Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.08) на тему:Роль некоторых бактерий в снижении качества молока и разработка ускоренных методов его ветеринарно-санитарной экспертизы

. - Г С\ &

V ..3 -

Л I

Р Ш!

На правах рукописи

ЯКУБЧАК Ольга Николаевна

ЮЛЬ НЕКОТОРЫХ БАКТЕРИЙ В СНИЖЕНИИ КАЧЕСТВА МОЛОКА И РАЗРАБОТКА УСКОРЕННЫХ МЕТОДОВ ЕГО ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ

16.00.08 - гигиена животных, продуктов животноводства и ветеринарно-санитарная экспертиза 16.00. 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учено й степени доктора ветеринарных наук

Москва - 1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии и Белоцерковском государственном аграрном университете

Научный консулы-амт - доктор ветеринарных наук, профессор.

заслуженный деятель науки Российской Федерации В.М. Карташова.

Официальные оппоненты: 1. Доктор биологических наук,

профессор A.B. Куликовский (ВНИИВСГЭ).

2. Доктор ветеринарных наук, профессор М.А. Сидоров (МГУПБ).

3. Доктор ветеринарных наук, профессор П.В. Житенко (МГАВМиБ).

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности.

Защита состоится "ЛЬ" JMttjfUrtÜ' 1997 года в ~ часов на заседании диссертационного совета Д.020. 50. 01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, ВНИИВСГЭ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийскою научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Автореферат разослан" ЛЧ " СрЩШЛЯ 1997 г.

"УченЕгйтекретарь-

диссертационного совета, кандидат биологических наук

Л. П. Пименова

3.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Получение молока высокого качества следует рассматривать как проблему, имеющую большое народнохозяйственное значение, так как от качества сырья зависит выпуск высококачественных молочных продуктов. Кроме того, это имеет большое социальное значение с точки зрения обеспечения населения биологически полноценными продуктами питания. Наиболее важным критерием качества молока является общая численность микроорганизмов, от которого в основном зависит санитарное состояние молока (В.М.Карташова, 1985, 1989; Н.С.Королева, В.Ф.Семенихина, 1975; В.Ф.Семенихина, Э. Ф.Поникарова, 1984, 1986; Н.В. Барабанщиков, 1986; В.И. Хоменко, 1990; П.В. Житенко, 1988; Ф. Катона, Г. Сижа, 1982; Г.Кильвайн, 1980; Г.Д. Мюнх, 1985 и др.).

Несмотря на то, что к заготовляемому молоку предъявляются высокие требования, однако до настоящего времени остаются недостаточно изученными вопросы уровня контаминации сырого молока мезофильяыми анаэробными л актатсбраживаю тцим и микроорганизмами, психротрофными и термостойкими бактериями; невыясненными причины, которые снижают пригодность молока при его использовании в качестве сырья для производства молочных консервов, продуктов детского питания и твердых сычужных сыров. Актуальным также остается изучение видов мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов, наиболее часто встречающихся в молоке.

До настоящего времени неразработаны ускоренные и вместе с тем эффективные методы выявления вышеуказанных микроорганизмов и отсутствует ветеринарно-санитарная оценка молока и молочных продуктов при контаминации их технологически опасными бактериями. Не на достаточном уровне выяснены первопричины возникновения пороков молока, вызываемых определенными видами микроорганизмов.

Кроме того, при выработке стерилизованного молока предъявляются повышенные требования к качеству исходного сырья, особенно к его термоустойчивости. Известно, что около 50 % молока, поступающего на молочные заводы, непригодно для стерилизации из-за низкой термоустойчивости. Поэтому изучение причин тепловой коагуляции молока имеет большое практическое значение. В настоящее время накоплен обширный материал по этому

-ioupocy, однако проблема еще далека от полного разрешения.

В связи с этим изучение вышеуказанных вопросов является актуальным и имеет большое научно-практическое значение.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилось изучение уровня и источников обсеменения молока микроорганизмами, снижающими его санитарное качество и технологические свойства и разработка ускоренных, методов ветсанэкспертйзы молока при его контаминации этими бактериями.

Соответственно цели на разрешение были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить общую бактериальную обсемененносгь молока с ввдовой идентификацией микроорганизмов по классам молока; уровень контаминации молока психротрофными, термостойкими и мезофильными анаэробными лактатсбраживающими бактериями.

2. Установить источники и уровень контаминации сырого и пастеризованного молока психротрофными микроорганизмами и их предельно допустимую концентрацию в сырье.

3. Разработать ускоренные методы и средства выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из сборного молока и смывов с молочного оборудования.

4. Установить уровень и источники контаминации сырого и пастеризованного молока мезофильными анаэробными лактатсбраживающими микроорганизмами.

5. Изучить видовой состав мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов, наиболее часто встречающихся в сыром молоке.

6. Разработать высокоэффективные, ускоренные методы и средства выделения мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов из сборного молока.

7. Изучить наиболее распространенные пороки молока -"горькое" и "тягучесть".

8. Исследовать этиологические факторы, влияющие на термоустойчивость молока, и усовершенствовать метод ее определения.

9. Разработать методы ветеринарно-санитарной оценки молока при контаминации его некоторыми технологически опасными микроорганизмами.

следующем:

- впервые изучен состав микроорганизмов в зависимости от

4

а

класса сырого молока, а также уровень его контаминации гтсихротрофными, термостойкими и мезофилышми анаэробными иактатсбраживакмцими микроорганизмами;

установлена предельно допустимая концентрация психротрофных микроорганизмов в сыром молоке;

- разработаны и внедрены высокоэффективные ускоренные методы и средства выделения и идентификации Р. aeruginosa из сборного молока и смывов с молочного оборудования (положительные решения № 94006960/13 и № 94-006961/13 от 28.02.94 о выдаче патентов на изобретение, авторы - В.М. Карташова, О.Н. Якубчак);

- впервые изучены уровень и источники контаминации сырого и пастеризованного молока мезофильными анаэробными ¡тактатсбраживающими микроорганизмами;

- впервые изучен видовой состав мезофильных анаэробных яактатсбраживающих микроорганизмов в молоке ;

- разработаны высокоэффективные ускоренные методы и средства выделения мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов из молока (положительные решения № 94006962/13 от 28.02.94 о выдаче патента на изобретение,авторы - В.М. Карташова, О.Н. Якубчак, В.И. Хоменко и№ 95103469/13 йт 10.03.95,

авторы В.М. Карташова, О.Н. Якубчак);

изучены наиболее распространенные пороки молока бактериологического происхождения "горькое" и "тягучесть";

- изучены некоторые этиологические факторы, влияющие на гермоустойчивость молока и предложен ускоренный метод ее определения;

- предложены методы ветеринарно-санигарнон экспертизы молока при его контаминации некоторыми технологически опасными микроорганизмами.

Практическая ценность. Разработаны питательные среды М и М, для ускоренного выделения и идентификации Р. aeruginosa из молока и смывов с молочного оборудования. Предложенные элективные питательные среды также могут быть использованы при бактериологической диагностике мастита псевдомонозной этиологии.

Разработанные питательные среды КАЯ-1 и КАЯ-2 позволяют в 2-3 раза ускорить выделение спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов, а питательная среда КАЯ-1 выявляет и вегетативные формы этих бактерии.

Для широкого применения предложен нами ускоренный метод

5

-пределения термоустой--швости молока.

Реализация результатов. Результаты исследований и разработанные методы и средства вошли в: 1. Методические рекомендации по ускоренному обнаружению спор и вегетативной формы мезофильных анаэробных лактатсбраживаюдщх микроорганизмов в молоке (утверждены 22 »пеня 1995 годя секцией "Ветеринарная санитария, гигиена, и экология" Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 2); 2. Дополнения к Методическим указаниям по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров, утвержденными Главветупром ( с Государственной ветеринарной инспекцией) МСХ СССР 30.12.83 г. (утверждены зам. начальника Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России В.В.Селиверстовым 4 июля 1996 г.); 3. Наставление по бактериологическому и цитологическому исследованию молока и секрета молочной железы коров на наличие возбудителей мастита. Наставление рассмотрено, утверджено и рекомендовано к изданию и внедрению секцией животноводства и ветеринарной медицины Научно-технического совета Минсельхозпрода Украины (протокол №4, 19-20 декабря 1996 г.) - на украинском языке. 4. Государственный стандарт Украины "Молоко коровье цельное. Требования при закупках." Заключительная редакция одобрена 18.02.97г. Кабинетом Министров Украины, подана Госстандарту Украины для регистрации (на украинском языке). 5. Практикум по ветеринарно-санитарной экспертизе с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства и растениеводства (для высших учебных заведений - на украинском языке).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения общей бактериальной обсемененности с идентификацией микроорганизмов по классам молока; уровень контаминации сборного молока различных классов психротрофными, термостойкими и мезофилыгыми анаэробными лактатсбраживающими бактериями;

обоснование предельно допустимой концентрации психротрофных микроорганизмов в сборном молоке;

- ускоренные методы и средства выделения и идентификации Р. аегц^шока из сборного молока и смывов с молочного оборудования;

- результаты ычуи^пчя~ирпптга-1.-гч1тпминр1п«<_и пигшрой состав мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов, наиболее часто встречающихся в сыром молоке;

6

- ускоренные методы и средства выделения мезофилъных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов из сборного молока;

- результаты бактериологических исследований молока с пороками "горькое" и "тягучесть";

- результаты влияния солевого и белкового состава молока на его термоустойчивость;

- методы ветеринарно-санитарлой экспертизы молока при его контаминации некоторыми технологически опасными микроорганизмами.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава Белоцерковского государственного аграрного университета (г. Белая Церковь, 1987-1996 г.г.), координационных совещаниях по итогам научных исследований во ВНИИВСГЭ (г.Москва, 1987-1996 г.г.), научно-технической конференции (г. Москва, 1993), научной сессии (г.Углич, 1993), республиканской научно-практической конференции (г. Днепропетровск, 1994), Украинской конференции молодых ученых (г.Киев, 1994), научно-практической конференции, посвященной 70-летию Витебского ветеринарного института (Витебск, 1994), Всероссийской научно-производственной конференции (г. Чебоксары, 1994), научно-практической конференции, посвященной 75-летию Белоцерковского государственного сельскохозяйственного института (г.Белая Церковь, 1995), республиканской научно-практической конференции (г.Белая Церковь, 1995), Первой Всеукраинской научно-практической конференции ветеринарных патологов (г. Киев, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 работ, 4 предложения признаны изобретениями (положительные решения о выдаче патентов).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 297 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения материала, выводов, предложений для практики, списка литературы и приложений. Материал иллюстрирован 43 таблицами, 18 рисунками, 10 графиками. Список литературы включает 327 наименований, в том числе 173 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования. Работу проводили на молочных заводах Киевской (Белоцерковский, Володарский, Сквирский) и Московской (Люберецкий) областей, в также в хозяйствах Белодерковского и Володяпского районов Киевской области и Щелковского района Московской области.

Комплексные лабораторные исследования при определении общей бактериальной обсемененности молока, технологически опасных микроорганизмов, группового и видового состава бактерий, исследования по разработке методов выделения мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов и P. aeruginosa проводили на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы и патологической анатомии Белоцерковского государственного аграрного университета, в лабораториях санитарии молока и профилактики мастита и санитарной микробиологии и вирусологии Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии, Центральной научно-производственной ветеринарной лаборатории Российской Федерации.

В опытах были использованы 5 культур мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов ( Cl.butyricum, CI. tyrobutyricum, CI. tertium, CI. lentoputrescens, Cl.sporogenes), полученные из Всероссийского научно-исследовательского института маслоделия и сыроделия, по одной культуре P. aeruginosa, P. fluorescens, E.coli, S. aurens, S. agalactiae, S. faecaiis, P. vulgaris, B. subtilis, B. cereus, полученные из ВИЭВ, по одной культуре A. aerogenes, М. luteus, М. viscosus, М. varians, полученных из лаборатории технологически опасных микроорганизмов НИИ микробиологии и вирусологии mi. Д.К. Заболотного (г.Киев).

Определение общего количества бактерий проводили в чашках Петри по ГОСТу 9225-84. Для учета психротрофной микрофлоры засеянные чашки культивировали при 7°С в течение 7-10 суток. Количество термостойких бактерий определяли после прогревания проб при 65°С в течение 30 минут с последующим охлаждением проточной водой. Инкубацию посевов на МПА осуществляли при 30°С - 72 часа. Мезофильные анаэробные лактатсбраживающие микроорганизмы

(' целью изучения группового состава микрофлоры молоканами-применялись методики с использованием селективных питательных

сред для выделения лактококков, стафилококков, микрококков, псевдомонад, энтерококков, бактерий группы кишечной палочки (БГКП), коринебактерий, дрожжей и плесеней.

Определение протеолитических бактерий проводили по В.М.Богданову, 1967 и Р.Г.Алагезяну, 1981. Определение свободных жирных кислот проводили в жиромере Бабкока. Термоустойчивость молока и пороки вкуса и запаха - общепринятыми стандартными методами, активную кислотность молока - рН-метром ОР-201.

Результаты исследования обрабатывали методами вариационной статистики по А.М.Шевченко, В.С.Богораду, А.П.Яворскому, 1985.

В процессе выполнения работы бактериологическому исследованию подвергнуто 3583 пробы сборного молока, из них 386 -сборного пастеризованного молока, 129 проб воды, 46 проб подстилки, 54 - корма, 1028 - смывов с молочного оборудования и посуды; проведено 2486 физико-химических исследований сборного молока.

Для опыта было отобрано 200 белых мышей, 160 из которых заражали Р. аеги^поза подкожно, 35 - внутрибрюшинно и 5-рым подкожно вводили физраствор (контроль). Из 200 мышей, использованных в опыте, пало 148.

Быстрыми маститными тестами исследовали 4648 коров на заболеваемость различными формами мастита.

При исследовании молока на термоустойчивость использовали 583 пробы сборного молока. В лабораторных опытах использовано 837 образцов молока для этих целей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Изучение состава микроорганизмов сборного сырого молока

Изучение состава микроорганизмов проводили по классам молока в соответствии с ГОСТ 13264-88.

Проведенные исследования 58 проб молока высшего класса показали, что его общая бактериальная обсемененность мезофияьными микроорганизмами составляла 227,4 ± 30,9 тыс./см3, т.е. 88,63% от общего количества выделенных бактерий. Психротрофные микроорганизмы составляли 11,26% от общего количества. Термостойкие - выделены в 0,11% случаев.

В молоке I первого класса общая бактериальная обсемененность мезофильными микроорганизмами составляла 426,0 ±61,8 тыс./см , что соответствует 89,96% от общего количества выделенных бактерий.

Г! жротрофных микроорганизмов обнаруживали а 9,86%. Термостойкие бактерии выделены в 0,18% случаев.

Исследования 109 проб молока сборного, относящегося ко II классу показали, что в нем преобладали мезофильные микроорганизмы, которые составляли 71,03% от общего количества выделенных бактерий. Психротрофные микроорганизмы также обнаруживали в значительном количестве ( 28.82% от общего числа). Термостойкие бактерии выделены в 0,15% случаев. По сравнению с молоком высшего и I классов по бактериальной обсемененности значительно повысилась контаминация его психротрофными (40,57%) и незначительно - термостойкими бактериями (0,22%).

Выделенные культуры мезофнльных микроорганизмов высевали на дифференциально-диагностические среды для определения их групповой принадлежности. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Результаты проведенных исследований показали, что по групповому составу выделенных микроорганизмов молоко высшего, I и И классов по бактериальной обсемененности, на первый взгляд, отличается незначительно, но в количественном отношении разница существенная. Так, согласно проведенным исследованиям, в молоке И класса резко уменьшено число лактококков (до 58,15%), тогда как высшего и I класса их число составляло 82,1 и 78,03% соответственно (от общего количества мезофильных микроорганизмов). Все другие группы бактерий при этом играют значительно меньшую роль, хотя с ухудшением класса молока явно наблюдается увеличение количества стафилококков, БГКП, энтерококков, стрептококков, микрококков, коринебактерий, дрожжей и плесеней. Следует отметить высокое содержание психротрофных, термостойких и мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов, оказывающих влияние на технологические свойства молока.

Учитывая то, что классность молока является наиболее универсальным показателем об условиях получения молока, проведены исследования по гарантированному получению молока высшего и першого сортов. Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что для гарантированной сдачи молзаводу молока высшего сорта его общая

бактериальная обсемененность не должна превышать 50 тыс. /см3, а

I сортом - не более 100 тыс./см'. При Микробном—числе— свежевыдоенного молока от 100 до 300 тыс., его приемка на заводе в 25% случаев идет второсортным. Кроме того, анализ приведенных

10

данных показывает, что получение молока высшего сорта возможно только в случае, если не менее 100% смывов с молочного оборудования будет иметь микробное число не более 10 тыс., а для получения молока I сорта - не менее 96 % смывов будет иметь микробное чисто не более 10 ты с./см".

Такта« образом, для сдачи молока на перерабатывающие предприятия высокого санитарного качества, согласно нашим исследованиям, микробное число свежевыдоенного молока должно быть не более 50-100 тыс./см1 при коли-титре не меньше 0,01;

Таблица I.

Данные по выделению мезофильных микроорганизмов изсборного молока высшего, I и II классов по бактериальной обсемененности

Микроорганизмы Количество выделенных м.о. в зависимости от класса, тыс7с.\г

Высший, М+гп % I. М±т % 11, М±т %

Стафилококки 2,3+0.4 1,01 6,4+2.1 1,50 36,3+15,17 5.92

БГКП 4,6+1.21 2,02 18,6+3,7 4.37 56,0+12,36 9,14

Стрептококки 24.313.64 10,69 46.715,8 10,% 86.3+24.13 14.09

Энтерококки 1,3+0,06 0.57 4.6+0.6 1,08 24,7+0,8 4,03

Микрококки 3.6+0,32 1,58 7,4+1,2 1,74 18.4+11,2 3,0

Корннебактерик 3,8+1,2 1,67 8,7+2,4 2,04 25,8+3,3 4,21

Лл кто кокки 186,7+23.84 82.1 332,4+36,7 78.03 3563+98.46 58,15

Дрожжи и плесени 0.8±0.23 0,35 1.2+0,34 0,28 8,9+0.9 1,45

при этом микробное число смывов с молочного оборудования - не более 10 тыс./см' при коли-титре более единицы, и при соблюдении существующих санитарно-гигиенических требований в процессе хранения и транспортировки молока.

Микрофлора "горького" молока и молока с пороком "тягучесть"

Известно, что пороки молока возникают вследствие изменения физико-химических и биохимических свойств молока, его микробиологического состава. Такие изменения обычно наблюдаются при воспалении молочной железы и других неблагоприятных факторах.

В связи с этим свои экспериментальные исследования мы начали с изучения взаимосвязи качества молока и появления пороков с заболеванием коров маститом. При этом установили, что прямой

П

••;овиеимости пороков молока "горькое" и "тятучеетъ" от мастита в стаде не отмечали. Это свидетельствует о том, что заболеваемость коров маститом не является основной причиной появления пороков молока ("горький" вкус, "тягучесть" и др.).

Для установления причин появления в молоке горького вкуса проведено обследование нескольких ферм, сдаваемое молоко которых имело этот порок. При обследовании обращали внимание на условия кормления, содержания, диагностику мастита коров, санитарное состояние ферм и доильного оборудования.

Следует особо подчеркнуть, что на данных фермах регулярно проводилось обследование коров на заболеваемость маститом, а также осуществлялась соответствующая его профилактика. При проведении клинических и лабораторных исследований на заболевемость коров маститом количество больных животных не превышало 1,5-2%. Кроме того, на фермах соблюдались санитарные правила при доении и первичной обработке молока.

В то же время, как правило, в одном танке-охладителе сливали молоко из трех удоев: дневного, вечернего и утреннего. Первичное охлаждение молока до его поступления в емкость для охлаждения происходило в потоке.

Пробы сборного молока отдельных удоев, воду, смывы с молочного оборудования высевали на общую бактериальную обсемененность (ОБО), БГКП, стрептококки, стафилококки, мезофильные анаэробные лактатсбраживающие микроорганизмы и психротрофные бактерии. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Из приведенных данных в таблице 2 видно, что обсемененность молока и молочного оборудования лсихротрофными

микроорганизмами в несколько раз превышало общую бактериальную обсемененность, т.е. значительно преобладало, особенно в сборном молоке всех трех удоев и смывах с танка охладителя. Исследованиями свободных жирных кислот (СЖК) в молоке было установлено, что в свежевыдоешюм молоке их наличие колебалось в пределах 0,2-0,4° СЖК, а в молоке из трех удоев - 0,8-1,4° СЖК. Кроме того, необходимо отметить, что в 76% случаев при выделении психротрофных микроорганизмов обнаружили бактерии из рода Pseudomonas (Р flimrpigc.pin<; и _ а в 24% - из рода

Alcaligenes u Achromobacter.

Нами было проведено исследование 160 проб сборного молока

12

до пастеризации и после таковой при температуре 65°С в течение 30 минут. Пробы параллельно выдерживали при температуре 20°С и 4-6°С в течении 6-ти суток. При этом установили, что горький вкус чаще появляется в пастеризованном молоке по мере его хранения. Исходя из этого, было проведено бактериологическое исследование такого молока. В нем преобладающей во всех случаях была психротрофная микрофлора (60-84%).

В связи с тем, что большинство психротрофов обладает сильной протеолитической и липолитической активностью, мы нашли, что они и могут вызывать этот порок, особенно в охлажденном пастеризованном молоке, когда уменьшается значение другой микрофлоры.

В лабораторных условиях мы провели исследование с искусственной контаминацией стерильного молока культурами психротрофных микроорганизмов, которые 1ими были выделены из проб "горького" молока. В течении суток определяли вкус контаминированного молока, выдерживая его при температуре 4-6°С и 20°С. Установлено, что в течение 6 часов появлялся горький вкус молока при обсеменении его психротрофами в количестве 1 млн. м.о. в 1 см3, причем за это время более отчетливее горький вкус в молоке, хранившемся при комнатной температуре, чем в условиях холодильника. Появление горького вкуса молока можно объяснить как образованием в молоке продуктов протеолиза и липолиза, так и лротеолитических и липолитических ферментов, вырабатываемых психротрофными микроорганизмами.

Не исключая возможности появления горького вкуса молока, вызванного другими группами бактерий и, учитывая технологию получения, хранения, первичной обработки молока, мы пришли к заключению, что горький вкус молока, равно как и приготовленных из него молочных продуктов, возникает из-за обильного обсеменения его психротрофными микроорганизмами, вследствие хранения такого молока при пониженных температурах. При комнатной температуре в наших исследованиях порок возникает, если обсеменение его психротрофами составляло не менее 1 млн м.о./см3.

Для дифференциации с целью ветеринарно-санитарной оценки молока по выявлению горького вкуса микробиологического происхождения от кормового или каких-либо других факторов мы поставили эксперименты с внесением 1-1,5 см3 "горького" молока в 100-150 см3 стерильного натурального молока. При внесении "горького" молока микробиологического происхождения с

13

1аблица2.

______________________________, _______________ ...... ..... , „.. ания

Наименование образцов Кол-во «сслед. проб Выделенные м.о., (тыс./см', тыс./см2)

ОБО БГКП Стафилококки Стрептококки Мезофильные анаэроб, л-сб. м.о Р.аеп^тоБа Псахротроф-1 ные бактерии

Молоко сборное всех трех удогв 12 816+112,0 19,3 14+2 89+37 0,02 0,4+0,12 80+60

Молоко сборное отдельных удоев 15 162+24 1,2+0,3 1,5+0,5 48+6 0,007+0,003 0,02+0,01 140+60

Питьевая вода 7 88+8 - - 6+2 - - 10+2

Смывы с молочного оборудования 26 128+64 10+4 1,2+0,6 12+4 12+0,007 0,32+0,12 60+120

Смывы с танка охладителя 15 84+12 12+6 0,6+0,2 8+2 0,08+0,002 0,24 340+130

контаминацией в 1 млн. микробных клеток/см3 горечь пояшгалаеь через 4-6 часов; при меньшей контаминации (200-300 тыс./см3 ) -через 24 часа.

В то же время при внесении в стерильное молоко "горького" кормового происхождения или вызванного какими-либо другими факторами (например, молока от коров запускного периода) изменение вкуса, т.е. появление горечи, не происходило . Этот метод предлагается для дифференциации горького молока.

Особого внимания также заслуживает порок молока "тягучесть", который мы изучили в производственных и лабораторных условиях.

В производственных условиях - КСП "Заря" Фастовского района Киевской области мы подробно изучили этот порок с постановкой ряда экспериментов.

Для установления причины появления порока мы исследовали молоко на разных этапах его получения органолетггаческими и бактериологическими методами. Порок "тягучесть" появлялся в течение 2-3 часов после доения в сборном молоке и при опускании в такое молоко ложки или мутовки, а затем вынув их, стекающее молоко образовывало длинные нити. Результаты микробиологического исследования по изучению порока "тягучесть" представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты бактериологического исследования молока с пороком "тягучесть"

Пробы молока Выделенные м.о, тыс./см'

А.асго»епс5 М. Уг^оуия Рзеидотопаз БГКП

Сборное с пороком "тягучесть" 550,0 120,0 18,0 56,0

Молоко с возникшим пороком после добавления ячменной соломы 750,0 68,0 - 12,0

Молоко с нестойким пороком, находящееся на скотном дворе 56,0 320,0 - 230,0

Фляжное молоко 84,0 18,0 6,5 36,0

Молоко из доильных ведер 68,0 12,0 6,0 24,0

Анализируя полученные нами данные (табл. 3), необходимо отметить, что преобладающими видами микроорганизмов в сборном молоке с пороком "тягучесть" были A. aerogenes и М. viscosus, хотя значительное количество составляли также БГКП и P. fluorescein. Молоко, являясь хорошей питательной средой для развития микроорганизмов, послужило причиной их интенсивного развития ( в наших исследованиях до 750 тыс./см3 A. aerogenes, и 320 тыс./см" М .viscosus), что и послужило возникновению стойкого порока. В го же время из отдельных четвертей вымени молоко не содержало вышеуказанных бактерий.

При выявлении причин порока "тягучесть" нам необходимо было исследовать качество воды и кормов. Микробиологический состав воды в основном был представлен P. fluorescens - 18 тыс./см3, микрококками - 9 тыс. /см3 и БГКП - 0,2 тыс./см'. Общая бактериальная обсемененность зеленой массы и комбикормов была достаточно высокой и составляла свыше 500 тыс./1 г. В то же время из выделяемых нами микроорганизмов, кроме незначительного количества БГКП ( 0,003-0,2 тыс./1г) и микрококков (1,5-1,8 тыс. в 1 г) других бактерий, которые могли бы участвовать в образовывают порока, не было обнаружено.

В связи с тем, что в существующих "Рекомендациях по диагностике, профилактике и мерам борьбы с пороком молока "тягучестью" (1988) указывается, что он вызывается A.aerogenes, нами был проведен следующий эксперимент. Имея чистые культуры A. aerogenes, М. luteus, М. viscosus, М. varians (любезно предоставлены институтом микробиологии , г. Киев) мы обсеменили свежее молоко этими видами микроорганизмов. При этом установили, что A. aerogenes в концентрации до 800 тыс. микроорганизмов в 1 см3 не вызывал порока "тягучесть" и только в большей концентрации появляется "слабая тягучесть", которая при тщательном перемешивании молока исчезала. Появление хорошо выраженной тягучести молока наблюдалось при концентрации этого ввда 1 млн. 100 тыс. - 1 млн. 200 тыс./см3. Однако уже при концентрации 300 тыс./см3 A. aerogenes и 60-80 тыс./см3 М. viscosus появлялся хорошо выраженный порок молока "тягучесть". М. viscosus и М. varians такой способностью не обладали. Сам же М. viscosus вызывал этот порок только при концентрации его в молоке 800 тыс. - I мл1Г200тыс-с-1-см1 При этом порок не всегда был резко выражен. ~ "

На основании проведенных исследований мы сделали вывод, что А. aerogenes вызывает "тягучесть" молока в присутствии чаще всего M.viscosus, хотя в большой концентрации (свыше J млн. микроорганизмов в 1 см3) может вызвать порок молока самостоятельно.

Таким образом, порок молока "тягучесть" возникает при высокой контаминации его этими микроорганизмами в монокультуре (800 тис. - 1,2 млн./см3), хотя в ассоциации их достаточно в количестве 300 тыс./см3 А. aerogenes и 60-80 тыс./см3 М. viscosus.

Контаминация сборного молока психротрофными микроорганизмами при его получении и переработке

Следующие экспериментальные исследования мы начали с изучения общего количества психротрофных микроорганизмов в молоке, а также подвергли дифференциации выделенные бактерий? Исследование видового состава проводит с целью выяснения допустимого уровня психротрофных микроорганизмов с точки зрения образования пороков. Всего было подвергнуто экспериментальному изучению 928 проб сборного молока. При этом значительную часть микроорганизмов молока, полученного в традиционных условиях, составляли психротрофные бактерии. Общее количество психротрофных микроорганизмов равнялось при этом 248,6+28,7тыс./см3, из них псевдомонад - 127,6 + 17,9 тыс./см3. что в среднем соответствовало 51,33% от общего количества всех психротрофов. К наиболее распространенным родам психротрофных бактерий, которые были обнаружены нами в молоке относятся, кроме Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter и Alcaligenes.

При изучении источников психротрофных микроорганизмов, проводили их выделение из воды, применяемой для санитарной обработки доильного оборудования и молочной посуда, а также подстилки, кормов, кожи животных и др. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Анализируя проведенные нами исследования (табл. 4), можно сделать заключение, что одним из основных источников психротрофных бактерий является вода, применяемая для санитарной обработки доильного оборудования. Следует отметить, что смывы с молочного оборудования, стерилизованного паром, содержали меньшее количество психротрофных микроорганизмов ( в половине всех смывов

Таблица 4.

Результаты но выделению психротрофных бактерий из обьектов внешней среды

Объекты выделения Кол-во исследован, проб Т7_ измерения Кол-во выделенных психотрофных м.о., М+ш

Вода молочных заводов 28 тыс./см3 438,26±410,18

Вода из молочных ферм 36 тыс./см3 589,7+362.9

Доильные стаканы после ополаскивания водой 68 тыс./см2 1,6+0,4

Доильные стаканы после стерилизации паром 46 КОЕ/см2 5+4

Смывы, взятые с гладкой поверхности молочных танков 38 КОЕ/см2 40+20

Смывы, взятые с кранов молочный танков 26 тыс./см2 146,29+64,32

молочные фляги 64 тыс./см2 5,8+3,6

Смывы с молокоиро -водов после санитарной обработки 43 тыс./см2 1,4+0,3

Смывы с молокопро-водов только после ополаскивания водой 28 тыс./см2 8,7+4,3

Соломенная подстилка 46 млн./г 3,8+14

Грубый корм 28 млн./г 26+12

Комбикорм 26 млн./г 23+7

они отсутствовали) по сравнению со смывами, взятыми с оборудования после дезинфекции, проведенной химическим способом (гипохлоритом натрия или кальция). При химической обработке молочного оборудования во всех случаях выделены психротрофные микроорганизмы.

Таким образом, санитарная обработка доильного оборудования -Tf-f.fr> ппыш.гу тяцкрв с холодильными установками требует постоянного

контроля за их состоянием. -----

С целью определения обсемененности сырого молока

18

психротрофами и влияние температуры хранения на скорость их размножения проводили исследования молока с момента его получения до доставки па молокоперерабаты вагощие предприятия. Исследовати таюке сборное молоко из емкостей для хранения на молокозаводах. В результате установлено, что около 75% опытных образцов сборного молока при доставке на молочный завод или отобранных на заводе из емкостей для хранения сырого молока содержали более 1 млн./см3 психротрофных микроорганизмов. Молоко, доставленное на завод с фермы сразу же после дойки в неохлажденном виде, содержало в среднем 47 тыс./см3 психротрофных бактерий.

Наибольшее увеличение психротрофных микроорганизмов в молоке наблюдали во время его хранении при 9-10°С. Психротрофные бактерии в молоке, хранившемся при 9-10°С в течении 12-14 часов, составляли около половины от общего количества бактерий.

Несмотря на способность размножаться при низких температурах, скорость их роста соответственно зависит от температуры. Для изучения влияния температуры хранения на размножение психротрофных микроорганизмов отбирали пробы молока, полученные из отдельных хозяйств. Исследования проводили при 3° - 5°, 7° - 8° и 10° - 12° С. Молоко при каждой температуре хранения делили на три части: первую порцию молока выдерживали при заданной температуре без какой-либо предварительной обработки; в колбу со второй порцией молока вносили культуру P.fluorescens, после чего его хранили при заданных температурах; молоко в третьей колбе стерилизовали при 121°С в течении 10-15 минут, охлаждали до заданных температурных режимов хранения и инокулировали культурой P.fluorescens в такой же дозе, как молоко второго варианта.

В таблице 5 показано изменение общего содержания бактерий и количества психротрофных микроорганизмов в сыром молоке в зависимости от температуры его хранения. Повышение температуры хранения с 4-5 до 10-12°С существенно ускоряло размножение психротрофных микроорганизмов и бактерий в молоке со сравнительно низкой первоначальной бактериальной обсемененностью (55 тыс./см*). Средняя удельная скорость размножения психротрофных микроорганизмов при 10° - 12°С была выше, чем за первые 24 часа инкубации в 1,86 раза, за 48 часов инкубации - в 2,04 раза (таблица 5). Время удвоения биомассы составило соответственно 4,3 и 9,8 ч в первые 24 часа инкубации и 4,6 и 10,2 часа - за 48 часов хранения. Для сравнения время генерации Pseudomonas fluorescens при 10°

19

Таблица 5.

Изменение общего количества микроорганизмов и психотрофных бактерии в молоке в зависимости от температуры его хранения

ОБО, тыс/см3. К-во

Молоко Темпера- Время психотрофных М О.,

тура хра- хране- М±ш TbIC./CM3^iyi+m

нения, °С ния, ч

- 0 55,0+26,0 8,0+0,4

Сырое с низ- 4-5 24 85,25+37,4 15,68+3,6

кой бактери- 7-8 24 107,42+48,1 21,27+5,8

альной обсе- 10-12 24 158,98+67,3 29,62+6,2

менностью 4-5 48 117,65+39,8 30,73+7,8

7-8 48 141,79+54,3 53,18+11,4

10-12 48 240,06+87,4 91,82+23,6

- 0 1748+332,4 536,7+97,8

Сырое с 4-5 24 2987,36±517,6 311,3+86,7

высокой 7-8 24 9263,82+612,4 296,4+78,2

бактери- 10-12 24 16845,18+816,2 187,3+72,6

альной обсе- 4-5 48 5073,46+713,4 336,2+78,9

менностью 7-8 48 28285,93+618,7 323,4+71,8

10-12 48 46089,1+816,2 143,49+51,7

- 0 - 1500

Стерилизован- 4-5 24 - 4290

ное, инокули- 7-8 24 - 3970

рованное 10-12 24 - 3275

культурой 4-5 48 - 9867

Р.ЯиогеБсепз 7-8 48 - 7392

10-12 48 - 6928

и 4°С согласно литературным данным R. Richter, (1979), равнялось 5,5 и 10,5 часов соответственно, что близко к полученным нами результатам.

Одновременно с содержанием психротрофных микроорганизмов возросло и общее количество бактерий при всех температурах хранения. Средняя удельная скорость роста общего содержания бактерий была ниже скорости размножения психротрофов, но, скорее всего, разница между способностью размножения психротрофных и тп1«чпф»ггп.нт.1У чнуроорганизмов была еще выше, так как согласно Определению Психротрофных баугррии~кта-итгарлпргешгамы лдтптия рост при 4-5 °С относятся к этой группе. Замедленный рост можно

объяснить тем, что за 10 суток при 7°С не все клетки психротрофных бактерий успели образовать колонии, а при температуре 30°С, применяемой при определении общего содержания бактерий, они образовали колонии на питательном агаре. Поэтому правомерно считать, что весь прирост бактериальной массы при 4-8°С и большая часть прироста при 10-12°С произошла за счет психротрофных микроорганизмов. Следует иметь в виду, что степень психротрофности даже у клеток одного и того же вида различна, поэтому соотношение между самими психротрофными бактериями во время инкубации мешегся в пользу вариантов, обладающих большей удельной скоростью развития при низких температурах. В этом случае больший процент клеток психротрофных бактерий сумеет образовать колонии за 10 суток при 7°С и разница между содержанием психротрофных и общим количеством бактерий по мере увеличения продолжительности хранения молока при низких температурах должна уменьшаться.

Иначе происходило развитие психротрофных микроорганизмов в сыром молоке с высокой первоначальной загрязненностью бактериями. Удельная скорость их роста при всех температурах была в несколько раз ниже, чем в молоке с низкой бактериальной обсемененностью. Причем их количество при вышеуказанных температурах хранения снижалось. При 10-12°С в период с 24 до 48 часов продолжалось снижение количества интенсивного роста психротрофных бактерий.

Следовательно, психротрофные микроорганизмы не были основной микрофлорой ни при одной температуре хранения. Абсолютное их содержание в молоке после 48 часов хранения при 10-12°С было в 2,25 раза меньше, чем в молоке при 7-8°С.

Проведенные исследования показывают, что в молоке с высокой бактериальной обсемененностью микроорганизмами, обусловленной его нахождением при повышенных температурах до момента доставки на молочный завод, развитие психротрофных бактерий во время хранения при 4-12°С в значительной степени подавлено другой микрофлорой (особенно во время его хранения при 10-12°С). Быстрое нарастание кислотности сырого молока свидетельствует о том, что в этом случае доминирующей микрофлорой в нем являются, скорее всего, лактококки, а ингибирующий рост психротрофных микроорганизмов фактором - снижение рН среды до 5,8 (при 7-8°С) и 5,3 (при 10-12°С) и повышение титруемой кислотности до 33°Т (при 7-8°С) и 48°Т (при

21

1<Н2°С) При этом в период с 24 по 48 часов микрофлора молока оказывала не только бшпсриосгатичсское, но и заметное бактерицидное

^"дополнительное обсеменение сырого молока с низкой исходной бактериальной обсемененностью псевдомонадами,

- - - ПО

IttVJJAVMv«-» у -----

ДОМИНИРУЮТ В ПСИХрОТрОфНОЙ МШфОфЛиро ^

удельную скорость роста психротрофных бактерии при 4-5 Си уменьшало при 7-8° и Ю-12°С. Увеличение удельной скорости роста ^—Температуре связано с тем, что после инокул,фОВания молока псевдомонадами они составили абсолютное

психротрофных, а псевдомонады обладают сравнительно высокой —ГрГно« в молоке, гораздо труднее обьясшш, _е скорое™ роста психротрофных бактерии в молоке при 7-8 и 10-12 L.

при массовом обсеменении его псевдомонадами.

Как следует из проведенных нами предающих исследовании исих^ Г— —вать негативное — на =о молока при их содержании в нем более 1 млн/см . Учитывая время гшеоадии при 4-5°С, их количество за 27 часов возрастало в 8 раз. Следовательно, с точки зрения потенциальной опасности влияния псГо^фнь« бактерии на качество молока, как исходного сырья дая "ei ~х продуктов, оо^о ^ консервов продуктов детского питания при 4-5 С молоко можно

пс^~и T^Z^ — экспериментов, р.но 6 «Гг Следовательно, за сутки они при этой температуре делают tibJe mrepai В этом случае молоко можно хранить в течении «WM содержании в нем психротрофных бактерии не Z 3. ПРиА10Р-12^С можно хранить молоко ^лько с очень

низким исходным содержанием микроорганизмов (10 /см

Учитывая что при пастеризации молока большинство ™ интепесно было выяснить влияние высоких

TS

эГо Дфоса в опытах использовали различные температурные

Р6ЖИМЫ Проводили нагревания 215 проб молока I и II класса по бактери^иойХш^шосгн-при-б^ г ЯП-МИ^Й выдержкой, SS? ™психротрофных микроорганизмов,

которые при этом погибали. 22

В другой серии опытов культуры бактерии Pseudomonas сначала выдерживали от одного до семи суток на питательной среде. Далее пастеризованное молоко при 65 °С обсеменяли этими культурами. Все культуры бактерий выдерживали действие указанной температуры на протяжении 0,5 минут и гибли через 1-2 минуты в зависимости от количества микроорганизмов в 1 см3. При контаминации до 2,5 тыс./см3 гибель бактерий отмечали через 1 минуту, а свыше - через 2.

Пастеризацию молока ( 65°С - 30 минут), которое содержало от 102 до 106 клеток в 1 см3 бактерии видов P.fluorescens и A.tolerans выдерживало небольшое количество клеток. И это в значительной степени зависело от начального количества микроорганизмов.

После пастеризации молоко выдерживали в течении 10 суток при 5°С. Исследования показали, что бактерии Pseudomonas не обнаруживали даже после 10-дневного выдерживания, когда их начальное количество было ниже 104 клеток/см3. Alcaligenes tolerans были более термостойкими

Исходя из этого можно считать, что среди психротрофных бактерий имеются более теплостойкие формы , особенно при обильном обсеменении ими молока. Поэтому нами были выделены теплостойкие формы бактерий из молока, которое подвергали пастеризации при 72°С в течении 1-2 минут и выдерживали при 7°С сутки.

Полученные данные показали, что с повышением концентрации психротрофных бактерий в молоке, особенно их теплостойких форм, количество выживших бактерий после пастеризации повышается. В связи с этим необходимо повышать температуру пастеризации или время пастеризации.

Проведенные исследования свидетельствуют, что некоторое количество клеток психротрофных микроорганизмов может оставаться в молоке после пастеризации, однако абсолютное их большинство гибнет. Поэтому нами были проведены исследования по выявлению количества психротрофных бактерий в сыром молоке при поступлении на молокоперерабатьгвающие предприятия, после проведения пастеризации и в постпастеризационный период.

В сыром молоке, поступающем на Белоцерковский, Володарский Киевской области, Люберецкий Московской области молочные заводы, количество психротрофных микроорганизмов колебалось от 250 тыс. до 1,5 млн.клеток в 1 см3 и составило от 40,5% до 85% от общего количества бактерий в молоке. Наибольшее

•.олачество этих микроорганизмов обнаруживали в оееннз-зимний период, когда сравнительно низкая температура молока задерживала рост молочнокислой микрофлоры.

В молоке, отобранном после пастеризации обнаруживали 10-100 клеток психротрофных микрооргагшзмов в 1* см3 молока. Однако после прохождения его через технологическое оборудование отмечали увеличение количества психротрофных микроорганизмов. Их в молокохранительном ганке было в среднем 25,0 + 0,8 гыс./см3, т.е. увеличилось по сравнению с количеством после пастеризатора в сотни раз. В бутылке или пакете после разливочно-укупорочного автомата количество психротрофных микроорганизмов достигало 74,0+32,0 тыс./см\ т.е. после разлива количество психротрофных микроорганизмов увеличилось в 3 раза.

В процессе хранения при низких температурах происходило увеличение психротрофных бактерий. Кроме того, следует отметить, что увеличение психротрофных микроорганизмов при температуре 6-8°С происходит интенсивнее, чем при 2-4°С. Поэтому для повышения сроков хранения молока необходимо рекомендовать температуру 2-4°С.

Разработка методов выделения и идентификации P.aemgmosa из проб сборного молока и смывов с молочного оборудования.

Существующие методы выделения и идентификации P.aeruginosa трудоемки, длительны за счет многоэтапное™ исследований и требуют большого набора реактивов, отдельные из которых являются дефицитными и дорогостоящими. Поэтому для установления приемлемой питательной среды для культивирования P.aeragiaosa, нами были апробированы широко применяемые питательные среды, среда с цетримидом, CN-цетилперидиния хлоридом, СА-03, среда с антибиотиками.

Нам необходимо было выяснить их селективные свойства, чувствительность и скорость роста. С этой целью были поставлены лабораторные опыты. Выбор гетерогенных культур был связан с частотой встречаемости этих микроорганизмов в молоке (секрете молочной железы) и смывах с доильного оборудования. В опыт были взяты следующие культуры: P.aeruginosa, P.fluorescens, E.coli, S.aureus, S.agalactiae, S.fäecalis, Proteus vulgaris, В. subtilis, B.cereus.

,-. Проведенные—исследоБанпя—ппь-я->ящ что наибольшей чувствительностью обладали среды: с цетримидом, СА-03, ТТХ, с

этонием, с антибиотиками. С. лучшими селективными свойствами оказались питательные среды с цетримидом и СА-03 (на них помимо P.aeruginosa росли только два ввда посторонней микрофлоры). При этом следует отметить, что на этих средах проявлялось и пигментообразование. Скорость же роста на всех средах была примерно одинакова, за исключением небольшого ускорения роста на среде СА-03 и с этонием.

Проведенные опыты показали, что все испытанные питательные среды не обладают достаточно высокими селективными свойствами и поэтому выделенные культуры требуют дальнейшей идентификации.

Нами были апробированы три схемы выделения и идентификации P.aeruginosa.

1 -я схема, взята из "Методических указаний по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров", утвержденных бывшим ГУВ МСХ СССР в 1983 году, 2-я - из "Методических указаний по выделению и идентификации культур синегнойной палочки из спермы и материала генигалиев сельськохозяйственных животных", утвержденных ВАСХНИЛ в 1982 году, 3-я - из методических рекомендаций "Выделение и идентификация штаммов синегнойной палочки из клинического материала", утвержденных в 1984 году.

Выделение P.aeruginosa из молока проводили согласно "Методическим указаниям по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров" (1983).

При использовании 3-х схем выделения и идентификации P.aeruginosa выделено 32 культуры синегнойной палочки. При сравнительном изучении описанных схем выделения и идентификации P.aeruginosa оказалось, что схема, рекомендуемая в "Методических указаниях по выделению и идентификации синегнойной палочки из спермы и материала гениталий сельскохозяйственных животных", наиболее трудоемка - требует для идентификации постановки 18 тестов при посеве на 14 питательных сред. Кроме того, постановка всех тестов занимает 6-7 дней. Схемы, рекомендуемые для выделения P.aeruginosa из молока и клинического материала (разработанная ИЭМ им. Гамалеи), состоит из 16 тестов и для них необходимо пересев на 12 питательных сред. Срок исследования - 3 дня.

В то же время для предупреждения заболевания людей и молодняка животных при контаминации молока P.aeruginosa и для

успешной борьбы с маститом псевдомонозной этиологии выделение P.aeruginosa необходимо проводить как можно в сжатые сроки и без снижения достоверности полученных результатов. Тем более, что мастит, вызванный P.aeruginosa, обладает высокой конгагиозностью, поэтому длительные сроки проведения лабораторной диагностики затрудняют лечение и меры борьбы с ним.

В связи с этим мы поставили перед собой задачу разработать среду и наиболее приемлемую схему выделения и идентификации P.aeruginosa из молока и смывов доильного оборудования, которая была бы достаточно простой и вместе с тем более эффективной при использовании в практических условиях.

При разработке питательной среда мы исходили из того, что применяемые для культивирования P.aeruginosa питательные среды, обычно содержат ингибирующие соединения, которые не только подавляют конкурирующую бактериальную флору, но и оказывают нежелательное действие на эти бактерии. Поэтом)' нами была разработана питательная среда, свободная от ингибирующих соединений, которая основана на принципе хорошего роста P.aeruginosa в среде, содержащей аммиак, как источник азота и глюкозу в качестве источника углерода (Берги, 1978, 1980). Чтобы добиться максимально возможного селективного действия, мы взяли химическое вещество которое содержит аммиак в связанной форме. Им оказалась мочевина -самое простое и доступное химическое соединение, которое содержит аммиак и ацетат в связи кислота - амид. При этом известно, что немногие бактерии могут расщеплять мочевину и поэтому для большинства из них она непригодна. В то же время P.aeruginosa разлагает мочевину на аммиак и углекислый газ, которые и служат питательными веществами, необходимыми для собственного роста и развития этих микроорганизмов.

Учитывая, что серные соединения необходимы для образования бактериальных белков, среду дополняли ионами сульфата. Кроме того, P.aeruginosa нуждается в большем количестве углерода, по сравнению с азотом для построения собственных структур. Поэтому накапливается часть полученного аммиака и рН сдвигается в щелочную сторону. Сдвиг рН мы предотвращали с помощью добавления .фосфатного буфера. Ионы калия и особенно аспарагин облегчают

пйрячпияттр пигмрнтя I 1р>яг7п-^.пипс-«п?_:ч-ггупятрпкмяд (p^flfl в Работе

обозначена как Мь а среда М такого же состава без аспарагина. На

обеих средах P.aeruginosa растет идентично и различие состоит только в том, что на среде Mt практически всегда наблюдается пигментообразование, а на среде М оно часто отсутствует.

Испытания сред проводили в пяти повторностях. Для этого из суточных агаровых культур микроорганизмов готовили суспензии в стерильном физиологическом растворе (при помощи оптического стандарта мутности). Затем, методом последовательных серийных разведений, получали следующие разведения для P.aeruginosa 10, 100, 1000 кл./см3 (1:100000000; 1:10000000; 1: 1000000), а для P.fluorescens, E.coli, S. aureus, S. faecalis - 3 млн., 5 млн. кл./см3. Смеси вышеупомянутых культур готовили в разведениях 1000 и 10000 кл./см'\ На чашки со средами высевали по 0,1 см4 взвеси. После инкубирования при 37°С в течении 24 часов подсчитывали количество выросших колоний на питательных средах. После испытания предлагаемых сред М и Mi оказалось, что они обладают высокой чувствительностью и селективными свойствами.

Полученные данные о высокой чувствительности и селективных свойствах предлагаемых сред, позволили нам вынести их на комиссионную, а затем - производственную апробацию в Центральной научно-производительной ветеринарной лаборатории Российской Федерации.

На основании проведенных производственных испытаний комиссия пришла к заключению, что предложенные среды обладают высокими селективными и ростовыми качествами; они вполне пригодны для культивирования P. aeruginosa из первичного материала. Среду Mj можно считать дифференциально-диагностической, так как она и выросшие на ней колонии приобретают характерную для P.aeruginosa пигментацию.

В связи с этим комиссия сочла возможным рекомендовать разработанные питательные среды М и Mi для ускоренного выделения и идентификации P.aeruginosa с целью исследования молока и молочных продуктов в ветеринарных производственных и молочных лабораториях.

Таким образом, нами разработаны высокоэффективные питательные среды, которые позволяют сократить сроки выделения и идентификации P. aeruginosa до 1-2 тестов, занимающих 1-2 дня; т.е. срок исследования сокращается в 2-3 раза по сравнению с применяемыми и утвержденными методами. Применение сред

,.;ономиг трудовые затраты и расходы на исследование. Ускоренные способы выделения и идентификации Р.аепщшаза из молока и смывов с молочного оборудования позволят в короткие сроки выделять данный микроорганизм и профилактировать заболевание людей, молодняка животных и распрос транение инфекции.

Разработка методов выделения мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов из молока

Частоту выделения вегетативной формы и спор мезофильных анаэробных лактасбраживающих микроорганизмов изучали в пробах сборного молока высшего, первого и второго классов по бактериальной обсемененности по сезонам года.

Полученные результаты исследований с высокой достоверностью подтверждают вывод о том, что количество мезофильных анаэробных лактасбраживающих микроорганизмов в сыром молоке не зависит от общей бактериальной обсемененности, а скорее всего, связано с сезоном года. Независимо от класса молока количество их было максимальным в феврале-марте и октябре-ноябре, минимальным - в летние месяцы, во время пастбищного содержания скота.

Наиболее часто го молока мы выделяли С1.5рогс^епе8, причем почти 90% образцов исследованных проб содержали споры анаэробов в количестве от 0,3 до 70 в см3. В осенне-зимний период преобладали виды С1^гоЬи(упсигп и С1.Ьи1упаш1, а в весенне-летний - СГвроп^епБ, Олегйшп. СНеЩорий-езсепБ выделяли во все периоды года почти равномерно и в незначительном количестве по сравнению с другими видами.

Нами были проведены исследования по влиянию пастеризации молока на сохранность спор лактатсбраживающих клостридий. Полученные данные показали, что в большинстве случаев количество спор мезофильных анаэробных микроорганизмов после пастеризации наоборот увеличивается. Причем увеличение идет в основном за счет С1. гугоЫйупсит. Особенно ярко это прослеживается в летние месяцы, когда в сборном молоке С1.(угоЪи1упсшп мы не обнаруживали, а после проведения пастеризации и прохождения молока через технологическое ■пДлруяпиянир -¥|рт вид появлялся в продукте. По нашему мнению, выделение этого вида из молока после пастеризадшг-объясняется—в— основном неудовлетворительной санитарно-гигиенической обработкой

28

технологического оборудования и результатом приспособления Ci.tyrobutyricum к кислой рН. Действительно, молочнокислое брожение создает необходимый для развития Ci.tyrobutyricum окислительно-восстановительный потенциал, обеспечивает ее энергетическим материалом, защитой от конкуренции других микроорганизмов, благодаря снижению рН. Этот факт подтверждается еще и тем, что все известные в литературе штаммы этого микроорганизма выделены из силоса и сыров, где они развивались после окончания молочнокислого брожения.

Одним из актуальных вопросов для выпуска

высококачественных сыров является контроль сырья, осуществляемый по ГОСТу 25102-90 "Молоко и молочные продукты. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий". Учет результатов исследования согласно существующего стандарта проводят через 72 часа, что не устраивает молочную промышленность. В связи с этим возникла необходимость разработать высокоэффективный ускоренный метод выделения спор и вегетативной формы мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов из молока. С этой целью мы изучили культуральные, морфологические, ростовые свойства указанных бактерий и на этой основе предложили высокоэффективную среду для ускоренного выделения спор и вегетативной формы мезофильных анаэробных лактасбраживающих микроорганизмов КАЯ-1.

Однако для молочной промышленности наибольший интерес представляет обнаружение спор этих микроорганизмов, поскольку их вегетативные формы погибают при пастеризации . В связи с этим для выделения спор Clostridium мы разработали более доступную и дешевую питательную среду КАЯ-2. Исследование этих питательных сред проводили в сравнение со средой ЛАССА (ГОСТ 25102-90).

На первом этапе исследования проводили посев чистых культур микроорганизмов Cl.butyricum, CL tyrobutyricum, CI. sporogenes. Cl.tertium, Cl.lentoputrescens. Посевы культур после прогревания их в стерильном молоке при температуре 75 +1°С и 65+1 аС проводили в количестве 2, 3, 5, 7, 10 и 20 спор. Разработанные среды разливали по 5 см3 в пробирки и посевной материал вносили на дно, не допуская взбалтывания среды. Сверху посевы заливали слоем 15-20 мм расплавленного и охлажденного до 45 + 1°С водного агара и инкубировали при температуре 37 +1°С. Учет результатов исследования

•«роаодили через 18, 24, 36, 48 и 72 часа Рост определяли по разрыву столбика среды и изменению ее цвета из фиолетового в лазурный (КАЯ-1) и из красного в соломенно-желтый (КАЯ-2). Посевы спор на среду ЛАССА проводили в соответствии с ГОСТом 25102-90.

Проведенные исследования показали, что разработанные питательные среды являются высокочувствительными, так как они выявляли 2 и более спор испытуемых культур микроорганизмов в течении 72 часов, 10 и более спор - за 24 часа. В то же время на среде ЛАССА (контроль) мы обнаруживали рост только 7 и более спор С1.ЬШупсит и С1.1угоЬ1Цупсит , 10 спор О.зроп^епез и только 20 спор СЦегйит и С1. !ег1ори1ге8сепз через 72 часа. Таким образом, срок исследования на предлагаемых средах сокращается в 2-3 раза.

Итак, из проведенных нами исследований можно заключить, что при контаминации молока 10 и более спорами мезофильных анаэробных лактасбражившощих микроорганизмов на предлагаемых средах (КАЯ-1 и КАЯ-2) их можно выявить в течении 24-36 часов. Кроме того, среды обладают значительно большей чувствительностью, более демонстративны по цветовой реакции и образовании газа, а также доступны по своему составу.

Исходя из этого, питательные среды были вынесены на производственную апробацию, которую проводили в Центральной научно-производственной ветеринарной лаборатории Российской Федерации.

В результате проведенных испытаний комиссия рекомендовала питательные среды КАЯ-1 и КАЯ-2 для внедрения в практику лабораторных исследований с целыо выделения мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов для контроля качества молока, используемого в сыроделии, при выработке молочных консервов и продуктов детского питания. Разработанные среды позволяют проводить ветеринарно-санитарную экспертизу молока но количеству спор Оой&Мшп.

Изучение этиологических факторов, влияющих на термоустойчивость молока и усовершенствование метода ее

определения.

Одним из показателей качества сырого молока является (то ур.рмоустойчивость. которая характеризует пригодность молока для выработки стерилизованных —д тч пт™»™

питания. Принято считать, что молоко с низкой термоустойчивостью

30

поступает с молочных ферм при нарушении рационов кормления, условий содержания, а также связано с физиологическим состоянием животных и другими факторами.

Анализируя данные литературы, мы можем отметить, что этот вопрос изучен крайне недостаточно как с точки зрения причины появления низкой термоустойчивости молока, так и с точки зрения эффективных методов контроля этого показателя.

В настоящей работе исследовали значение некоторых факторов, определяющих стабильность молочных белков к тепловому воздействию при температуре 130°С: рН, солей, отдельных белковых компонентов и их взаимодействие. Для определения термостабильности использовался метод прямого измерения времени термоагуляции белков при температуре ]30°С, т.к. именно этот метод позволяет более полно выявить процессы, происходящие при тепловой обработке молока. Действительно, при исследовании зависимости термостабилъности от рН коровьего молока методом спиртовой пробы мы не обнаружили максимума ( при рН 6,6 - 6,7) и минимума (при рН 6,8-6,9), характерных для результатов исследования методом прямого измерения времени термокоагуляции.

Проведенные нами исследования роли белков в термоустойчивости молока показали, что общая концентрация белка играет меньшую роль, чем концентрация отдельных белковых фракций или же структурные свойства белков. Так, двукратное уменьшение концетрации общего количества белка при сохранении количества растворимых солей практически не изменило зависимость термоустойчивости от рН. Однако структурные изменения казеиновых мицелл, например, их измельчение при разбавлении молока дистиллированной водой или при гомогенизации изменяет зависимость термостабильности от рН.

Исследование роди солей в термоустойчивости молока показало, что основное значение имеют растворимые соли молока, в частности, соли кальция и фосфаты. Связывание ионов кальция введенным в молоко ортофосфатом калия по-разному сказывается на термоустойчивости молока при различных его значениях рН. При этом в области максимума (рН 6,6-6,7) большую роль играет снижение концентрации ионов кальция, вследствие чего термоустойчивость повышается. В области минимума (рН 6,8-6,9) существенно количество коллоидного фосфата кальция. По-видимому, увеличение содержания

м- кальциевых (Са СЬ), так и фосфашых {КН2 РО4) солей способствует образованию коллоидного фосфата и его преципитации на комплексе К-казеина Р-лактоглобулина при нагревании подщелоченного молока, что и приводит к значительному углублению минимума

термостабильности.

Учитывая результаты экспериментов, проведенных на изолированных белках, мы считаем, что основой термоустойчивости молока является термостабильность его казеиновой фазы; сывороточные белки снижают либо не изменяют термоустойчивости в зависимости от определенных условий. Кроме того, термоустойчивость в области максимума (рН 6,6-6,7) отражает термостабильность казеина, не подвергнутого дестабилизирующему действию Р-лактоглобулина.

Проведенные исследования как с алкогольной пробой в различных вариантах, так и теоретических вопросов с изменением солевого и белкового состава показали недостаточную эффективность алкогольной пробы и необоснованность ее применения в качестве тестированной.

В связи с этим мы приступили к изысканию более простого и эффективного метода определения термоустойчивости и других свойств, определяющих доброкачественность молока.

С этой целью мы испытали ряд методик: алкогольную пробу, кислотный тест в различных вариантах с изменением режима исследования, концентрации реактивов, условий постановки опытов. В результате проведенных исследований мы разработали и предлагаем термический тест (термотест).

Для его постановки необходимо иметь 9% уксусную кислоту и температуру нагревания молока на водяной бане до 63 + 2°С.

Постановка реакции: в пробирки отбирают но 9-10 см3 сборного сырого молока высшего или 1 сорта и добавляют 1-2 капли (0,03-0,08 см3) 9%-ной уксусной кислоты, закрывают пробирки резиновыми пробками и тщательно перемешивают путем переворачивания 2-3 раза. Затем пробирки помещают в водяную баню с температурой 68-75°С с тем, чтобы внутри пробирки температура молока в течении 5 мин. была 63 + 2°С. Через 5 минут пробирки вынимают и учитывают результаты. Термоустойчивое молоко образует ровный плотный сгусток по высоте столбика без выделения сыворотки. Нетер моусто ич йвве—молоко,—т ^ "годное для выработки

стерилизованных молочных продуктов характеризуется образованием

плотного сгустка, опускающегося на дно пробирки с выделением сыворотки или образуется рыхлый сгусток с сывороткой по всему столбику испытуемого молока.

При исследовании 162 проб молока с кислотностью 16-18°Т и по бактериальной обсемененности относящегося к I классу на термоустойчивость при помощи алкогольной пробы, термотеста и проводя термическую его обработку, близкую по технологическим параметрам, используемым при изготовлении продуктов детского питания только 129 проб дали совпадение по всем трем тестам, что составляет 79,6%. Совпадение термопробы и термической обработки была 100%-ной то есть 57 проб (35,2%) дали отрицательную реакцию и выдержали термическую обработку и 105 проб были положительными и не выдержали термической обработки. Совпадение алкогольной пробы и термической обработки в 14,8% случаев (24 пробы), то есть данная проба дает завышенные результаты, так как термическую обработку выдержали всего лишь 57 проб молока из 162.

Анализируя проведенные исследования необходимо отметить, что совпадаемость алкогольной пробы (ГОСТ 25222-82) составила 42,1% с предлагаемым нами термотестом. В го же время термотест был подтвержден путем термической обработки молока в 100% случаев. Кроме того, следует отметить, что термопроба более демонстративна, менее громоздка, по точности превосходит алкогольную пробу и мы ее рекомендуем для ветеринарно-санитарной экспертизы молока на его термоустойчивость в условиях молочных ферм, при выработке продуктов детского питания и других молочшлх консервов.

выводы

1. Впервые изучен состав микроорганизмов сырого молока по классам в соответствии с ГОСТ 13264-88. При этом установлено, что в молоке высшего и первого классов доминировали лактококки (82,1 % и 78,03 %), а в молоке второго класса наряду с лактококками (58,15 %) присутствовали стрептококки (14,09 %), БГКП (9,14 %), стафилококки (5,92 %), корннебактерии (4,21 %), энтерококки (4,03 %), микрококки (3,0 %), дрожжи и плесени (1,45 %), а также психротрофные бактерии.

2. Для выделения вегетативных и споровых форм мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов разработаны две селективные питательные среды (КАЯ-1 и КАЯ-2), обладающие более высокой чувствительностью и демонстративностью по сравнению со средой ЛАССА (ГОСТ 25102-90). Дано их научно-теоретическое обоснование и разработаны методы ветеринарно-санитарной оценки молока при его обсеменении этими бактериями.

3. При изучении контаминации молока мезофильными анаэробными лактатсбраживающими микроорганизмами установлено, что их количество не связано с классностью молока, но зависит от сезона года. Содержание их было максимальным в феврале-марте и октябре-ноябре (70+8 и более 110 микроорганизмов/см3), в летнее время уровень лактатсбраживающих анаэробов не превышал 38+9 микробных клеток в 1 см3.

4. Разработанные ускоренные, доступные методы исследования для выделения мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов позволяют проводить контроль молока на любом этапе его поступления и использования.

Установлено, что молоко, содержащее 7 и более спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий в 1 см3 непригодно для изготовления сыров, детского питания и других молочных продуктов.

5. На основании изучения биологических особенностей P. aeruginosa подобраны ингредиенты для конструирования селективных питательных сред (М и Mj), позволяющие выделять синегнойную палочку в чистой культуре из молока и других объектов внешней среды без использования ингибирующих компонентов; время исследования и стоимость анализа сокращается в 2-3 раза по сравнению с классическими методами. ----

6. Изучены причины возникновения порока

34

микробиологического происхождения "горькое" молоко на молочных фермах и молокоперерабатывающих предприятиях, в котором преобладали психротрофные бактерии; подавляющее большинство из них составляли псевдомонады - 51,33%, затем - бактерии родов Ака^епеэ - 25,5%, АсЬгошоЬас1ег - 11,54%, ЯауоЬа^епшп - 9,94% и другие микроорганизмы - 1,69%.

Установлено что порок возникает в молоке не выше И класса и в нем, как правило, обнаруживается не менее 1 млн./см3 психротрофных бактерий при условии незначительного содержания лактококков.

7. При изучении этиологической роли определенных видов психротрофных микроорганизмов путем искусственной контаминации сырого и пастеризованного молока установлено, что порок "горькое'1 молоко появляется через 6-12 часов в результате внесения Р. йиогезсеиз в количестве 1 млн. - 600 тыс./см3; в ассоциации с другими психротрофными бактериями существенной разницы в сроках изменения вкуса молока не было отмечено.

8. Впервые выделен нами М. \iscosus при пороке "тягучесть" из сборного сырого молока в ассоциации с А. аек^епев; их количество составляло 320 тыс. и 750 тыс./см3 соответственно. Лабораторными опытами установлено, что М. У15со5из может вызывать порок "тягучесть" в монокультуре при внесении в молоко в концентрации не менее 800 тыс./см3 . Резервуарами этих микроорганизмов являются корма, подстилка и вода.

9. Порок "тягучесть" в молоке выявлялся нами, как правило, через 2-3 часа после доения органолептически; такое молоко непригодно для пищевых целей и может быть использовано внутри хозяйства для кормления животных.

10. Установлен допустимый уровень концентрации психротрофных микроорганизмов с целью предупреждения появления пороков молока и молочных продуктов. Так, при хранении молока в течение суток их количество не должно превышать 1,25 х 10 /см при температуре хранения 4-5° С; 6,25 х 104 - при 7-8 С и до Ю2 микроорганизмов - при 10-12° С.

11. Для выработки высококачественных стерилизованных молочных продуктов неотъемлемым критерием является термоустойчивость молока, что послужило основанием изучения этого теста, механизм которого заключается в коагуляции белков молока.

Для ветеринарно-санитарной оценки качества молока на

•ггрмоустойчивость разработан нросгой, высохочувстветепьньш к более эффективный метод по сравнению с алкогольной пробой (ГОСТ 2522282), что подтверджено в 100% случаев тепловой обработкой молока при высоких температурных режимах.

12. Термоустойчивость молока зависит от его рН и характеризуется наличием максимума термостабиявности при рН 6,66,7 и минимума - при рН 6,8-6,9.

Кроме того, повышение концентрации ионов кальция в молоке снижает термоустойчивость в области как максимума, так и минимума рН. Однако добавление однозамещенных ортофосфатов калия и цитратов повышает термоустойчивость в области минимума рН.

13. Казеин, растворенный в диализате солей молока характеризуется высокой термоустойчивостью: время коагуляции увеличивается ог 100 до 150 мин. при повышении рН от 6,1 до 7,1. Сывороточные белки, растворенные в том же диализате солей, нетермоустойчивы.

Характерные минимум и максимум термоустойчивости наблюдаются при нагревании смеси казеина и сывороточных белков молока в диализате его солей; при этом максимум термоустойчивости соответствует термостабильности изолированного казеина в том же диализате солей.

14. В результате проведенных исследований разработаны для ветеринарно-санитарной экспертизы молока ускоренные методы индикации и выделения мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов и P. aeruginosa; установлен допустимый уровень психротрофных микроорганизмов в сыром молоке при различных режимах его хранения с целью предупреждения появления пороков; для контроля качества молока на термоустойчивость разработан высокоспецифичный и доступный термический тест.

Предложенные методы и средства доступные для широкого использования при ветеринарно-санитарной оценке молока позволят обеспечивать своевременный, эффективный контроль на различных этапах первичной и производственной переработки молока, что даст возможность выпускать высококачественные молочные консервы, сыры, продукты детского питания и стерилизованное молоко для длительнбгггхранишя:---—____

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Материалы диссертации вошли в нормативные документы, указанные на с. 6 и могут быть использованы при ветеринарно-санитарной экспертизе молока в случае определения обсеменения его P.aerugmosa, другими психротрофными микроорганизмами, контаминации сборного молока мезофильными анаэробными лактатсбраживающими микроорганизмами.

Кроме того, результаты проведенных исследований используются при чтении курса лекций по ветсанэкспертизе молока в Белоцерковском аграрном университете и Национальном аграрном университете (г. Киев).

СПИСОК опубликованных работ по теме диссертации

1. Загаевский И.С., Якубчак О.Н. Методические указания по ускоренным методам обнаружения в молоке условно-патогенной микрофлоры и примеси молока больных маститом коров в сборном: (Дня студентов ветеринарного факультета). - Белая Церковь, 1985. -

12 с.

2. Загаевский И.С., Якубчак О.Н. Методические рекомендации по изучению факторов, влияющих на качество мяса и молока: Для студентов ветеринарного факультета и ветврачей повышения квалификации.- Белая Церковь, 1988. - 64 с.

3. Загаевский И.С., Микитюк П.В., Якубчак О.Н. Ветеринарно-санитарный контроль пищевых продуктов на колхозных рынках. Методические рекомендации для студентов ветеринарного факультета и слушателей ФПК.-Белая Церковь, 1988. - 72 с.

4. Якубчак О.М. За високоякюне молоко // Тваринництво Укршни-1991. -№ 12. -С. 3-4.

5. Якубчак О.Н. Технология профилактики токсикозов стафилокко-молочного происхождения // Экологические проблемы ветеринарной санитарии: Тез. докл. научн. -техн. конф. 7-8 апреля 1993 г. - М„ 1993. - С. 90-92

6. Дудко И.С., Якубчак О.Н. О структурных преобразованиях в молочной железе коров //Влияние аноптогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей и клеток человека и животных: Материалы 2-й Всерос.конф. / 16-18 сентября 1993 г./. -

37

Саратов, 1993. -Ч. 1. - С. 75.

7. Якубчак О.Н. Взаимосвязь охлаждения и бактериологического качества сырого молока // Материалы науч,-практ.конф., посвящ. 70-летию Витебского вет. ин-та. - Витебск, ¡994. -С.23-25.

8. Якубчак О.М. Дослздження молока на його термоспйгасть //Проблеми шдвищення продуктивное п тварин та ефективноегт 1х .ткування: Тези 7-1 респ. наук, -практ. конф. 12-21квпня 1994 р,-Дшпропетровськ, 1994 - С. 47-48.

9. Якубчак О.М. Вплив силосу на обаменшня молока спорами анаеробних м1крооргашзм1в // Украшська конференщя молодих вчених "Сучасш проблеми ветеринарно! медицини" - К., 1994. - С. 71.

10. Якубчак О., Тетарчук К. Про термосгтшюсть молока У/ Твариннищво Укра1ни.-1994. -№6. - С.11.

11. Якубчак О.М., Кучеренко Т.С. Про удосконалення метода дослщження молока та молочних продукпв в лаборатор!ях ветсанекспертизи р года в //Матер1али наук.-практ. конф., присв'яч. 75-р1ччю Бшоцершв. держ. с.-г. iн-тy. -Бша Церква, 1995. - С.127.

12. Карташова В.М., Якубчак О.М. Саштарно-гн1ешчш аспекти присутносп P.aeruginosa в сиром}' молото //Матер]али наук.-практ. конф., присв'яч. 75-р1ччю Бшоцерив. держ. с.-г. 1н-ту. - Бша Церква, 1995 - С. 73-74.

13. Якубчак О.М. Виявлення контамшаш'1' молока мезофшьними анаеробними лактатзброджуючими м1крооргашзмами //Нещфекщйна паталопя тварин: Матер! ал и наук.-практ.конф,- Бита Церква, 7-8 червня 1995 р.-Бша Церква, 1995. - 4.2. - С. 124-125.

14. Якубчак О.Н. Методы выявления "тягучести" молока // Аграрная наука. - 1995. - № 4. - С. 62.

15. Якубчак О.Н. Проблемы контроля качества молока К Молочная промышленность. - 1995. - № 7 - С. 13-14.

16. Якубчак О.Н. Контроль санитарного качества молока по общей бактериальной обсемененности // Ветеринария. - 1995. - № 12. -С. 44-46.

17. Карташова В.М., Якубчак О.Н. Изменение ввдового состава микроорганизмов сырого молока // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 1995. - № 5 - С. 45-46.

ПГ Якубчак О.Н. Методы выявлении "шучщли11—молока— //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 1995. -№ 5. - С. 68-69.

19. Карташова В.М., Якубчак О.Н. Зооветеринарные требования к молочным фермам зон еыроделения // Молочное и мясное скотоводство. - 1995. - № 2. - С. 24-27.

20. Карташова В.М., Якубчак О.Н. Горечь молока и профилактика этого порока // Молочное и мясное скотоводство. - 1995. - № 4. - С,16-18.

21. Карташова В.М., Якубчак О.Н. Методические рекомендации по ускоренному обнаружению спор и вегетативной формы мезофильных анаэробных лактасбраживающих микроорганизмов в молоке. - М., 1995. - 6 с.

22. Карташова В.М., Якубчак О.Н. Выделение спор мезофильных анаэробных лактасбраживающих микроорганизмов из сборного молока // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии: Сб. науч. тр. - М., 1995. - Т. 98, ч. I. - С. 122-124.

23. Хоменко В., Якубчак О. Контамшащя молока мезофшьними анаеробними лактатзброджувальними мжрооргашзмами // Ветеринарна медицина Украши. - 1996. - № 3. -С. 8-9.

24. Якубчак О.Н. Термоустойчивость молока и методы ее выявления //Хранение и переработка сельхозсырья. - 1996. - № 3. - С. 49-50.

25. Якубчак О.М. Зпркнення молока бактер1ального походження // Актуалыа питания ветеринарно! патологи: МатеР1али Першо\ BceyKpaiHCbKoi науково-виробничо? конферегщп ветеринарних патолопв. - К., 1996. - С. 364-365.

26. Якубчак О.М. "Тягупсть" молока i методи н виявлення //Актуальш питания ветеринарно!' патологи : Матер^али Першо/ ВсеукрашськоУ науково-виробничо? конференцн ветеринарних патолопв. - К., 1996. - С. 366-367.

27. Якубчак О.М. Виявлення контамшацн Pseudomonas aeruginosa 3ÖipHoro молока //Вкник Биюцерювського державного аграрного угаверситету. - Вип. 1. - Бша Церква, 1996. - С. 45-48.

28. Практикум по ветеринарно-сатптарнж encnepTmi з основами технолог!!' i стандартизац11 продук-пв тваринництва i рослинннцтва /ВЛ. Хоменко, П.В. Микитюк, Р.Й. Кравщв, О.М. Якубчак та in. - К., 1997. -404 с.

29. Настанова по бактерюлопчному i цитолопчному досладженню молока та секрету молочноУ залози Kopie на наявшеть збудниыв мастипв /В.1. Хоменко, М.К. Оксамитний, О.М. Якубчак та in. - К., 1997. - (у друхц).

30. Державний стандарт Украши "Молоко коров Vie незбмргне. Вимоги при закугавлГ' (заключна редакщя одобрена 18.02.97 р. Кабшетом Miiricrpie Украши, подана Держставдарту Укршни для реестрацп). - (у друщ),

31. Заявка 94006960 Россия, МКИ6 С 120 1/04. Питательная среда для выделения псевдомонад /В.М. Карташова (Россия); О.Н. Якубчак (Украина). Заяв. 28.02.94 - 3 с.

32. Заявка 94-006961 Россия, МКИ6 С 120 1/04. Питательная среда для выделения Pseudomonas aeruginosa /В.М. Карташова (Россия); О.Н. Якубчак (Ураина). - Заяв. 28.02.94. - 3 с.

33. Заявка 94006962 Россия, МКИ6 С 12 1/04. Питательная среда для выделения бактерий рода Clostridium /В.М. Карташова (Россия); О.Н. Якубчак (Украина); В.И. Хоменко (Украина). - Заяв. 28.02.94. - 4 с.

34. Заявка 95103469 Россия, МКИ6 С 12 1/04. Питательная среда для выделения Clostridium /В.М. Карташова (Россия); О.Н. Якубчак (Украина). - Заяв. 10.03.95. - 3 с.