Серологическая диагностика вирусного энтерита гусей методом иммуноферментного анализа

Маслов, Дмитрий Владимирович

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Серологическая диагностика вирусного энтерита гусей методом иммуноферментного анализа

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Маслов, Дмитрий Владимирович Санкт-Петербург 2006 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Серологическая диагностика вирусного энтерита гусей методом иммуноферментного анализа

На правах рукописи

МАСЛОВ ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА ГУСЕЙ МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург-2006

'/4о2 - /

Работа выполнена в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства, НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва), на Катайском гусекомплексе Курганской области и фермерских хозяйствах Ленинградской области.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор ветеринарных наук

Трефилов Борис Борисович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор ветеринарных наук, доцент

Соколова Лидия Николаевна

доктор ветеринарных наук, профессор Борисов Александр Владимирович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт ветеринарной медицины'

Омского государственного аграрного университета

Защита диссертации состоится «23» июня 2006 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» ■ по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан «20» мая 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Узюмова О.В.

1. Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Серьезным препятствием на пути развития промышленного гусеводства наряду с факторами нарушения технологического режима выращивания являются различные инфекционные болезни молодняка, среди которых особое место занимает вирусный энтерит (парвовирусная инфекция) гусей. Это заболевание до настоящего времени имеет широкое распространение среди гусят 1-30-суточного возраста, протекает остро и характеризуется высокой смертностью, достигая до 90-100% (В.В. Малушко, 1982; JI.M. Контримавичус, 1983; Б.Б.Трефилов, 2000; А. Белецкая, 2003; Varga J., 2000). •

Данные эпизоотологических и клинических наблюдений, патологоанатомической картины и лабораторных исследований свидетельствуют о том, что вирусный энтерит гусей (ВЭГ) протекает как моноинфекция и как смешанная инфекция с бактериальными, грибковыми и паразитарными болезнями (сальмонеллезы, колибактериоз, аспергиллез и кокцидиозы) (Б.Б.Трефилов, 2000; Kisary J., 1986).

Диагностика смешанных инфекций связана со значительными трудностями и требует комбинированного использования современных вирусологических и микробиологических методов исследования.

Следует отметить, что существующие методы лабораторной диагностики ВЭГ (реакция диффузионной преципитации, метод флуоресцирующих антител, реакция нейтрализации) являются либо недостаточно чувствительными, либо весьма трудоемкими, дорогостоящими, требуют специального оборудования и связаны с сезонностью репродуктивного периода гусей.

Поэтому разработка и совершенствование методов лабораторной диагностики этой болезни являются актуальными и имеют большое научное и практическое значение.

В зарубежной и отечественной литературе имеются сообщения о все возрастающей роли в диагностике инфекционных болезней, микотоксикозов и эймериозов животных иммуноферментного метода, обладающего высокой специфичностью, чувствительностью и лишенного недостатков, отмеченных при других вышеуказанных методах.

Цель и задачи работы. Учитывая опасность ВЭГ для гусеводства и отсутствие экспресс-метода диагностики заболевания, целью настоящих исследований явилась разработка иммуноферментной тест-сиегемы для диагностики ВЭГ, основанной на выявлении специфических антител к вирусу энтерита гусей.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: получить высокоочищенный антиген вируса энтерита и вирусспецифическую гипериммунную сыворотку гусей;

получить антивидовой иммунопероксидазный конъюгат специфичный к ^ С гусей; разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения антител к вирусу энтерита в сыворотке крови гусей методом последовательных разведений и методом одного разведения;

изуч1гть диагностическую ценность ИФА в сравнении с реакцией нейтрализации при диагностике ВЭГ';

испытать иммуноферментную тест-систему при изучении иммуногенеза у вакцинированных против ВЭГ гусей;

- разработать Методические указания для лабораторной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна. Впервые в РФ для серологической диагностики ВЭГ разработан непрямой вариант ИФА с использованием отечественных препаратов и реактивов. Выделен из сыворотки крови интактных гусей, получен конъюгат

иммунопероксидазный антивидовой гусиный. Дана сравнительная оценка непрямого метода ИФА с реакцией нейтрализации при ВЭГ. Изучена кинетика формирования поствакцинального иммунитета у гусят и гусей родительского стада против вирусного энтерита с применением ИФА в экспериментальных и производственных условиях. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител в сыворотках крови гусей к вирусу энтерита.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований разработаны иммуноферментная тест-система для диагностики ВЭГ и методические указания по ее применению в птицеводческих хозяйствах и научно-производственных лабораториях. Показана перспективность применения ИФА при проведении серологического мониторинга и определении уровня поствакцинального иммунитета гусепоголовья.

Основные положения, выносимые па защиту:

- иммуноферментная тест-система для выявления и количественного определения антител к вирусу энтерита гусей при тестировании сывороток в одном разведении;

- результаты получения высокоочищенного антигена вируса энтерита и вирусспецифической гипериммунной сыворотки крови гусей;

- результаты получения антивидового иммунопероксидазного конъюгата специфичного к1ёС гусей;

- результаты сравнения разработанной тест-системы и реакции нейтрализации;

- результаты изучения трансовариального иммунитета при контрольном заражении вирулентным штаммом вируса энтерита гусят, полученных от вакцинированных и невакцинированных родителей;

- результаты изучения динамики иммуногенеза у 1усят и гусей родительского стада против ВЭГ в экспериментальных и производственных условиях.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Методических советах отдала вирусологии и ОБП ВНИВИП (2003-2005гг.), на Международной Юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике в промышленном птицеводстве» (г. Санкт-Петербург -Ломоносов, 14-16 сентября 2004) и на 18-й Международной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии».

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 3 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах, иллюстрирована 8 таблицами и 10 рисунками. Список использованной литературы включает 254 источника, из них 143 зарубежных.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в 2002-2005 гг. в соответствии с утвержденным планом научно-исследовательской работы ВНИВИП по заданию 07.01 (№ госрегистрации 01.2.00 109631).

Соисполнителями отдельных фрагментов работы были старший научный сотрудник Никитина Н.В. и научные сотрудники НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва).

Вирус. В работе использовали контрольный штамм П-75 вируса энтерита гусей, адаптированный к гусиным эмбрионам, и вакцинный «клон 6» с титрами соответственно 4,3 ^ ЭЛДчг/О.Зсм1 и 7,5 ^ ТЦД^ц/см3. Вирус хранили при температуре -20°С и поддерживали на развивающихся гусиных эмбрионах и в культуре клеток.

Лабораторные животные. В опытах использовали клинически здоровых гусят 1-30 - суточного возраста, доставленных из фермерских хозяйств Ленинградской области,

благополучных по вирусным заболеваниям птиц, и в том числе по вирусному энтериту гусей.

Получение антигена. Очистку вируса энтерита гусей проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливинилпирролидоном. Степень очистки вируса оценивали по белку.

Получение конъюгата. Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат специфичный к IgG гусей, получали модифицированным методом периодатного окисления (Nacane, 1981). Очистку конъюгата от несвязавшихся белков и пероксидазы проводили методом гальфильтрации на колонках с сефадексом G-200. Активность конъюгата проверяли в прямом сэндвич-методе со специфическим иммуноглобулином.

Иммунофермеитный анализ. В работе использовали непрямой твердофазный метод ИФА, оптимальные условия постановки которого определяли экспериментально. Субстратом служила 5-аминосалициловая кислота (5-АСК), высокоочищенная (99%) производства США.

ИФА проводили на плоскодонных 96-луночных полистироловых планшетах производства Biohit, Финляндия. Результаты реакции учитывали на иммунофермснтном анализаторе «Униплан» при длине волны 450 нм.

Постановка бионробы. Экспериментальное заражение гусят проводили введением контрольного штамма П-75 вируса энтерита в дозе 1000 ЭЛДзо в 0,5 см3 внутримышечно. Наблюдение за гусятами вели в течение 14 суток, результаты контрольного заражения оценивали положительно в случае гибели гусят с характерными клиническими признаками.

Статистический анализ данных. Для статистической обработки экспериментальных данных использовали компьютерную программу Microsoft Excel.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа. 2.2.1.1. Очистка вируса энтерита гусей. Важнейшим условием непрямого метода ИФА является наличие высокоочшценных препаратов вируса. Активный и специфичный антиген ВЭГ получали из вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости инфицированных 9-суточных гусиных эмбрионов с титром не менее 4,30 lg ЭЛД50 /0,3см3. Вируссодержащую жидкость центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин, с целью освобождения от балластных белков. Затем проводили очистку надосадочной жидкости, содержащей вирус, методом молекулярно-ситовой хроматографии на МПС,

обработанном 4% раствором поливинилпирролидона, путем подбора размера диаметра пор стекла, концентрации и рН элюирующего буфера и количества наносимого вирусного материала. Показано, что очистка экстраэмбриональной внруссодержащей жидкости, используя МПС с диаметром пор 700Á, 0,01 М натрий-фосфатный буфер с содержанием 0,15М хлорида натрия, рН 7,2-7,4 и количество наносимого вируса, равное 1/10 части от объема препаративной колонки, позволяла получать очищенный вирус С концентрацией белка 30-40 мкг в 0,1 см3. Очистка вируса составляла 98%. Активность антигена вируса энтерита, сорбированного в лунках планшет для ИФА, сохранялась более 12 месяцев при хранении при 4-8°С.

2.2.1.2. Получение специфической положительной и отрицательной сывороток крови гусей. Для получения специфической гипериммунной сыворотки крови к вирусу энтерита использовали клинически здоровых гусят 30-суточного возраста, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней: ньюкаслская болезнь, гепатит, аденовирусная, peo- и парвовирусная инфекции гусей. Схема иммунизации была основана на введении нарастающих доз очищенного вируса энтерита. Экспериментально было показано, что оптимальным методом получения гипериммунной сыворотки крови гусей является трехкратное введение птице очищенного вируса энтерита по схеме: двукратное введение антигена вируса подкожно в объеме 0,5 см3 с интервалом в 7 дней. Третья иммунизация через 7 дней внутрибрюшинно в объеме 1,0 см3. Через 14 дней после последней иммунизации гусей тотально обескровливали путем взятия крови из сердца. Активность полученной гипериммунной сыворотки определяли в реакции нейтрализации на культуре клеток гусиных эмбрионов в Р-варианте. Гипериммунная специфическая сыворотка крови гусей была высокоактивной и имела титр 9,0 logj. Титр в ИФА составил 1:4000. Полученная сыворотка крови в лиофильно высушенном состоянии при хранении при 4-8С" не теряла своей активности в ИФА в течение 12 месяцев. Отрицательную сыворотку крови гусей получали от клинически здоровых гусят 30-суточного возраста, выращенных в камеральных условиях, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней птиц, в том числе к вирусу энтерита гусей, во-первых, для отрицательного контроля в ИФА, во-вторых, для получения антивидового иммунопероксидазного конъюгата. 2.2.1.3. Получение конъюгата. Качество конъюгатов, полученных периодатным методом, оценивали по активности пероксидазы и специфических иммуноглобулинов и по соотношению пероксидазы и иммуноглобулина в конъюгате. Обнаружено, что предварительная очистка производственного препарата пероксидазы на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой повышала активность фермента. RZ различных серий препарата после

очистки колебалась от 3,0 до 3,8, в то время как различные серии производственного препарата давали разброс от 2,7 до 3,0. Очищенная пероксидаза была электрофоретически гомогенна. При электрофорезе в ПААГ исходный препарат пероксидазы содержал 4 фракции, тогда как очищенный в лабораторных условиях фермент давал одну доминантную полосу и две слабовыраженные минорные полосы. На стадии очистки конъюгата от несвязавшихся белков и пероксидазы использовали пиковые фракции с коэффициентом связывания от 0,4 до 0,6, так как именно при этом коэффициенте достигается оптимальное соотношение фермента с иммуноглобулином в конъюгате, когда каждая молекула иммуноглобулина связана с одной или более молекулами пероксидазы. Активность конъюгата в прямом методе ИФА была 1 ."6000. Для выявления специфических антител к ВЭГ подбирали оптимальное рабочее разведение конъюгата, которое составило 1:300 - 1:400. Конъюгат в лиофилизированном состоянии при хранении при 4-8°С сохранял свою активность в течение 24 месяцев.

2.2.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к парвовнрусу гусей

2.2.2.1. Оптимизация условий постановки ИФА. Оптимизацию параметров постановки реакции при выявлении специфических антител к ВЭГ вели по иммуноспецифическим и неспецифическим компонентам диагностической тест-системы. Установлено, что для получения активного твердофазного иммуносорбента лучше использовать планшеты фирмы Biohit (Финляндия). Оптимальным режимом сенсибилизации полисгироловых планшет антигеном ВЭГ является инкубация при 4°С в условиях бытового холодильника в течение 18 часов в 0,01М натрий-фосфатном буфере с содержанием 0,15М хлорида натрия, рН 7,2-7,4, с концентрацией вирусного белка 5-8 мкг/0,1см3. В процессе постановки реакции исследуемые, контрольные сыворотки и конъюгат инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 минут. В качестве промывочной буферной системы, обеспечивающей специфичность ИФА, использовати 0,01М калий-фосфатный буфер, рН 7,2-7,4, содержащий 0,5М NaCI с 0,1% конечной концентрацией детергента твин-20.

2.2.2.2. Определение диагностического титра сыворотки в ИФА. Диагностический титр в ИФА устанавливали методом «шахматного титрования» различных положительных сывороток, начиная с разведения 1:10, при стандартной концентрации (8 мкг на лунку) сорбированного антигена. Показано, что разведение сывороток 1:100 дает возможность не пропустить слабоположительные сыворотки. При этом 20 сывороток крови из благополучных по вирусному энтериту хозяйств были отрицательными в ИФА, что

подтверждает специфичность разработанной диагностической тест-системы. Установлено, что при обследовании гусеводческих хозяйств на ВЭГ целесообразно начинать постановку ИФА с разведения сыворотки 1:50 и считать разведение сыворотки 1:100 диагностическим титром на вирусный энтерит.

2.2.2.3. Количественная оценка титра антител к вирусу энтерита гусей методом одного разведения. Для определения конечного титра тестируемых сывороток по одному разведению использовали метод регрессионного анализа в компьютерной программе Microsoft Excel. Математические расчеты проводили для разведений сывороток 1:50, 1:100 и 1:200 (табл.1). Были найдены коэффициенты линейной регрессии для величин lg S/P и lg Т (рис.1). Установлено, что наиболее высокое значение коэффициента корреляции определено для разведения сыворотки 1:100, которое и было принято за рабочее. Уравнение линейной регрессии (lg Т = 2,02401 lg(S/P) + 3,50738) для разведения сыворотки 1:100 было использовано для расчета числового значения титра. Полученное уравнение линейной регрессии будет достоверно для определенных значений оптической плотности отрицательной и положительной контрольных сывороток. Статистическая обработка 40 таких значений показала, что ОП контрольных сывороток с 95% уровнем достоверности должна находиться в интервале от 0,420 до 0,930 для положительной и в интервале 0,065 до 0,150 для отрицательной контрольных сывороток.

Таблица 1

Коэффициенты линейной регрессии и корреляции для исследуемых

раззеденни

Разведение А В R

1:50 2,11234 3,46748 0,89385

1:100 2,02401 3,50738 0,95832

1:200 1,93311 3,55175 0,95152

А, В - коэффициенты линейной рег рессии; R — коэффициент корреляции.

Lg S/P

Ric.1. График зависимости величин IgToT Lg S*P для рабочего разведения ськороткн

2.2.4. Вычисление позвтивно-пегативного порога. Для разграничения неспецифическон, сомнительной и специфической реакций, определяли пороговые значения S/P-отношения. В качестве пороговой величины для отрицательной реакции приняли S/P-показатель, который соответствовал верхней границе 95% доверительного интервала исследованной выборки значений ОП, S/P-показатель для отрицательной реакции составил 0,14. Пороговой величиной, соответствующей минимальной ожидаемой положительной реакции, считали значение S/P, установленное для верхней границы 95% доверительного интервала. Величина S/P для положительной реакции составила 0,18. Промежуточные величины соответствовали зоне «сомнительных» результатов, 2.2.2.5. Оценка чувствительности и специфичности разработанной тест-системы. Оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы проводили путем

сравнительного анализа результатов тестирования сывороток в ИФА и в реакции нейтрализации (РН), которая является классическим тестом диагностики вирусных заболеваний. Результаты исследования представлены в табл.2. Параллельное тестирование 30 сывороток крови гусей различной активности показало, что корреляция между результатами исследования в ИФА и РН составила 96%, 90% и 85%, соответственно. С отрицательными и гетерологичными сыворотками крови гусей результаты иммуноферментнон реакции были отрицательными (Р<0,05). Полученные результаты исследований подтверждают высокую чувствительность и специфичность разработанной нммуноферментной тест-системы.

Таблица 2

Результаты сравнительного изучения серологических реакций

№ п/п Исследуемые сыворотки крови гусей Активность сывороток коэффициент корреляции, г

РН, 1ойг ИФА

1. гипериммунная сыворотка (положительный контроль) 9,0 3388 0,96

2. отрицательная сыворотка (отрицательный контроль) 0,75 — —

3. сыворотка крови от невакцинированных гусей 0,75 — —

4. сыворотка крови от вакцинированных гусей 8,5 2884 0,90

5. сыворотка крови суточных гусят, полученных от вакцинированных родителей 5,8 305 0,85

6. гетерологичные сыворотки к вирусам: - гепатита - реовируса — — —

2.2.3. Практическое использование разработанной тест-системы на основе непрямого метода ИФА. 2.2.3.1. Изучение защитных свойств трансовариального иммунитета против вирусного энтерита при контрольном заражении гусят. Изучение напряженности трансовариального иммунитета проводили на суточных гусятах из «Катайского гусеводческого комплекса», от гусей родтельского стада вакцинированных против вирусного энтерита. Гусят заражали контрольным штаммом П-75 вируса энтерита в дозе 1000 ЭЛДзо внутримышечно. Антитела в сыворотках крови гусят выявляли в ИФА с применением разработанной тест-системы. Результаты представлены на рис.2.

Возраст (сут.)

Рис. 2. Процент положительных (ПЛ) в ИФА проб сыворотки крови гусят, полученных от вакцинированных родителей

Установлено, что у суточных гусят, полученных от вакцинированных родителей материнский иммунитет составил 100%. На 3-й, 6-й и 9-й день исследований количество положительно реагирующих проб составило 70, 50 и 25%, соответственно. На 15-й день исследуемые пробы сыворотки крови гусят были отрицательными. У гусят, полученных от невакцинированных родителей, во все сроки исследований пробы сыворотки крови были серонегативными. Результаты контрольного заражения представлены в табл. 3.

Таблица 3

Поствакцинальный иммунитет у гусей и напряженность материнского иммунитета у гусят

Группа Средний титр антител* Заражено Результаты контрольного заражения гусят Е,%

родители гусята Заболело Пало

А 2852±230 Р<0.05 499±бб 20 2 — 90

В 215±23 Р<0.05 — 20 10 8 —

* - титр антител в обратных величинах А - вакцинированные против энтерита родители; В - невакцинированные против энтерита родители; Е - иммунологическая эффективность.

Показано, что материнский иммунитет был напряженным. Средний титр антител составил 499±66. Иммунологическая эффективность составила 90%, что согласуется с результатами серонейтрализации при проведении испытаний вирусвакцины сухой культуральнон ВНИВИП против вирусного энтерита гусей (Б.Б. Трефилов, 1993). 2.23.2. Изучение формирования иммунитета у гусят в лабораторных условиях методом ИФА. В опытах использовали гусят 10-суточного возраста, полученных из фермерского хозяйства Ленинградской области, благополучного по вирусному энтериту. Птицу вакцинировали вирусвакциной ВНИВИП. Ревакцинацию проводили через 20 дней. Сыворотки тестировали в ИФА с применением разработанной тест-системы с интервалом в 5 дней. Результаты исследований представлены на рис. 3.

4000

* 3500

■<5

§ 3000

" 2500

5 2000

« 1500

о. 1000

н 500

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Время, сут.

Рис. 3. Динамика формирования антител у гусят, вакцинированных против ВЭГ

— м — первая вакцинация на 10 сут.;

- х - ревакцинация через 20 сут.; ------ контроль.

Изучение динамики иммуногенеза у гусят, вакцинированных вирусвакциной ВНИВИП в экспериментальных условиях, показало, что разработанная иммуноферментная тест-система выявляет специфические антитела в сыворотке крови гусят уже на 5-е сутки после вакцинации, ревакцинация через 20 дней индуцировала в организме гтгицы значительное увеличение уровня антител в сыворотке крови. . 2.2.3.3. Изучение поствакциналыюго иммуногенеза у гусей в производственных условиях. Результаты серологических исследований проб сывороток крови гусей, полученных из ООО «Катайский гусеводческий комплекс», показали, что в результате двукратной вакцинации гусей родительского стада вирусвакциной ВНИВИП в организме птицы формируется напряженный иммунитет (табл. 4.).

Таблица 4

Результаты серологических исследований проб сывороток крови гусей в ИФА (п=25), Р<0,05

№ и/и Наименования групп Обратная величина среднего титра Число положительных реагирующих проб (TIP), %

1. Сыворотки крови суточных гусят от вакцинированных родителей 305±26 100%

2. Сыворотки крови гусей пред вакцинацией 830±54 100%

3. Сыворотки крови гусей после 1-й вакцинации гусей 572±107 100%

4. Сыворотки от ревакциниро-ванных гусей 1579±151 100%

5. Сыворотки от вакцинированных гусей на пике яйцекладки 2808±216 100%

Средний титр антител на пике яйцекладки составил 2808 (Р<0,05), а у гусят, полученных от вакцинированных родителей, средний титр антител в ИФА составил 305 (Р<0,05). Этот титр обеспечивал защиту гусят от полевого заражения, что подтверждается ранее полученными результатами (Б.Б. Трефилов, 2000).

Апробация разработанной иммуноферментной тест-системы во всех вариантах ее практического применения показала высокую чувствительность и специфичность при обнаружении антител к парвовирусу гусей.

Таким образом, комплекс проведенных исследовательских работ позволил разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения антител к вирусу энтерита в сыворотках крови гусей методом последовательных разведений и методом одного разведения. Результаты применения иммуноферментной тест-системы свидетельствуют о том, что данный экспресс-метод является высокочувствительным и специфичным для обнаружения специфических антител при проведении ретроспективной диагностики и определения уровня поствакцинального иммунитета при вирусном энтерите гусей (парвовирусной инфекции).

3. Выводы

1. Разработана высокочувствительная имму ноферментная тест-система для выявления специфических антител при ретроспективной диагностике парвовирусной инфекции гусей и определении уровня поствакцинального иммунитета при этой болезни.

2. Очищенный антиген ВЭГ, полученный методом молекулярно-ситовой хроматографии на МПС, высокоактивен, специфичен и стабилен при сорбции на полистироловые планшеты для ИФА.

3. Гипериммунная сыворотка крови гусей, полученная путем иммунизации гусят очищенным вирусом энтерита, является высокоактивной и специфичной. Сыворотка стабильна при хранении в лиофилизированном состоянии.

4. Конъюгат к гусей, полученный периодатным методом, активный, специфичный и стабильный при хранении в лиофилизированном состоянии.

5. Установлено, что оптимальными параметрами постановки ИФА тест-системы при ВЭГ являются: сенсибилизирующая доза антигена 5-8 мкг/лунку; адсорбция антигена в 0,01М натрий-фосфатном буфере с содержанием 0,15М КаС1, рН 7,2-7,4; продолжительность инкубации в течение 18 часов при температуре 4°С, а проведение реакции: инкубация исследуемых и контрольных сывороток, а также конъюгата в разведении 1:400 при 37°С в течение 30 минут, соответственно; промывочная буферная система 0,01 М калий-фосфантный буфер, рН 7,2-7,4, содержащая 0,5М №С1 с 0,1% конечной концентрацией детергента твин-20.

6. Разработанная твердофазная имму ноферментная тест-система для ретроспективной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей является высокочувствительным методом по сравнению с серонейтрализацией и позволяет обнаружить антитела в исследуемых пробах сывороток крови в течение 3-5 часов. Установлена высокая корреляция в результатах ИФА и РН.

7. Изучена динамика иммуногенеза у гусят й гусей родительского стада против ВЭГ с применением ИФА и РН в экспериментальных и производственных условиях.

4. Практические предложения

На основании проведенных исследований разработаны «Методические, указания для лабораторной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей методом иммуноферментного анализа», предназначенные для ветврачей-вирусологов региональных, областных, зональных и специализированных лабораторий и научно-исследовательских учреждении ветеринарного и биологического профиля.

5. Список научных работ, опубликовапных по материалам диссертации

1. Трефилов Б.Б. Изучение культуральных свойств вируса энтерита гусей / Трефилов Б.Б., Маслов Д.В., Кривенцев К.А. // Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве: Материалы международной юбилейной научно-практической конференции (14-16 сентября, 2004, г. Санкт-Петербург-Ломоносов) / ВНИВИП.-СПб.,2004.-С. 106-107.

2. Трефилов Б.Б. Методические указания для лабораторной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей методом иммуноферментного анализа /Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Маслов Д.В. - СПб., 2005.-С. 12.

3. Маслов Д.В. Диагностика вирусного энтерита гусей методом иммуноферментного анализа / Д.В. Маслов, Н.В. Никитина, Б.Б. Трефилов// Новые фармакологические средства в ветеринарии: Материалы XVIII Международной межвузовской научно-практической конференции / СПбГАВМ.-СПб.,2006.-С.57.

Подписано в печать 12.05. 006. Формат бумаги 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 3774. Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ. 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр.26

Оглавление диссертации Маслов, Дмитрий Владимирович :: 2006 :: Санкт-Петербург

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарной вирусологии.

2.2 Краткие исторические данные, распространение вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей и ущерб, причиняемый этим заболеванием.

2.3 Характеристика семейства парвовирусов.

2.4 Эпизоотологические данные болезни.

2.5 Клинико-патоморфологические признаки.

2.6 Диагностика заболевания.

2.7 Профилактика и меры борьбы.

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1 Материалы и методы.

3.1.1 Очистка вируссодержащей жидкости методом гельхроматографии на макропористом стекле

3.1.2 Выделение иммуноглобулинов.

3.1.3 Получение иммунопероксидазного конъюгата.

3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.2.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа.

3.2.1.1 Получение очищенного вируса энтерита гусей.

Я 3.2.1.2 Получение положительной сыворотки крови к вирусу энтерита гусей.

3.2.1.3 Получение отрицательной сыворотки крови гусей.

3.2.1.4 Получение антивидового иммунопероксидазного конъюгата.

3.2.2 Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к парвовирусу гусей.

3.2.2.1 Определение сенсибилизирующих доз антигена.

3.2.2.2 Определение рН сорбирующего буфера.

3.2.2.3 Определение времени и температуры сорбции парвовирусного антигена.

3.2.2.4 Определение времени и температуры инкубации сывороток с адсорбированным парвовирусным антигеном.

3.2.2.5 Определение специфичности иммуноферментного анализа.

3.2.2.6 Определение диагностического титра сыворотки в ИФА.

3.2.2.7 Количественная оценка титра антител к вирусу энтерита гусей методом одного разведения.

3.2.3 Практическое использование разработанной тест системы на основе непрямого метода ИФА.

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

5 ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Маслов, Дмитрий Владимирович, автореферат

Гусеводство, как любая отрасль птицеводства является резервом ускоренного увеличения производства мяса. Кроме того, развитие его оправдано тем, что гусиное мясо, отличаясь по вкусовым качествам от мяса других видов птиц, расширяет ассортимент мясных продуктов. Мясо молодых, 2-месячного возраста гусят-бройлеров известно, как ценный диетический продукт питания, а гусиная печень, получаемая при откорме специальных пород гусей (вишнитес, рейнских и др.), относится к деликатесам. Гусиный жир используется в парфюмерной и фармацевтической промышленности, а пух и перо являются ценным сырьем для легкой промышленности.

Актуальность проблемы. Серьезным препятствием на пути развития промышленного гусеводства наряду с факторами нарушения технологического режима выращивания являются различные инфекционные болезни молодняка, среди которых особое место занимает вирусный энтерит (парвовирусная инфекция) гусей. Это заболевание до настоящего времени имеет широкое распространение среди молодняка 1-30-суточного возраста, протекает остро и характеризуется высокой смертностью, достигая до 90-100% (В.В. Малушко, 1982; JI.M. Контримавичус, 1983; Б.Б.Трефилов, 2000; А. Белецкая, 2003).

Цель и задачи работы. Учитывая опасность ВЭГ для гусеводства и отсутствие экспресс метода диагностики заболевания, целью настоящих исследований явилась разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики ВЭГ, основанной ■ на выявлении специфических антител к вирусу энтерита гусей.

В соответствии с поставленной целью в задачи наших исследований входило:

1. Получить высокоочищенный антиген вируса энтерита и вирусспецифическую гипериммунную сыворотку гусей;

2. Получить антивидовой иммунопероксидазный конъюгат специфичный к IgG гусей;

3. Разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения антител к вирусу энтерита гусей в сыворотке крови гусей методом последовательных разведений и методом одного разведения;

4. Изучить диагностическую ценность иммуноферментного анализа (ИФА) в сравнении с реакцией нейтрализации при диагностике ВЭГ;

5. Испытать иммуноферментную тест-систему при изучении иммуногенеза у вакцинированных против ВЭГ;

6. Разработать Методические указания для лабораторной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна. Впервые в РФ для серологической диагностики ВЭГ разработан непрямой вариант ИФА с использованием отечественных препаратов и реактивов. Выделен IgG из сыворотки крови интактных гусей, получен конъюгат иммунопероксидазный антивидовой гусиный. Дана сравнительная оценка непрямого метода ИФА с реакцией нейтрализации при ВЭГ. Изучена кинетика формирования поствакцинального иммунитета у гусят и гусей родительского стада против вирусного энтерита с применением ИФА в экспериментальных и производственных условиях. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител в сыворотках крови гусей к вирусу энтерита.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Методических советах отдела вирусологии и ОБП ВНИВИП (2003-2005гг.), на Международной Юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике в промышленном птицеводстве» (г. Санкт-Петербург-Ломоносов, 14-16 сентября 2004) и на 18-й Международной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии».

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 3 печатных работах.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 254 источника, из которых 143 зарубежных.

Заключение диссертационного исследования на тему "Серологическая диагностика вирусного энтерита гусей методом иммуноферментного анализа"

5 Выводы

1. Разработана высокочувствительная иммуноферментная тест-система для выявления специфических антител при ретроспективной диагностике парвовирусной инфекции гусей и определении уровня поствакцинального иммунитета при этой болезни.

4. Конъюгат к IgG гусей, полученный периодатным методом, активный, специфичный и стабильный при хранении в лиофилизированном состоянии. ,

5. Установлено, что оптимальными параметрами постановки ИФА тест-системы при ВЭГ являются: сенсибилизирующая доза антигена 5-8 мкг/лунку; адсорбция антигена в 0,01М натрий-фосфатном буфере с содержанием 0,15М NaCI, рН 7,2-7,4; продолжительность инкубации в течение 18 часов при температуре 4°С, а проведение реакции: инкубация исследуемых и контрольных сывороток, а также конъюгата в разведении 1:400 при 37°С в течение 30 минут, соответственно; промывочная буферная система 0,01М калий-фосфантный буфер, рН 7,2-7,4, содержащая 0,5М NaCI с 0,1% конечной концентрацией детергента твин-20.

6. Разработанная твердофазная иммуноферментная тест-система для ретроспективной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей является высокочувствительным методом по сравнению с серонейтрализацией и позволяет обнаружить антитела в исследуемых пробах сывороток крови в течение 3-5 часов. Установлена высокая корреляция в результатах ИФА и РН.

7. Изучена динамика иммуногенеза у гусят и гусей родительского стада против ВЭГ с применением ИФА и РН в экспериментальных и производственных условиях.

Практические предложения

На основании проведенных исследований разработаны «Методические указания для лабораторной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей методом иммуноферментного анализа», предназначенные для ветврачей-вирусологов региональных, областных, зональных и специализированных лабораторий и научно-исследовательских учреждений ветеринарного и биологического профиля.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2006 года, Маслов, Дмитрий Владимирович

1. Акулов А.В. Патоморфологические изменения у гусят при вирусном энтерите / Акулов А.В., Контримавичус JI.M. // Тр. ВИЭВ.- 1975.- Т.43.-С.384-392.

2. Андреева З.М. Ускоренный иммуноферментный анализ / З.М. Андреева и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-1985.-№4.-С.60-63.

3. Ашмарин И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов / Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Л.: Изд-во ЛГУ, 1975.-78 с.

4. Байдевлятов А.Ф. Заболевание гусей невыясненной этиологии / Байдевлятов А.Ф. // Ветеринария.- 1966.-№ 4.- С.42-44.

5. Белецкая А. Вирусный энтерит под контроль / Белецкая А. // Птицеводство.- 2003.- №8.- С. 17.

6. Бондаренко А.Ф. Вирусный энтерит на Кубани / Бондаренко А.Ф., Капитанаки М.В. // Сб. науч. тр. СКЗНИВИ.- Краснодар, 1975.- С.132-135.

7. Бондаренко А.Ф. Изучение массовых заболеваний гусят на гусеводческих фермах Краснодарского края / Бондаренко А.Ф., Капитанаки М.В., Сажнев В.Н. // Сб. науч. тр. СКЗНИВИ.- Краснодар, 1975.- С.135-138.

8. Бондаренко А.Ф. Течение смешанной инфекции у гусят / Бондаренко А.Ф., Капитанаки М.В. // Ветеринария.- 1975.- №2.-С. 63-64.

9. Бондаренко А.Ф. Об этиологии вирусного энтерита гусят / Бондаренко А.Ф. // Болезни птиц : тр. СКЗНИВИ.- 1977. -С.67-69.

10. Бондаренко А.Ф. Усовершенствование методов диагностики и профилактики вирусного энтерита гусей : автореф. дис. . канд. вет. наук / Бондаренко А.Ф. -Краснодар, 1982.- 18 с.

11. Вербов В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа / Вербов В.Н. // Твердофазный иммуноферментный анализ : сб. науч. тр. /

12. Ленингр. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.-Л., 1988.-Т.64.-С.З-27.

13. Вирусные болезни животных: учеб. пособие / Сюрин В.Н. и др..-Москва : ВНИТИБП, 1998.-С. 17-20.

14. Вирусный энтерит и меры борьбы с ним / Малушко В.В., Иващенко

15. B.Г., Щеглова И.В., Трефилов Б.Б. // Актуальные вопросы вет. вирусологии : тез. докл. 5 Всерос. конф. 1980.-С.32.

16. Георгиу X. Оценка серологических реакций при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец / Георгиу X. // Вестник ветеринарии.-1998.-№8(2).1. C.82-85.

17. Держи Д. Культуральные свойства, антигенное родство и морфология различных штаммов вируса энтерита гусей / Держи Д., Контримавичус Л.М., Надточей Г.А. // Доклады ВАСХНИЛ.- 1975.-№ 7.-С.36-37.

18. Джавадов Э.Д. Иммуноферментный метод диагностики болезни Гамборо: дис. . канд. вет. наук / Джавадов Э.Д.-Л., 1988.-126 с.

19. Иващенко В.Г. Усовершенствование диагностики, мер борьбы и профилактики вирусного энтерита гусей : автореф. дис. . канд. вет. наук /Иващенко В.Г.-Л., 1986.-25 с.

20. Изучение массового заболевания гусят невыясненной этиологии и опыт его профилактики (по материалам 1963-1965гг.) / Контримавичус Л.М., Семилит И.Л., Клейхменева Л.Н., Карпов Г.М. // Тр. Горьковской НИВС.- 1968.-№3.-C.33-39.

21. Капитанаки М.В. Эпизоотия вирусного энтерита на Кубани / Капитанаки М.В., Чечула Л.Д. // Бюл. НТИ / Краснодарская НИВС.-1970.- Вып.2.- С.82-85.

22. Капитанаки М.В. К вопросу этиологии энзоотического энтеро-кутикулита гусят / Капитанаки М.В., Бондаренко А.Ф., Чечула Л.Д. // Бюл. НТИ / Краснодарская НИВС.- 1970.- Вып.2.- С.79-82.

23. Капитанаки М.В. Вирусный энтерит гусят / Капитанаки М.В., Бондаренко А.Ф., Чечула Л.Д. // Ветеринария.- 1971.-№7.-С. 58-59.

24. Капитанаки М.В. Лечение гусят при вирусном гастроэнтерите / Капитанаки М.В., Чечула Л.Д., Манохин А.В. // Птицеводство,-1971.-№12.- С.46-47.

25. Капитанаки М.В. Опыт применения лечебно-профилактических средств при инфекционном гастроэнтерите гусей / Капитанаки М.В., Чечула Л.Д., Манохин А.В. // Науч. тр. / Краснодарская НИВС.- 1972.-Т.5.- С.28-27.

26. Капитанаки М.В. О вирусном гастроэнтерите гусят / Капитанаки М.В., Чечула Л.Д. // Сб. тр. / ВНИВИП.- 1976.- Вып.11.- С. 231-236.

27. Колабская Л.С. Методические указания по определению количественного содержания классов иммуноглобулинов сыворотки крови птиц с помощью модифицированного микротеста / Колабская Л.С., Шорникова Л.Л. Л., 1984.

28. Кондаков М.П. Патологоанатомические изменения у гусят при вирусном энтерите / Кондаков М.П. // Сб. науч. тр. Дон. СХИ.-1973.- Т.8, вып. 1.- С. 139-140.

29. Кондаков М.П. Патоморфологические изменения у гусят при вирусном энтерите / Кондаков М.П., Фадин B.C. // Тр. 5 Всесоюз. науч. метод, конф. по патолог, анатомии животных (Тбилиси, 1972 г.) / МВА.-М., 1973.-С.37-40.

30. Кондаков М.П. Морфологическая реакция у гусят на введение крови переболевших вирусным энтеритом гусей / Кондаков М.П., Фадин B.C. // Материалы 6 Всесоюз. конф. по патолог, анатомии животных.- Тарту, 1977.- Т. 2.- С.158-160.

31. Контримавичус JI.M. Предварительные данные о культивировании вируса энтерита гусят в культуре ткани / Контримавичус Л.М., Майборода А.Д. // Бюл. ВИЭВ.- 1968.- Вып. 4.-С.11-12.

32. Контримавичус Л.М. Инфекционный энтерит гусят / Контримавичус Л.М. // Тр. ВИЭВ.- М., 1968. -Т.35.- С.292-301.

33. Контримавичус Л.М. Инфекционный энтерит гусят / Контримавичус Л.М. // Эпизоотология. М.: Колос, 1969,- С. 355-356.

34. Контримавичус Л.М. Некоторые биологические свойства вируса энтерита гусят / Контримавичус Л.М. // Бюл. ВИЭВ.- 1970.- Вып.7.-С.32-35.

35. Контримавичус Л.М. К эпизоотологии вируса энтерита гусят / Контримавичус Л.М. // Бюл. ВИЭВ.- 1970.- Вып. 7.-С.36-38.

36. Контримавичус Л.М. Вирусный энтерит гусей (Enteritis virosa anserculorum) / Контримавичус Л.М. // Болезни птиц.-М.: Колос,1971.-С.77-82.

37. Контримавичус JI.M. Некоторые вопросы инфекционной патологии гусят / Контримавичус Л.М. // Ветеринария.- 1972.-№8.-С.66-68.

38. Контримавичус Л.М. Микрофлора кишечника гусят, больных вирусным энтеритом // Контримавичус Л.М., Подкопаев Б., Туров // Передовой науч.-производ. опыт в птицеводстве : экспресс-инф.- 1972.-№11.-С.37-38.

39. Контримавичус Л.М. Распространение Enteritis virosa anserculorum у гусят и ГЭ / Контримавичус Л.М., Шуляк А. // Передовой науч.-производ. отчет в птицеводстве : экспресс-информ.- 1973.-№5.-С.28-30.

40. Контримавичус Л.М. К лабораторной диагностике вирусного энтерита гусят / Контримавичус Л.М. // Ветеринария.- 1974.- № 8. -С. 108-110.

41. Контримавичус Л.М. Вирусный энтерит гусей и меры борьбы с ним / Контримавичус Л.М. // Птицеводство.- 1974.- №6,- С.45-46.

42. Контримавичус Л.М. Сравнительная характеристика штаммов вируса, выделенных от больных энтеритом гусят / Контримавичус Л.М. // Тр. ВИЭВ.- 1975.-Т.43.-С.212-224.

43. Контримавичус Л.М. Оценка активности гипериммунных сывороток против вируса энтерита гусей / Контримавичус Л.М. // Ветеринария.-1975.-№1.-С.37-38.

44. Контримавичус Л.М. Стандартизация сывороток против вирусного энтерита гусей / Контримавичус Л.М., Кишари Я. // Ветеринария.- 1976.-№8.-С.50-51.

45. Контримавичус Л.М. Основные дифференцирующие признаки вирусного энтерита гусей / Контримавичус Л.М. // Ветеринария.- 1976.-№3.-С.64-66.

46. Контримавичус JI.M. Вирусный энтерит гусей : дис. . д-ра вет. наук / Контримавичус JI.M. -1978.- 320 с.

47. Контримавичус JI.M. Эпизоотологические и клинико-анатомические вирусного энтерита гусят / Контримавичус Л.М., Макогон В.Ф., Навроцкий В.В. // Ветеринария.- 1980.-№7.-С.34.

48. Контримавичус Л.М. Усовершенствование диагностики вирусного энтерита гусей / Контримавичус Л.М., Суворов A.M. // Ветеринария.-1982.-№11.-С.67-68.

49. Корнеева В.И. Лабораторная диагностика вирусного энтерита на гусиных эмбрионах / Корнеева В.И., Фадин B.C., Куриленко А.В. // Материалы I Сибирской зональной науч.-произв. конф.- Омск, 1973.-С.27-30.

50. Котляр П.Ю. Иммуноферментный метод диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц : автореф. дис. .канд. вет. наук / Котляр П.Ю. -СПб., 1995.-18 с.

51. Кравченко Т.М. К этиологии массового заболевания гусят /Кравченко Т.М., Липская В.В. //Ветеринария.- 1966.-№8.-С.88-90.

52. Крылов М.В. Инфекционные и инвазионные болезни водоплавающих птиц / Крылов М.В., Терюханов А.Б. Л. : Колос, 1975.-С.14-18.

53. Макогон В.Ф. Массовое заболевание гусят энтеритом / Макогон В.Ф., Болдырев Д.Н., Поворознюк В.Ф. // Ветеринария.- 1974.-№8.-С.55-56.

54. Макогон В.Ф. Захворювання гусенят енеритом у господарствах Кримсько1 областш / Макогон В.Ф. // Ветеринария.- 1975.- Вип.40.-С.58-61.

55. Макогон В.Ф. Профилактика вирусного энтерита / Макогон В.Ф. // Птицеводство.- 1979.-№3.-С.42-43.

56. Малушко В.В. Изучение этиологии, разработка мер борьбы с малоизвестными вирусными болезнями водоплавающей птицы / Малушко В.В. // Сб. рефератов НИР и ОКР.-1976.-№3.-С.ЗО.

57. Малушко В.В. Вирусный энтерит гусей / Малушко В.В. // Справочник вет. врача птицеводческих предприятий.- М. : Колос, 1982.-С.103-105.

58. Метод ИФА для диагностики вирусного энтерита гусей / Фадель М., Надточей Г.А., Контримавичус JI.M., Суворов А.В. // Ветеринария,-1989.-№7.-С.36-39.

59. Методические рекомендации по культивированию первичных культур клеток и субкультур / ВАСХНИЛ, ВИЭВ.- М., 1985.

60. Монашон Т. Изучение, проведенное научно-исследовательской станцией «Артигер» по улучшению выращивания гусей / Монашон Т. // Тр. XIII Всемир. конгресса по птицеводству.- 1966.

61. Набор компонентов для выявления антител к вирусу синдрома снижения яйценосткости-76 (ССЯ-76) иммуноферментным методом / Никитина Н.В., Дубовой А.С. // : ТУ 9388 016 00495674-2003.-С.18.

62. Набор компонентов для диагностики реовирусного теносиновита кур иммуноферментным методом / Никитина Н.В., Трефилов Б.Б.// : ТУ 9388-009-00495674-2001. Регистр.: 23.04.01.-С. 18 .

63. Оценка результатов прямого твердофазного иммуноферментного метода для определения антигенов / Г.В. Резапкин и др. // Вопросы вирусол.-1986.-№5.-С.573-577.

64. Паникар И.И. Заболевание гусят с признаками энцефаломиэлита / Паникар И.И., Белицкий Б.И. // Вюник сшьстко-господ. науку.- 1971.-№3 .-С. 105-107.

65. Петелина Е.А. Морфологические изменения в энтероцитах тонкого отдела кишечника гусят при вирусном энтерите / Петелина Е.А. // Бюл. ВИЭВ.-М., 1983.- Вып. 50.-С.58-60.

66. Петелина Е.А. Биологические и физико-химические свойства вируса энтерита гусей : автореф. дис. . канд. вет. наук / Петелина Е.А. М., 1984.

67. Разработка тест-системы для иммуноферментного метода диагностики аденовирусной инфекции птиц / А.С. Дубовой и др. // Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями сельскохозяйственных птиц: сб. науч. тр. / ВНИВИП.-Л., 1988.

68. Результаты изучения инфекционного энтерита гусят / Контримавичус Л.М., Семилит И.Л., Клейхменева Л.Н., Карпов Г.М., Козлова Е.И., Кудрявцев Ф.С. // Ветеринария.- 1966.-№12.-С.34-36.

69. Ройт А. Иммунология: / Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д.-Москва : Мир, 2000.-С.592.

70. Рудянова В.Г. Вирусный энтерит гусят в Новосибирской области / Рудянова В.Г. // Профилактика болезней с.-х. животных / ВАСХНИЛ. Сиб. отд.- 1976.- Вып. 1.-С.83-86.

71. Сергеев В.Д. Методические рекомендации по очистке и концентрированию аденовирусов птиц /Сергеев В.Д., Рождественский И.К. -Л., 1988.-30 с.

72. Сергеев В.Д. Иммуноферментный метод в диагностике болезней птиц / Сергеев В.Д., Никитина Н.В., Мухамедшина Л.Р. // Тр. ВНИВИП.-Л., 1989.-С.75-82.

73. Сергеев В.Д. Получение очищенного и специфического антигена вируса инфекционного бронхита кур для иммуноферментного анализа / Сергеев В.Д., Токарских В.В. // Вирусные болезни с.-х. животных : тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф.-Владимир, 1995.

74. Способ определения антител к антигену реовирусного теносиновита кур / Никитина Н.В., Коровин Р.Н., Трефилов Б.Б., Явдошак Л.И. // : Патент № 2192012. Регистр.: 3.07.2000.

75. Старкова Т.В. Оценка различных методов инструментального учета результатов ИФА с антигеном трихинелл / Старкова Т.В., Полетаева О.Г. // Материалы докл. Седьмой науч. конф. по трихинеллезу человека и животных.- М., 1996.-С.93-95.

76. Суворов A.M. Антигенные свойства парвовируса гусей / Суворов A.M. //Бюл. ВИЭВ.-М., 1982,-Вып. 48.-С.16-18.

77. Суворов A.M. Антигенные и иммуногенные свойства аттенуированных штаммов вируса энтерита (парвовируса) гусей : автореф. дис. . канд. вет. наук / Суворов A.M. М., 1986.- 22 с.

78. Сюрин В.Н. Руководство по ветеринарной вирусологии / Сюрин В.Н. -М.: Колос, 1966.-С.141-185, 206, 207.

79. Теория и практика иммуноферментного анализа / Егоров A.M. и др..-М.: Высш. шк., 1991.-288 с.

80. Терентьев П.В. Практикум по биометрии / Терентьев П.В., Ростова Н.С.- Л., 1977.-151 с.

81. Трефилов Б.Б. Разработка средств профилактики вирусного энтерита гусей / Трефилов Б.Б. // Ветеринария. -1990.-№6.-С.6.

82. Трефилов Б.Б. Производственные испытания вирусвакцины ВНИВИП против вирусного энтерита гусей / Трефилов Б.Б. // Система мероприятий обеспечения эпизоотического благополучия птицеводческих предприятий : сб. науч. тр.- СПб., 1993.-С.41-49.

83. Трефилов Б.Б. Эпизоотологические особенности вирусного энтерита гусей / Б.Б. Трефилов // Ветеринарная профилактика в промышленном птицеводстве : сб. науч. тр. / СПб-Ломоносов, 1996.-С.48-56.

84. Трефилов Б.Б. Проблема вирусного энтерита гусей в промышленном птицеводстве / Трефилов Б.Б. // Материалы науч.-производ. конф., посвящ.190.летию высш. вет. образования в России и 100-летию вет. науки.- СПб., 1998. -Т.2.- С.99.

85. Фадин B.C. Применение сыворотки от гусей-реконвалесцентов при инфекционном энтерите гусят / Фадин B.C., Дедкова JI. // Земля Сибирская Дальневосточная.- 1970.-№7.-С.35.

86. Фадин B.C. Цитратная кровь гусей-реконвалесцентов в профилактике вирусного энтерита / Фадин B.C., Романовская А., Вронская М. // Птицеводство.- 1971.-№5.-С.45.

87. Фадин В. Вирусный энтерит гусят / Фадин B.C. // Земля Сибирская Дальневосточная.- 1972.-№5.-С.32.

88. Фадин B.C. Некоторые данные по эпизоотологии вирусного энтерита гусят / Фадин B.C. // Итоги науч. исследований и рекомендаций по профилактике болезней птиц в хозяйствах промышленного типа : тез. докл. (Куйбышев, 12-15 ноября 1973 г.).

89. Фадин B.C. Экспериментальное заражение гусят вирусным энтеритом / Фадин B.C., Погуляева Л.В., Жданова М.Е. // Профилактика заразных и незаразных заболеваний животных в Сибири.- 1973.-С.122-125.

90. Фадин B.C. Профилактика вирусного энтерита цитратной кровью / Фадин B.C., Мельников Н.М. // Науч. тр. Омского вет. ин-та.- 1973.-Т.29, вып. 3.-С.27-30.

91. Фадин B.C. Методика диагностики и профилактики вирусного энтерита гусят / Фадин B.C. // Вет. профилактика болезней с.-х. животных в Сибири. Новосибирск, 1973 .-С. 157-161.

92. Фадин B.C. Эпизоотология вирусного энтерита гусят / Фадин B.C., Лапин Б.И. // Земля Сибирская Дальневосточная.- 1974.-№10. -С.36-37.

93. Фадин B.C. Производственное испытание цитратной крови гусей -реконвалесцентов в профилактике вирусного заболевания гусят / Фадин B.C. // Сб. науч. работ СибНИВИ.- 1975.-Вып. 22. -С.168-175.

94. Фадин B.C. Вопросы эпизоотологии и диагностики вирусного заболевания гусят / Фадин B.C. // Сб. науч. работ СибНИВИ.- 1975.-Вып. 22.-С.160-167.

95. Фадин B.C. Вирусоносительство при вирусном энтерите гусей / Фадин B.C., Куриленко А.В., Корнеева В.И. // Сб. науч. работ СибНИВИ.-1977.- Вып. 29.-С.61-62.

96. Фадин B.C. Материалы по эпизоотологии вирусного энтерита / Фадин B.C. // Науч. основы вет.-профилакт. мероприятий в промышленном производстве : тез. докл. Всесоюз. конф. (3-6 окт. 1977 г.).-Кишинев, 1977.

97. Фадин B.C. Экспериментальный вирусный энтерит гусят / Фадин B.C. // Сб. науч. работ СибНИВИ.- 1979.-Вып. 34.-С. 134-137.

98. Фадин B.C. Экономический ущерб при вирусном энтерите гусей и экономическая эффективность серопрофилактики / Фадин B.C. // Сб. науч. работ СибНИВИ.- 1979.- Вып.34.-С.138-141.

99. Фадин B.C. Профилактика вирусного энтерита гусят / Фадин B.C. // Актуальные вопросы вирусологии : тез. докл. 5 Всесоюз. конф. Казань, 1980.-С.31-32.

100. Чард Т. Радиоиммунологические методы / Чард Т. М. : Мир, 1981. — С.246 .

101. Чекшиев В.М. Влияние гипериммунизации гусей вируссодержащей аллантоисной жидкостью на белковый спектр крови / Чекшиев В.М., Фадин B.C. // Сб. науч. работ / СибНИВИ 1976.- Вып. 26.-С.99-104.

102. Чечула Л.Д. Испытание цитратной крови переболевших гусят и гусынь, желудочного сока с фуразолидоном и уросала при вирусном гастроэнтерите / Чечула Л.Д., Капитанаки М.В. // Сельск. зори-1971.-№8.-С.53.

103. Шлапаченко А. Профилактика энтерита гусят / Шлапаченко А., Гострик В., Грабовский П. // Птицеводство.- 1981.-№ 6.-С.34.

104. Щеглова И.В. Чувствительность возбудителя к некоторым химиотерапевтическим препаратам / Щеглова И.В., Малушко В.В. // Передовой науч.-производ. опыт в птицеводстве : экспресс-информ.- 1975.-№ 4.-С.26.

105. Ahmed A.A.S. Wirusinfectionen bei Gansen / Ahmed A.A.S. // Berlin und Munchen tierart. Wochenschr.- 1973.-Jg. 86, H.2.-S.28-32.

106. Aktiv immunizalasi kiserletek a kisliban Derzsy- fele befegsege (un libainfluenza) ellen. 1. Csokkent viry lenciajn virustorzs vizgalata / Kisary J., Derzsy D., Kontrimavichus L.M., Bezsilla E. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1977.-T.32, №12.- S.785-787.

107. Anawis M.A. Stabilized enzyme conjugate composition / Anawis M.A., Lindberg R.E. // Patent №EP0152847.-1985-08-28.

108. Anderson M. J. The human parvovirus / Anderson M. J., Pattison J. R. // Arch. Virol.- 1984.-Vol.82, №3/4.-P. 137-148.

109. Application of the immunoperoxidase technique for the detection of Derzsy's desease virus antigen in cell culture and goslings / Roszkowski J., Gardzinski P., Kozaczynski W., Bartoszoze M. // Avian Pathol.- 1982.- Vol.11, №4.-P. 571-578.

110. Ashihara Y. Method of measuring biological ligand by utilising amylase / Ashihara Y., Kasahara Y. // Patent №EP0152305.-1985-08-21.

111. Autonomous parvovirus Lu3 encapsidates equal amounts of plus minus DNA strands / Bates R. C., Snyder С. E., Banerjee P.T. et al. // J. Virol.- 1984.-Vol. 49, №2.-P. 319-324.

112. Bergmann V. Pathologie und elektroneumikroskopischer virusnachweis im Gevebe bei der Derzsyschen Krankheit (Parvovirus Infection) der Gossel /Bergmann V. //Arch, exper. Vet. Med.- 1987.-Jg.41, H.2.-S. 212-221.

113. Bernath S. Visgalator libapipek kozott 1969 ben jelentrezett megbetegedes koroktananak tisztazasara. 1. Fertozesi kiserletek / Bernath S., Szalai F. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1970.- T.25, № 10.- S.531-536.

114. Bernath S. A busa Fabrici eltavolitasanak hatasa kislibar virus okoztra veromleses bel-es vesegyalladas ban megnyilvenullo betegsegenek korfe.lodeseben / Bernath S., Pethes G. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1971.- T.26, №7.- S.366-367.

115. Blake D.A. Specific biding assay based on enzyme cascade amplification / Blake D.A., Boguslaski R.C. // Patent №EP0144744.-1985-06-19.

116. Brodbeck H. Stabilized peroxidase compositions / Brodbeck H., Gallati H. // Patent №US4448882.-1984-05-15.

117. Brot N. Novel reductase / Brot N., Weissbach H. // Patent №US4374928.-1983-02-22.

118. Byrd J.W. Evaluation of the enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Brucella abortus antibodies / J.W. Byrd, F.C. Heck, R.J. Hidalgo // Am J. Vet. Res.-1979.-40(6).-896-898.

119. Carlies G. Enzymo-immunoassaiss / Carlies G., Bont D., Capron A. // Bulletin de e'Institute Pasteur.-1981.-T.79.-P.317-333, 343-346.

120. Carlsson H.E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for titration of antibodies against Brucella abortus and Yersinia enterocolitica / H.E. Carlsson, B. Hurvell, A.A. Lindberg // Acta Pathol Microbiol Scand.-1976.-3(6).- P. 168-176.

121. Carter B. J. Parvovirus transcription / Carter B.J., Laughlin C.A.,

122. Marcus-Secura C.J. // Parvoviruses. -N. Y.; London, 1984.-P.153-207.i

123. Carter B.J. Adeno-associated virus defectiveness and the nature of the adenovirus helper function / Carter B.J., Laughlin C.A. // Parvoviruses. N. Y.; London, 1984.- P.67-128.

124. Characteristics and taxonomy of Parvoviridae / Siegl G., Bates R.C., Berns К. I. et al. // Intervirology.- 1985.- Vol.23, №2.- P.61-73.

125. Cleef S.A.M. Sen ernstige acta verlopende virusziekte bij ganzekuikens, gepaard gaande met grote sterfte / Cleef S.A.M., Van Miltenburg J. Th. // Tijdschr. diergeneeskunde.- 1966.- Bd.91, H.6.- S.372-382.

126. Coudert M. Symptomes et lesions de la maladie a virus de l'oison / Coudert M. // S'aviculture.- Rec. Med. Vet.-1973.- T.197, №12.- P.15-16.

127. Crighton G.W. A disease of goslings new to Britain / Crighton G.W., Wilkinson G.T. // Vet. Rec.- 1970.-Vol.87, №2.- P.58-59.

128. CsatariM. A libainfluenzajarvanyos elofordulasa hazankban / Csatari M. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1965.- T.20, №4.- S.148-151.

129. Csatari M. A libainfluenza korokzoja hak bakteriologiai jellemzoi / Csatari M., Nyiredy I. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1966.- T.21, № 4.- S. 16-18.

130. Csontos L. Etiological studies on gosling influenza. Isolation of virus / Csontos L., M-K. Csatari M. // Acta Vet. Acad. Sci. Hung.- 1967.-T.17, №1.-P.107-113.

131. Csontos L. Experimental infections with the isolated virus / Csontos L., Csatari M-K.M. // Acta Vet. Acad. Sci. Hung.- 1967.- T.17, № l.-P.l 15-120.

132. Csontos L. Labak influenzajanak kozoktani vizsgalata. 1. Virusilalas. 2. Fertozesi kiserletek az izolalt virussal / Csontos L., M-K. Csatari M. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1967.- T.22, №1.- P. 9-14.

133. Dawson E. Stabilization of peroxidase / Dawson E., Homan J. // Patent №US43317611982-05-25.

134. Derzsy D. Vizsgalatok az un libainfluenza koroktanarol (Elozetes kozlemeny) / Derzsy D., Szep I., Szoke F. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1966.-T.21, №9.- S.388-389.

135. Derzsy D. A viral desiease of goslings. 1. Epidemiological, clinical, pathological and aetiological studies / Derzsy D. // Acta Vet. Acad. Sci. Hung.-1967.- T. 17, № 4.- P.443-445.

136. Derzsy D. Napirenden: a libainfluenza 11 Derzsy D. // Magyar Nezogazdasan.- 1968.- Vol.23, №19.-P.16-17.

137. Derzsy D. Az un libainfluenza egges jarvanytani kerdesei es a vedekezes lehetosegei / Derzsy D., Meszaros J. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1969.-№10.-S.537-541.

138. Derzsy D. A viral disease of goslings / Derzsy D. // Jear book of the Vet. Med. Res. Inst. Hung. Res. Inst. Hung. Ac. of Sci. (1964-1969).-1970.- Vol.11.-P.79-88.

139. Derzsy D. A kislibak virusos betegsogei / Derzsy D. // Barom Baromfiipar.-1971.-Hg.18, №11.-S.513-520.

140. Derzsy D. A viziszarnyasok fertozo betegsegei elleni vedekezes immunologiai kerdesei / Derzsy D., Szedo M. // Magyar Allatorv. Lapja.-1973.- T.28, №8.- S. 423-430.

141. Derzsy D. Aetiologie und Bexampfung der Ganseinfluenza / Derzsy D. // Monatsch vet. med.- 1973.-Hg. 28, №24.- S. 956.

142. Derzsy D. Eine virusbedingte Erkrankung der Gansekuken / Derzsy D. // IV. Intern. Kongress der W.V.P.A. (Beograd, 15-17 IX 1969).- S.423-428.

143. Derzsy D. Introductory Report / Derzsy D. // Goose virus work meeting (Febr. 20-22). Budapest, 1973.

144. Detection of antibodies against goose parvovirus by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / Kwang, M.J., Tsai H.J., Lu Y.S. et al. // J. Chin. Soc. Vet. Sci.- 1987.- Vol.13, № 1.- P. 17-23.

145. Detection of antibodies against goose parvovirus by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / Kwang, M.J., Tsai H.J., Lu Y.S. et al. // Vet. Bull.- 1988,-Vol.58, №5.-P. 334.

146. Doman I. Fiatal libak ismeretlen oktanu belgyulladasa / Doman I. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1970.- T.25, №10.- S.529-531.

147. Dulbecco R. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses / Dulbecco R., Vogt M. // J. Exp. Med.- 1954.-Vol. 99, №2.-S. 167-182.

148. Dvorak В. Infekcni hepatitida housat (Derszyno choroda) diagnostica, prevence a profylaxe / Dvorak В., Dvorakova D. // Veterinarstvi.- 1980.- T.30, № 8.-S.365-366.

149. Eine Viruskrankheit bei Gansekiiken (virushepatitis der Ganse, Ganse-hepafitis) / Fenske G., Kiihne L. Mienhart H., Wilhelm A. // Monatsch. Veter. Med.- 1975.- Bd.30, H.5.- S.192-196.

150. Electron microscopic comparison of the sequenses of single-stranded genomes of mammalian parvoviruses by heteroduplex mapping / Banerjee P. Т., Olson W. H., Allison D. P. et al. // J. Mol. Biol.- 1983.-Vol.166, №3.-P.257-272.

151. Engvall E. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) a anlitative assay of immunoglobulin G / Engvall E., Perlmann P. // Immunochemistry.-1971.-Vol.89.-P.871-879.

152. Equine parvovirus: unitial isolation and partial characterization / Wong F. C., Sperman J. G. Smolenski M. A. et al. // Can. J. Сотр. Med.- 1985.-Vol.49, №l.-P.50-53.

153. Etiologie de la maladie a virus de l'oison / Dannacher G., Coudert M., Fedida M., Peillon M., Fonillett X. // Rec. Med. Vet.- 1972.-T.148, №12.-P.1333-1349.

154. Fang D.U. Studies on the aetiology and specific control of goose parvovirus infection / Fang D. U., Wang U. K. // Sci. Agricult. sinica.- 1981.-№4.- P. 1-8.

155. Farr A.G. Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a brief review / Farr A.G., Nakane P.K. // J. of Immunological Methods.- 1981.-№47.-P. 129-144.

156. Frey G. Agent and process for detection of redox system / Frey G., Zimmermann G. // Patent №DE3433946.-1986-03-27.

157. Freytag J.W. Immunoassay utilizing covalent conjugates of polymerized and antibody / Freytag J.W., Ishikawa E. // Patent №EP0175560.-1986-03-26.

158. Gallacher J. Partially oxidized enzyme conjugates / Gallacher J. // Patent №GB2067572.-1981-07-30.

159. Gallacher J. Stabilization of indicators for detecting enzyme activity / Gallacher J. // Patent №US4615972.-1986-10-07.

160. Gantzer M.L. Stabilized test composition, devise and method for the determination of peroxidatively active substances / Gantzer M.L. // Patent №EP0130520.-1985-01 -09.

161. Gough R.E. Isolation and Characterisation of a parvovirus from goslings / Gough R.E., Sparckman D., Collins M.S. // Vet. Rec.- 1981.-Vol. 108, №18.-P.399-400.

162. Gough R.E. Studies with a duck embryo adapted doose parvovirus vaccine / Gough R. E., Sparckman D. // Avian Pathol.- 1982.-Vol. 11, № 3.- P.503-510.

163. Gough R.E. Application of the agar gel precipitin and virus neutralisati on test to the serological study of goose parvovirus / Gough R.E. // Avian Pathol.-1984.-Vol.3. -P.501-509.

164. Gough R.E. Persistence of parvovirus antibody in geese that have survived Derzsy's disease / Gough R.E. // Avian Pathol.- 1987. Vol.16, №2.-P.327-330.

165. Grassi J. Compound labeled with acetylcholine sterase from Electrophorus electricus, method for its preparation and its use a marker in enzyme immunoassays / Grassi J., Pradelles P. // Patent №EP0139552.-1985-05-02.

166. Hall J.E. Zymogene activation, cascade amplification immunoassay /Hall J.E., Hargreaves W.R. //Patent №EP0123265.-1984-10-31.

167. Hanh N.V. Fiatal libak megbetegedese Vietnamban / Hanh N.V. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1974.- T.29, № 4.- S.262-267.

168. Hansen H. Derzsy's desease (pervavirus infection has gaes) / Hansen H. // Dansk Erhversfjerkrt.- 1979.-Vol. 8.- S.423-425.

169. Hansen H.Ch. Derzsy's disease (Parvovirusinfection has gaes) / Hansen H. Ch. // Dan. Veterinaertiedsskr.- 1980.- Bd.63, №5.- S. 191-194.

170. Harris C. Cascade amplification enzyme immunoassay / Harris C. // Patent №US4463090.-1984-07-31.

171. Hauswirth W.W. Autonomous parvovirus DNA structure and replication / Hauswirth W.W. // Parvoviruses. N. Y.; London, 1984.- P. 129-152.

172. Have P. Detection of goose Parvovirus antibodies by microneutralisation and enzyme-linked immunosorbent assay / Have P., Hansen H.C. // Proc. 7th World. Vet. Poult. Assoc.- 1981.- P.60.

173. Herrman J.E. Quantitation of immunoglobulin adsorption to plastics / J.E. Herrman, Collins M.F. //J. Immun. Method.-1976.- V.10.-№4.-P.363-366.

174. Hoekstra J. Observations on host range and control of goose virus hepatitis / Hoekstra J., Smit Т. H., Corrie van Brakel // Av. Pathology.- 1973.- Vol.2, № 3.- P. 169-178.

175. Hoekstra J. Gansenvirushepatitis Vortrag / Hoekstra J., Yadin W.A. I I 5. Internat. Kongr. Welt-Geflugel-Vereinigung. Munchen.- 1973.- № 2.

176. Johannsson A. Biochemical detection method and kit for use therein / Johannsson A. // Patent №EP0132948.-1985-02-13.

177. Johnson F.B. Parvovirus proteins / Johnson F.B. // Parvoviruses. N.Y.; London, 1984.- P.259-295.

178. Kardi V. Use of ELISA procedures for the detection of Derzsy's disease virus of geese and of antibodies produced against it / Kardi V., Szegletes E. // Avian Pathologie.-1996.-№25.-P.25-34.

179. Katsuyama H. Color indicator composition and film for detecting hydrogen peroxide / Katsuyama H., Shishido T. // Patent №DE3213 786.-1983-01-05.

180. Kisary J. Viral disease of goslings. IV. Characterization of the causal agent in tissue culture system / Kisary J., Derzsy D. // Acta Vet. Acad. Sci. Hung.-1974.- T.24, №3.- P. 287-292.

181. Kisary J. Az un libainfluenza korokotana a korokotana, korokozo rendszertani besorolasa / Kisary J., Derzsy D., Demokos // Magyar Allatorv. Lapja.- 1975.- T. 30, №3.- S.199-201.

182. Kisary J. Az un libainfluenza elleni szikimmunitas jarvanytani je lentosege / Kisary J., Derzsy D., Horvath E. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1975.- T.30, №10.- S.721-723.

183. Kisary J. Aktiv immunizalasi kiserletek a kisliban Derzsy- fele befegsege (un libainfluenza) ellen.2. Laboratoriumi es nagyuzemi vedesi kiserletek / Kisary J., Meszaros J. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1977.- T.32, №12.-S.788-792.

184. Kisary J. Immunnological of Derzsy's, diseases in goslings / Kisary J. // Avian pathol.- 1977.- Vol. 6, №4.- P.327-334.

185. Kisary J. Presense of parvovirus in the intestine of chickens showing stunting syndrome / Kisary J., Nagy В., Bitay Z. // Avian Pathology.- 1984,-Vol.13, №2.-P.339-343.

186. Kisary J. Indirect Immunofluorescence as a diagnostic tool for parvovirus infection of chickens / Kisary J. // Avian Pathology.-1985.-№ 14. P.269.

187. Klenner D. Stabilization of peroxidase activity in solution / Klenner D., Kleinhamer G. // Patent №EP0197447.-1986-10-15.

188. Kokles R. Zur Parvovirusinfection der Gungganse (Derzy'she Krankheit) (Kurzmitteilung) / Kokles R., Kinpel A., Reckling K.H. // Mh. Vet. Med.-1985.- S.707-708.

189. Krauss H. Eine verlustreiche Aufzuchtkrankheit bei Gansekiiken (Erste Mitteilung) / Krauss H. // Berl. und Munch. Tierarztl. Wochenschrift.- 1965.-Jg.78, H.19.- S.372-375.

190. Krauss H. Aviare REO Viren / Krauss H. // Berl. und Munch, tierarztl. Wschr.- 1967.-Jg.80, H.23.- S.458-461.

191. La maladie a parvovirus de Poison. La forme tardive Coudert M., Fedida M., Dannacher G., Peillon M. // Rec. Med. Vet.- 1974.- T. 150, № 10.-P. 899-906.

192. La maladie dite: "maladie a virus de l'oison" / Coudert M., Dannacher G., Peillon M., Sabatut R., Ferlin P. // Rec. Med. Vet.- 1972.-Vol.148, №4.-P.455-472.

193. Labie Ch. Hepato-nephrite-ascite (HNA) des Oisons histopathologic et histoimmunofluorescence / Labie Ch. // Ann. Rech. Veter.- 1972.- Vol.3, №3.-P. 483-492.

194. Lenz H. Process for the determination of an immunologically-bindable substance involving a Fab fragment / Lenz H., Kleinhammer G. // Patent №DE3430905.-1986-02-27.

195. Liao Y.K. Detection of Derzsy's disease viral antigen by ELISA and latex agglutination / Liao Y.K., Lu Y.S. // Proceedings of the 5th Asian-Australasian Association of Animal Production Societies Congress, Taipei, ROC on Taiwan. 1990.-Vol.3.-P.208.

196. Litman D. Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay / Litman D., Ullman E. // Patent №US4533629.-1985-08-06.

197. Majaniemi I. Early events in the replication of parvovirus Lu3 / Majaniemi I., Siegl G. // Arch. Virol.- 1984.-Vol.81, №3/4.-P.285-302.

198. Matthews R.E.F. Classification and nomenclature of viruses / Matthews R.E.F. // Intervirology.- 1982.-Vol.17, №l/3.-P.72-75.

199. Mendelewska J. Proba analizy upadkow gesi w chowie intensywnym / Mendelewska J., Mendelewska F. // Med. Weter. -1980.- T.36, №1.- P.42-45.

200. Molitor T.W. Porcine parvovirus: virus purification and structural and antigenic properties of virion polypeptides / Molitor T.W., Joo H.S., Collet M.S. // J. Virol.- 1983.- Vol.45, №2.-P.842-854.

201. Mtiller D. E. Maturation of parvovirus Lu3 in a subcellular system.I. Optimal conditions for in vitro synthesis and encapsidation of viral DNA / Muller D. E., Siegl G. // J. Gen. Virol.- 1983.-Vol. 64, №5.-P.1043-1054.

202. Nagy Z. A viral disease of goslings. 2. Microscopic lesions / Nagy Z., Derzsy D. // Acta Veter. Acad. Sci. Hung.- 1968.- T.18, №1.- P.3-18.

203. Noguchi H. The quantitative analysis of antigen by the enzyme-antibody bridge method / Noguchi H., Nakanishi T. // Patent №EP0125893.-1984-11-21.

204. Oliver D.G. Thermal gradients in microtitration plates, effects on enzyme-linked immunoassay / D.G. Oliver, A.H. Sanders // J. Immun. Method.-1981.V.42.-№1.-P. 195-201.

205. Parham M. Assay of peroxidase enzyme activity / Parham M., Warren W. // Patent №US4596770.-1986-06-24.

206. Peter W. Virologische Arbeiten zur Gancehepatitis / Peter W. Monatsh. Veterinarmed.- 1982.- H. 22.- S.847-849.

207. Peter W. Parvovirusinfection bei Gansen / Peter W. // Mh. Vet.-Med.-1985.-Jg.40, H.19.- S.63-68.

208. Presence of reoviruses in centain goose embryo isolates obtained from outbreaks of viral gosling disease and in chickens embryos / Derzsy D., Kisary J., Kontrimavichus L. M., Nadtochey G.A. // Acta Veter. Acad. Sci. Hung.- 1975.- T.25, №4.- S.383-391.

209. Prophylaxie de la "maladie a virus de l'oison" / Coudert M., Dannacher G., Fedida M., Peillon // Rec. Med. Vet.- 1973. T. 149, № 2.- S. 197-208.

210. Protein measurment with the folin-phenol reagent / Lowry O.M., Rosenbrough W., Farr A., Randall R.V. // J. Biol. Chem.- 1951.- P. 193, 235.

211. Reperti istlogici ed ultramicroscopidi una malattia virale delle giovnioche / Mandelli G., Valeri A., Rinaldi A., Lodetti E. // Folia Veter. Latina.- 1971.-Vol.l, №1.- P.121-170.

212. Resultats d'une enquete serologique effectuce en France (Vendee) chez canard a rotiz / Marius V., Bonnaud P., Gultet M. et al. // Av. Pathol.- 1983.-Vol.12, №4.- P.412-435.

213. Samberg G. A new infections disease of goslings in Israel / Samberg G., Bock R., Perlstein Z. // Refuah Veterinarith.- 1972.- Vol.29, № 1.- P.29-33.

214. Saunders G.C. Application of the indirect enzyme-labeled antibody microtest to the detection and surveillance of animal diseases/ Saunders G.C. et al. // J. Microbiol.-1976.-3(6).-P.604-608.

215. Schettler C.H. Virushepatitis bei Gansen. I. Mittellung:Untersuchungen zur Klarung der Atiologie / Schettler C.H. // Tierarztl. Umsahau.- 1971.-Jg.26, № 2.- S.60-66.

216. Schettler C.H. Virus hepatitis of Geese II. Host Range of goose hepatitis virus / Schettler C.H. // Avian Dis.- 1971.- Vol.15, №4.- P.809-823.

217. Schettler C.H. Gansezucht wird wieder sttraktiv / Schettler C.H. // Dt. Geflugelwirsch.- 1971.- Jg.23, H.3.-S.55-74.

218. Schettler C.H. Goose virus hepatitis in the Canada goose and snow goose / Schettler C.H. // J. Wildlife Desease.- 1971.-Vol.7, №3.- P. 147-148.

219. Schettler C.H. Isolation of a highly pathogenic virus from geese wiht hepatitis / Schettler C.H. // Avian Dis.- 1971.- Vol.15, №2.- P.323-325.

220. Schettler C.H. Nachweis der vertikalen ubertragung des virus der Ganschepatitis / Schettler C.H. // Dt. Tierarztl. wschr.- 1972.- Hg.79, № 8.-S.202-203.

221. Schettler C.H. Virus hepatitis of Geese III. Propertis of the cause agent / Schettler C.H. // Av. Pathol.- 1973.- Vol.2.- P.179-193.

222. Shaffar M.R. Method of stabilizing peroxidase in a serum protein based medium / Shaffar M.R. // Patent №US4252896 1981-02-24.

223. Siegl G. Biology and pathogeneticity of autonomous parvoviruses / Siegl G. // Parvoviruses.-N.Y.; London, 1984.-P.297-362.

224. Siegl G. The human parvovirus / Siegl G. // Parvoviruses. -N.Y.; London, 1984.-P.389-395.1. V V

225. Snoflak J. Vakcina proti chorobi / Snoflak J., Vachova H. // Veterinarstvi.-1982.- Vol.32, №1.- P. 33-35.

226. Srivastava A. Nucleotide sequence and organization of the adenoassociated virus 2 genome / Srivastava A., Lusby E.W., Berns K.I. // J. Virol.- 1983.-Vol.45, №2.-P.555-564.

227. Stout R. Catalyzed colorimetric substrates for peroxidase enzyme determinations / Stout R. // Patent №EP0103784.-1984-03-28.

228. Structure and replication of minute virus of mice DNA / Astell C. R., Thomson M., Chow M. B. et. al. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.-1983.- Vol.47, №2.-P. 751-762.

229. Sun Ming. Stabilized peroxidase compositions / Sun Ming // Patent №US4504579.-1985-03-12.

230. Siiveges T. Kislobak tomeges elhullasanak koroktani vizsagalata / Siiveges Т., Szencsenyi I. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1970.- T.20, №10.-S.541-545.

231. Szedo M. Laboratory ad practical serotherapeutie experiments against the so called goose influeza with special reference to be the antigenic variante / Szedo M. // Report delivered at the Internat. Symposium Geese. -Budapest, 1971.

232. Szencsenyi I. Adatok az " un libainfluenza" jarvanytanahoz, es a vedekezes lehetosege / Szencsenyi I. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1967.- T.22, №11.-S.516-524.

233. Szenczenyi I. Attempts to create breeding flocks of geese free from "influenza" / Szenczenyi I. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1971.- T.26, №11.-S.637-640.

234. Tattersall P. The parvoviruses an introduction / Tattersall P., Ward D. // Replication of mammalian parvoviruses, Cold Spring Harbor.- 1978.- P.3-12.

235. Temesi Z. Kiserletek a libainfluenza koroktanaval kapesolatban / Temesi Z. // Magyar Allatorv. Lapja.- 1966.- T.21, № 9.- S.385-388.

236. The complete DNA sequence of minute virus of mice, an autonomous parvovirus / Astell C. R., Thompson M., Merchlinsky M. et al. // Nucl. Acids Res.- 1983.-Vol. 2, №4.-P. 999-1018.

237. Trager U. Reagent and method for detection hydrogen peroxidases / Trager U., Sojka B. // Patent №EP0068356.-1983-01-05.

238. Viral desease of goslings III. Isolation, properties and antigenic pattern of < the virus strains / Derzsy D. Dren Cs., Szedo M. et al. // Acta Veter. Acad. Sci.

239. Hung.- 1970.-T.20, №4.-S.419-428.

240. Virusinfectionen bei Gansen-eine ubersicht / Fenske G., Kuhne L., Mienhart H., Wilhelm A. // Monatsch. Veter. Med.- 1974.- Jg.22.- S. 860-863.

241. Vuillaume A. A propos de la maladie des oisons d'apparition tardive on nephrite hemorragigue enterite de l'oie (N.H.E.O.) / Vuillaume A., Tournut J., Banon H. // Rev. Med. Vet.- 1982.- T.133, №5.- P.341-346.

242. Wada H. Composition for assaying hydrogen peroxide/ Wada H., Kosaka Y.// Patent №DE3443415.-1986-02-27.

243. Wagner D. Amplified assay a ligand/ Wagner D. // Patent №EP 174753.1986-03-31.

244. Wehner R. Process for stabilizing the activity of peroxidase in solution / Wehner R., Mattersberger J. // Patent №DE3509238.-1986-09-18.

245. Younger J.S. Monolayer tissue cultures: preparation and standardization of suspensions of trypsin-dispersed monkey kidney cells / Younger J.S. // Prac. Soc. Exp. Biol, and Med.-N.Y., 1954.-Vol.85, №2.- P.202-209.

246. Zalay J. Az "un libainfluenza" elofordulasa Bekes medyci termeloszovetkzetek libaallomnyaban / Zalay J. // Magyar Allatorv. Lapja.-1967.- T.22, №11.- S.525-528.

247. Zum auttreten einer virusbedingten Ekrankung bei Moschusenten / Ziedler K., Marx G., Heidrich R., Sobanski E. // Mh. Vet.-Med. 1978. -Jg.33, H.45.