периферическую кровь и соответствует деструктивным изменениям в костной ткани.

Период 7-28-х суток характеризуется развитием иммуноморфологи-ческой перестройки лимфоидных органов. В этот период происходит снижение количества клеток, обогащенных супрсссорной активностью в 2

раза по сравнению с начальным периодом (0,91±0,07 х109/л), накопление хелперной активности клеток в 1,6 раза (до 0,62±0,03 х109/л), увеличение В-клеток (0,40±0,03 х109/л) и макрофагов (до 97,2±9,3 тыс/мл). Увеличиваются показатели факторов естественной резистентности в среднем в 2 раза. Количественные характеристики функциональной активности системы крови направлены на восстановление поврежденной костной ткани.

Период 28-42-х суток репаративного остеогенеза проявляется клинической стабилизацией, активизацией факторов естественной резистентпо-сти, а также усилением хелперных влияний, В-лимфоцитов и макрофагов. Состояние травмированных животных в этот период по внешним клиническим признакам не отличается от интактных крыс. Следующий период (с 42-56-х суток) - период клеточной стабилизации. Клеточный состав системы крови находится в диапазоне исходных данных. Показатели факторов естественной резистентности не отличаются от физиологических значений, статодинамические структуры травмированной конечности восстанавливаются в полном объеме.

Морфофункциональный анализ экспериментальных и клинических исследований показывает, что структурно-функциональные нарушения ос-теогенеза характеризуются снижением активности факторов естественной резистентности в ранний посттравматический период. При этом нет научно обоснованных схем проведения иммунотерапии, основанных на стадийности репаративного процесса и направленных на ускорение формирования костного регенерата. Это предполагает поиск средств, позволяющих бережно вмешиваться в процессы репарации и использовать взаимоотношение структуры и функции лимфоидных органов, пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток, воздействуя на которые, можно, не нарушая основ биологических законов морфологической перестройки органов, влиять на их активизацию, ускоряя тем самым регенераторный процесс.

Теоретическое обоснование иммунокоррекции в процессе репарации костной ткани. Клинический и экспериментальный опыт показывают, что стимуляция остеогенеза должна сопровождаться поддержанием высокого уровня функциональной стабильности органов гемо- и иммуногенеза и клеточного состава периферической крови в достаточно длительный промежуток времени. Вторым аспектом при выборе препарата и схемы применения явилось уточнение сроков введения иммунокорректоров, что дает возможность проводить стимуляцию без риска интоксикации и анафилактических явлений. В данном контексте определяющим является выраженное воздействие на макрофагальные и лимфоцитарные звенья иммунной системы, способствующие в итоге скорейшему восстановлению костной ткани.

Проведена серия экспериментов, с помощью которых отрабатывали приемлемую схему введения препаратов. В процессе разработки собствен-

ной схемы использовали данные аннотаций по применению препаратов, учитывали живую массу и особенности метаболизма организма крыс как лабораторной модели.

Отбор препаратов проводили по оценке показателей гемо- и миело-граммы на интактных крысах (п=65). Скрининг семи (байпамун, иммуно-фан, левамизол, миелопид, полиоксидоний, продигиозан, Т-активин) препаратов (табл. 1) осуществляли после трехкратного парентерального введения путем подсчета клеток крови и костного мозга.

Таблица 1

Показатели периферической крови и костного мозга крыс после введения иммунокорректоров

№ п/п Наименование препаратов Лейкоциты, х109/л Эритроциты, х10,2/л Миелокариоциты, тыс/мл

Стат. показатель М ш М т М ш

Физиол. показатель 7,2 оа 7,8 0 Л 190,0 2,7

1 Байпамун 7,6 0,3 7,9 0,2 191,6 3,7

2 Иммунофан 7,8 0,3 7,4 0,3 188,3 2,9

** .> Левомизол 7,3 0,6 7,6 -0,6 183,4 3,8

4 Миелопид 8,9* 0,3 9,3* •0,6 208,9* 3,4

5 Полиоксидоний 10,3* 0,2 8,6* 0,2 212,8* 6,3

6 Продигиозан 7,6 0,2 8,2 0,3 196,7* 3,4

7 Т-активин 7,3 0,6 7,9 0,2 187,6 2,9

Примечание. Показатели, отмеченные звездочкой, достоверны по отношению к физиологическим данным (Р<0,05) и отличаются наибольшим количественным значением.

Критерием отбора было установление наибольшего количественного показателя периферической крови и клеточности костного мозга во всех пробах. В результате, как отражено в табл. 1, были отобраны три препарата (миелопид, полиоксидоний, продигиозан), при введении которых отмечали максимальное увеличение миелокариоцитов, лейкоцитов и эритроцитов

В качестве препарата для отработки схемы иммунотерапии в процессе репаративной регенерации использовали разработанный нами синтетический иммуномодулятор - полиоксидоний.

Кратность введения препарата определяли на 252 клинически здоровых крысах-аналогах в возрасте 3-х месяцев, живой массой 200 г. Выборочно у крыс по общепринятой методике брали пробы крови для проведения общего клинического анализа крови и определения исходных данных, лающих представление о физиологической норме.

Экспериментальных крыс разделили на 7 групп: по 36 крыс в каждой. После проведения общей анестезии всем задействованным в экспери-

менте крысам наносили травму голени в виде полного перелома костей. Контролем служили крысы 1-й группы, которым не вводили иммунокор-ректор (ИК). Крысам 2-й опытной группы в течение 3-х дней подряд после травмы инъецировали полиоксидоний в дозе 0,1 мл 3%-го раствора. Крысам 3-й группы после травмы иммунокорректор вводили 5 дней подряд, а животным 4-й группы — в течение 10-ти дней после травмы в указанной дозе. В 5-й группе после введения препарата три дня подряд интервал составлял 3 дня,-в 6-й группе - 5 дней, в 7-й - 10 дней. Затем крысам этих опытных групп повторно инъецировали полиоксидоний в течение 3-х дней подряд в указанной дозе.

Изучение динамики иммунокомпетентных клеток крыс в посттравматический период выявило деструктивные изменения, сопровождающиеся снижением факторов клеточного иммунитета. Введение полиоксидония в течение первых 3-х дней подряд (рис. 1) показало, что через сутки после травмы произошло незначительное снижение процентного содержания Е-рокдо 17,2± 1,2 % по отношению к исходным данным, но уже на 3-й сутки отмечено усиление Т-клеточной реакции, которое продолжалось до 7-х суток. Количественный показатель в этот период составил 31,3±3,6 %. Данпое увеличение напрямую связано с активизацией клеток, обогащенных хелперной активностью. В начальный период эксперимента установлен количественный подъем ТФР-рок периферической крови. В 1-й день процентное содержание ТФР-рок составило 8,2±0,2 %, а к 7-м суткам количество теофиллинрезистентных клеток составило 24,2±1,3 %, что в 8 раз превысило значения исходных данных. Этот период можно характеризовать как активизацию Т-клеточных факторов, развивающихся в рамках стимулированного иммуногенеза. Этот же период совпал с активизацией мононуклеарной активности, которая увеличилась с 13,2± 1,2 до 28± 1,3 % к 7-му дню и продолжала возрастать в дальнейшем, при исходных показателях 12,0±0,2 %. Розеткообразующая активность ЕАС-рок была снижена через сутки после травмы до 14,2±0,3 % при исходных данных 16,0±0,3 %. На 3-й сутки посттравматического периода процентное содержание ЕАС-рок в периферической крови составило 21,2±1,2 %. Увеличение количества В-лимфоцитов продолжалось до 7-го дня и составило 27,3±2,1 %. Начиная с 10-го дня, как показано на рис.1, в динамике иммунокомпе-тентных клеток произошли изменения, которые выявили снижение относительного содержания как Т-, так и В-клеточного звеньев иммунитета.

Динамика накопления хелперной активности, отчетливо проявившаяся на 7-й день, сменилась снижением, которое продолжалось до окончания эксперимента. Обратно пропорциональную динамику хелперов имели графические изменения ТФЧ-рок. С первых суток после травмы (рис.1) и введения иммунокорректора установлено усиление супрессорного фактора -с 8,1 ±1,3 % (ИД) до 9,2+1,2 % на 1-е сутки, 6,1 ±0,9 % - на 3-й; 5,0±0,9 % -на 5-е; 7,2±0,6 % - на 7-е сутки.

Рис. 1. Динамика иммунокомпетентных клеток в крови животных при введении полиоксидония в течение 3 дней подряд после травмы

Супрессорные влияния совпали со снижением В-клеточного звена в первый день, а снижение ТФЧ-рок сопровождалось усилением рецептор-ной активности ЕАС-рок. Следует отметить, что влияние клеток-супрессоров не отразилось на фагоцитарной активности мононуклеаров. Увеличение супрессорной активности к 13-му дню до 10,2± 1,2% влекло за собой снижение В-клеток и клеток-хелперов.

Исследование группы лабораторных животных, которым после травмы инъецировали иммунокорректор в течение 5-ти дней подряд (3-я опытная группа), выявило, что после 5-й инъекции происходило снижение Т-клеточной активности. Хелперные влияния, проявившиеся положительной динамикой до 3-го дня, сменились резким снижением уже к 5-му дню - с 19 % до начала опыта к 14,0±0,6 % - на 3-й день. На 7-е сутки количество ТФР-рок снизилось до 9,2±1,1 %. Снижение уровня клеток продолжалось до 15-го дня и составило в этот период 6,1±0,2 %. Документировано снижение клеток-супрессоров, хотя их динамика изменялась в период эксперимента, но тенденция к снижению просматривалась до окончания эксперимента. Потеря относительного содержания В-клеток установлена с 5-го дня после начала введения полиоксидония, и снижение их определяли до конца опыта.

Данное распределение клеток мы связываем с нарушениями взаимодействия Т- и В-клеточного звеньев, вызванных чрезмерным воздействием препарата. При сравнении с трехкратным применением в данном случае можно говорить об относительном дисбалансе клеточного звена Макрофа-гальная активность оставалась высокой практически до окончания иссле-

дований. В данном случае мононуклеарное звено — единственная популяция, сохранившая свою функциональную активность.

Применение полиоксидония в течение 10-ти дней подряд (рис.2) вызвало еще больший депрессивный эффект, отчетливо проявившийся к 7-му дню после введения препарата. В этот период началось снижение количества Е-рок, сопровождаемое снижением ТФР- и ТФЧ-рок.

Рис. 2. Динамика илшунокомпетентных клеток в крови животных при введении полиоксидония в течение 10-ти дней подряд после травмы

Дисбаланс был определен и при изучении В-клеточного звена. С 7-х суток отмечена стойкая потеря относительного содержания В-лимфоцитов. Как представлено на рис. 2, аналогичной была картина при исследовании фагоцитарной активности мононуклеаров, хотя потеря клеток в данном случае установлена после 10-го дня. На 13-е сутки показатель был в пределах исходных значений, а к 15-м суткам он снизился в 1,3 раза по отношению к ИД и в 3,2 раза по отношению к 7-м суткам.

Причина таких изменений, по нашему мнению, заключена в искусственной неспособности клеточных мембран воспринимать влияния имму-нокорректора. Видимо, происходит блокировка рецепторов на клеточкой мембране, и клетка прекращает отвечать на активацию. Выявленное тотальное снижение всех показателей говорит о выраженной дисфункции системы при явных признаках иммунодифицита. Пятой опытной группе полиоксидоний вводили дробно на 1; 2; 3; 7, 8 и 9-й дни после травмы. Шестой группе — на 1, 2, 3; 9, 10 и 11-й дни после травмы голени. Седьмой - препарат вводили первые 3 дня, затем 10-дневный перерыв и снова в течение 3-х дней - на 14, 15 и 16-й дни после травмы.

Использование ИК с интервалом в 3 дня (рис. 3) позволило увеличить к 10-му дню количество Е-рок до 34,0±1,2 %, к 13-му - до 36,0±2,3 %, по сравнению с исходными данными и достоверно превысить значения контрольной группы. Достаточно высокий уровень Т-лимфоцитов отмечали до 15-х суток после травмы. Т-клеточные изменения сопровождались усилением хелперной активности.

Е рок —Тфр - рок —Тфч - рок —ЕАС-рок —М—НСТ-тесг

ИД исходные данные ИД-исходиыс данные

Рис. 3. Динамика нмчунокомпетеитных клеток в крови животных при дробном введении полиоксидония по схеме: 1,2,3; 7, 8,9

На 10-е сутки количество ТФР-рок составило 26,0±2,1 %, к 13-му дню отмечали снижение уровня клеток до 23±1,2%. До окончания эксперимента уровень ТФР-рок оставался на уровне, превышающем ИД.

Стойкое увеличение В-клеток, как видно из рис. 3, продолжалось до 15-х суток. В это время был зарегистрирован самый высокий показатель: 35,3±2,7%, тогда как в контрольной группе количество В-клеток составило 17,1 ±1,2 %. Количественный показатель клеток-супрессоров определяли на уровне исходных значений на протяжении всего эксперимента. Исключение составил 13-й день, когда количество ТФЧ-рок увеличилось до 13,0±0,3 %. В этот же день в контрольной группе значение ТФЧ-рок документировано на уровне 6,0±0,1 %. Усиление макрофагальной активности в пятой группе (рис. 3) происходило постепенно и к 10-му дню достигло 37,2±0,8 %. Высокий уровень данных клеток отмечали на всем протяжении эксперимента.

При исследовании иммунологической резистентности после дробного введения полиоксидония с интервалом в 5-10 дней нами документирован результат клеточной активности, не имеющий достоверных различий с группой крыс, которым вводили полиоксидоний с интервалом в 3 дня.

Введение ИК на 1, 2, 3-й дни необходимо для купирования процесса снижения количества иммунокомпетентных клеток и создания условий для начального этапа ремоделирования. В этот период ранних посттравматических преобразований за счет усиления макрофагальной активности происходит быстрая утилизация тканевого детрита, что является пусковым механизмом для функциональной активации иммунокомпетентных клеток и репарации дефекта.

Введение ИК на 7, 8 и 9-й дни способствует пролиферации и диффе-ренцировке костномозговых клеток, активизации процессов восполнения клеточности в органах иммуногенеза, а также непосредственному влиянию иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих эффект детоксикации организма, и предварительной подготовке к закладке регенерата. Интервал во введении иммунокорректора обусловлен тем, что механизм клеточных превращений запущен, и главное - дать возможность организму произвести весь комплекс дифференцировочных и пролиферативных преобразований. В процессе репаративного остеогенеза при появлении циркулирующего пула эффекторных или регуляторных клеток осуществляется цепь превращений, которая может быть реализована через взаимодействие с ос-теотропными клетками.

Использование ИК позволяет увеличить возможность взаимодействий клеток и их функциональную активность. Возможно и двухступенчатое проявление активности - через дифференцировку и пролиферацию, а также усиление рецепторной активности клеток.

Следует отметить, что главным в работе иммунной системы под воздействием ИК, на наш взгляд, является удовлетворение потребности в восстановлении соединительнотканных образований и регуляция поступления пластического материала. Не исключена активизация «временно ин-тактных» клеток иммунокомпетентного пула в органах иммуногенеза. Особо значимым следует считать детоксикационное и антиоксидантное действие препарата, проявляющееся за счет высокой молекулярной массы (Некрасов А.В., Пучкова Н.Г. с соавт. 2000; Пинегин Б.В., Ильина Н.И. с соавт., 2002).

Таким образом, в результате проведенных экспериментов и изучения иммунологических изменений под воздействием полиоксидония выработана и обоснована схема применения ИК. Наилучший эффект получен при использовании дробной схемы иммунокоррекции - трехкратно в течение первых 3-х дней после травмы, интервал между введениями не менее 3-5 дней и вновь инъекции трехкратно.

Анализ показателей естественной резистентности крыс в процессе репаративного остеогенеза под воздействием полиокендония, про-дигиозана и миелопида. Для изучения влияния иммунокоррекции по разработанной выше схеме и сравнительного анализа воздействия полиокси-дония на репаративный остеогенез, периферическую кровь и костный мозг

в эксперименте задействованы 4 группы травмированных лабораторных животных. Под воздействием иммунотерапии находилось 126 лабораторных крыс. 1-я группа - контрольная (п=36), 2-й группе инъецировали по-лиоксидоний (п=42), 3-й - продигиозан (п=42), 4-й - миелопид (п=42). Анализ проводили посредством сравнения стимулированных групп с контролем, а также учитывали исходные значения.

В тестах, с целью изучения клеточных и гуморальных факторов иммунитета периферической крови, дополнительно использовали группу клинически здоровых крыс - интактную (п=28). В данном эксперименте в качестве контрольных и интактных показателей учитывали значения, полученные при проведении первого этапа экспериментов (табл. 2).

Использование ИК по указанной схеме увеличивает к 7-му дню количество клеток и сывороточных факторов в периферической крови в среднем в 2 раза, к 14-му дню - в 1,7 раза, по отношению к контролю. Сравнительный анализ результатов показал, что полиоксидоний выявил отличные от остальных свойства, проявившиеся в логически предсказуемых сдвигах и в увеличении активности сывороточных факторов, а также клеточного иммунитета.

Как видно из табл. 2, изменения в периферической крови и костном мозге являются достоверными и характеризуют влияние иммунокоррекции в целом, а также позволяют на основе анализа данных выявить отличия контрольной группы от групп, премированных препаратами различных классов. Все представленные препараты в указанных дозах и при разработанной схеме введения обладают иммуномодулирующим действием на травмированных животных.

Результаты изучения морфологии костного мозга (КМ) коррелируют с результатами функциональной активности гемопоэтического региона в начальный период репарации и характеризуются усилением пролиферации миелоидной и эритроидной составляющих. В сосудистом регионе увеличивается просвет вен и происходит сужение артериол. В период 14-28-х суток происходит структурно-функциональное восстановление активности костного мозга.

Анализируя влияние иммунокорректоров на КМ, можно констатировать, что полиоксидоний обладает выраженными преимуществами перед препаратами других классов. Это выражается в активизации миелоидного и эритроидного ростков кроветворения. Периферическая кровь получает выброшенный костным мозгом пул иммунокомпетентных клеток практически сразу вслед за введением препарата. В динамике клеток ретикулярной стромы также отмечен ускоренный их выход в периферическую кровь. Это связано с тем, что препарат, активизируя макрофагальный росток, способствует сохранению функциональной активности эритробластических островков и поддержанию физиологического статуса в гемопоэтическом регионе.

Таблица 2

Показатели костного мозга и периферической крови лабораторных животных под воздействием иммунокорректоров

Дни ис- Группы Показатели (п =126), М±т

следо- Миелокарио- Лейкоциты, Фагоцитарная ТФР-рок ТФЧ-рок ЕАС-рок НСТ-тест,

ваний циты, тьтс/мл х10и активность, % х 109/л х Ю'/л х Ю'/л тыс/мл

I 2 3 4 5 6 - 7 8 9

Стат. показатель М т М ш М ш М т М ш М т М т

ид 186,8 6,1 7,2 0,2 31,6 2,7 0,59 0,06 0,57 0,09 0,39 0,04 88,9 4,6

1 К 226,6 8,7 10,1 0,2 26,7 1,3 0,33 0,04 0,91 0,07 0,31 0,07 54,6 8,8

2 К 216,6 6,7 8,1 0,1 24,4 1.4 0,29 0,06 0,66 0,03 0,21 0,08 73,4 8,9

к 149,2 7,7 7,6 0,2 29,7 2,4 0,15 0,06 0,68 0,04 0,28 0,06 64,5 4,3

7 Ро 114,7+ 6,6 8,9* 0,1 36,4* 0,9 1,38* 0,06 0,10* 0,02 1,07* 0,04 142,4* 7,1

Рго 142,6 6,6 9,5 0,2 28,7 0,9 1,05 0,02 0,59 0,03 0,79 0,07 112,7 9,3

Мс1 133,6* 4,3 7,2 0,7 32,0 0,8 1,26 0,04 0,30 0,06 0,94* 0,06 106,4 4,9

К 164,6 6,3 6,8 0,3 32,9 1,3 0,62 0,03 0,48 0,06 0,40 0,03 97,2 9,3

14 Ро 122,8* 4,1 9,4* 0,4 38,0* 0,7 1,41* 0,07 0,17* 0,02 1,18* 0,08 168,6* 8,7

Рго 203,6 14,1 8,0 0,2 29,4 0,4 1,08 0,04 0,53 0,05 0,86 0,03 126,6 7,4

Мс1 147,6 6,3 7.1* 0,6 35,8 0,6 1,22 0,07 0,44 0,07 0,72 0,04 151,8 6,7

Продолжение табл.

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Стат показатель М ш М m М m М m М m М m М m

28 К 176,4 5,4 6,3 0,3 34,1 0,7 0,78 0,04 0,58 0,05 0,53 0,04 121,3 9,6

Ро 214,0* 8,4 7,4* 0,2 35,8 0,6 1,12* 0,06 0,37* 0,06 1,06* 0,07 146,7* 6,4

Pro 195,4 6,3 6,3 0,2 26,3 0,4 0,72 0,06 0,74 0,04 0,72 0,08 119,6 6,5

Md 188,4* 8,4 5,2 0,2 28,0* 0,3 0,86 0,03 0,57* 0,06 0,89 0,07 136,8* 4,7

42 К 212,0 6,8 6,8 0,2 26,7 0,7 0,67 0,03 0,60 0,06 0,59 0,03 106,4 6,6

Ро 226,7* 4,7 6,0* 0,2 32,1* 0,7 0,86* 0,02 0,51* 0,03 0,96* 0,10 122,7* 8,1

Pro 185,4 5,2 5,6 0,2 29,4 0,6 0,46 0,05 0,63 0,02* 0,66 0,04 82,9 7,3

Md 203,7* 9,7 6,1 0,3 29,8 0,7 0,84* 0,04 0,53* 0,06 0,78 0,04 142,8 5,7

56 К 196,4 9,1 5,6 0,7 29,7 0,6 0,71 0,02 0,5 0,12 0,76 0,06 92,8 7,4

Ро 212,6* 5,6 7,1* 0,2 31,6 0,6 0,76* 0,03 0,52 0,04 0,86* 0,06 123,4* 12,3

Pro 195,4 7,1 6,4 0,3 29,0 1.1 0,61 0,03 0,57 0,08 0,69 0,09 102,6 6,3

Md 187,4 6,3 6,9* 0,4 30,7* 0,7 0,62* 0,10 0,76 0,04 0,63 0,08 122,6* 10,3

Примечании: ИД - исходные данные; К - контрольная группа, Ро - животные, которым вводили полиокендоний; Pro иродигнозан; Md - мислопид. Показатели, отмеченные звездочкой, достоверны по отношению к контролю, жирный шрифт достоверны но отношению к Ро (Р >0,05)

Таким образом, установлено избирательное действие полиоксидония на макрофаги, количество которых в костном мозге увеличивается, обеспечивая тем самым функциональную активность органа. При этом лимфо-идные, моноцитарные и плазматические клетки покидают костный мозг. Не исключен вариант, при котором полиоксидоний, взаимодействуя с клетками иммунной системы и встраиваясь в мембрану, способствует их пролиферации и дифференцировке. Полученные данные демонстрируют прямую зависимость деструктивных и восстановительных процессов в костном регенерате, а также количественных изменений в клеточном составе периферической крови и КМ. Отсюда не менее важным является анализ структурных и функциональных компонентов лимфоидных органов под воздействием иммунокорректоров.

Структурные и функциональные аспекты органов иммуногенеза в организации репаратионого остеогенеза

Структурные и функциональные изменения лимфатического узла, селезенки и тимуса изучали на крысах, разделенных на пять групп. 1-я группа лабораторных животных не подвергалась травматическому воздействию и оставалась интактной (п=28). Животным всех других групп наносили травму голени в средней трети диафиза. 2-я группа составляла травмированный контроль (п=42). Лимфоидные органы крыс, для проведения исследований в интактной и контрольной группах, отбирали в процессе изучения количественных показателей периферической крови и костного мозга на первом этапе экспериментов. Под воздействием иммунокорректо-ров находилось 180 лабораторных крыс-аналогов. 3-й травмированной группе инъецировали полиоксидоний (п=60); 4-й - вводили продигиозан (п=60); 5-й - миелопид (п=60). Введение препаратов осуществляли в два этапа по три инъекции с интервалом в три дня.

Морфофункцнональиый анализ изменений регионарных лимфатических узлов крыс. Данные, представленные в табл. 3, показывают, что к 7-м суткам в лимфатических узлах животных группы полиоксидония уменьшается количество лимфоцитов в корковом веществе, формируются центры размножения в белой пульпе, в которых отмечается наличие клеток лимфопоэтического ряда в состоянии митотического деления. Морфомет-рические показатели к 7-му дню установлены в следующих пределах: без светлых центров 5,6±0,2 %, что в 1,14 раза ниже, чем в контроле; с реактивными центрами отмечали увеличение (5,44±0,02 %) - в 1,8 раза; мякот-ные тяжи (9,25±0,07 %) были уменьшены в сравнении с контролем в 1,09 раза. Паракортикальная зона (9,44±0,0б %) к этому дню приближалась к группе здоровых животных и в 1,2 раза превышала значение контрольной группы. В дальнейшем установилась тенденция к накоплению клеток лимфатическим узлом. Центры размножения увеличиваются, и количество митозов в них растет. При этом снижается количество лимфоцитов в корко-

вом веществе. Эти изменения продолжают усиливаться к 14-му дню. Происходит стирание границы между корковым и мозговым веществом, формирование реактивных центров заканчивается, они становятся крупными и макрофагальная активность в них увеличивается. На 14-й день площадь фолликулов без светлых центров превысила фоновый показатель в 1,2 раза, со светлыми центрами — в 4,4 раза, мякотных тяжей — в 1,4 раза, паракор-тикальной зоны — в 1,2 раза. Морфологически реактивные центры в лимфатических узлах, проходя стадию клеточной дифференциации, полностью исчезают к 28-му дню эксперимента. Процесс изменений паракортикаль-ной зоны и мякотных тяжей продолжался до 28-х, а фолликулов без светлых и со светлыми центрами - до 42-х суток. К окончанию опытов изученные показатели продолжали превышать контроль: лимфоузелки без светлых центров - в 1,6 раза, со светлыми центрами - в 3,7 раза, паракорти-кальная зона - в 1,14 раза. Площадь мякотпых тяжей соответствовала контрольному уровню, составив 9,9 % (контроль 9,8 %). В данной группе количественные и структурные изменения усиливаются к 14-му дню, что незамедлительно отражается на организации остеогенеза, восстанавливаюсь к 28-му дню. В лимфатических узлах корковая, паракортикальная зона, мя-котные тяжи уменьшаются в размерах до 7-го дня. В период с 14 по 28-й дни происходит активное формирование реактивных центров. Структурные изменения достигают своего пика и коррелируют с динамикой клеток в органах. Увеличивается тимусзависимая площадь органа и сужается диаметр В-зоны. В период 42-56-х суток морфологические изменения приходят к физиологическим показателям.

Структурные изменения показателей иммунокомпетентных зон под воздействием иммунотерапии демонстрируют прямую зависимость между структурной и функциональной активностью органа и восстановлением костной ткани. При исследовании структуры регионарных лимфатических узлов в группе животных, получавших продигиозан и миелопид, морфологические и функциональные изменения в большей степени соответствовали контрольной группе.

Показатели содержания Т-лимфоцитов интактной группы находились в пределах 25,80± 1,02 % (табл. 3). Начало репаративного процесса в группе после применения полиоксидония по указанной схеме к 7-м суткам выявило снижение количества Т-лимфоцитов до 15,4±0,6 %, что в 1,32 раза было ниже, чем в контроле. К 14-м суткам показатель Е-рок имел тенденцию к увеличению и составил 17,3±1,15 %, при контрольных значениях 15,9±1,3 %. Начиная с 28-го дня (19,0±0,3 %), количество Т-лимфоцитов увеличивалось и к 42-му дню превосходило значения контрольной группы в 1,24 раза на этот срок исследования и в 1,2 - к 56-му дню. При этом накопление количественного показателя Е-рок в контрольной группе также увеличивалось, но уступало группе, премированной полиоксидонием (табл. 3).

Исходное количество В-лимфоцитов находилось в пределах 22,6±2,3 %. Из представленной таблицы следует, что начало репаративного процесса сопровождается ускоренным выходом В-лимфоцитов, значения которых к 7-м суткам составили 12,07±0,33 %, при показателе контрольной группы 17,3±0,3 %. На 14-й день снижение количества В-лимфоцитов усилилось и составило 11,8 ±0,7%, что в 1,74 раза уступало контрольной группе. Но уже к 28-му дню процентное содержание ЕАС-рок увеличилось, до 20,8±0,3% и превысило контрольные значения в 1,6 раза. На 42-й день увеличение продолжалось (21,2±0,3%), также превышая показатель контрольной группы. К 56-му дню значения контрольной и группы полиоксидония занимали близкое графическое расположение.

Таким образом, установлено снижение количества Т- и В-лимфоцитов в лимфатическом узле лабораторных животных в ранний посттравматический период и постепенное восстановление первоначальной концентрации, начиная с 14-го дня. В группе полиоксидония отмечен спад относительного содержания лимфоцитов в период иммунокоррекции до 14-го дня и быстрое восстановление клеточности органа, начиная с 28-го

ДНЯ.

Исходные данные содержания общего количества лимфоцитов в аде-нограмме экспериментальных крыс находились в диапазоне 92,6±2,6 %. Полученные данные, приведенные в табл. 3, показали сходные динамические сдвиги общего количества лимфоцитов лимфатического узла во всех группах. В группе полиоксидония к 7-му дню отмечали снижение количественного показателя клеток в 1,2 раза по отношению к контролю (66,3+1,2 %). К 14-му дню уровень лимфоцитов в данной группе увеличился, и разница с контролем сократилась до 1,1 раза. На 28-й день исследований показатель группы полиоксидония вырос по отношению к контролю в 1,1 раза и составил 94,6+1,6 %. К 42 и 56-му дням количество лимфоцитарных клеток превышало контроль в 1,03 раза. Исходные данные макрофагаль-ных клеток в аденограмме находились в диапазоне 0,3010,07 %. Как представлено в табл. 3, после применения полиоксидония количество макрофагов превосходило контроль в 1,2 раза, и составило 0,43±0,01 %. Накопительная тенденция установлена и на 14-й день, превышая количественный показатель контрольной группы в 1,24 раза. На 28-й день показатель контрольной группы достиг максимального значения - 0,52+0,03 %, причем значения в группе полиоксидония в этот период (0,46±0,06%) начали снижаться, приближаясь к исходным данным. С 42-го дня количество клеток контрольной группы также снижалось, и к 56-му дню их концентрация приблизилась к исходному значению.

На протяжении репаративного периода в костной ткани клеточный состав лимфатических узлов реагирует фазовыми изменениями, особенно проявляющимися в первые дни. В период деструктивных изменений (1-7-е сутки) в группах происходит снижение клеточности органа практически

по всем показателям. В период 7-28-х суток (иммуноморфологической перестройки) отмечается тенденция к восстановлению содержания лимфоцитов и макрофагов. В этот же период клеточный состав стабилизируется, создавая баланс в соотношении клеток, тем самым способствуя восстановлению структуры. В период 28-42-х суток (фаза клинической стабилизации) накопление клеточного состава продолжается, и динамика клеток не носит разнонаправленной тенденции. В период с 42-х суток и в более поздние сроки клеточный состав по всем основным компонентам приближается к исходным данным.

Использование иммунокоррегирующих препаратов активизирует изменения, происходящие в лимфатических узлах. Под воздействием иммунотерапии отмечены ускоренный выход лимфоцитов и макрофагов в периферическую кровь, что ярко проявляется в группе полиоксидония к 7-14-му дням, и восстановление количественного состава органа в более короткие сроки. При этом наиболее заметные сдвиги установлены в динамике клеток макрофагального звена. Отмечена наибольшая их активность в дни введения препаратов.

Таким образом, в период восстановления костной ткани наиболее объективные изменения начинаются со 2-х суток с восстановлением количества клеток на 28-42-е сутки. Динамические сдвиги клеточного состава лимфатического узла свидетельствуют о выраженной реактивности не только в ответ на острый посттравматический процесс, но и в период закладки костного регенерата, что говорит о потребности лимфоцитарного присутствия в регенерирующей ткани. Морфологические исследования архитектоники лимфатического узла, а также цитологические исследования динамики клеток органа, как видно из табл. 3, демонстрировали их неразрывное взаимодействие в структуро- и функциогенезе. Иммунокоррекция репаративных процессов не изменяет направленности данных процессов, ускоряя их во времени. Отмечено резкое снижение процентного содержания лимфоцитов, продолжающееся до 14-го дня. Восстановление клеточ-ности органа отмечали с 28-го дня, особенно проявившееся в группе поли-оксидония.

Морфофункциональный анализ изменений селезенки крыс. Анализ гистограмм показал, что у животных после первого этапа иммунотерапии полиоксидонием (7-е сутки) установлено уменьшение количества клеток лимфоидного ряда в периферических отделах узелков, стиралась граница между центром размножения и краевой зоной, увеличивалось количество макрофагальных клеток. Все вышеперечисленные изменения достигали своего пика к 14-му дню. В этот период установлены максимальные изменения в белой пульпе, увеличение количества макрофагальных клеток с включениями.

Усиление иммунологических процессов в лимфоидной ткани селезенки доказано увеличением количества и размеров реактивных центров, усилением фагоцитарной активности макрофагов и уменьшением лимфо-

цитов в периферических отделах фолликулов. На 14-е сутки по завершении повторного курса иммунотерапии активность селезенки продолжала повышаться. К этому сроку исследуемые показатели превышали параметры предыдущего срока исследования. Так, площадь лимфоидных узелков без светлых центров расширилась в 1,2 раза, со светлыми центрами - в 5,6 раза, периваскулярных муфт - в 2,4 раза (табл. 4).

Таблица 4

Структурно-функциональные изменения селезенки в период репаративного остеогеиеза

Показатель Группа Стат. Дни исследования

ИД I 7 | 14 | 28 | 42 | 56

Морфометрические исследования, %

Лимфатические узелки без светлых центров К М 124 7,0 8,75 9,5 10,9 10,5

ш 0,3 0,5 0,02 0,03 0,6 0,5

Ро М 11,9 8,6* 9,9* 15,8* 12,4 12,2*

т 0,6 0,4 0,3 0,5 0,4 0,5

Лимфатические узелки со светлыми центрами К М 1,80 - 3,90 2,75 2,44 2,01

т 0,01 - 0,05 0,06 0,04 0,03

Ро М 1,90 1,25* 6,75* 7,90* 4,62* 4,01*

т 0,04 0,08 0,02 0,03 0,02 0,03

Периваскулярная лимфоидная муфта К М 7,44 2,75 4,25 6,90 6,44 6,25

ш 0,05 0,03 0.02 0,06 0,03 0,03

Ро М 7,25 5,37* 12,6* 14,9* 12,3* 8,7*

ш 0,07 0,07 0,1 0,1 0,1 0,1

Функциональная активность Т- и В-лимфоцитов, %

Е-рок селезенки К М 2137 19,62 18,62 14,37 17,62 20,0

ш 2,83 2,83 0,61 0,47 0,88 1.3

Ро М 22,37 19,87 15,75* 24,25* 21,75 21,37

т 2,17 0,95 0,51 0,61 0,97 0,88

ЕАС-рок селезенки К М 36Д5 27,75 29,87 27,62 31,5 32,75

т 1,17 1,67 1,48 2,06 1,74 1,23

Ро М 34,5 20,12* 21,75* 34,00* 35,12 35,25

т 1,1 1,34 1,47 1,26 1,23 2,13

Спленограмма, %

Лимфоциты спленограммы К М 85,0 57,6 61.2 72,1 76,2 81,2

т 2,1 2.3 2,3 2,2 2,6

Ро М - 51,6* 47.6* 92,2 87,2 93,1*

ш - 2,9 1.6 2,6 2,0 1,6

Макрофаги спленограммы К М 0,50 0.67 0,75 0,64 0,75 0,40

т 0,06 0,03 0.04 0,03 0,03 0,03

Ро М - 0,90* 0,89* 0,60* 0,51* 0,53*

т - 0,01 0,02 0,03 0,02 0,06

Примечание. ИД - исходные данные; К - контрольная группа; Ро - группа, инъецированная полиоксидонием. Показатели, отмеченные звездочкой, достоверны по отношению к контрольной группе (Р<0,05).

Максимального значения площади исследованных структур достигли к 28-м суткам. К этому сроку эксперимента площадь фолликулов без светлых центров превысила показатель здоровых животных в 1,3 раза, со светлыми центрами - в 3,7 раза, переваскулярных лимфоидных муфт - в 2 раза. С этого момента морфологические изменения были менее выражены. На 42-й день исследований наблюдали уменьшение площади исследованных структур селезенки. Площадь, занимаемая лимфатическими узелками без светлых центров, приблизилась к интактному уровню, со светлыми центрами — превышала контроль в 2,7 раза, периваскулярными лимфоидньши муфтами - была выше, чем в 1-й группе, в 1,6 раза. К 56 дню гисто-структурный компонент селезенки крыс, премированных полиоксидонием, несущественно отличался от показателей контрольного уровня. Т-клеточная активность проявилась значительными динамическими сдвигами в контрольной группе (табл. 4) и характеризовалась увеличением розет-кообразующей способности лимфоцитов до 14-х суток и снижением ее активности на 28-е сутки в 1,53 раза по отношению к исходным данным. При изучении В-клеточного звена иммунитета установлено снижение рецеп-торной активности клеток, особешю проявившееся на 2 и 28-й дни - в 1,7 и 1,3 раза соответственно.

Установлено снижение процентного содержания лимфоцитов и восстановление клеточности селезенки лишь к 42-му дню. Введение иммуно-корректоров к 7-му дню усилило активизацию всех задействованных звеньев иммунной системы. На 14-й день количественный показатель кле-точности селезенки, превосходивший в своем снижении значения контрольной группы, восстанавливался до уровня физиологической нормы к 28-му дню. Морфологические исследования структурных элементов селезенки экспериментальных животных в процессе заживления костной ткани выявили значительные сдвиги, проявляющиеся в изменении площадей органа. Наиболее выраженные проявления со стороны белой пульпы отмечали, начиная со 2-го до 14 - 28-го дней эксперимента. Эта динамика находится в прямой зависимости от функциональных преобразований в органе. Наиболее показательна динамика в группе полиоксидония. При этом группа миелопида достоверно ей уступала. Применение продигиозана выявило динамику, близкую к контрольной группе.

Морфофункциональнын анализ изменений вилочковой железы. Репаративный остеогенез в испытуемых группах сопровождался уменьшением площади корковой зоны тимуса в 1,6 раза, по отношению к интакт-ным животным, площадь мозгового слоя сократилась в 1,15 раза, по сравнению с интактной группой (табл. 5). В гистологических препаратах ви-лочковой железы животных, получавших полиоксидоний, структурные изменения к 7-м суткам носили более выраженный характер по сравнению с контрольной группой, что проявлялось усилением лимфоидной реакции в виде уменьшения количественного состава клеток в структурных компонентах вилочковой железы и макрофагальной активности.

Морфометрические исследования, представленные в табл. 5, показали, что в этот период корковая и мозговая зоны были изменены в 1,2 раза по сравнению с контролем и в 1,4 раза по сравнению с интактной группой. Наибольшие изменения в вилочковой железе отмечали к 14-м суткам во всех исследуемых группах. Отмечена тенденция к усилению структурно-функциональных изменений тимуса в группе животных, получавших по-лиоксидоний, по сравнению с контролем. Установлено уменьшение количества лимфоцитов в корковой зоне, увеличение фагоцитарной активности макрофагов; в сосудах сохранялись изменения в виде полнокровия венозного русла. Структурные изменения корковой зоны в группе полиоксидо-ния при сравнении с интактной группой были меньше в 1,14 раза, но превосходили контроль. Мозговая зона уменьшилась в сравнении с предыдущим сроком, но превосходила по площади интактную группу. К 28-м суткам в тимусе изменения практически отсутствовали. Все структуры соответствовали исходным данным, распределение лимфоцитов в корковом и мозговом слоях возвращалось к исходному состоянию. На 28,42 и 56-е сутки динамика морфометрических исследований менялась незначительно. Корковая зона на протяжении этих дней была больше в 1,0-1,2 раза: Мозговая зона, находясь практически в пределах физиологических данных, была ниже контрольной в 1,15-1,1 раза.

Таблица 5

Структурно-функциональные изменения тимуса в период организации репаратнвного остеогенеза.

Показатель Гр. Стат. Дни исследования

ИД | 7 | 14 | 28 | 42 | 56

Морфометрические исследования, %

Корковая зона К М 59,4 49,4 47,0 50,2 52,4 56,7

т 0,5 0,5 0,9 0,7 0,9 0,7

Ро М 60,1 41,7* 49,7 56,9* 56,7* 57,0

т 0,5 1Д 0.9 0,8 0,4 0,7

Мозговая зона К М 43,1 54,6 53,0 49,8 47,6 49,3

т 0,8 0,6 0,9 1,0 0,5 1,1

Ро М 44,4 55,2 50,2 43,1* 43,2* 43,0*

т 0,6 1,5 1,0 0,8 1Л 0,8

Функциональная активность Т-лимфоцитов х/0*

Е-рок К М 483,6 340,2 397,9 387,6 486,6 480,8

ш 12,8 14,5 8,0 12,6 83 11,6

Ро М 489,8 263,8» 311,73* 476,4* 512,3 507,6

ш 13,7 12,6 11.7 6,4 13,7 11,3

Примечание. ИД - исходные данные; К - контрольная группа; Ро - группа, инъецированная полиоксидонием. Показатели, отмеченные звездочкой, достоверны по отношению к контрольной группе (Р < 0,05).

Динамический диапазон Е-рок лимфоцитов тимуса интактных крыс находился на уровне 472,8± 16,7-521,4± 11,6 хЮ6 кл/орг. На 7-е сутки в группе с использованием полиоксидония количество клеток (263,8± 12,6 х106 кл/орг) было в 2 раза ниже, чем в интактной и в 1,3 раза ниже, чем в контрольной группах. В дальнейшем динамика стимулированной группы продолжала снижаться, и разница составила 1,3 раза. К 28-м суткам произошло увеличение абсолютного содержания Е-рок до 476,4±6,4 х10б кл/орг, которое сохранялось до 56-х суток (табл. 5).

Таким образом, снижение количества розеткообразующих клеток сопровождается усилением структурных изменений в виде сужения корковой и увеличения мозговой зон, наиболее проявляющихся к 7-му дню. Гисто-структурный анализ компонентов тимуса в этот период сопровождается выраженной пролиферацией лимфобластических клеток и макрофагов. К 14-му дню розеткообразующая способность Т-лимфоцитов усилилась, что также сопровождалось структурными изменениями мозговой и корковой зон тимуса. Установлено, что в вилочковой железе в период деструктивных изменений в костной ткани и развертывания иммуноморфологиче-ской перестройки происходят динамические изменения площадей корковой и мозговой зон. Характерным является усиление пролиферации лим-фобластов в корковом слое. В период клинической и клеточной стабилизации структурные показатели органа восстанавливаются до физиологических границ.

Применение иммунокорректоров ускоряет выход Т-лимфоцитов из ткани вилочковой железы. При этом восстановление клеточности органа и иммунокомпетентных структур в группе полиоксидония происходило к 28-м, тогда как в других группах - к 42-56-м суткам. В гистопрепаратах тимуса после инъекций миелопида принципиальных различий с препаратами группы полиоксидония не обнаружено, однако отмечены некоторые морфологические сдвиги, проявляющиеся в замедлении иммунологических реакций во времени. Препарат продигиозан, вызывая незначительную активизацию тимуса, не имел достоверных отличий своей активности в сравнении с контрольной группой.

Морфологические изменения в процессе репаративного остеоге-неза экспериментальных животных. При исследовании костного регенерата в группе крыс под воздействием полиоксидония к 7-м суткам в ме-жотломковом пространстве выявлены очаги некроза, преобладание рыхлой волокнистой соединительной ткани и участков кальцифицированных костных балок. Среди фибробластических элементов обнаружены макрофаги и лимфоидные клетки, превосходящие по своему количеству контрольную группу, что является необходимым звеном в активизации остеогенных клеток и характеризуется как период структурной дезинтеграции костной ткани и дисбаланса иммунной системы.

По прошествии 14-ти суток в межотломковом регенерате: незрелые, неправильно ориентированные костные балки, формирующие интермеди-

арную мозоль, между ними находятся остеобласты, увеличено число расширенных сосудистых каналов, диастаз перекрывается периостальной мозолью. Все новообразованные структуры содержат коллаген юных и средних изоформ. На рентгенограммах - межотломковая зона заполнена костной мозолью, костномозговой канал закрыт замыкательными пластинками. В контрольной группе диастаз между отломками заполнен грубоволокни-стой соединительной тканью, в которой отмечены очаги хондроида, в некоторых локусах молодые костные трабекулы и юные коллагеновые фибриллы. На месте костного мозга обнаружены отдельные экстравазаты, пе-риостальная и эндостальная мозоли представлены рыхлыми напластованиями соединительной ткани и незрелой кости.

Через 28 суток в группе полоиоксидония костные структуры регенерата выглядят сравнительно зрелыми. Регенерирующие ткани отличаются от костной ткани лишь неправильной ориентацией костных балок, границы пластинок умеренно контурированы. Пери- и эндостальная мозоли сформированы из сети зрелых костных балок. На рентгенограммах - перио-сталыюе мозолеобразование не выражено, формируется костномозговой канал. В контрольной группе в этот же период идут процессы интенсивного остеогенеза в виде появления сети зрелых костных балок, расположенных из концах отломков по периостальной и эндостальной поверхности кортикальной пластинки. Данный период характеризуется пролиферацией и дифференцировкой иммунокомпетентных клеток, восстановлением количественного состава клеток в органах иммуногенеза и образованием соединительнотканного регенерата в зоне кортикотомии.

К 42-м суткам в стимулированной группе происходит полная редукция периостальной и эндостальной мозолей, костные структуры становятся едиными и непрерывными. Костномозговой канал заполнен желтым костным мозгом с небольшими прослойками рыхлой соединительной ткани. На рентгенограммах - сформирован кортикальный слой, костномозговой канал восстановлен. Особенность этого периода состоит в восстановлении структурной и функциональной активности органов иммуногенеза, формировании остеогенной структуры и клинической стабилизации.

В контрольной группе к 56-му дню отмечено, что репаративный ос-теогенез характеризуется заполнением области диастаза регенератом, наползающим со стороны эндо- и периоста, неправильной ориентацией костных балок, границы пластинок умеренно контурированы. Костная мозоль обширна, с участками резорбции. Структурное восстановление ткани происходит к 70-м суткам. В группах после иммунотерапии с 42-56-х суток стато-динамические функции восстанавливаются, определяют клеточную стабилизацию в системе органов и структурную состоятельность костной ткани.

Таким образом, анализ восстановления костной ткани позволил впервые осуществить целенаправленную коррекцию репаративной регенерации. Во всех экспериментальных группах репаративные процессы в об-

ласти костной раны, а также в гемопоэтических структурах костного мозга проходили в соответствии с биологическими законами регенерации. Отличия установлены лишь в скорости течения восстановительных реакций, сменяющих друг друга, но приводящих к единой, морфологически детерминированной структуре. После инъекций синтетического иммунокоррек-тора полиоксидония документально подтвержден факт ускоренного восстановления костного дефекта голени крыс к 42-му дню, кроме того, репарация протекает по более совершенному типу - осте-десмальному. В группе животных после применения миелопида завершенность репаративного остеогенеза определяется к 56-му дню, а в контроле и в группе с продш ио-заном данный процесс только лишь вступает в заключительную стадию.

Результаты исследований позволяют заключить, что процесс репарации у всех задействованных групп животных протекает в соответствии с фазами репаративного остеогенеза. При этом скорость закладки костной мозоли значительно отличается и коррелирует со структурно-функциональными изменениями в органах иммуногенеза в те же сроки исследования. Выход иммунокомпетентных клеток в периферическую кровь, их взаимодействие и реализация их функций на месте формирования регенерата обеспечивает ускоренный процесс созревания коллагена, закладки грубоволокнистой соединительной ткани и формирование остеогенных структур. В данном случае лимфоидные органы функционируют как единая система, направленная на организацию репаративного процесса.

Структурно-функциональный анализ реконструктнвно-восстановительного остеогенеза спонтанно травмированных собак

Реконструктивно-восстановительный остеогенез изучали на спонтанно травмированных собаках живой массой от 18 до 32 кг с переломами длинных трубчатых костей в средней трети диафиза. Травмированные животные были разделены на 4 группы. Первая группа (п=28) составляла контроль. Второй ipynne животных (п=78) вводили полиоксидоний в дозе 0,1 мг/кг. Третьей группе (п=40) инъецировали продигиозан (0,5 мг/кг). Четвертой (п=42) - инъецировали миелопид (0,1 мг/кг). Иммунотерапию осуществляли на 3; 4; 5- и 9; 10; 11-й дни.

Исследование спонтанно травмированных собак (табл. 6) показало, что после первичного введения полиоксидония количество миелокариочи-тов снижается в 1,2, после повторного- в 1,4 раза. Количество лимфоцитов в лимфоузлах и селезенке снижено в среднем в 1,2 раза по сравнению с контрольными показателями. При этом в лимфоидных органах происходит увеличение количества макрофагальных клеток, в периферической крови -содержания эритроцитов и лейкоцитов в 2 раза, что обеспечивает поддержание необходимого баланса для усиления формирования костного регенерата. В соответствии с разработанной схемой введение полиоксидония в сравнении с другими ИК, оказывает более выраженный системный эффект

на организацию репаративного остеогенеза за счет усиления кооперативных связей иммунокомпетснтных клеток, выраженного макрофагального и остеогенного воздействия.

Использование в период репаративного остеогенеза методов аспира-ционной биопсии органов иммуногенеза (табл. 6), наряду с общепринятыми клиническими методами исследования, позволяет осуществлять контроль над процессами восстановления костной ткани и иммунотерапией.

Показатели стадийности репаративного остеогенеза собак. В результате проведения испытаний препаратов-корректоров установлено, что заживление переломов во всех задействованных группах происходит по единым законам стадийности репаративного остеогенеза. При этом необходимо заметить, что скорость заживления, темпы формирования рентге-ноконтрастной интермедиарной мозоли и восстановление опороспособно-сти конечности после применения ИК проявлялись неодинаково.

Таблица 6

Показатели лимфондных органов и периферической крови в период реконструктивно-восстановителыюго остеогенеза собак

Препараты Стат, Дни исследований

ИД 1 14 56 100 160

К К К Ро К Ро К Ро К Ро

Мнелокарио-циты, тыс/мл М 192,0 218,3 163,3 122,8* 201,0 189,2 196,9 148,0* 197,2 188,4*

ш 2,6 3,3 2,3 4,1 2,7 5,0 1,8 3,1 7,7 3,8

Лейкоциты х109 М 9,5 11,1 6,4 8,4* 8,5 9,3* 8,9 10,9* 9,5 9,3

т 0,6 од 0,7 0,5 0,1 0,1 0,1 0,2 0,6 0,4

Эритроциты хЮ" М 7,1 3.3 3,5 6,1* 6,9 7,9* 7,1 8,3* 7,5 8,3*

т 0,27 0,3 0,4 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2

Аденогралша собак

Лимфоциты, % М 87,3 77,7 81,2 76,3* 88,6 93,6* 91,7 97,8* 88,3 93,7*

ш 1,3 1.6 1,7 0,7 0,9 0,7 2,1 1,7 1,8 0,9

Макрофаги, % М 0,27 0,33 0,44 0,67* 0,37 0,61* 0,36 0,42* 0,42 0,47

т 0,01 0,02 0,02 0,03 0,03 0,03 0,03 0,05 0,03 0,02

Спленогралша собак

Лимфоциты, % М 80,5 72,6 63,6 51,7* 74,2 83,8* 873 91,2 793 87,6*

т 2,3 3,6. 2,8 и 0.9 1.2 2,6 1,8 0,8 1,2

Макрофаги, % М 0,55 0,66 0,72 0,83* 0,69 0,78* 0,67 0,72* 0,73 0,76*

т 0,01 0,02 0,01 0,01 0,03 0.02 0,03 0,01 0,03 0,02

Примечание. 11Д - исходные данные; К - контрольная гр>тта; Ро - группа, инъецированная полиоксидонием. Показатели, выделенные звездочкой, достоверны по отношению к контрольной группе (Р<0,05).

В группе животных после применения полиоксидония удовлетворительную опороспособность определяли к 50-70 дням. К 100 дню признаки статической хромоты не обнаруживались. Уверенное движение конечности у всех собак группы, премированной миелопидом, определяли к ПО дню. Статическая хромота у отдельных особей (п=8) продолжалась до 130-140 дней. В группе продигиозана восстановление костных структур напоминало таковое в контрольной. Полное заживление костной ткани определяли в период 140-160 дней. В контрольной группе отмечено отставание в формировании костного регенерата и восстановление опороспособности к 160 дню.

Таким образом, введение иммунокорректоров в указанных дозах обеспечивает улучшение клинических показателей животных в период восстановления костной ткани и оказывает выраженное влияние на процессы ремоделирования кости, проявляющееся в ускоренном формировании прочной интермедиарной мозоли и надежной опороспособности. Влияние полиоксидония превосходит по скорости заживления группу, премированную миелопидом, в 2 раза, группу продигиозана - в 3, контрольную - в 3,2 раза. Воздействие миелопида ускоряет процессы регенерации, по отношению к группе продигиозана в 1,4, к контрольной — в 1,8 раза. Введение продигиозана незначительно влияло на процессы регенерации по отношению к контрольной группе (в 1,1 раза).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе разработанных научных положений и полученных экспериментальных данных структурного и функционального восстановления костной ткани установлено, что организация репаративного остеогенеза представлена периодами, проявляющимися деструктивными изменениями в костной ткани, дисбалансом клеточных гуморальных факторов системы крови. Начало образования зрелого регенерата в зоне перелома сопровождается иммуноморфологической перестройкой в органах иммуногенеза. Период восстановления структурной и функциональной состоятельности лимфоидных органов с завершающей фазой формирования остеогенной структуры характеризует клиническую и клеточную стабилизацию в системе и органах животного.

Полученные результаты исследований демонстрируют коррелятивные связи между количественными и структурными сдвигами в органах иммуногенеза, периферической крови, а также закладкой и формированием костной мозоли. Использование иммунокорректоров в комплексе с симптоматической, патогенетической и противомикробной терапией способствует устранению дисбаланса в системе лимфоидных органов и периферической крови, оказывая выраженный эффект на регенеративные процессы. Разработанная и научно обоснованная система иммунокоррекции позволяет существенно сократить сроки восстановления костной ткани у животных.

Применение синтетического препарата полиоксидония по разработанной схеме способствует быстрой реализации механизмов кроветворения и остеогенеза, повышает иммунологическую резистентность, усиливает макрофагалыгую активность и раскрывает необходимый комплекс клеточных и гуморальных взаимодействий в организации репаративного ос-теогенеза.

Показатели структурных и функциональных изменений, полученные на экспериментальных и спонтанно травмированных животных, раскрывают закономерность организации репаративного остеогенеза. Научно обоснованные теоретические подходы к проведению иммунокорекции вносят значительный вклад в развитие фундаментальных аспектов общей патологии. Внедрение и использование иммунотерапии при костной патологии, разработка морфофункциональиых основ прижизненного контроля над проведением иммунокоррекции имеет важное научное и прикладное значение в решении вопросов посттравматического восстановления тканей как одной из приоритетных задач ветеринарной науки и практики.

ВЫВОДЫ

1. Закономерность организации репаративного остеогенеза проявляется: а) структурной дезинтеграцией ткани, дисбалансом иммунной системы - до 7-х суток; б) иммуноморфологической перестройкой в лимфо-идных органах, образованием соединительнотканного регенерата в зоне перелома с 7 по 28-е сутки; в) структурной и функциональной состоятельностью органов иммуногенеза, формированием остеогенной структуры с 28 по 42-е сутки и клинической стабилизацией животных; г) структурной состоятельностью костной ткани и началом клеточной стабилизащга - с 42- 56-х суток.

2. Структурные и функциональные преобразования в органах гемо-иммуногенеза заключаются в изменении площадей иммунокомпетентных зон, в активизации лимфатических фолликулов с выраженным проявлением на 2, 7, 14 и 28-е сутки репаративного процесса. В костном мозге 7-14-е сутки посттравматического периода характеризуются

дистого русла, усиленной пролиферацией миелоидного стков кроветворения и клеток ретикулярной стромы.

3. Изменение количества лимфоцитов в лимфоидных

текает волнообразно, в соответствии с фазами репаративного остеогенеза. Количество Т-лимфоцитов (Е-рок) в тимусе снижается на протяжении 28-ми суток (в 1,3-1,7 раза). Количество Е-рок в лимфатическом узле и селезенке после увеличения на 2-е сутки в 1,2 раза к 14-28-м суткам снижается в среднем в 1,5 раза по отношению к интактным значениям. Функциональная активность В-лимфоцитов проявляется снижением их концентрации ко 2-м (в 1,4) и к 28-м суткам (в 1,7 раза) по отношению к интактиой группе. Клеточный состав органов восстанавливается к 42-м суткам.

4. Репаративный процесс (1-7-е сутки) сопровождается снижением количества миелокариоцитов в 1,25, лейкоцитов и эритроцитов в 1,3-1,2 раза. Бактерицидная и лизоцимная активность сыворотки снижается в 2,9 раз; фагоцитарная в 1,3, розеткообразующая активность лимфоцитов в 1,5, макрофагальная мононуклеаров в 1,6 раза, В период 7-28-х суток количество клеток костного мозга и периферической крови увеличивается в среднем в 1,2-2,3 раза. В период 28-56-х суток показатели крови и костного мозга восстанавливаются в пределах исходных значений.

5. Макрофагальная активность мононуклеаров крови снижена в 1-7-е сутки и усилена в костном регенерате, наряду с клетками лимфоид-ного ряда, а с 7-14-х суток их активность в крови возрастает. Количество макрофагов и лимфоцитов в костном регенерате снижается по мере восполнения раны остеогенными структурами. К 28-м суткам происходит количественная стабилизация клеточных показателей.

6. Экспериментальное применение ИК по разработанной схеме на 3, 4, 5 и 9, 10, 11-е сутки посттравматического периода не нарушает восстановительного процесса. Использование полиоксидония к 7-м суткам ускоряет выход иммунокомпетентных клеток из центральных и периферических органов иммуногенеза в 1,3, а к 14-м - в 1,26 раза по отношению к контролю. В периферической крови количество иммунокомпетентных клеток крови и сывороточных факторов увеличивается в 2 раза.

7. На основе анализа структурной и функциональной организации репаративного остеогенеза научно обоснована и внедрена в клиническую практику система коррекции посттравматического восстановления костной ткани животных.

8. У спонтанно травмированных собак после введения полиоксидо-ния на 3, 4 и 5-е сутки, количество миелокариоцитов снижается в 1,2; после введения на 9, 10, 11-е сутки - в 1,4 раза, при этом количество лейкоцитов и эритроцитов в крови увеличивается в 2 раза. В лимфоидных органах снижается число лимфоцитов в среднем в 1,23 раза, увеличивается количество макрофагальных клеток в среднем в 1,6 раза.

9. Иммунокорректоры различных классов ускоряют репарацию костной ткани, но различаются своей активностью. Применение полиоксидо-. ния ускоряет репаративный процесс и превосходит в скорости заживления кости группу, премированную миелопидом, в 2 раза, группу продигиозана в 3, контрольную - в 3,2 раза.

10. Применение полиоксидония в соответствии с разработанной схемой оказывает выраженный эффект на организацию репаративного остео-генеза за счет усиления кооперативных связей иммунокомпетентных клеток выраженного макрофагального и остеогенного воздействия. Аспираци-онная биопсия лимфоидных органов в период реконструктивно-восстановителыюго периода, наряду с общеклиническими исследованиями, позволит осуществить контроль над репаративным остсогенезом животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Наставление по применению полиоксидония. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 01.08. 1995 г. № 13-4-2/367. Методические рекомендации по иммунокоррегирующей терапии при лечении переломов трубчатых костей у собак. Одобрены отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 22.10.2003 г.

Изданы монография «Организация репаративного остеогенеза животных. Экспериментальные и клинические исследования». - М.: ООО «Франтера», 2004. — 144с; учебное пособие «Репаративная регенерация костной ткани у собак». - М.: МГУПБ, 2003.- 60 с; методические рекомендации к проведению лабораторно-практических занятий со студентами ветеринарных факультетов и вузов «Хирургия и иммунокоррекция при переломах трубчатых костей у собак». - М.: МГУПБ, 2003. - 17с. Материалы экспериментальных и клинических исследований используются в учебном процессе при подготовке ветеринарных врачей по курсам патологическая анатомия, ветеринарная хирургия и патологическая физиология животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ватников Ю.А Гистогенез костной ткани в условиях эксперимента // Сборник научных трудов Кировского сельскохозяйственного инта. -Киров, 1994.- С.34-35.

2. Ватников Ю.А. Трансчелюстной компрессионный способ лечения переломов нижней челюсти // Актуальные проблемы ветсанконтроля с.-х. продукции: Материалы международной научн. практ. конференции. -М., 1997.- 4.2. -С.76.

3. Ватников Ю.А., Камышко В.Е. Клеточные факторы иммунитета при костной травме // Актуальные проблемы ветеринарной науки: Сборник научных трудов. - М.: МВА им К.И. Скрябина, 1999. - С. 115-116.

4. Ватников Ю.А. Значение макрофагов в восстановлении костной ткани // Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях: Материалы международной научно-практической конференции. - Воронеж, 2000.-Т. 1.-С. 246-247

5. Ватников Ю.А. Динамика хелперых и супрессорных влияний в ранний посттравматический период // Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях: Материалы международной научно-практической конференции. - Воронеж, 2000. - Т. 1. - С. 245-246.

6. Ватников Ю.А. Морфологические и биохимические изменения периферической крови крыс в ранний посттравматический период // Инновационные технологии и повышение качества в приборостроении. - М., 2000. - Вып. 4. - С. 127-130.

7. Ватников Ю.А., Трошина Н.И. Особенности морфофункциональ-ной реакции некоторых внутренних органов на костную травму // Материалы VIII международного конгресса по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных. - М., 2000. - С. 92.

8. Ватников Ю.Л., Раскин А.В. Прикладной критерий репаративно-го остеогенеза // Материалы IX международного конгресса по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных. - М., 2001. - С. 226.

9. Ватников Ю.А. Влияние иммунокорректора «Полиоксидоний» на экспериментальный остеогенез крыс // Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных: Материалы IV международной практической конференции. - Троицк, 2001. - С. 79-80.

10. Ватников Ю.А., Камышко В.Е., Раскин А.В. Полиоксидоний в репаративном остеогенезе собак // Новые фармакологические средства для животных и ветеринарии: Материалы научно-практической конференции. -Краснодар, 2001. - Т.2. - С.25.

11. Ватников Ю.А Гематологические показатели экспериментальных моделей в острый посттравматический период // Пища. Экология. Человек: Материалы IV международной научно-технической конференции. -М., 2001.-С.313-314.

12. Ватников Ю.А. Изменения морфологического состава крови и костного мозга в рашшй посттравматический период у собак // Пища. Экология. Человек: Материалы IV международной научно-технической конференции. - М., 2001. - С.315-316.

13. Ватников Ю.А. Влияние препаратов полиоксидоний, миелопид и продигиозан на динамику некоторых факторов естественной резистентности // Современные иммуноморфологические проблемы развития животных при ассоциативных инфекционно-инвазионных заболеваниях и использование для их профилактики биологически активных продуктов пчеловодства: Сборник научных трудов. - М., 2001. — С.243-246.

14. Ватников Ю.А. Патогенетические изменения в системе кроветворения при экспериментальной травме голени // Современные иммуномор-фологические проблемы развития животных при ассоциативных инфекци-онно-инвазионных заболеваниях и использование для их профилактики биологически активных продуктов пчеловодства: Сборник научных трудов. - М., 2001.-С. 235-240.

15. Ватников Ю.А. Влияние биологически активных веществ на иммуноморфологические реакции в селезенке // Современные иммуноморфо-логические проблемы развития животных при ассоциативных инфекцион-но-инвазионных заболеваниях и использование для их профилактики биологически активных продуктов пчеловодства: Сборник научных трудов. -М, 2001. -С. 251-253.

16. Ватников Ю.А. Иммуноморфологические реакции в тимусе при введении в организм крыс биологических веществ // Современные имму-номорфологические проблемы развития животных при ассоциативных ин-фекционно-инвазионных заболеваниях и использование для их профилактики биологически активных продуктов пчеловодства: Сборник научных трудов. -М., 2001 .-С. 253-255.

17. Ватников Ю.А. Влияние полиоксидония на фагоцитарную активность гранулоцитов в период острой костной травмы собак // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветсанконтроля с.-х. продукции: Материалы IV международной научно-практической конференции. - М, 2002.-Т.1.-С. 195-196.

18. Ватников Ю.А. Репаративный остеогенез собак под воздействием иммунокорректоров различных классов // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветсанконтроля с.-х. продукции: Материалы IV международной научно-практической конференции.- М., 2002.- Т.1. - С. 21-22.

19. Ватников Ю.А. Морфогенез костной ткани под влиянием полиок-сидония// Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветсанконтро-ля с.-х. продукции: Материалы IV международной научно-практической конференции. - М., 2002.- Т.1. - С. 29-30.

20. Ватников Ю.А. Влияние байпамуна С/К на восстановление костной ткани крыс // Инновационные технологии и повышение качества в приборостроении: Сборник научных трудов. - М., 2001. - Вып. 5. - С. 106112.

21. Ватников Ю.А. Показатели эритро- и лейкопоэза в патогенезе асептической травмы // Ветеринария. - 2002. - №7. - С. 36-38.

22. Ватников Ю.А. Фагоцитарная активность мононуклеаров в патогенезе экспериментальной травмы под воздействием иммунокорректоров // Аспирант и соискатель.- 2002. №5. С. 173-176.

23. Ватников Ю.А. Травматическая болезнь - нозологическая единица в ветеринарной хирургии // Материалы XI международного ветеринарного конгресса. - М, 2003. - С. 142-143.

24. Ватников Ю.А. К вопросу о посттравматической патологии // Ветеринария. - 2003. - №7. - С. 12-13.

25. Ватников Ю.А., Карелина Е.А. Влияние асептической костной травмы на лизоцимную активность сыворотки крови крыс // Аспирант и соискатель. 2003. - №2. - С. 233 - 236.

26. Ватников Ю.А. Состояние органов иммуногенеза у мелких домашних животных в период репарации костной ткани // Пища, экология, человек: Материалы V международной научно-технической конференции. - М., 2003. -С. 255-257

27. Ватников Ю.А. Факторы естественной резистентности под воздействием экспериментальной асептической травмы костей голени // Доклады V международной научно-технической конференции. - М., 2003. -С. 94-96.

28. Ватников Ю.А. Репаративная регенерация костной ткани у собак: Учебное пособие. - М: МГУПБ, 2003:- 60 с.

29. Ватников Ю.А. Организация репаративного остеогенеза животных. Экспериментальные и клинические исследования: Монография. - М.: ООО «Франтера», 2004. - 144с.

Список сокращении и обозначении

ИД - исходные данные

ИК - иммунокорректор

КМ — костный мозг

Е-рок - Т-лимфоциты

ЕАС-рок - В-лимфоциты

ТФР-рок - клетка, обогащенная хелперной активностью

ТФЧ-рок - клетка, обогащенная супрессорной активностью

НСТ-тест - тест для определения фагоцитарных мононуклеаров

К - контрольная группа

Ро - полиоксидоний

Рго - продигиозан

Мё . -миелопид

Подписано в печать 17.05.2004 усл. печ. л.'2,5. Заказ#/<йр . Тираж 100 экз. МГУПБ. 109316. Москва, ул. Талалихина, 33 ПбОЮЛ "Митрофанов Р.В." тел.: 277-0386 109316 ул. Талалихина, 33

04 - 1 409 7

Структурная и функциональная организация репаративного процесса, как неотъемлемая составляющая травм несет в себе клинические проявления как местных, так и общих деструктивных изменений, охватывающих ключевые звенья общей патологии. И.В. Давыдовский указывает «. какой бы ни была характеристика патологического процесса (травматического, инфекционного.) - это саморазвивающийся процесс не зависящий, от того участвует ли в нем этиологический фактор». В этой связи выявление закономерностей развития репаративного остеогенеза, вопросов активизации его составляющих заслуживает самого пристального внимания, так как количество травм с каждым годом увеличивается. К.А. Петраков с соавт. (1994) констатирует, что костно-суставная патология у собак составляет более 10-12% по отношению к другим хирургическим заболеваниям. По утверждению A.C. Кашина с соавт. (1995), более 14,4%. По данным Объединения ветеринарии г. Москвы на 1999 г. количество травм составило 17-19%; в 2000 г. - 13-23%; 2001 г. - 12- 26%. В 2003 г. травмы составляли в среднем от 18% до 26% всей хирургической патологии. Смертность при этом (до оказания первой помощи) за этот же период составила 12-24% от общего показателя гибели животных. По информации Государственного центра травматологии Объединения ветеринарии, костный травматизм составляет 80% от общего числа пациентов (Слесаренко H.A., Самошкина И.Б. с соавт, 2002). Данная статистика находит свое подтверждение в исследованиях В.Н. Авророва, 1990; С.Ю. Концевой, 1999; О.Б. Чапкевич, 1999; А.Н. Безина, 2000; H.A. Слесаренко с соавт, 2001; С. А. Ягникова, 2001; В. А. Лукьяновского с соавт., 2002; И.Б. Самошкина с соавт., 2002; М. Dudley et al., 1997; К.Н. Kraus et al., 1998; W. McCartney, 1998; P. Muir et al., 1999.

Лаврищева Г.И. с соавт. (1981) утверждают, что современные методы лечения переломов направлены главным образом на выполнение механических подходов - репозиция и фиксация костных отломков, которые, достигнув совершенства, исчерпали свои возможности. Свидетельство обилие технических средств и неудовлетворительные результаты лечения, зачастую приводящие к образованию псевдоартрозов (Слесаренко H.A., Самошкин И.Б. с соавт. 2002). Разработка аппаратов и устройств для стабильной фиксации костных фрагментов, безусловно, позволила улучшить результаты лечения переломов костей и их последствий. Однако установлено, что статика имплантата и динамика конечности есть разнонаправленные силы, действующие на контактирующие поверхности. Не создана идеальная механическая конструкция для сопаставляемых фрагментов кости (Muller М., Winzel U., 1984; Heitemeyer U., Hierholzer G., 1985; Brunner U., Kessler S. et al., 1990; Мюллер M.E., Алльговер M. с соавт., 1996), не решены вопросы «критических напряжений восстанавливающихся тканей», «пределов устойчивости к деформации» (Rahn В.А., 1971; Rahn В.А., Perren S.M., 1975), а также реакции кости и ремоделирование под воздействием имплантатов (Perren S.M., Cordey J., 1980; Мюллер М.Е., Алльговер М. с соавт., 1996). Нет достоверно доказанного влияния межфрагментарной компрессии на регенерацию кости (Matter Р., Brennwald J. et al., 1974). Несостоятельность металлоконструкций, ряд этих и других осложнений (Шапошников Ю.Г., 1997; Рагимов A.A., 1999; Parfit A.M., 1989), заставляет искать пути преодоления несовершенного костообразования.

Восстановление тканей, исходя из положения о биологической структуре и функции, есть совокупный динамический процесс, проявляющийся изменением структурных и функциональных аспектов тканей и органов во времени. Системность в генетически детерминированном аспекте подчинена строгому структурному принципу разграничения тканей. При этом его организация осуществляется при сложном взаимодействии различных систем и органов. Анализ литературных данных, экспериментальные исследования, собственный клинический опыт, позволяют заключить, что основной системой в организации репаративного остеогенеза являются органы гемо-иммуногенеза. В данном контексте именно они «владеют» рененераторной информацией. В этой связи изыскание путей воздействия именно на систему гемо-иммуногенеза представляется необходимым и перспективным фактором.

Из собственных клинических наблюдений явствует, что в большинстве случаев переломов костей не проводится стабилизация основных систем и органов животного, не изучаются вопросы коррекции репаративного остеогенеза. Практикующие врачи-травматологи не уделяют должного внимания системному подходу к восстановлению костной ткани. Наблюдения за состоянием системы кроветворения и органов иммуногенеза в -подавляющем большинстве случаев ограничиваются рамками клинического анализа крови. Причина состоит в том, что изучению состояния лимфоидных органов в процессе репаративного остеогенеза посвящены лишь единичные работы, не раскрывающие в полной мере сущности изменений со стороны иммунопоэза, а работы по его изучению у спонтанно травмированных собак в доступной литературе отсутствуют.

Анализируя вышесказанное, можно с уверенностью утверждать, что вопрос о регулируемой организации в репаративном остеогенезе остается открытым. На сегодняшний день в ветеринарии нет средств и методов, обеспечивающих надежную, отработанную схему влияния как на «местное», так и на «общее» проявление репарации тканей. В этой связи исследования в области применения препаратов, оказывающих иммунокоррегирующее действие может, по нашему мнению, влиять на восстановление отдельных тканей, не нарушая биологические законы структуры и функции. Не вызывает сомнений тот факт (Детлав И.Э., 1982), что знание закономерностей оптимального применения иммунокорректоров, целенаправленно влияющих на отдельные звенья защитной цепи, позволит не только сократить лечение, но, главное, индивидуализировать терапию.

Необходим системный, научно обоснованный подход к вопросам организации репаративного остеогенеза на основе анализа структурных и функциональных механизмов иммуноморфологической обеспеченности репаративного процесса, а также решения вопросов регулирования процессами репарации. В этой связи представляется весьма актуальным раскрытие закономерности механизмов репаративной регенерации костных структур, контроля над их состоянием и целенаправленного воздействия на восстановительный остеогенез.

Цель исследования. Выявить закономерность структурной и функциональной организации репаративного остеогенеза. Разработать научно обоснованную систему коррекции посттравматического восстановления костной ткани животных.

Задачи исследования:

• Провести анализ структурных и функциональных изменений центральных и периферических органов иммуногенеза и периферической крови в период репаративной регенерации костной ткани в условиях эксперимента.

• Обосновать целесообразность использования иммунокорректоров в репаративном остеогенезе и экспериментально доказать целесообразность их применения.

• Проанализировать изменения лимфоидных органов и периферической крови экспериментальных животных под воздействием иммунокорректоров различных классов.

• Изучить морфофункциональные аспекты репаративного остеогенеза в условиях эксперимента под воздействием иммунотерапии.

• Изучить структурные и функциональные изменения организации репаративного остеогенеза под воздействием иммунотерапии у спонтанно травмированных собак.

• Предложить способы контроля состояния периферической крови и органов иммуногенеза у спонтанно травмированных собак в период репарации костной ткани на основе экспериментальных и клинических исследований.

• Разработать и внедрить в клиническую практику схему иммунокоррегирующей терапии в период репаративной регенерации костной ткани у спонтанно травмированных животных.

Научная новизна. Впервые на основе комплексной оценки структурных и функциональных изменений центральных и периферических органов иммуногенеза и системы крови представлена закономерность репарации костной ткани. Установлена взаимосвязь восстановления материального субстрата костной ткани и активности иммунокомпетентных клеток в процессе организации репаративного остеогенеза, коррелирующая с изменением иммунозависимых зон лимфоидных органов.

Впервые дано теоретическое обоснование проведения иммунокоррекции в репаративном остеогенезе, основанное на экспериментальных данных, клинических наблюдениях и анализе специальной литературы. Доказана целесообразность коррекции восстановительного процесса костной ткани и установлены основные закономерности развития стимулированного остеогенеза. На основе системного исследования, разработанных теоретических положений и экспериментальных данных проведен сравнительный анализ эффективности применения иммунокорректоров различных классов в процессе заживления костной ткани, подтвержденный иммуноморфологическими, гистологическими и рентгенологическими методами. Разработана и внедрена в клиническую практику система коррекции репаративного остеогенеза спонтанно травмированных животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе разработанных теоретических положений и экспериментальных исследований, подтвержденных морфологическими материалами, представлена система коррекции репаративной регенерации костной ткани спонтанно травмированных животных. Для осуществления контроля над процессом репарации костной ткани отработана и предложена методика оценки структурно-функционального состояния центральных и периферических лимфоидных органов путем аспирационной биопсии. Разработан препарат нового поколения — синтетический иммуномодулятор полиоксидоний, утвержденный Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России, созданный совместно с коллективом ГНЦ

Института иммунологам Минздрава РФ. Препарат внедрен в клиническую практику. Представлена схема его применения в период репаративной регенерации костной ткани у экспериментальных и спонтанно травмированных животных. Внедрение полиоксидония в ветеринарную практику позволило, не нарушая биологических законов репарации тканей, существенно сократить сроки заживления переломов длинных трубчатых костей животных. Основные положения теоретического обоснования иммунокоррекции используются при комплексном изучении патогенетических аспектов костной патологии животных.

Научные разработки, положения и выводы вошли в Наставления по применению полиоксидония, утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 01.08.95 г., № 13-4-2/367; Методические рекомендации «Иммунокоррегирующая терапия при лечении переломов трубчатых костей у собак», одобренные Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 23.10.03 г.

Исследования по структурно-функциональному остеогенезу в посттравматический период представлены в монографии «Организация репаративного остеогенеза животных. Экспериментальные и клинические исследования». - М.: ООО «Франтера», 2004. — 144с. и учебном пособии «Репаративная регенерация костной ткани у собак». — М., 2003. — 60с. Материалы диссертации используются в цикле лекций по курсу «Ветеринарная хирургия». Изданы и внедрены в учебный процесс и клиническую практику методические рекомендации «Хирургия и иммунокоррекция при переломах трубчатых костей у собак». — М., 2003. -17с.

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в рамках научно-исследовательской работы и в соответствии с планом НИР МГУПБ, регистрационный номер 7-3-01В. «Травматизм и репаративная регенерация костной ткани» - код темы по ГРНТИ 68.41.33; 68.41.47.

Апробация работы. Результаты научных и клинических исследований были доложены на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветсанконтроля с.-х. продукции». — М., 1997; Международной научно-практической конференции «Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях». — Воронеж, 2000; IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных». — Троицк, 2001; Научно-практической конференции «Новые фармакологические средства для животных и ветеринарии». - Краснодар, 2001; IV Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек».- М., 2002; V Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек». - М., 2003; IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветсанконтроля с.-х. продукции». - М., 2002; VIII Московском международном ветеринарном конгрессе. - М., 2000; IX Московском международном ветеринарном конгрессе. - М., 2001; X Московском международном ветеринарном конгрессе. - М., 2002; XI Московском международном ветеринарном конгрессе. — М., 2003.

Публикации результатов исследований. По материалам собственных исследований опубликовано 29 печатных работ, в которых отражено основное содержание диссертации.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Аспекты закономерности организации репаративного остеогенеза.

• Теоретическое обоснование иммунокоррекции в процессе репаративного остеогенеза.

• Состояние периферической крови и органов иммуногенеза в процессе репаративной регенерации костной ткани под воздействием иммунокорректоров в эксперименте.

• Морфофункциональный анализ органов иммуногенеза и влияние иммунотерапии в период реконструктивно-восстановительного остеогенеза спонтанно травмированных собак.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Закономерность организации репаративного остеогенеза проявляется: а) структурной дезинтеграцией ткани, дисбалансом иммунной системы - до 7-х суток; б) иммуноморфологической перестройкой в лимфоидных органах, образованием соединительнотканного регенерата в зоне перелома с 7 по 28-е сутки; в) структурной и функциональной состоятельностью органов иммуногенеза, формированием остеогенной структуры с 28 по 42-е сутки и клинической стабилизацией животных; г) структурной состоятельностью костной ткани и началом клеточной стабилизации - с 42- 56-х суток.

2. Структурные и функциональные преобразования в органах гемо-иммуногенеза заключаются в изменении площадей иммунокомпетентных зон, в активизации лимфатических фолликулов с выраженным проявлением на 2, 7, 14 и 28-е сутки репаративного процесса. В костном мозге 7-14-е сутки посттравматического периода характеризуются расширением сосудистого русла, усиленной пролиферацией миелоидного и эритроидного ростков кроветворения и клеток ретикулярной стромы.

3. Изменение количества лимфоцитов в лимфоидных органах протекает волнообразно, в соответствии с фазами репаративного остеогенеза. Количество Т-лимфоцитов (Е-рок) в тимусе снижается на протяжении 28-ми суток (в 1,3-1,7 раза). Количество Е-рок в лимфатическом узле и селезенке после увеличения на 2-е сутки в 1,2 раза, к 14-28-м суткам снижается в среднем в 1,5 раза по отношению к интактным значениям. Функциональная активность В-лимфоцитов проявляется снижением их концентрации ко 2-м (в 1,4) и к 28-м суткам (в 1,7 раза) по отношению к интактной группе. Клеточный состав органов восстанавливается к 42-м суткам.

4. Репаративный процесс (1-7-е сутки) сопровождается снижением количества миелокариоцитов в 1,25, лейкоцитов и эритроцитов в 1,3-1,2 раза. Бактерицидная и лизоцимная активность сыворотки снижается в 2,9 раз; фагоцитарная в 1,3, розеткообразующая активность лимфоцитов в 1,5, макрофагальная мононуклеаров в 1,6 раза. В период 7-28-х суток количество клеток костного мозга и периферической крови увеличивается в среднем в 1,2-2,3 раза. В период 28-56-х суток показатели крови и костном мозге восстанавливаются в пределах исходных значений.

5. Макрофагальная активность мононуклеаров крови снижена в 17-е сутки и усилена в костном регенерате, наряду с клетками лимфоидного ряда, а с 7—14-х суток их активность в крови возрастает. Количество макрофагов и лимфоцитов в костном регенерате снижается по мере восполнения раны остеогенными структурами. К 28-м суткам происходит количественная стабилизация клеточных показателей.

6. Экспериментальное применение ИК по разработанной схеме на 3, 4, 5 и 9, 10, 11-е сутки посттравматического периода не нарушает восстановительного процесса. Использование полиоксидония к 7-м суткам ускоряет выход иммунокомпетентных клеток из центральных и периферических органов иммуногенеза в 1,3, а к 14 - в 1,26 раза по отношению к контролю. В периферической крови количество иммунокомпетентных клеток крови и сывороточных факторов увеличивается в 2 раза.

7. На основе анализа структурной и функциональной организации репаративного остеогенеза научно обоснована и внедрена в клиническую практику система коррекции посттравматического восстановления костной ткани животных.

8. У спонтанно травмированных собак после введения полиоксидония на 3, 4 и 5-е сутки количество миелокариоцитов снижается в 1,2; после введения на 9, 10, 11-е сутки - в 1,4 раза, при этом количество лейкоцитов и эритроцитов крови увеличивается в 2 раза. В лимфоидных органах снижается число лимфоцитов в среднем в 1,23 раза, увеличивается количество макрофагальных клеток в среднем в 1,6 раза.

9. Иммунокорректоры различных классов ускоряют репарацию костной ткани, но различаются своей активностью. Применение полиоксидония ускоряет репаративный процесс и превосходит в скорости заживления кости группу, премированную миелопидом в 2 раза, группу продигиозана в 3, контрольную — в 3,2 раза.

10. Применение полиоксидония в соответствии с разработанной схемой оказывает выраженный эффект на организацию репаративного остеогенеза за счет усиления кооперативных связей иммунокомпетентных клеток, выраженного макрофагального и остеогенного воздействия. Аспирационная биопсия лимфоидных органов в период реконструктивно-восстановительного периода, наряду с общеклиническими исследованиями, позволит осуществить контроль над репаративным остеогенезом животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Наставления по применению полиоксидония Утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 01. 08. 1995 г. № 13-42/367. Методические рекомендации по иммунокоррегирующей терапии при лечении переломов трубчатых костей у собак, Одобрены отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 22.10. 2003 г.

Изданы монография «Организация репаративного остеогенеза животных. Экспериментальные и клинические исследования». - М.: ООО «Франтера», 2004. - 144с., учебное пособие «Репаративная регенерация костной ткани у собак». — М., МГУПБ, 2003 — 60 с. Опубликованы методические рекомендации к проведению лабораторно-практических занятий со студентами ветеринарных факультетов и вузов «Хирургия и иммунокоррекция при переломах трубчатых костей у собак». - М., МГУПБ, 2003. - 17с. Материалы экспериментальных и клинических исследований используются в учебном процессе при подготовке ветеринарных врачей по курсам патологическая анатомия, ветеринарная хирургия и патологическая физиология животных.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ИД - исходные данные ик - иммунокорректор км — костный мозг

Е-рок - Т-лимфоциты

ЕАС-рок - В-лимфоциты

ТФР-рок - клетка, обогащенная хелперной активностью

ТФЧ-рок — клетка, обогащенная супрессорной активностью

НСТ-тест - тест для определения фагоцитарных мононуклеаров

К — контрольная группа

Ро - полиоксидоний

Рго - продигиозан

Мс! - миелопид

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе разработанных научных положений и полученных экспериментальных данных структурного и функционального восстановления костной ткани установлено, что организация репаративного остеогенеза представлена периодами, проявляющимися деструктивными изменениями в костной ткани, дисбалансом клеточных гуморальных факторов системы крови. Начало образования зрелого регенерата в зоне перелома сопровождается иммуноморфологической перестройкой в органах иммуногенеза. Период восстановления структурной и функциональной состоятельности лимфоидных органов с завершающей фазой формирования остеогенной структуры характеризует клиническую и клеточную стабилизацию в системе и органах животного.

Полученные результаты исследований демонстрируют коррелятивные связи между количественными и структурными сдвигами в органах иммуногенеза, периферической крови, а также закладкой и формированием костной мозоли. Использование иммунокорректоров в комплексе с симптоматической, патогенетической и противомикробной терапией способствует устранению дисбаланса в системе лимфоидных органов и периферической крови, оказывая выраженный эффект на регенеративные процессы. Разработанная и научно обоснованная система иммунокоррекции позволяет существенно сократить сроки восстановления костной ткани у животных.

Применение синтетического препарата полиоксидония по разработанной схеме способствует быстрой реализации механизмов кроветворения и остеогенеза, повышает иммунологическую резистентность, усиливает макрофагальную активность и раскрывает необходимый комплекс клеточных и гуморальных взаимодействий в организации репаративного остеогенеза.

Показатели структурных и функциональных изменений, полученные на экспериментальных и спонтанно травмированных животных, раскрывают закономерность организации репаративного остеогенеза. Научно обоснованные теоретические подходы к проведению иммунокорекции вносят значительный вклад в развитие фундаментальных аспектов общей патологии. Внедрение и использование иммунотерапии при костной патологии, разработка морфофункциональных основ прижизненного контроля над проведением иммунокоррекции имеет важное научное и прикладное значение в решении вопросов посттравматического восстановления тканей как одной из приоритетных задач ветеринарной науки и практики.