Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Серологическая диагностика инфекционного гепатита собак

РГ 8 ОД

' .1 . «jf! '-"T'O.

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ¿'-.¡i

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧ1Э>;ГССЛЬ'ДО?/5ТЕЛЬСГ-Ш ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ,

СТАНДАРТИЗАЦИИ К СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

j'i правах рукописи. УДК 619: 816. ЭВ: 578. 826. 2Г: 576. 077. 3: 636. 7

ЗАХАРОВА Клена Дмитрий вна

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА СОБАК

16.00.03 - esT^iniHïtpu&H микробцо.чйг'ив, вирусология, апиеоотилогин, микологии и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

дмосертац»»» на соис!»н;;5- ученой отэпекп кандидата наук

hç'ii'aa - г^о.

Работа выполнена в лаборатории контроля а стандартизации препаратов, применяемых в звероводстве. Всероссийского государственного научно-исследовательского ¡шатитута контроля, стандартизации а сертификации ветеринарных препарг ов MGX Российской Федерации.

¡Шшишшшш: - заслуженный деятель науки РСФСР,

доктор ветеринарных наук, профессор

A.В.СЕЛИВАНОВ

~ доктор ветеринарных наук

B.И.У1АС0В.

ОФщзиальэде опронацты - доктор ветеринарных наук

Н. Т.ТАТАРИНЦЕВ ¡[ВГНКИ} ,

- кандидат ветеринарных наук В.А.ЕСИПЁНОК (МВА).

Ведущая; - Всероссийский научно-исследовательский

институт охоты а охотничьего хозяйства.

Защита состоится ¿-¿¿C'AJ* 1993 г. в час. на засада-

гаи Специализированного совета Д.120.8§.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных прс аратов МСХ Российской Федерации по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ.

С диссертационной работой ыотю ознакомиться в библиотека ВГНКИ. Автореферат разослан 1993 г.'

Учений секретарь Специализированного совета

Козырев Ю.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АвташаазхЬ-Д^ЙЩ.« Июйекциок^ы:' гепатит собак протекаем с пре-имущвс?веяптгяора~епие»ГпечёниТ сопровождается воспалением слизистых'оболочек глаз, дыхательних путай, не. /авнием д нельнооп; почек» центральной нервной системы ( Б.НиЬаг^ 1947 г.). 1двотгша переспевают как в острой, так и в хронической форме. Поело клини-шо ко го выздоровления наблюдается длительное выла лани е. вируса во внешнюю среду. Наносимый собаководству ущерб обусловлен гибелью молодик собак, скияаниам опяодотворяамости само...

Для предупреждения распространения заболевания и выбора тактики лечения необходима своевременная и точная постановка диагноза.

При лабораторной диагностике вирус!, го гепатита плотоядных применяют гиотологичаские исследования, выделение вируса в гтаьтурах клеток, но наибольший интерес в этом плане представляют серологические исследования ( У.СиЬааво 1954 г., Читав В.А. 1965-1990 гг., Зонин П.Ф. 1966-1986 гг., Уласов В.К. 1985-1991 гг.). В наше:! .гране (гч диагностика ИГС используют реакцию диФ^узвон"ой арсципптацпа •• агаровом гале (РДП). Реакция доступна и проста в испоянапии, по пме-зт низкую чувствительность и применяется в практике только для уета-ювления видовой специфичности антител к аденовирусам собак без ;прэделекия их титра.

Способность вируса ИГС вшивать агглютинации эритроцитон по. шет использовать это свойство для совершенствования серологической шагностикп при данном заболевании. Н.смотря па простоту и доступ-юсть реакции гемагглюгинации (РХ'А) и реакции торможения гвмагглютт» -1ации (РТГА' эти методы практически на используются в даагное лиса, гак как на разработаны способы получаняя стабильт— препаратов и :тандартные методики для проведения реакций для их осузесгвла.чия.

Даль-Са.1а1.Ц: 1.оучать гв^дтлгатшшруэдиэ свойства аденовирусов обак и способ эсть бстаствзнпо-воспрличчпвцх и лабораторию: «ц«еог-

пых образовывать тормозящие гемагглютянацию антитела. Разработать методические рекомендации по обнаружению специфически:' антител у собак к вирусу инфекционного гепатита в реакции торможения гг агглютинации.

ашшя_ш&Д£Д0вашШ=

- изучение гамагглютипирующих свойств некоторых штаммов аденовирусов собак;

- определение оптимальных способов и сроко_ получения, стабилизация и хранения гемагглю^инирущих антигенов аденовирусов собак;

- определение способов получения, стабилизации и хранения специфических антисывороток к аденовирусам собак.

Научная новязад. Определены оптимальные условия постановки ЕГА я РТГА, вид кивогного, к эритроцитам которого вирус обладает максимальной гемагглюти.чирующей способностью.

Получены новые данные об изменении гемагглютинирувдей актив-кости вируса ИГС при воздействии различных физических и химических факторов.

Получены новые данные о накоплении специфических антител к вирусу КГС у лабораторных животных, а также у экспериментально зараженных и вакцинированных собак. Определена диагностическая ценность РТГА в сравнении с РДП.

ПШ.К1ИНай15йалШШ1йй1Ь- Определены оптимальт. сроки и способ получения вирусного сбора для приготовления гемагглютинирупцего антигена вируса гепатита собак. Разработаны режимы инактивации, ляофилизации и хранения гемагглютинирующэго антигена, предназначенного для реакции торможения гемагглютинации. Разработана схема ги..лрим1-.!унизации и способ получения даагностической сыворотки на кроликах и козах.

3 результате проведенных исследований.разработаны и утверж-

;аны Глаг'ым управлением ветеринарии Министерства сельского хо-яйства и продовольствия СХГ 15. т1.1991 г. "Методические реко-:андади_по_поотановке_раакции-тормояения-гё>ш,гл!отинаци!!~длл бнаружения специфических антитзл к вирусу гепатита собак".

М1>МаШ5Я_Еай2ТЦ- Материалы диссертации доложены и одобрены а: - научно-проблемной методической ко«, .сии ВГНКИ ватпрвяара-ое по вирусологии (Москва, 1991 г.);

- IX. X, XI Научных конференциях молодых ученых ВГНКИ ват-репаратов (Москва, 1987, 7.988, 1989 гг.);

- Конференции молодых ученых Всесоюзного научно-исследова-альского ящурного института (Владимир, 1990 г.);

- Всесоюзной научной конференции ВГНКИ "Соваршенствовр-ио атодов государственного контроля ветеринарных препаратов" (Москва, 991 г.);

- Ш Всесоюзной конференции по эпизоотологии (Новосибирск, 991 г.);

- Семинаре "Болезни мелких домашних животных. Диагностика, ечениа, профилактика" (Москва, 1991 г.).

Проведены комиссионные испытания специфичности и активности «акции торможения гемагглюгин ни; для выявления в сыворотках крои специфических антител при контроле вакцины против инфекционного апатита собак в ВГНКИ (1950 г.).

На базе Московской городской ветеринарной яяборагорчи с поло-итеяьнш результатом проведаны комиссионные межведомственные,испы-ания предложенного метода- постановки реакции хормо-еиая гамагглю-¡¡нахши для оинао.укс;кип специей чвок*и л гмрус,,

об,ч [• (1991 г.).

Пу^шфдий. По гемз диоевртаца« ?цу>1зд:<ованс лО гич-пых рай- .

диссертация иР^ояена на страницах машинописного текста I!

включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложи шя, список литература. Работа содержит 23 таблицы и 18 рисунков. Список ли-рагуры включает 205 источников, -з них 129 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Ыажашажл-мазюаы Г 5ота выполнена в период с 1987 по 1992 ^од в лаборатории контроля и стандартизации препаратов, применяемых в звероводства,, ВГНКИ ветпрепаратов.

Б опытах использовали штамм ВГНКИ вируса инфекционного гепатита собак (аденовирус собак типа I), выделенный В.И.Уласовым, А.В.Селивановым, А.А.Сулимрвым; штамм Ада вируса инфекционного ларинготрахекта собак (аденовирус собак типа 2), выделенный в 1988 г. В.И.Уласозым, А.В.Селивановым, А.А.Сулямовым, Ю.И.Могильным, Н.А.Селивановым; штамм Рекс вируса инфекционного гепатита собак, выделенный в 1959 г. и пассированный на белых мышах В.А.Ананьевым, Б.К.Безпрозванным, С.".Карским.

Вирусные расплодки получали в первячно-трипсишшрованных культурах клеток почки щенка собаки (Щ), почки эмбриона свиньи (ПЭС), в перевиваемой линии клеток ЭДСК. Ростовая среда для культур клеток содержала' 45 % сред^ ИГЛА, 45 % ГЛА (0,5 %) в растворе Хенкса к 10 % сыворотки крупного рогатого скота, с добавлением антибиотиков. Посла заражения на монослой, для поддержания культуры клеток использовали среды без добавления сывороток. Культивирование- продолжали в течение 4-7 суток. При развитии цитопати-" 1кого действия с повреждением 70-80 % монослоя и при отсутствии повреждения клеток в контрольных матрасах культуру замораживали при температура ~40°С.

В. яа ораторных опытах использовали: 43 кролика породы шиншилла массой 1,5-2,5 кг; 24 (*.,рсгх свинга массой 250-300 г, 24 -сирийских-хомяка~массоЙ~50-60'"г;~18ТдамГв 'возрасте 30-35 суток, 85 белых мншой массой 10-12 г, 5? собак пазних пород в возраста от 3 до 12 месяцев. Проведено вскрытие и исследование патологического материала от 28 павших от вирусного 'апатита собак. Проведено исследование 247 проб сывороток крови собак.

Инфекционную активность вируса устанавливали методом .титрования на культуре клеток. Для этого готовили десг-пкрагныа разве-ю-Т й

ния вируса от 10 до 10 на среда без сыворотки. Каждым разведением заражали по 4 пробар-ч с культурой клеток. Результаты учитывали через 4-6 суток. Инфекционный титп рассчитывали по г тоду Рида и Менча и выражали в ТЩ^о/мл*'

Для лиофилизации вируоа использовали среду ВГНКИ $ Ъ. обезжиренное пастеризованное молоко, сорбит-келатозу и пять экспериментальных срзд. Лиофилизацию проводили в однокамерном аппарате темы СТ-2. Материал предварительно замораживали при температуре '..ганус 45-60°С.

В работе использованы эритроциты крупного рогатого скота, бараков, свиней, белых крыс, мор ,<их свинок, петухов. Кровь получали 1 раствор Альсевера в соотношении 1:3-1:5. Отмывали трехкратным центрифугированием по 10 мин. при 1500 об/мин, готовили суспензия эритроцитов 0,5; 0,7 я I % концентрации в забуфераниоа физиологическом растворе о рН от 6,2 до 7,8.

Реакцию гамагглютинация и реакцию торможения г-«агглютинации проводили по общепринятым в вирусологии схемам в плексигласовых панелях с лунками, имеющими " и"-образное дно,-ёмкостью I мл -макрометодом и до 0,1 мл - микромвтодом при температура:'. 37, 2и а 4 °С (+ 0,5°С).

Реаидоо диффузионной преципитации ставили в 1% агаровом гала в чашках Патри. Гель готовили из агара Дифко на фпзиог-рлчаоком раствора хлористого натрия с добавлением 0,05% фенола. РДП провода . 1 согласно наставлению, утверяда. .ому 04.03.74 г. ГУБ МСХ СССР. Ирецидитирующий антиген из штамма ВГНКИ получали по методике, изложенной в инструкции по изготовлению и контролю набора для диагностик;! инфекционного гепатита плотоядных в реакции диффузионной преципитации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

. ццшащааазгеошт ВДУ.QДQДЛLйsxifflШffl-Д!lJlJ!Ш Первый этап наших исследований заключался в выбора гаках условий проведения РТА, при которых геиагглютинины вируса гепатита ообак стабильно проявляют свою активность и имеют наибольшие титры.

Таблица I

Гемагглютинирущая активность культурального вируса гепатита собак с эритроцитами различных видов животных

Титр вируса в РТА

пп Вид животного Температура (град. С + 0.5)

4 20 37 ....

I Морская свинка 1:2-1:4 1:2-1:4 0

2 Баран 0-1:2 1:4-1:8 1:2-1:4

3 Белая крыса 1:32-1:64 1:8-1-16 0

4 Петух , 0 0 0

5 Свинья 0 0 0

6 Крупный рогатый скот 0 0 0

Вирус агглютинировал эритроциты барана и морской свинки в титра: не более 1:4-1:16. С эритроцитами свиньи, крупного рогатого скота (1СРС), петуха геаагглютннации на наблюдали. Гемагглютинирую-щая активность вируса ИГС проявлялась в наиболее высоких тиграх с эр;тро;ц!тачи бело" крысч.

При исследовании влияния различных температурных режимов на результаты РТА наилучшей оказала температура плюс 4°С, при ко^о-ррй_рвакцию_учитнвали-чар83-2,5-3-часа—Рсакцпя'проходила'бастрае при. температурах 37° и 20°С, но титры Bi'^vca были ниже.

Существенное влияние на результаты реакции оказывала концентрация водородных ионов в суспензии эритрс:,,;тов. С эритроцитами белой крысы высокие показатели титра гемагглытшшнов по..учены при значениях рН от 7,0 до 6,2, но наибольшая гемагглютинирующая активность отмечена при значапаи 6,4.

При использовании эритроцитов в 0,5 , 0,7 и I % концентрации результаты отличались на I-.; разведения, с повышением концентрации эритроцитов чувствительность реакции еш'чалась. Реакция ret. .гглю-тинации, проведенная микро- и макроаетодом, давала результаты, отличавшиеся на более чем на I разведение. В дальнейшей работе мы отдавали предпочтение микромегоду, так как он болае удобен и экономичен.

В результате проведанных исследований использование в РГА с вирусом гепатита собак 0,7 % эритроцитов балой крысы при рН, равном 6,4, и температура 4°С было признано оптимальным.

:иФических.антитод к вирусу гагщгцта собак необходимо было определить продолжительность контакта исследуемых сывороток крови с антигеном. В результате проведенных опытов установлено» что для того, чтобы произошло взаимодействие смороточных антител с рецепторами вируса, контакт должен быть но менее 60 минут. При продолжительности контакта от 90 до 130 даад? титри сывороток различались по оолвв чем нг I разведение. Контакт сыворотки с антигеном, продолжавши ¡1ая 150 шшут и более, сопровождайся зиачктллышм сийчзнз ok ого гвмагглютии рувдэй ак пвиости, и нельзя было провести учат

реакции. В дальнейшей работе для получения сопоставимых результатов мы выдерживали разведения сывороток с антигеном р течение 2 часов.

В сыворотках крови собак част, содержатся неспецифичаские агглютинины к эритроцитам белых крыс, а также не специфические ингибиторы вирусных гемагглютининов. Неподготовленные сыворотки ..крови бол'-шх собак содержали гемагглютинины в титрах от 1:16 до 1:128. Феномен торможения при исследовании так х сывороток практически не проявлялся. Обработка сывороток эритроцитами позволяла значительно уменьшить количество неспецифических гемагглютининов. Их титр снмналея до 1:4-1:8. Направленные на удаление неспецифических ингибиторов прогревание проб при- 56°С и обработка взвесью каолина не влияли на величину тигра тормозящих агглютинацию антител и не являлись необходимыми. Но после таких обработок сыворотки становились прозрачным, картина тормоаения гемагглютинации -более четкой, частично удалялись неспецифические гемагглюгинирую-щие факторы. Поэтому при проведении РТГА для определения антител к возбудителю инфекционного гепатита в сыворотках крови собак мы рекомендуем подготавливать пробы.в следующей последовательности: прогревание при 56°С, обработка эритроцитами и каолином.

Во всех испытанных культурах появление виру ных гемагглютининов совпадало по врамэни с началом развития цитопатического действия. Результаты исследований показаны в таблица 2.

Максимальных значений концентрация гемагглютининов достигала при разрушении клеточного .монослоя на 70-80 %. Установлено, что «¿...большее количество гемагглютининов вируса гепатита собак накапливается в культура клеток почки щоика на 5-6 сутки. Средние значения титров гемагглютининов составили для aTav.ua ВГНКИ - 6,51ов2

Таблица 2

Накоплений гемагглютинин з пои репродукции штамма ВГККИ в культурах 1слатрк._(1ок2„ орвднаго-геоматричесхогс_титр£ГТГт)

Культура клеток Время с момента заражения (сутки) Инфекционный титр вируса при ЦПД на 4-г

4 5 6 [ 7

ПЭС вдек 4,5*0,3 2,5*0,6 3,3*0,3 5,0*0,4 3,0*0,7 3,7*0,3 6,5*0,5" 5,0*0,4 2.0*0,4 2,0*0,4 2,5*0,8 1,0*0,5 .... .............! . ............ 105,5+0,4 103,5±0,4 105.0±0,5

для штамма Ада-- 7 • а инфекционная активность вирусных рас-плодок соответственно ТО5'5 Ш^о/щ и Ю4,5 ЩИ50/Ш.

В культуре клеток ПЭО как гемагглют пирующая, гак и инфекционная активность вируса для обоих штаммов была нике. Следует отметить, что в культура клеток, ЦЩСК при .высокой инфекционной активно-1 сти титр агглютининов у обоих истканных тташов оставался невысоким.

Наши исследования показывают, что вирусные гамагглюпшини выявляются сначала в пораженных клетка:: и позднее, при разрушении части клеток, обнаруживаются в кулътуральной среде. Активность ге-магглютининов .в культуральнон , ,;зде на протяжении всего периода "■ультивированая в 4-8 раз ниже, чем в клеточном детрита.

В результате проведанных описоз установлено, что оптимально'' заратавдей дозой при получении гемаггдютинцруодаго антигена вируса ИГС в культуре клеток почки щенка собс'гси является 0,01-0,1 ТЦД50/клат> (6,0 ± 0,4 1ов2 ). Пои ениченич дозы дс 0,001 14%,^,. гемагглюгинирукшя активность цодучзиао.. вирусни!: р-.енллакч понижалась до 3,5 + 0,4 .

При получении ¡5 'хранении культуральных пиру сит. раолло^од вируса существенное г'ияние на го активность оказывает температурный фактор. Установлено, что при 56°С вирус терял инуекционнсоть

через 50-60 минут, а при 37°С через 25 суток. Гемагглютинины вируса разрушались при 56°С через 10 минут, при 37°С чере? 7 суток.

. При низких температурах гемагг;штинины сохранялись более длительно. Р--»рушение гемагглютининов происхо. по при +4°, -4°, -10°, -40°С через 2, 3, Ю и 14 недель соответственно. Вирус, хранившийся при +4°С, вызывал характерные изменения в культура клеток через 9 месяцев, а при -40°С - спустя 2 года. Устойчивость гемагглютининов наивного вируса в составе культуральной среды 1ыла невысокой. Быстрое разрушение гемагглютининов происходило при повторяющемся замораживании и оттаивании. После двух воздействий титр гемагглютининов снижался в два раза, а после трех равнялся 0. Учитывая эти данные, для сохранения гемагглютининов вируса ИГС следует избегать передержи культура льных: матрасов в термостата и проводить для разрушения клеток только одно замораживание и оттаивание.

Болае продолжительное сохранение гемагглютинируящих свойств

ч

вируса обеспечивали лиофильным высушиванием. При подборе стабилизатора были испытаны 8 вариантов широко употребляемых и экспериментальных защитных ср,д. Положительные результаты получены при проведении лиофаллзации со средами, состоящими из ряствора сахарозы, МПБ и имевшими в составе сыворотку лошади или поливинилпир-ролидон. В процессе лиофилизации с этими защитными средами активность гемагглютинируюцего антигана снижалась толт:о в два раза и ■ при хранании в течение 12 месяцев в условиях бытового холодильника не изменялась.

Проведена работа по изысканию методов инактивации вируса, не вызывали их значительного снижения гемагглютинируодей активности. Ус лновлано, что димер этиленимина и формальдегид в концентрациях от 0,05 до 0,2 % при инактивации инфекционного вируса гепатита собак практически одновременно разрушают гемагглютинины.

Использование этих веществ.?.о. поставленной задачи не решало.

Положительные результаты получены пои инактивации аденовируса

собак ультрафиолетовым^лучат._лри_ульграшиолетозом-облучении----

лучистым потоком с плотностью 68 Вт/м"" (лампы ДБ-30-1) вирус терял инфекционную активность через 25 минут, а гемагглгатинпрующую через 90 минут» Антиген, прошедший облучение в дозе j. 22-135 кдя/м^, обладал достаточной для проведения Pi'fA ге.',(агглютинирующей активность» 5,5 log? , не инфицировал культуру клеток и на вызывал заболевания у собак при внутрибршинном заражении. Титр геыагглютининов при облучении снижался на 0,5 iog2 -

ш&жшшашиЕадажа

Выбор продуцента диагностических сывороток проводили с учетом экспериментальных данных о патогенности и иммуноген"ой активности вируса ИГС для 6 видов животных.

■ Этамм ВШКИ вируса гепатита собак, введенный паренторально з

с

дозе от I до 5» 10 ЩД^Др, не вызывал заболевания у кроликов, хомяков, белых мыт эй я цыплят. Кратковременное ухудшение общего состояния, сопровождавшееся отказом от корма, наблюдали у зараженных внутрибрюшинно морских свинок. При введении вируса внутривенно и внутримышечно морские евин...! на заболевали.

После заражения штаммом ВИКИ вируса ИГС в сыворотках крови кроликов, морских свинок и хомяков присутствовали прзципитирутациа и тормозящие агглютинацию антитела, причем сыворотки с наибольшими титрами антител получены от коз и кроликов, которым вирус вводили внутривенно.

Существенное влияние на накопление специфических антител в кропи доноров оказывали доза вируса, метод введения, интервалы и кратность иммунизирующих воздействий. При введении вируса .двум

группам кроликов ч^оез 3-4 и через 7 дней рбзультаты были неудовлетворительными. В сыворотках крови кроликов этих групп антитела' накапливались в невысоких титрах - 0,8log2 и 0,7iog2 . Возрастание титров антитьл наблюдали при повторении инъекций через 21-42 дня. Более высокой была активность сывороток, полученных по схемам, включающим 3-4 инъекции с интервалами в 18-28 дней. Применение адыованта Фрейнда также способствовало повышению количества антител в сыворотках. I 6 ""пользовании . в наших опытах схем ги-периммунизапии наиболее рациональной была схема, включавшая введение вируса внутривенно, подкожно с адыовантом Фрейнда и внутрикож-но с интервалом в 21 и 28 дней. В результате получены сыворотки крови с тиграми антител в РДП - 41о£2 и в РТГА - 71og2 .

Хоро; ;м донором для получения диагностических сывороток к вирусу гепатита собак были козы. Вирус вводили подкожно с адыовантом Фрейда затем подкожно и внутривенно через 21 день. Через две недели после третьей инъекции активность антител в сыворотках*крови достигала максимальных значений: в РТГА 8,3 1°£2 , в РДП - 4,5log2 . Далее инъекции* повторяли с интервалами в 1,5-2_ месяца. Титры сывороток через две надели посла каждой инъекции были на нижа 7 log2 в РТГА и 3 ios2 в РДП.'В итоге проведенных исследований предложены рациональные схемы иммунизации кроликов и коз.

Дг гностические сыворотки в замороженном при -40°С состоянии сохраняли активность ь РТГА в течение 9 месяцев, в лиофилизирован-ном виде более 12 месяцев.

• Полученные диагностические сыворотки имеют в РДП одинаковы? титры антител к аденовирусам собак первого и второго типа. В РТГА тигры сворогок к возбудителю ИГС на 6-8 разведений ваша, а к возбудителю адзновироза на 2 р^зведешт выше с гомологичным антигоном, чам с гстерологич'шм. Такчм образом, в РДП и РТГА проявляется

перекрестная антигенная ак^чвность двух деротнпов адеяовлрусоь собак, причем в РТГА с гетерологичтм антигеном активность'сывороток к аденовирусам собак 2 типа значительно вша, чем у сывороток к -аде1Юв:?русу~РтЖа.

Специфичность диагностических сывороток,проверяли в РДП и РТГА с использованием антигенов возбудителей инфекционных болезппй плотоядных. Сыворотки были отрицательными по отношению к вирусу болезни Ауески, чуда плотоядных, вирусу алеутской болезни норок, парвовирусам плотоядных.

В опытах, посвященных- определению гемагглютинирующей активности различных штаммов аданогирусов собак и. других возбудителей заболеваний плотоядных, установлено, что штаммы ВГНЮ' Карабаш, Ада • агглютинируют эритроциты крысы в титрах от 1:16 до 1:64 и выше. Активность штамма В была низкой - 1:2. Вирус чумы, парвовирусного энтерита, болезни Ауески и алеутской болезни норок при проведении РГА по разработанной методике эритроциты не агглютинируют. Способность аденовирусов собак агглютинировать эритроциты крысы отличает их от других возбудителай болезней плотоядных со-сходным спмптомо-комплексом и может быть использована для идентификации возбудителя инфекционного гепатита собак.

Для изучения возможности приманения разработанных методов диагностики вирусного гепатита исследовали пробы патматариала от экспериментально зараженных и спонтанно заболевших животных.

Штамм ВГНКИ проявил высокую вирулентность для собак, вызвав у них через 4-6 суток после заражения яркую клиническую картину заболевания инфекционным гепатитом с поражением печени и нарушением деятельности желудочно-кишечного тракта. Заболевание собак вирусным

гепатитом было по-^веркдено наличием характерных изменений, обна-; руганных при вскрытии и при гистологических исследованиях. Наибо-"•»е тяжело болезнь протекала у собак, заратанных в переднюю камеру глаза, пало 60 % кпвотных. При введении вируса внутримышечно и внутрибршинно заболевание проходило подостро и вызывало гибель 20 % зараженных животных.

Патологический материал от собак, павших с клиническими признаками вирусного renal..га проб), исследовали в РДП и РТГА. Ь реакции гемагглютинации пробы селезенки были положительны в 100 %, печени - в 90 %, почек - в 41 %, легких - в 33 % случаев. Все пробы из миндалин были отрицательными. Полодагельныэ результаты б"ли подтверждены в РТГА с гипериммунной сывороткой кролика. При сравнении даннь^ РДП и РТА результаты совпадали в 66 % случаев, но чувствительность РТА была на 56 % выше. Наибольшее количество полояш-тельныг результатов получено с пробами селезенки. Средний геометрический титр гемагглютининоя в пробах 'селезенки составлял 3,0 + 0,7 logg , а в прооах печени - 4,0 ± 0,4 log2 .

Таким образом реакция, гемагглютинации может быть использована для посмертного обнаружения вируса гепатита собак, но низкие титры гемагглютининов в патматериале несколько снижакг перспективность применения данного метода для диагностики ИГЛ.

С ецифичность результатов РТГА при обнаружении антител к ви-. русу гепатита собак проверяли с использованием гипериммунных диагностических сывороток к возбудителям чусч и парвовирусного энтерита собак, алеутской болезни норок, болезни Ауески, лэптоспироза, сальмонеллеза и кодибактериоза.

Позитивные сыворотки к вирусу ИГС от гипериммунизированных и переболевших животных проявляли активность в тиграх 1:32-1:1024 и выше. Прочие сиг^ротки, использованные в опыте, были отрицательны-

ми. Полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности РТГА

при обнаружения аитнтел к вирусу vanan- -1 собак.

_____Сыворотки крови_ от .экспериментально зараженных- л ^спонтанно

заболевших собак исследовали параллельно в Р'ГГА и в РДП. Слаций«-ческиа антитала выявляли на II день посла экспериментального заражения в PITA у 60 %t в РДП у 30 % животных. На 24 день все сыворотки биля положительны з с5еях реакциях. При сравненпи результатов исследований парных проб сывороток, полученных от экспериментально зараженных и спонтанно заболевших собак с интервалом в 10— í"4 суток,- отмечено повншвнве a-итров в РГГА на 2-3 логарифма (таблица 3).

Таблица 3

Результаты исследований парных проб сувороток от больных

•КГС собак

Группа животных Средний Геометрический титр (log, + ш ) .

на 5-10 дань заболевания на 15-24 лань заболевания

Спонтанно заболевшие Экспериментально зараженные 5,3 ¿ 0,42 3,2 + 0,3 8,5 + 0,43 1С,3 + 1,5

Анализ данных о присутствии антител в сыворотках крови больных собак показывает, что,тормозящие агглютинацию антитела выявляются о 5 дня заболевания в титрах от 1:16 до 1:4096 и через 10-14 дней их уровень возрастает в 4 и более раз, что является важным диагностическим признаком и подтверждает ценность мэтода.

Проведено исследование процесса накопления специфических антител к вирусу гепатита у вакцинированиях собак.

Уровень специфических антител после двукратного введения вак-цкны, предусмотренного наставлением по применению, возрастал в

те чз ни о 21 дня и достигал .максимальных значений в РТГА - 6,0 logg в РДП - 2,7 log2 , в последующем до 60 дня величина титров практически не изменялась. При более позднем исследовании сывороток кровь вакцинированных собак через 3 и 6 месяцев отмечено снижение . тормозящих агглютинацию антител до 5,0 log2 и 3,4 log2 . Все собаки были устойчивы к заражению вирулентным вирусом. Полученные данные свидетельствуют о высокой антигенной активности вакцины и могут служить основание" для разработки эгода контроля вакцины ..j индуцируемым антителам.

Д- .паи относительно небольшой, не более 3 месяцев, продолжительности сроков возрастания титров тормозящих агглютинацию антител у вакцинированных собак представляют интерес при оценке результатов доследований сывороток крови, подозреваемых по заболе- . ваиию ИГС. Анамнестические данные относительно вакцинации, провале; ,ой в течение трех предшествующих месяцев, обычно нетрудно установить. В случае, если собаку не вакцинировали или вакцинировали более .3 месяцев наза.., рост тормозящих агглютинацию антител в сыворотке крови связан со свежим случаем заболевания животного вирусным гепатитом. ' .

Специфические антитела к вирусу гепатита определяли параллельно методом РТГА и РДП в 247 сыворотках крови от больных и кли-. нически здоровых собак, направленных в городскую ветеринарную лабораторию г. Москьы и доставленных из собаководческих литомников в ВШКИ. 58,7 % от общего количества проб были положительны в РТГА и 55.5 % в РДП. Положительные результаты в РТГА и РДП совпадали в 84,0 % случаев. Полученные данные подтверждают, что FITA превосходит' РЛП по чувствительности и специфичности при определении, ■нтител к вирусу гепатита соак. Выявляемые в PITA высокие титры специфических антител у больных вирусным гепатитом собак, а также

отмечаемое увеличение титр"-* через 10-14 дней в 4 и более раз служат ванным диагностическим признаком и определяют ценность метода. В результате проведанных исследований разрайотан_мьтод...обна-_

руления специфических антител к возбудителю гепатита собак в сыворотках больных и вакцинированных животных в PITA с использованием эритроцитов крысы и сухого инактивированного гамагглютинкрущегс антигена. Метод предназначен для диагностики вирусного гепатита собак при исследовании парных сывороток крови, а также для определения антигенной активности при проведении контроля инактивирован-пой вакцины против вирусного гепатита собак. Метод с положительными результатами прошел внутриинститутские и межведомственные комиссионныа испытания и может быть рекомендован для ветарин.-оной практ1"-и. •

ВЫВОДЫ •

1. Изучена даргншка накопления гемагглютининоз аденовирусов собак в некоторых видах культур клеток. Наибольшее их количество накапливается в культуре клеток почки щенка через 6 суток после заражения в дозе 0,01 - 0,1 ТЦДдд на клетку.

2. Гемагглютиншш возбудителя ИГС обладают Невысокой устойчивостью к температурным воздействиям. Продолжительность сохранения гемагглютининов в культуральной расплодке при -40°С на превышает 14 недель, а трёхкратное замораживание я оттаивание приводит к

их полному разрушению.

3. Разработан способ инактивации вируса гапатита собак ультрафиолетовыми лучами с помощью лампы ДБ-30-1 в доза 122-135

о

кдж/м .

4. Защитная среда, содержащая сахарозу, ШБ и поливш-шлпир-ролидон, является оптимальным стабилизатором при лиофильном вису-

шивании гемагглютинврувдэго антигена возбудителя гепатита собак, обеспачивает сохранение .активности вируса в РТА и РТГА 1. течение 12 месяцев.

5. Штамм В1Ж. аденовируса собак I типа непатогенен для лабораторных и сельскохозяйственных животных, вызывает образование специфических антител, выявляемых в РТГА и РДП у коз, кроликов, морских свинок и хомяков.

■6. Предложены .схемы ги1. ^иммунизации кроликов и коз, позволяющие полу 1ть активные и специфичные диагностические сыворотки к аденовирусам собак.

7. Определены оптимальные условия постановки реакции гамагглю-тинации для обнаружения антигена аденовирусов собак в вируссодер-жащих субстратах. Реакцию ставят на фосфатно-буферном раствора

(р^т = 6,4) с эритроцитами белой крысы в концентрации 0,7 %, при температура реакционной смеси 4°С и учитывают через 3 часа.

8. Освобождение иссл дуэмых сывороток крови от неспецифических гемагглютишшов (адсорбцией с эритроцитами крысы) и ингибиторов (прогреванием при 56°С 30 минут и обработкой 25 % суспензией каолина) обеспечивает получение стабильных результатов при определении титра антигемагглютининов к вирусу гопатита собак. Продол-кителыюсть контакта разведений сывороток с антигеном должна составлять 2 часа.

9. Реакция гемагглютинации лригодна чля выявления антигена . вируса, гепатита собак в гомогенатах селезенки и печени павших

кивотных. 'Титр гемагглютишшов в пробах составляет 3-41ое2 .

1Г У спонтанно заболечш?" и экспериментально зараженных вирусным гепгтитом собак специфические антигсмагглюги.чикы в сыворотках крош р- :влялл с 6 ли заболззанкя. При повторном

исследовании через 10-14 д-^н титр антител з РТГА возрастал в и более раз.

II. Инактишрованная вакцина против вирусного гепатита индуцировала у собак образование специфических антител с активностью в РГГА 1:64 и выше или возрастание титра ачтиг° «агглютининов в 4-8 ряз, что является показателе" en высокой аптигзнно* активности .

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРВД01ЖШ

Разработаны "Методические рекомендации по постановке реакции торможения гемагглптинации для обнаружения специйичзских антител к вирусу гепатита' собак", 'утвержданныа ГУБ Минист'ерс" ча оольегто хозяйства и продовольствия СССР 15 ноября 1991 г.

ОПИСОК РАБОТ, ОНЛЗШКШАШЖ ПО ТЕ'.З ЯВСЕРМЯЙ

I. Захарова S.4., Улаеов В.й. Усозершеяствокшиз спосооа получения диагностических орецацитирующих сызороток против инфекционного гепатита плотоядных // Контроль и стандартизация средств с пени фи че с ком профилактики и диагностики туберкулеза и вирусных болезней животных: Сб. паучп тр. ЗГНКИ, - 1988. - С. 103-10?.

2„ Инфекционный гепатит плотоядных у щенков собак / Селиванов й.Е-, Улаеов 3JÍ., Захарова 5.Д., Илотвипов А.П. // Контроль и стандартизация средств специфической профилактики а диагностики туберкулеза и вирусных болззней животных: Сб. научн. тр. ВГНКИ. -1968. - С. 149-152.

3. Разработать и внедрить метода поддержания з храпения производственных штаммов вируса инфекционного гепатита плотоядных с цельв получения с короток / Уласов З.И,, Селиванов A.B., Суликоз

A.A., Захарова Е.Д-, Могильный Ю.И., Опарин Ю.Г. // Заключительный отчет. - 1989. - № госрегистрации 01860043381, ü инвентарный" 02890060415.

4. Захарова Е.Д., Уласов В.И. Реакция гамагглютинации .с вирусом инфекционного гепатита собак // Разработка методов контроля биологических препаратов и диагностических средств: Сб. научн. тр. ЗГНКИ. - 1989. - С. I09-II3.

5. Адановироз собг / Ужасов В.И., еЛиванов A.B., Гельман Б.Г., Середа C.B., Захарова Е.Д. // Ветеринария. - 1990. - !Ъ 5. -С. 69-'...

6. Захарова Е.Д. Патогенность вируса инфекционного гепатита плотоядных // Биопрепараты, методы их стандартизации и контроля: Сб. научн. тр. ВГНКИ. - 1990. - С. II9-I26.

7. Захарова Е.Д. Изучение гемагглютшшрукщей активности вируса .шфекпдонного гепатита собак // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Тез. докл. научн. теор. конференции мол. ученых ВНИШ. г. Владимир. - 1990. - С. 45-46.

8. Захарова Е.Д., Уласов В.И. Специфические антитела у собак, иммунизированных инактивированной вакциной против инфекционного гепатита собак // Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов: Тез. докл. Всесогазн. научн. конф. ВГНКИ.' Москва. - Май 1990. - С. 60-61.

9. Захарова Е.Д. Методы лабораторной диагностики инфекционного гепатита собак // Болезни мелких домаг"'их животных. Диагностика, лечение и профилактика: Сб. мат. семинара ТОО Мое. ват. центр.' - 1991. - С. 65-78.

10. Захарова Е.Д., Селиванов A.B. Реакция торможения гемагглю-лшации для диагностики инфекционного гепатита плотоядных // Таз. докл. 3 Bcocc.j3Hoit конференции по эпизоотологии (сентябрь 1991). -Новосибирск. - С. 227-228. •