Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.07) на тему:Пути усовершенствования биотехнологии размножения овец

... На правах рукописи

МАНУЙЛОВ Игорь Михайлович

ПУТИ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ РАЗМНОЖЕНИЯ ОВЕЦ

16.00.07 - АКУШЕРСТВО И ИСКУССТВЕННОЕ ОСЕМЕНЕНИЕ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискаиие ученой степени доктора ветеринарных наук

Ставрополь 1998

Работа выполнена в Ставропольском государственном университете

Научный консультант:

Академик международной академии наук высшей школы и Академии аграрного образования, доктор ветеринарных наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Никитин В.Я.

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Ильинский Е.В. доктор ветеринарных наук Слипченко С.Н. доктор ветеринарных наук Тимченко Л.Д.

Ведущая организация: Горский государственный аграрный университет, г. Владикавказ

Защита диссертации состоится « \! » декабря 1998 г. в час. на заседании специализированного совета Д. 120.53.02 при Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии по адресу: 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан « \Л » ноября 1998 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, доцент

Боголюбова А.П.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. Развитое продовольственной и сырьевой базы ю многом зависит от успехов в области биологических и сельскохозяйственных гаук, требуя постоянного расширения и углубления исследований как в тео-эетическом плане, так и в плане внедрения достижений науки в производство.

Как известно, благодаря широкому применению разработанного отечествен-(ыми учеными метода искусствегаюго осеменения и усовершенствованных призов племенной работы, удалось в течение двух-трех десятилетни преобразовать, неталое в прошлом, грубошерстное овцеводство нашей страны в тонкорунное и галугонкорунное и создать ряд новых высокопродуктивных пород овец.

Главное преимущество искусственного осеменения заключается в возмож-юсти наиболее рационального использования особо ценных производите-1ей для быстрейшего повышения продуктивности животных на племенных 1 товарных фермах. Для достижения эт;ой цели требуется значительно увели-шть количество приплода, получаемого от ценных элитных производите-гей. Последнего можно добиться увеличением продолжительности случного 1ериода, применением методов длительного хранения спермы, обеспечива-ощих возможность ее заготовки на протяжении всего года, уменьшением дозировки спермы без ущерба для оплодотворяемости осемененных овец.

Первый способ в районах развитого овцеводства не может дать положительного эффекта, поскольку границы практически применяемого сезона случ-<и ограничены здесь полутора - двумя месяцами (октябрь - ноябрь). Второй ;пособ в настоящее время не имеет широкого применения в связи с низкой зплодотворяемостью овец при использовании замороженной спермы барана.

Что касается возможности уменьшения дозировки свежеполучае-мой спермы, то в этом отношении высказывалось, как правило, пессимистическое мнение. Снижение узаконенной дозы 0,05 мл неразбавленной спермы, содержащей около 150 млн. спермиев, неизбежно приводило к закономерному сни-кению оплодотворяемости овец. В то же время у коров регистрируется вы-:окая оплодотворяемость при введении 30 и даже 20 млн. спермиев.

При решении задачи уменьшения дозировки спермы при искусственном эсеменении овец следует учитывать, что с помощью микрошприцев можно звести сперму в объеме не менее 0,05 мл. Поэтому при уменьшении дозы со 150 до 50 или 30 млн. спермиев необходимо разбавить сперму в 3 или 5 раз.

Отсюда возникает вопрос, не снижается ли переживаемость и оплодотворяющая способность спермиев под действием применяемого разбавителя и нельзя ли предотвратить это нежелательное явление применением биологи-1ески полноценных синтетических сред? Решение этого вопроса могло по-

служить основой поиска биологически полноценных разбавителей спермь барана при уменьшении дозы спермиев, используемой для осеменения овец

В решении проблемы ускоренного воспроизводства овец существуют \ многие другие аспекты. Необходимо заметить, что широко применяемый I настоящее время метод анабиоза, осуществляемый при охлаждении спермы до температуры +2 -+4°С,приводит к определенному снижению оплодотво-ряемости овец, осемененных сохраняемой спермой. Это явление может быть связано с целым комплексом факторов, таких как биологическая полноценность применяемых разбавителей, степень разбавления, температура и длительности хранения, способ транспортировки, влияние микроорганизмов, развивающихся в процессе сохранения спермы и мн. др.

Следует учесть, что все эти факторы могут оказывать определенное влияние на основное свойство спермиев - детерминацию нормального развития зиготы. Следствием этого могут быть нарушения пренаталыюго развития зародыша, эмбриональная смертность и бесплодие овец.

1.2. Цель и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного и была определена основная цель проведенных исследований - научное обоснование и разработка рекомендаций, направленных на повышение оплодотворя-емости овец, осеменяемых свежей и сохраняемой спермой.

Для достижения цели решались следующие задачи:

- сравнительная оценка биологических свойств и оплодотворяющей способности эпидидимальной и эякулированной спермы барана с хронической фистулой одного спермопровода;

- изучение влияния различных разбавителей на биологические свойства спермы барана и жизнеспособность возникающих при оплодотворении зигот;

- изучение оплодотворяемости овец, осемененных уменьшенными дозами спермы, разбавленной полноценными синтетическими средами;

- оценка морфологических, физиологических и биохимических свойств спермиев в зависимости от применяемого разбавителя и способов транспортировки сохраняемой спермы;

- установление степени количественной и качественной бактериальной и грибковой загрязненности спермы (видовой состав микрофлоры, изменение ее в процессе хранения, влияние на выживаемость й оплодотворяющую способность спермиев);

- изучение бактериальной и микозной загрязненности родополовых путей и ее изменение при использовании различных технологических приемов в искусственном осеменении.

1.3. Научная новизна и теоретическая значимость работы. Изучена морфология, физиология и биохимия спермиев эпидидимальной спермы барана

и выяснена физиологическая роль секретов придаточных половых желез. Усовершенствование методики наложения хронической фистулы на сперми-опровод позволило получать свежую эпидидимальную сперму систематически на протяжении длительного периода. Наложение односторонней фистулы дало возможность от одного и того же животного получать и сравнивать как эпидидимальную сперму, так и сперму, смешанную с секретами придаточных половых желез.

Методом прямого биоконтроля выяснены основные биологические свойства эпидидималыюй спермы: переживаемость в половом тракте самки, оплодотворяющая способность и биологическая полноценность в смысле детерминации нормального развития зародыша. Установлено положительное действие секретов придаточных половых желез на переживаемость спермиев в половом тракте самки.

Впервые проведена сравнительная оценка различных синтетических и биологических разбавителей спермы барана методом внутритрубного введения спермы, разбавленной испытуемыми средами в 1000 раз. Изучены и теоретически обоснованы способы снижения дозы спермы для осеменения овец со 150 до 50, а возможно и до 30 млн. спермиев, доказано преимущество «фосфатных» разбавителей, применяемых для разбавления спермы.

Установлены основные причины снижения оплодотворяемости овец, осемененных перевозной спермой. Разработаны теоретические обоснования перспективности осеменения овец кратковременно сохраняемой спермой, разбавленной глюкозо-желточно-фосфатпым разбавителем.

Впервые изучена динамика количественных и качественных изменений бактериальной и микозной микрофлоры в сохраняемой сперме барана и ее влияние на оплодотворяющую способность спермиев.

Разработано теоретическое обоснование использования люминесцентной микроскопии для оценки качества свежей и сохраняемой спермы барана.

Проведено изучение микрофлоры различных участков половых органов овец на интактных животных и животных с хронической фистулой рога матки. Наряду с этим исследовалось бактериальное содержимое половых путей при интравагиналыюм способе синхронизации.

Исследованы основные причины эмбрионлыюй смертности и бесподия овец. Проведены бактериологические и микологические исследования гениталий бесплодных животных.

1.4. Практическая значимость работы. Материалы исследований позволили рекомендовать в производство способ осеменения овец трехкратно уменьшенными дозами спермы, разбавленной глюкозо-фосфатным или глюкозо-желточно-фосфатпым изотоническим раствором. Эти рекомендации широко применя-

ются в овцеводческих хозяйствах Ставропольского края, способствуя значительному увеличению числа маток, осеменённых элитными производителями.

Результаты исследований использованы для разработки технологии транспортировки спермы, сохраняемой в глюкозо-фосфатном разбавителе при комнатной температуре в течение 3-4 часов.

Использование рекомендаций, разработанных на основании проведенных экспериментов, позволяет сшпить эмбриональную смерл госты [бесплодие у овец.

1.5. Реализация результатов исследований. Основные научные положения и практические предложения вошли в "Рекомендации по оптимальному режиму использования высокоценных племенных баранов при длительной их эксплутации на протяжении года", ВАСХНИЛ, Москва, 1987, "Рекомендации по организации осеменения овец", утвержденной начальником Госпле-минспекции 9.9.90 г., рекомендации Совета по пропаганде и организации освоения достижений науки и техники ВАСХНИЛ "Организация осеменения овец", Москва, 1991. Метод исскуствеииого осеменения овец уменьшенными дозами спермы широко используется на овцетоварных фермах.

Материалы диссертации вошли в рекомендации и учебные пособия, цитируются в научных работах, используются при проведении обучения ветврачей, зооинженеров и техников по искусственному осеменению.

1.6. Апробация работы. Основные материалы исследований неоднократно доложены и одобрены на научных конференциях и ученых советах ВНИИОК, на научных конференциях Ставропольской сельскохозяйственной академии и Ставропольского государственного университета, на 7-ом Международном конгрессе по размножению и искусственному осеменению животных в Париже.

1.7.Публикации. Основные материалы исследований, включенные в диссертацию, опубликованы в 38 печатных работах.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 302 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований, анализа результатов собственных исследований, выводов, практических предложений, списка используемой литературы, включающей 302 наименования, в том числе 173 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 20 фотографиями микрофотографиями.

1.9. Предметом защиты является научно обоснованная технология получения большего числа потомства от наиболее ценных производителей, учитывающая специфические особенности воспроизводительной способности баранов и маток, а именно:

- сравнительная оценка биологических свойств и оплодотворяющей способности эпидидимальной и эякулированной спермы барана;

- влияние различных разбавителей на биологические свойства спермы барана;

динамика качественных изменений спермы в процессе хранения при температуре +2... +4°С и +16... +18°С.

- влияние микроорганизмов и бактериологических веществ на пережи-иаемость и оплодотворяющую способность спермиев барана;

- влияние вибрации па качество сохраняемой спермы;

- метод осеменения овец трехкратно уменьшенной дозой спермы, разбавленной глюкозо-фосфатиым буфером;

• метод осеменения овец кратковременно (3-4 часа) сохрашемой спермой.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методика исследований. Для лабораторных исследований и научно-производственных опытов сперму получали на искусственную вагину от клинически здоровых баранов-производителей, содержащихся на полноценном рационе. Использовали только сперму с активностью не ниже 3 баллов и концентрацией спермиев не менее 2,5 млрд в 1 мл.

В собственных исследованиях для определешм и изучения биологических свойств спермы, не имевшей контакта с секретами придаточных половых желез, была разработана специальная методика наложения хронической фистулы на спер-миопровод барана (H.A. Желтобрюх, Н.В. Логинова, И.М. Мануйлов, 1966), что позволило получать эшздидималы iyio сперму i и протяжаши длителы юге периода.

Фистулу накладывали на один спермиопровод, а получаемая при эякуляции сперма из второго семенника служила контролем к фистульному. В качестве дополнительного контроля использовали нормально эякулированную сперму интактных производителей.

Эпидидимальную и эякулированную сперму исследовали на активность по десятибалльной системе, концентрацию (путем подсчета в камере Горяева), резистентность (по Короткову-Милованову, 1951), живучесть (по Асланяну, 1951). Кроме того, в каждой пробе подсчетом 200 половых клеток определяли количество спермиев с протоплазматической капелькой. С помощью электронного микроскопа проводилась морфологическая оценка спермиев. Препараты для электронной микроскопии готовили нанесением на коллоидные подложки взвеси фиксированной контрольной и опытной спермы. Фиксацию спермы проводили изотоническим раствором формалина. Коюрасгирование объектов достигалось применением 2 -10% раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты, нейтрализованной до pH -7,4. Микроскопию проводили с помощью электронного микроскопа «Тесла-28»

В целях проверки резистентности к глубокому охлаждению, эпидидималь-ную и эякулированную сперму замораживали в гипертоническом глюкозо-цитратном разбавителе по методу В.А. Морозова (1957), в модификации Н.В. Логиновой (1959). В одном из вариантов опыта эпидидимальную сперму перед замораживанием разбавляли в два раза секретами придаточных половых желез, полученными от вазектомированного барана. Оттаивали замороженную сперму при комнатной температуре.

При изучении переживаемое™ эпидидималыюй спермы в половом тракте самки применяли внутритрубное и цервикалыюе осеменение овец. Первым способом осеменяли маток за 2 - 3 часа до овуляции или через такой же срок после ее завершения, а вторым - через 12 - 22 часа до наступления охоты, т.е. за 8-10 часов до момента овуляции. Критерием переживаемости и оплодотворяющей способности спермы служило наличие дробящихся зигот через 2 - 3 дня после осеменения, а показателем биологической полноценности спермиев -плацентация зародышей и нормальное завершение беременности. Оценка качества разбавителей осуществлялась методами косвенного и прямого биоконтроля. Сущность первого сводилась к сравнительной оценке живучести спермы при I +38°С в неразбавленном виде и при различных степенях разбавления. По окончанию исследований определяли оптимум и максимум разбавления. Первый показатель характеризовал степень разбавления спермы, обеспечивающую наибольшую переживаемость спермиев, второй - степень разбавления, при которой переживаемость разбавленной спермы соответствует продолжительности жизни неразбавленной спермы. При этом методика М.М. Асланяна (1951) была дополнена определением суммарной живучести, то есть суммой показателей активности при всех степенях разбавления спермы.

Метод прямого биоконтроля заключался в изучении переживаемости разбавленной спермы в половом тракте овец, определении оплодотворяющей способности спермиев и проверке жизнеспособности образующихся зигот.

Оплодотворяющую способность разбавленной спермы определяли методом внутритрубного осеменения. Испытуемую сперму разбавляли в 4 или 1000 раз. Тысячекратное разбавление применялось с целью нейтрализации защитных свойств плазмы спермы и более полного проявления действия разбавителя,

В лабораторных условиях всесторонним исследованиям были подвергнуты глюкозо-цитратный стандартный, глюкозо-цитратный эквйлибрированный, глюкозо-фосфатный, содово-углекислый, щавелево-винный, глюкозо-тартрат-ный, глюкозо-сульфатпый, глюкозо-цитратно-трилоновый разбавители, инактивированная сыворотка крови овец и обезжиренное коровье молоко.

Результаты косвенного и прямого биоконтроля проверялись в прямом лабораторном эксперименте по изучению переживаемости и оплодотворяю-

Материалы основных опытов обработаны биометрически (П.Ф. Рокитс-кий, 1967; Е.К. Меркурьева, 1970).

2.2. Изучение влияния секретов придаточных половых желез на биологические свойства спермы барана. В процессе эякуляции сперма барана почти вдвое разбавляется секретами придаточных половых желез. Относительно биологического значения этих секретов высказываются разноречивые мнения, По данным большинства исследователей, функции секретов придаточных половых желез сводятся к подщелачиванию эпидидималыюй спермы, повышению активности и обеспечению спермиев энергетическим материалом, прежде всего, фруктозой. Такое представление о роли секретов придаточных половых желез основывалось на экспериментах с центрифугированием эякулированной спермы и единичных положительных опытах по осеменению самок взвесью спермиев из придатка семенника.

Однако уже первые опыты по изучению эпидидималыюй спермы барана (White, Wales, 1961) показали, что спермин, не имевшие контакта с секретами придаточных половых желез, отличаются от эякулированных половых клеток некоторыми морфофизиологическими особенностями. По данным этих авторов, эпидидимальная сперма обладает большей устойчивостью к температурному шоку, а способность ее к утилизации фруктозы в анаэробных условиях понижена.

В опытах В.И. Тертышник и В.И. Канцедал (1965) установлено, что сперма из придатка семенника содержит значительно больше азота, фосфора и кальция по сравнению с эякулированной. Все это дает основание полагать, что секреты придаточных половых желез не являются биологически индефе-рентными разбавителями эпидидимальной спермы, а выполняют определенную, и при том весьма существенную, физиологическую функцию. Однакс количество исследований по затронутому вопросу было весьма ограничено а многие биологические свойства эпидидимальной спермы оставались неизученными. Это обстоятельство и послужило основанием для проведенш собственных экспериментов. м

Фистулу спермиопровода накладывали на один семенник (левый), а получаемая при эякуляции сперма служила контролем к фистульному. Сбор фистульной спермы производился в специальный спермиоприемник, состоящий из градуированного цилиндра емкостью 1 мл.

Бараны с фистулой спермиопровода, использовались для получения эпидидимальной спермы в течение 3-4 месяцев, что вполне обеспечивало необходимые условия для проведения опытов по изучению биологической рол* секретов придаточных половых желез.

Эякулированную сперму получали на искусственную вагину непосредствен-

но перед опытом. В качестве дополнительного контроля использовали нормально эякулированную сперму от неоперированных (интактных) баранов.

Как видно из материалов таблицы 1, у всех подопытных баранов активность и живучесть фистульной спермы были ниже, а концентрация значительно выше по сравнению с эякулированной. Резистентность эпидидималь-ной спермы у двух из трех баранов была ниже, а у треть его выше, чем в контроле. Интересно подчеркнуть, что по активности, резистентности, живучести, а также по устойчивости к низким температурам эякулированная сперма подопытных баранов мало отличалась от эякулированной спермы интактных самцов, несмотря на то, что у первых относительное количество секретов придаточных половых желез было значительно больше, чем у вторых. Следовательно, секреты придаточных половых желез, активизируя спермии, не оказывают на них отрицательного действия (не разрушают липопротеидный покров и не сокращают продолжительности жизни).

По внешнему виду фистульная сперма отличалась от эякулированной значительно большим количеством спермиев с протоплазматическими капельками. Если в эякулированной сперме подопытного и контрольного баранов количество таких спермиев в среднем составляло соответственно 5,1 и 7,4%, то в эпидидималыюй сперме оно достигало 55,5%. Можно поэтому предположить, что секреты придаточных половых желез обладают специфическим действием на липопротеидную оболочку, значительно ускоряя процесс отторжения киноплазматических капелек с ее поверхности.

Таблица 1

Основные показатели качества фистульной и эякулированной спермы

Качественные показатели спермы Способ получения спермы

фистульный На искусственную вагину Контроль

Объем эякулята, мл. 0,26 ±0,004 0,69 ± 0,005 0,99 ± 0,011

Характеристика спермиев Активность, балл 7,4 ± 0,053 8,8 ±0,071 9,2 ± 0,078

Резистентность, тыс. 16,7 ±0,183 17,2 ±0,194 20,6 ± 0,168

Концентрация, млрд./мл. 5,8 ± 0,043 3,1 ±0,027 4,8 ±0,029

, Живучесть, у.е. 1,70 ±0,009 2,2 ±0,006 2,5 ± 0,004

Резистентность спермиев к низким температурам (активность, балл.):

После размораживания 2,4 4,0 3,9

Через 3 часа 17,5 23,0 25,3

Через 5 часов 8,5 14,7 16,7

В литературе встречаются данные о наличии обратной связи между концентрацией моносахаридов в плазме спермы и резистентностью ее к низким температурам (М.П. Кузнецов, 1963).

Биохимические исследования показали, что концентрация фруктозы в эпидидимальной сперме во всех случаях ниже по сравнению с эякулированной, причем разница статистически достоверна (Т = от 3,2 до 3,5).

2.2.1. Изучение переживаемости в половом тракте овец и оплодотворяющей способности эпидидимальной и эякулированной спермы барана. Наиболее важными в биологическом отношении показателями являются пере-живаемость спермы в половом тракте самки и срок сохранения ее оплодотворяющей способности. Эти показатели связаны с многочисленными функциональными и морфологическими свойствами спермиев и в интегрированном виде отражают комплекс жизненно важных свойств мужских половых клеток.

Опыты по изучению переживаемости и оплодотворяющей способности спермы проведены в лабораторных условиях на 35 мериносовых овцах. Начало охоты у маток определялось с точностью до 2 часов, для чего выборка овец производилась через каждые 2 часа на протяжении суток. При изучении переживаемости эпидидимальной спермы в половом тракте самки применялось внутритрубное и цервикальное осеменение. Первым способом осеменяли маток за 2-3 часа до овуляции или через такой же срок после ее завершения, а вторым через 12-22 часа после наступления охоты, т.е. за 8-20 часов до момента овуляции.

При внутритрубном осеменении фистульной спермой 5 овец подвергли лапаротомии через 30-32 часа после наступления охоты для установления оплодотворяемости по наличию дробящихся зигот.

30 овец были осеменены цервикально. В этом случае фистульную или эякулированную сперму в дозе 0,05 мл вводили в каудальную складку шейки матки с помощью микрошприца. Для определения срока переживаемости и сохранения оплодотворяющей способности фистульной спермы ее вводили за различные сроки до наступления овуляции, в пределах от 8 до 20 часов. Эякулированную сперму, переживаемость кбторой была определена заранее, вводили за 23-29 часов до овуляции. Срок последней во всех случаях исчислялся 32 часами от момента наступления охоты.

Всего эпидидимальной спермой осеменяли 21, а эякулированной - 9 овец. По 5 овец из каждой группы было прооперированно через 3-4 суток после осеменения для проверки на оплодотворяемость по описанной выше

методике. Остальные овцы оставались под наблюдением до наступления второй охоты, а забеременевшие до конца суягности.

Таблица 2

Оплодотворяемостъ овец, осемененных эпидиднмалъиой и эякулированной спермой

Способ осеменения Время от осеменения до овуляции, ч Способ проверки на оплодотворя-емость Количество осемененных животных, гол. Из них оплодотворилось,гол.

Внутритрубно фистульной спермой 2-3 По наличию зигот 5 4

Цервикально фистульной спермой 8-20 По наличию зигот 5 2

По результатам ягнения 16 3

Цервикально эякулированной спермой 24-29 По наличию зигот 5 3

По результатам ягнения 4 3

Как видно из данных таблицы 2, оплодотворяющая способность фистульной спермы при внутритрубном осеменении оказалась достаточно высокой. Об этом свидетельствует наличие дробящихся зигот в яйцепроводах четырех из пяти овец, прооперированных через двое суток после введения спермы. Вместе с тем переживаемость спермиев в половом тракте самки была весьма низкой. Из пяти овец, осемененных фистульной спермой за 8, 10, 12, 16 и 20 часов до наступления овуляции, оплодотворилось лишь 2, осемененных в наиболее поздние сроки. У всех остальных в яйцепроводах обнаружены неоплодотворенные яйцевые клетки. Из 16 овец этой группы, оставленных для проверки на зачатие, суягными оказались лишь 3. Одна из них была осеменена за 8, вторая - за 10 и третья - за 16 часов до овуляции. Следовательно, фистульная сперма в половом тракте охотной овцы сохраняла оплодотворяющую способность в течение 10 и, максимум, в течение 16 часов. В то же время из 6 овец, осемененных цервикально эякулированной спермой за 28, 25 и 29 часов до наступления овуляции, у трех при лапарото-мии были обнаружены дробящиеся зиготы. При этом одной овце сперма была введена за 29 часов до овуляции. Из четырех овец, осемененных в те же сроки и проверенных на зачатие, 3 оказались суягными. Следовательно, сроки переживания и сохранения оплодотворяющей

способности у эякулированной спермы были в 2-3 раза выше, по сравнению с эпидидимальной.

Установленные в этих опытах более высокая переживаемость эякулированной спермы а половом тракте самки и более длительное сохранение ее оплодотворяющей способности, показывают, что секреты добавочных половых желез не просто активизируют попадающие в эякулят спермии, но вызывают в них более глубокие физиологические изменения и, прежде всего, повышают резистентность половых клеток к действию цервикального и маточного секретов.

Отсюда вытекает перспектива повышения переживаемости не только эпидидимальной, но и эякулированной спермы путем воздействия на нее биологически полноценными средами.

2.3. Сравнительная оценка различных синтетических сред, применяемых для разбавления спермы барана. Сохраняемая вне организма сперма неизбежно подвергается воздействию разнообразных факторов внешней среды, способных иногда оказать неблагоприятное влияние на физиологические свойства спермиев. Особо важную роль могут при этом играть применяемые разбавители, отдельные компоненты которых обладают высокой проницаемостью и способностью изменять метаболизм половых клеток. Масштабы и глубина получаемых изменений будут в данном случае зависеть от степени разбавления спермы, температуры хранения и длительности действия разбавителя.

Любой метод биологической оценки синтетической среды, используемой для разбавления спермы, основывается на определении срока переживания и сохранения оплодотворяющей способности спермиев вне организма самца. При этом внешней средой для спермиев может являться сам испытуемый разбавитель, смешанный в большей или меньшей пропорции с естественной плазмой спермы, или секреты генитального аппарата самки после введения в них спермы, разбавленной проверяемой средой. В первом случае качество разбавителя определяется такими показателями как оптимум и максимум разбавления, длительность сохранения электрического заряда спермиев, устанавливаемая по отсутствию агглютинации, количество активных спермиев и длительность их переживания при высоких титрах разбавления. При втором способе биологической проверки качество испытуемой синтетической среды оценивается по длительности переживания разбавленной спермы в половом тракте самки, скорости ее передвижения в яйцеводы, способности оплодотворять яйцо и давать полноценную зиготу.

В первой серии лабораторных экспериментов были испытаны следующие разбавители:

1. Глюкозо-цитратный - вода дистиллированная 100 мл, натрий лимоннокислый трехзамещепный пятиводный (№3С6Н507 • 5НгО)

- 2,8 г, глюкоза медицинская безводная - 0,8 г.

2. Глюкозо-фосфатный - вода дистиллированная 100 мл, натрий фосфорнокислый двузамещенный (№2НР04 • 12Н20) - 2,0 г, калий фосфорнокислый однозамещеиный (КН2Р04) - 0,08 г, глюкоза медицинская безводная (С6Н1206) -3,2 г.

3. Содово-углекислый, приготовляемый г(о методу С.П. Белякова (1959) - вода дистиллированная 100 мл, натрий лимоннокислый трехзамещепный (На3С6Н507 ■ 5Н20) - 2,85 г, углекислый натрий (Ка2СО}) -0,22 г, хлористый калий (КС1) - 0,035 г, глюкоза медицинская безводная - 0,82 г, стрептоцид белый - 0,2 г.

4. Щавелево-виннын, приготовляемый по методу И.Х. Хабибуллина (1965) - вода дистиллированная 100 мл, натрий лимоннокислый трехзамещепный пятиводный - 2,74г., глюкоза медицинская безводная - 0,77 г, винная кислота (С02Н(СН0Н)2С02Н) - 0,05 г, щавелевая кислота (С2Н204) - 0,06 г.

Лабораторные исследования показали, что оптимум разбавления с учетом показателя живучести оказался наиболее высоким (16 усл.ед) для фосфата, и самым низким (4 усл. ед) для щавелево-винного разбавителя. Это преимущество сохранялось и в отношении показателей максимума разбавления и суммарной живучести. Иными словами, фосфат оказался более пригодными для сильного разбавления спермы барана. Особенностью фосфатного разбавителя являлась его способность быстрее других нейтрализовать электрический заряд и вызывать заметную агглютинацию спермиев при высоких титрах разбавления.

2.3.1. Биологическая проверка разбавителей методом прямого биоконтроля. Определение качества разбавителей методом обычного биоконтроля позволяет установить действие той или иной проверяемой среды на такие физиологические свойства спермиев, как переживаемость вне организма, способность к активному поступательному движению. Одновременно удается установить и действие испытуемых разбавителей на морфологию спермиев, их биоэлектрический потенциал, структуру липопротеидиой оболочки иакросомы.

Однако наиболее важные биологические свойства мужских половых

клеток, а именно, их переживаемость в половом тракте самки, скорость

»

продвижения в краниальные участки гениталий, способность к оплодотворению яйца и детерминации последующего нормального развития зиготы, остаются при этом невыясненными. Вот почему при всестороннем и детальном изучении качества разбавителей, наряду с методом косвенного биоконтроля, должен применяться и более сложный способ прямой проверки действия испытуемой среды на биологические свойства спер-миев, интегрированные в их способности к оплодотворению яйца.

В экспериментах с внутритрубным осеменением овец проверялось биологическое действие различных разбавителей на оплодотворяющую способность спермы барана и жизнеспособность получаемых при оплодотворении зигот.

Испытуемую сперму разбавляли в 4 или 1000 раз, причем в первом случае ее хранили вне организма в течение суток, а во втором использовали сразу после разбавления. Тысячекратное разбавление применялось с целью нейтрализации защитных свойств плазмы спермы и более полного проявления действия разбавителя.

В собственных исследованиях часть овец осеменили внутритрубно спермой, разбавленной в 1000, а часть, разбавленной в 4 раза. 16 контрольных овец осеменили свежей неразбавленной спермой. Вводили сперму лапа-ротомированным овцам в дозе 0,05 мл непосредственно в яйцевод за 1-2 часа до овуляции или через такой же срок после ее завершения. Для проверки на оплодотворяемость 22 овцы через двое суток после внутритруб-ного осеменения оперировали вторично и исследовали у них яйцепрово-ды на наличие дробящихся зигот. Остальных овцы оставили для проверки на зачатие. Критерием его служило отсутствие повторной охоты на протяжении 2-3 циклов. Часть овец находилась под наблюдением до конца суягности.

Результаты исследований приведены в таблице 3. Из материалов этой таблицы видно, что испытанные разбавители заметно различались между собой по своему биологическому действию. Цитрат натрия при четырехкратном разбавлении спермы не оказал вредного влияния ни на оплодотворяющую способность спермиев, ни на жизнеспособность развивающихся зигот. Все четыре овцы, оставленные для проверки на зачатие, оказались суягными. Тысячекратное разбавление цитратом также не снижало оплодотворяющей способности спермы, но приводило к возникновению большого количества нежизнеспособных зигот; у всех четырех овец, проверенных на оплодотворяемость, в яйцепроводах обнаружены дробящиеся зиготы, а из 19 маток, оставленных для проверки на зачатие, суягными оказались только три (15,8%).

Таблица 3

Влияние разбавителей на оплодотворяющую способность спермы и жизнеспособность зигот (впутритрубные введения спермы за 2-3 часа до овуляции)

Из них проверено

Степень Осеменен на на зачатие

Разбавитель разбавле- о маток, оплодотворение

ния гол. количе- в т.ч. на количе- в т.ч.

ство зачатие ство суятных

Неразбавленная сперма (контроль) . 16" 8 8 8 6

Глюкозо-цитратный 4 4 4 4

Тоже 1000 23 4 4 19 3

Тоже с

антибиотиками 4 5 1 1 4 1

Глюкозо-

фосфатный 4 1 1 1 - -

Тоже 1000 5 1 1 4 4

Содово-углекислый 4 4 4

Тоже 1000 15 6 6 9* 1

Щавелево-винный 4 3 1 2 1

Тоже 1000 5 1 - 4 1

Хлористо-натриевый 1000 8 3 3 5 5

* - У одной овцы половой цикл удлинился до 21 дня, у второй - до 35 дней

.Содово-углекислый и щавелево-вшшый разбавители мало отличались друг от друга, но оба уступали по биологическим свойствам глюкозо-цитратному буферу. Даже при слабых степенях разбавления спермы зачатие наступало лишь у половины осемененных овец, а при высоких титрах эмбриональная смертность достигала 75 и более процентов. Гибель зародышей при этом нередко наблюдалась во время или несколько позже их имплантаций, на что указывало значительное удлинение полового цикла у некоторых осемененных овец.

В отличие от других синтетических сред глюкозо-фосфатный разбавитель даже при тысячекратном разбавлении спермы не повлиял на ее оплодотворяющую способность и выживаемость зигот: все овцы, использованных при испытании этого разбавителя оказались оплодотворенными, а у 4 оставленных для проверки на зачатие, наступила суягность.

Обращает на себя внимание тот факт, что у двух овец, осемененных внут-

ритрубно спермой, разбавленной в 1 ООО раз цитратным и углекислым разбавителями, в яйцепроводах имелись дегенерированные зиготы. В одном случае деформировалась прозрачная оболочка, во втором зигота состояла из бластомеров неправильной формы.

Следовательно, тысячекратное разбавление спермы цитратной, содово-углекислой и щавеяево-вшшой средами может вызывать в цитоплазме спермиев какие-то сложные биохимические сдвиги, хотя и не влияющие на га оплодотворяющую способность, но, тем не менее, пагубно отражающихся на биологической полноценности клеток и приводящих к возникновению нежизнеспособных зигот.

Зиготы, обнаруженные в яйцепроводах овец, осемененных внутритрубно спермой, разбавленной в тысячу раз глюкозо-фосфатным буфером, имели нормальное строение, что указывало на биологическую безвредность этой среды.

Подводя итог этой серии экспериментов, можно прийти к заключению, что биологически наиболее биологичным по отношению к сперме барана является глюкозо-фосфатный буфер. Этот разбавитель при кратковременном контакте со спермиями барана оказывался безвредным даже при тысячекратном разбавлении спермы.

На втором месте стоит глюкозо-цитратный буферный раствор. При четырехкратном разбавлении спермы он так же не снижал оплодотворяющей способности спермиев и не оказывал отрицательного действия на жизнеспособность возникающих зигот. Однако при тысячекратном разбавлении спермы этот раствор, в отличие от фосфата вызывал какие-то неблагоприятные сдвиги в биохимизме половых клеток, следствием чего являлась гибель значительной части возникающих при оплодотворении зигот. Подобные же явления наблюдались и при тысячекратном разбавлении спермы эк-вилибрированным глюкозо-цитратным буфером, содово-углекислым, щаве-лево-винным разбавителями и инактивированной сывороткой крови овец.

Следует подчеркнуть, что упомянутые и притом весьма существенные различия в действии испытанных разбавителей на сперму барана были обнаружены методом прямого биологического контроля, тогда как при косвенном биоконтроле резкой разницы между разбавителями установить не удалось. Это указывает на существенные преимущества первого способа перед вторым и на необходимость в качестве основного критерия в подобного рода экспериментах использовать оплодотворяющую способность спермиев. Последнее может быть установлено при быстром контакте испытуемой спермы с готовым к оплодотворению яйцом. Но в естественных условиях оплодотворение яйца зависит не только от сохранения спермиями их оплодотворяющей способности, но и в значительной мере и от их переживаемос-ти в половом тракте самки.

Изучению этого показателя в сочетании с оплодотворяющей способностью спермиев был посвящен второй этап лабораторных экспериментов.

2.3.2. Проверка оплодотворяющей способности спермы при цсрвикалыюм оссмснсшш овец. Первая серия опытов была проведена с целью изучения пе-реживаемости и оплодотворяющей способности спермиев в зависимости от состава разбавителя и дозы спермы при цервикалыюм ее введении.

Сперму разбавляли в 5 или 10 раз глюкозо-цитратной и глюкозо-фос-фатной средами и вводили цервикалыю в дозе 0,05 мл. 12 овцам ввели сперму, разбавленную глюкозо-цитратной или глюкозо-фосфатной средами с добавкой в качестве загустителя 2,5% поливинилового спирта. На третьи сутки после осеменения всех подопытных животных подвергли лапаротомии и исследовали у них яйцепроводы на наличие дробящихся зигот. Данные таблицы 4 показывают, что разбавление спермы глюкозо-цитратной средой и введение 30 млн. спермиев за 20-23 часа до овуляции резко снижает оплодотворяемость овец. Из 5 животных, осемененных такой дозой,

дробящиеся зиготы были обнаружены в яйцепроводах у 2 (40%). Лучшие результаты получены при разбавлении спермы фосфатным буфером. При осеменении овец спермой, разбавленной ггаокозо-фосфатным буфером, дробящиеся зиготы были обнаружены у 4 из 5 животных (80%).

Таблица 4

Влияние степени разбавления спермы на оплодотворяемость овец (цервикалъиое осеменение)

Разбавитель Степень разбавлен ия Количество спермиев в дозе, млн. Проверено на оплодотворяемость

всего в т.ч. оплодотвор илось

Глюкозо-цитратный 5 30 5 2

Глюкозо-фосфатный 5 30 5 4

Глюкозо-цитратный с загустителем 5 30 5 _

Глюкозо-фосфатный с загустителем 5 30 4 1

Глюкозо-фосфатный 10 15 3 1

Глюкозо-фосфатный с загустителем 10 15 3 _

Добавка поливинилового спирта привела к резкому снижению оплодотво-ряемости. Из 9 животных, осемененных цервикалыю спермой, разбавленной в

5 раз глюкозо-цитратной или глюкозо-фосфатной средами, с добавлением ПВС, дробящиеся зиготы обнаружены лишь в яйцепроводах одной из них.

Столь же резко понизилась оплодотворяемость овец при снижении дозировки до 15 млн. спермиев. Из трех маток, осемененных такой дозой, оплодотворилась одна, а при добавлении ПВС все три овцы оказались неопло-дотворенными.

Зиготы, 061 ируженные в яйцепроводах подопьгп 1ых овец, во всех случаях имели нормальное строение. Это показывает, что уменьшение дозировки вводимой спермы при осеменении овец задолго до овуляции может привести к дефициту спермиев в яйцепроводах к моменту выхода яйца и, как следствие, к невозможности его оплодотворения. Однако при наступившем оплодотворении возникшие зиготы сохраняют способность к последующему нормальному развитию. По-видимому, для оплодотворения яйца требуется определенный минимум спермиев, превышение которого не имеет существенного биологического значения.

Эксперименты по проверке разбавителей путём цервикалыюго осеменения овец разбавленной спермой подтвердили результаты опытов с внутритруб-ным осеменением овец. В этих исследованиях наиболее полноценными в биологическом отношении также оказался глюкозо-фосфатный буфер. Обычный и эквилибрированный глюкозо-цитратный разбавители оказались менее благоприятными в отношении переживаемости спермы, но равноценными по индуцированному, через спермии, воздействию на развитие возникающих зигот.

Особое место заняла инактивированная сыворотка крови овец. Не оказав существенного влияния на переживаемость и оплодотворяющую способность спермиев при слабом титре разбавления, она вызывала определенные биохимические сдвиги в их метаболизме, что привело к ускоренному дроблению, а в одном случае и к изменению бластомеров.

В этих опытах особенно четко проявилось дифференцированное влияние отдельных разбавителей натакие жизнеш ше свойства спермиев, как переживаемость, оплодотворяющая способность и потенциальная полноценность в отношении детерминации нормального последующего развития возникающих зигот.

На основании полученных результатов можно было предположить, что разбавление спермы фосфатом даст положительные результаты в отношении огаюдотворяемости и плодовитости овец как при введении нормальной дозы спермы, так и при снижении этой дозы в известных физиологических пределах. Разбавление спермы глюкозо-цитратным буфером при тех же условиях должно было, априори, привести к некоторому снижению оплодот-воряемости, а возможно и плодовитости. В отношении сыворотки крови овец можно предположить, что применение ее в качестве разбавителя существенно не отразится на оплодотворяемости овец по учету перегула, но снизит

конечные показатели оплодотворяемости и плодовитости за счет повышенной эмбриональной смертности.

2.33 Производственная проверка оплодотворяющей способности спермы, раз-бавлешюйсиитеппескими средами. Основная цель первого научпо-производствеи-пого опыта заключалась в проверке оплодотворяющей способности разбавленной спермы при введении ее в обычной дозе, содержащей 150-160 млн. спермиев.

Анализ таблицы 5 показывает, что умеренное разбавление спермы исследуемыми разбавителями, за исключением глюкозо-цитратиого, фактически не отразилось на ее оплодотворялощей способности (колебания от 76,7 до 79,0 против 78,0 в контроле). При использовании глюкозо-цитратиого буфера оп-лодотворяемость овец в первую охоту снизилась до 65,6%, то есть на 12,5%.

Хранение спермы в течение суток в глюкозо-цитратном буфере мало изменило ее оплодотворяющую способность, в то время как использование спермы, сохраненной в содово-углекислом и щавелево-вшшом разбавителях, снизило оплодотворяемость овец на 8,3 и 28,0%.

Таблица 5

Влияние разбавителей на отодотворяющую способность спермы барана

Разбавитель Срок хранения спермы, ч Учтено овец, гол. Оплодотворяемость овец от первого осеменения, % Всего объягнилось, % Эмбриональная смертность, % Получено. ягнят на 100 маток от первого осеменения

Свежая сперма контроль 50 78,0 96,0 2,0 130

Глюкозо-цитратный 61 65,5 93,5 5,0 132

То же + антибиотики 64 68,7 92,2 1,8 129

То же антибиотики 24 часа 85 67,1 93,0 3,5 130

Глюкозо-фосфатный - 76 79,0 93,5 2,6 132

Содово углекислый - 40 77,6 95,0 2,5 128

То же 24 часа 78 69,3 92,4 6,4 120

Щавелево-винный - 86 76,7 94,2 1,2 125

То же 24 часа 35 48,7 88,6 9,5 123

У овец, осемененных свежей разбавленной и неразбавленной спермой, эмбриональная смертность колебалась от 1,2 до 5%, а при использовании сохраненной спермы - от 3,5 до 9,5%.. Особенно резко повысилась эмбриональная смертность и снизился выход ягнят у овец, осемененных сохраненной спермой, разбавленной щавелево-винной средой. В этом случае разница в пользу свежей спермы по обоим показателям оказалась статистически достоверной (Т1=3,4, Т2=3,2). По остальным группам колебания были менее существенными и носили, вероятно, случайный характер. В связи с этим, некоторое снижение оплодотворяемости овец при использовании свежей спермы, разбавленной глюкозо-цитратным буфером, следует, по-видимому, объяснить только пониженной переживаемостыо спермиев, а не какими-либо более важными изменениями их биологических свойств. В противном случае, снижение оплодотворяемости должно было обязательно сочетаться с повышением эмбриональной смертности и уменьшением выхода молодняка, как это отчетливо наблюдалось при хранении спермы в содово-углекислом и, особенно, в щавелево-винном разбавителях.

На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что трехкратное разбавление спермы барана изотоническим раствором цитрата натрия и введении цервикалыю в дозе 150 млн. практически не отражается на его оплодотворяющей способности или снижает этот показатель в весьма незначительных пределах.

Содово-углекислый и щавелево-винный разбавители при кратковременном контакте со спермиями также не снижают их оплодотворяющей способности. Однако при суточном хранении спермы в условиях кислотного анабиоза они снижают этот показатель в большей степени, чем глюкозо-цитратный буфер.

Вместе с тем, при высоких (в тысячу раз) титрах разбавления все перечисленные разбавители даже при кратковременном контакте со спермиями вызывали в них глубокие физиологические изменения, неблагоприятно отражающиеся на жизнеспособности оплодотворенных яйцевых клеток. В отличие от них фосфатный буфер даже при высоких степенях разбавления спермы не вызывал таких нежелательных изменений, что подтверждается стопроцентной выживаемостью образующихся после оплодотворения зигот.

Поскольку описанные результаты производственного опыта получены при осеменении овец стандартной дозой спермы, они не могут служить достаточным основанием для выводов о полной безвредности испытуемых разбавителей для спермы барана. Известно, что при естественной садке в церви-кальныйканал проникает 60-70 млн. спермиев (М.П. Кузнецов, 1934), поэтому при введении 150 млн. спермиев создается значительный резерв семенных клеток, способный нивелировать незначительное ухудшение качества спер-

мы. При снижении дозировки до пределов или ниже физиологической нормы влияние качества спермы на оплодотворяемость самок может, по-видимому, проявляться в более четкой форме. Биологическая полноценность разбавителя может быть установлена еще более точно, если уменьшение дозировки будет сочетаться с повышением титра разбавления.

Проверке высказанных предположений был посвящен второй научно-производственный опыт, цель которого заключалась в изучении оплодотворяющей способности спермы, разбавленной различными синтетическими средами и вводимой в уменьшенной дозе.

Для разбавления спермы использовали глюкозо-цитратный и глюкозо-фос-фатный разбавители. Часть маток осеменили спермой, разбавленной цитратным или фосфатным буфером с добавлением 2,5% поливинилового спирта в качестве загустителя. Подопытных овец первой отары осеменили двукратно, с интервалом 24 часа дозой, содержащей 50 млн. спермиев. Сперму разбавляли в 3 раза.

Овец второй отары осеменили однократной дозой, содержащей 30 или 15 млн. спермиев. В первом случае сперму разбавляли в 5, а во втором - в 10 раз.

При осеменении загущенной спермой поливиниловый спирт вводили в разбавитель непосредственно перед разбавлением спермы. Контролем в каждом случае служили овцы, осемененные дозой 0,05 мл свежей спермы, содержащей 150-160 млн. спермиев.

Таблица 6

Оплодотворяемость овец, осемененных уменьшенными дозами спермы, разбавленной различными средами

Разбавитель Количество спермиев в дозе, млн. Учтено маток, гол Оплодотворяемость овец, % Всего объягнилось, % Эмбриональная смертность, % Получено ягнят на 100 маток от первого осеменения

1 отара

Неразбавленная сперма (контроль) 150 115 75,7 98,3 1,7 146

Глюкозо-цитратный 50 45 57,8 95,6 6,6 134

Глюкозо-фосфатный 50 63 88,9 96,8 1,6 132

Глюкозо-цитратный с загустителем 50 41 48,8 90,2 4,9 120

II отара

Неразбавленная сперма (контроль) 150 143 72,7 89,5 5,6 142

Глюкозо-цитратный 30 101 57,4 89,1 4,95 139

Глюкозо-фосфатный 30 98 70,4 86,7 5,1 144

Глюкозо-цитратный 15 • 37 35,1 81,1 13,5 123

Глюкозо-фосфатный 15 42 59,5 88,1 11,9 132

Материалы таблицы 6 показывают, что в первой отаре, при введении 50 млн. спермиев с использованием фосфатного разбавителя, оплодотворяемость овец составила 88,9% и была на 13,23% выше, чем в контроле. Наименьший процент оплодотворений (57,8%) зарегистрирован при применении цитрат-ного разбавителя. Введение в состав цитратного разбавителя поливинилового спирта снизило оплодотворяемость до 48,8%.

Сходные результаты были получены и во второй отаре, при осеменении дозами, содержащими 30 млн. спермиев. Правда, в этом случае оплодотворяемость при разбавлении спермы глюкозо-фосфатной средой была несколько ниже, чем в контроле (70,4 против 72,7%). Но если учесть, что такой результат получен при снижении числа вводимых спермиев в 5 раз и что при использовании других разбавителей оплодотворяемость была значительно ниже (57,4 и 60,5%), то и здесь преимущество глюкозо-фосфатного буфера оказалось очевидным. Уменьшение дозировки до 15 млн. спермиев и добавка поливинилового спирта привели к резкому снижению оплодотворяемос-ти овец. Однако и в этом случае преимущество сохранилось за фосфатным разбавителем.

Как известно, у овец критерием эмбриональной смертности служит задержка повторного наступления охоты или бесплодие маток, не перегулявших после первичного осеменения. В проведенном опыте количество таких овец колебалось по группам от 1,6 до 13,5%. Важно подчеркнуть, что эмбриональная смертность возрастала при этом по мере увеличения титра разбавления и уменьшения дозировки спермы и коррелировала со снижением выхода ягнят. Можно поэтому предположить, что применяемые разбавители, не оказывая вредного влияния при уменьшенных степенях разбавления спермы, способны вызывать неблагоприятные сдвиги в биохимизме спермиев при более сильном ее разбавлении.

Проведенные исследования показали, что оплодотворяемость овец при искусственном осеменении зависит как от дозы введенной спермы, так и от биологических свойств применяемого разбавителя. Роль последнего более четко проявляется при уменьшении доз спермы и повышении титра разбавления. Загущение спермы в этом случае не дает положительного эффекта.

На основании полученных результатов можно прийти к заключению, что замена глюкозо-цитратного разбавителя глюкозо-фосфатным позволяет, без ущерба для оплодотворяемости, снизить дозировку вводимой спермы до 50 миллионов спермиев, то есть в три раза по сравнению с рекомендуемой инструкцией.

Преимущество фосфатного буфера могло быть выраженным только при использовании свежеразбавленной спермы и нивелироваться при сохране-

нии разбавленной спермы. Поэтому была проведена следующая серия экспериментов, в которых изучались свойства разбавленной и сохраняемой спермы в зависимости от разбавителей и способов хранения.

2.4. Изучение биологических свойств спермы при хранении и транспортировке. Собственные исследования были направлены на изучение причин снижения оплодотворяемости овец, осемененных сохраненной и транспортируемой спермой, и разработку практических мероприятий для возможного их устранения.

В собственных исследованиях, в связи с поставленной задачей изыскания наиболее рациональных способов разбавления, консервации и транспортировки спермы барана, были изучены следующие синтетические буферные среды:

1. Глюкозо-желточно-цитратный разбавитель (ГЖЦР).

2. Глюкозо-желточно-цитратно-фосфатный разбавитель (ГЖЦФР),

3. Глюкозо-желточно-фосфатный разбавитель (ГЖФР).

4. Глюкозо-желточно-цитратный разбавитель для спермы барана (ГЖЦР-К), изготовляемый по методике, предложенной М. Г. Ковалевым (1969).

В лабораторных условиях методом косвенного биоконтроля испы-тывалось влияние разбавителей на жизнеспособность спермиев при хранении спермы барана. Данные биоконтроля уточнялись с помощью люминесцентного и электронного микроскопирования и биохимических исследований. При этом изучались морфологические, физиологические и биохимические свойства спермы баранов, сохраняемой в различных синтетических средах.

Лабораторные исследования показали, что по большинству показателей как свежеразбавленная, так и сохраняемая при I - + 2...+ 4°С сперма была лучше при использовании в качестве разбавителя глюкозо-желточно-фос-фатного буфера. Оптимум разбавления, при котором достигается наиболее высокая переживаемость спермиев для всех разбавителей, за исключением глюкозо-желточно-фосфатного, составил 8. Применение глюкозо-желточно-фосфатного буфера повысило этот показатель до 16.

Преимущество ГЖФР сохранялось и при изучении таких показателей как редукция метиленовон сини, дегвдрогеназная и цитохромоксидазная активность.

В то же время исследования показали, что независимо от применяемого разбавителя в процессе хранения спермы происходит закономерное снижение основных показателей. Однако степень этого снижения может быть различной.

При комнатной температуре происходит постепенное снижение активности, резистентности и живучести и уменьшение редукции метиленовой сини, дегидрогеназной и цитохромоксидазной активности (за 5 часов хранения разбавленной спермы эти показатели изменяются, примерно, на 5 - 8%). В то же время 5 - часовое хранение при t - +2...+4°С привело к снижению тех же показателей на 15 - 20%. Однако и в этом случае преимущество сохранялось за глюкозо-желточно-фосфатным разбавителем.

2.4.1. Сравнительная характеристика люминесцентного и обычного методов определения качества спермы, сохраняемой в испытуемых разбавителях.

Обычная глазомерная оценка активности, как известно, не отличается большой точностью, и дает лишь относительное представление о качестве исследуемой спермы. Для более точной оценки В.А. Морозов (1950) предложил окрашивать спермин 5%- ним раствором эозина или 1%-ным раствором коп-го-рот. Этот метод основан на неспособности витального окрашивания активных спермиев гистологическими красками и является более точным, чем обычная оценка качества спермы. Однако и этот метод не дает точной характеристики функциональных изменений половых клеток барана.

Это послужило поводом для проведения серии экспериментов, направленных на изучение качества испытуемых разбавителей методом люминесцентной микроскопии. Указанный метод основан на различном свечении нормальных, функционально измененных и мертвых спермиев при окраске спермы акридиновым оранжевым. При люминесцентной микроскопии живые активные спермии имеют ярко-зеленую флуоресценцию, спермин с нарушенными функциями - желтую, а мертвые - ярко-оранжевую окраску. Механизм накопления и свечения флюорохрома в живых и мертвых клетках недостаточно выяснен. Известно, однако, что он зависят не только от посмертных нарушений клеток, но и от изменений структуры ДНК (A.A. Шурубура, 1964. Е.М. Енчев, 1965, Г.А. Святовец, Г.Г. Погрибный, 1967).

В проведенных исследованиях качество спермы проверялось флюоресцентным методом после хранения ее в течение 24 часов в охлажденном до t + 2...+ 4°С, или замороженным до t - 79°С в испытуемых разбавителях.. При определении качества спермы подсчитывали процент спермиев с ярко-зеленой окраской (активные), с появлением желтой окраски (функциональные нарушения) и окрашенные в оранжевый цвет (мертвые спермии). Окраска спермиев флюорохромами не изменялась и после фиксации препарата высушиванием или 3-х процентным изотоническим раствором фенола (pH 7,2-7,4). Фиксированные препараты использовали для цветной микрофотографии.

Таблица 7

Сравнительная оценка разбавителей спермы барана методами обычной и люминесцентной микроскопии

Разбавитель Способ хранения Обычная оценка, балл Люминесцентная оценка, %

Активных Неактивных Нормальных Поврежденных Мертвых

ГЖЦ Свежая 9,0 1,0 85±0,76 6±0,04 9±0,08

24 ч. 1+2... + 4°С 6,7 3,3 53±0,26 18±0,14 29±0,31

ГЖФ Свежая 9,0 1,0 87±0,57 6±0,06 7±0,04

24 ч. 1 -+2... +4°С 6,9 3,1 57±0,33 17±0,09 26±0,05

ГЖЦФ Свежая 9,0 1,0 84±0,69 9±0,06 7±0,11

24 ч. 1- +2... +4°С 6,3 3,7 54±0,41 17±0,11 29±0,19

ГЖЦ-К Свежая 9,0 1,0 85±0,57 7 ±0,11 8±0,07

24 ч. 1 -+2... +4°С 6,1 3,9 49±0,52 19±0,14 32±0,23

ГЖЦ с глицерином Свежая 9,0 1,0 83±0,63 9±0,04 8±0,05

24 ч. 1 -79 °С 5,6 4,4 29±0,32 29±0,32 42±0,26

Параллельно с люминесцентной проводили обычную глазомерную оценку качества спермы.

Из материалов таблицы 7 видно, что при люминесцентной оценке качества спермы процент активных спермиев во всех случаях был 1шже, чем при обычной. Объясняется это тем, что при обычной оценке в число активных спермиев включаются подвижные половые клетки, имеющие функциональные повреждения. При люминесцентной микроскопии такие спермии начинают окрашиваться в желтый цвет и не включаются в число активных. Если учесть, что спермии с функциональными повреждениями обычно утрачивают способность к нормальному оплодотворению яйца, то становится ясным, что люминесцентный метод позволяет получить более объективные показатели качества спермы.

Обращает на себя внимание особенно резкая разница в количество активных спермиев при люминесцентной микроскопии и обычной оценке замороженной спермы (29 и 50%). Причина столь резких различий заключается вероятно в том, что при глубоком охлаждении значительная часть спермиев утрачивает нормальные функциональные свойства, не теряя подвижности. Следовательно, при оценке замороженной спермы люминесцентный метод приобретает особые преимущества по сравнению с обычным.

Касаясь качества исследуемых разбавителей, следует отметить, что при обоих способах оценки лучшим .оказался глюкозо-желточно-фосфатный, а

наихудшим, более гипертонический, предложенный М.Г. Ковалевым. Глю-козо-желточно-цитратная среда заняла при этом промежуточное место.

2.5.2. Влияние вибрации на качество сохраняемой спермы. Одной из причин снижения оплодотворяемое™ овец, осемененных охлажденной спермой, является повреждение спермиев под действием вибрации, возникающей при транспортировке (Д.И. Маликов, Г.В. Славная, 1951; О.Н. Новикова, 1967; Лысак, 1969).

В собственных исследованиях изучалось влияние вибрации на свежеполу-ченнуга и сохраняемую сперму баранов. В лабораторных условиях встряхивание семени производилось в термосе со льдом с помощью вибратора «Labor».

Исследования показали, что живучесть спермы, сохраняемой в наполовину заполненных флаконах, после вибрации и суточного хранения в охлажденном состоянии снижалась на 22-38 процентов. На сперму, сохраняемую в полностью заполненных флаконах, вибрация оказала гораздо меньшее влияние.

Полученные данные позволили предположить, что вибрация спермы, сохраняемой в неполностью заполненных флаконах, обусловливает образование пузырьков воздуха, приводящих к повреждениям спермиев.

Электронная микроскопия показала, что от 10 до 18 процентов спермиев после вибрации и суточного хранения имеют такие механические повреждения, как разрыв в области акросомы, разрыв и закручивание тела и хвоста спермия. У поврежденных спермиев наблюдался отрыв головки спермия от шейки. Это, по-видимому, объясняется тем, что соединение передней цент-риоли с углублением в теле спермия является наиболее уязвимым местом и при механическом сотрясении здесь чаще всего происходит разрыв.

Вибрация спермы, сохраняемой в заполненных флаконах, оказала менее заметное влияние на структуру спермиев, вызвав механические повреждения клеток лишь у 3-5 процентов.

2.5.3. Влияние микроорганизмов и бактериостатических веществ »а перс-живасмость и оплодотворяющую способность спермиев барана. Сперма, получаемая на искусственную вагину, способна в более или менее значительной мере загрязняться микробами. Частично микроорганизмы могут попадать в сперму из концевых отделов мочеиспускательного канала, однако инфицирование, в основном, происходит за счет громадного количества микробов, находящихся в препуциальном мешке, коже и шерстном покрове, на стенках искусственной вагины и спермоприемника, в разбавителе, а также в помещении, где производится взятие и разбавление спермы.

В задачу собственных исследований входило изучение общей микробной загрязненности спермы при кратковременном или 24-часовом хранении и оп-

ределение видового состава микроорганизмов, попадающих в сперму барана в процессе получения па искусственную вагину и дальнейшей ее обработке.

Определение общего количества микробов и видовой состав микрофлоры производили непосредственно после взятая спермы, через 1,2 3 и 5 часов хранения при комнатной температуре цельной, а также разбавленной в одном из испытуемых буферных растворов спермы. Оставшуюся часть спермы хранили при +2 ... +4°С и исследовали через 12, 24 и 48 часов хранения.

Результаты экспериментов по определению количественного состава бактериальной микрофлоры спермы в зависимости от способа разбавления и хранения спермы барана представлены в таблице 8.

Как видно из материалов таблицы 8, количественный состав микрофлоры в сохраняемой сперме барана значительно варьирует в зависимости от способа и времени хранения спермы. Сразу же после получения и разбавления спермы в 1 мл содержалось от 123,0 до 212,0 тысяч микроорганизмов. Однако, уже черва 1 час хранения, количество микробных тел значительно уменьшилось во всех пробах, независимо от температуры хранения. В неразбавленной сперме количество микробов начинает увеличиваться на 4-5 часу хранения при комнатной температуре.

Сперма, разбавленная и сохраняемая при комнатной температуре, к 4-5 часу содержала минимальное число микробов -0,71 -0,99 тысяч в 1 мл. Через 12 часов храпения число микробов увеличилось до 7,9, при 48-часовом хранении спермы на пластинчатом агаре в чашках Петри, даже при максимальном разбавлении, при высеве наблюдался рост в виде сплошного наложения, не поддающийся подсчету.

В сперме, сохраняемой при около нулевой температуре, в первые 5 часов хранения количество микробов значительно уменьшается, достигая минимума через 12 часов. Через 24 часа и, особенно, через 48 часов хранения t -при +2... +4°С количество бактерий в сохраняемой сперме увеличивается за счет развития психрофильной микрофлоры.

Выделенная из спермы барана бактериальная микрофлора характеризовалась видовым разнообразием в различных опытах, что, очевидно, обусловлено непостоянством микробов в помещениях, где проводилось взятие и разбавление спермы.

Видовой состав бактерий, выделенных во всех опытах, представлен следующим образом: Bact. proteus Zopfii, Bact. coscoroba, Bact. coli communis, Bact. sulfureum, Bact. subtyphosum, Bact. fluorescens capsulatum, Bact. vesiculiformans, Bact. annulatum, Bact. chlorophenum, Bact. coli citrovorum, Bact. subtilis, Staph. pyogenes aureus, albus, citreus и др.

Большинство микробов, выделенных из сохраняемой спермы были факульта-

тивиыми аэробами. Некоторые из них разжижали желатину, вызывали свертыва-ше и пептонизацшо молока, разложение белков до гащола и сероводорода. Это указьшаетна их биохимическую активность в отношении белковых веществ. Почти все микроорганизмы разлагали глюкозу с образова! тем кислоты и реже газа

Исследования грибковой загрязненности показали, что в сперме барана одновременно могут содержаться до 7-10 видов грибков, причем в пробах спермы одного и того же барана в разное время содержатся разные виды.

Видовой состав грибковой микрофлоры, выделенной из спермы баранов, представлен следующим образом: Penicillum felutans, crustosum, Aspergilius fumigatus, clavatus, niger, Mucor, Candida albicans, Thrichophyton, Alternaria, Clodosporium и др.

Таким образом, лабораторные исследования показали, что в сперме барана сразу же после получения на искусственную вагину содержится большое количество бактериальной и грибковой микрофлоры. Влияние микробов на биологические свойства спермиев изучено в производственном опыте.

2.6.1. Проверка влияния разбавителей на оплодотворяющую способность охлажденной спермы барана. Результаты осеменения овец спермой, сохраняемой при температуре + 2... + 4°С приведены в таблице S.

Как видно из материалов таблицы, оплодотворяемость овец, осемененных сохраняемой перевозной спермой, колебалась от 29,5 до 64,1%. Если учесть, что при осеменении овец дозой 0,05 мл свежеполученной спермы оплодотворяемость составляет обычно 75-85%) (В.М. Казаков, 1960; М.М. Асланян, 1967, Д.И. Маликов, 1969 и др.), то можно сделать вывод, что применение перевозной охлажденной спермы значительно снижает оплодотворяемость овцематок. Особо важное значение при этом имеет, по-видимому, время хранения спермы при пониженной до +2...+4°С температуре. Это видно из того, что в группах овец, осемененных спермой 3-часового хранения оплодотворилось 61,7% маток, а использование спермы 24-часового хранения снизило этот показатель до 32,6%. Разница была статистически достоверной (Т=7,2).

Таким образом, результаты научно-производственного опыта согласуются с результатами лабораторных экспериментов, посвященных изучению влияния времени хранения спермы барана на биологические свойства спермиев.

Снижение физиологических и биохимических показателей половых клеток барана в зависимости от срока хранения охлажденной спермы, полученное в лабораторных условиях, четко коррелирует со снижением оплодотво-ряемости овец, осемененных такой спермой в производственных условиях.

Зависимость качества спермы от времени хранения подтверждается и при анализе показателей бесплодия и эмбриональной смертности. Если при 330

асовом хранении спермы эти показатели составили, соответственно, в цитатной группе 8,3 и 4,6%, в фосфатной -10,5 и 4,1%, то при суточном хране-ии они увеличились, примерно, в 1,5-2,0 раза.

Таблица 9

Результаты ягнения овец, осемененных перевозной спермой, сохраняемой при температуре +2... +4°С

Разба- Срок хра- Учтено Оплодотво- Бесплод- Эмбрио- Получено

витель нения, ч. овец, рилось овец ных, % нальная ягнят на 100

гол от 1 -го осе- смертность, маток, гол

менения, % %

~ЖЦР 3 109 59,4 8,3 4,7 136

"ЖФР 3 82 64,1 10,5 4,1 138

ГЖЦР 24 137 34,3 17,1 8,4 121

^КЦФР 24 148 30,2 14,7 7,4 125

НЖЦР-К 24 91 29,5 15,2 7,1 120

ГЖФР 24 140 36,3 13,5 5,6 139

Снижение оплодотворяемости овец, осемененных спермой сохраняемой в терние суток, по сравнению с оплодотворяемостыо животных, осемененных спер-юй с 3-х часовым хранением, сочеталось с пониженным выходом молодняка. 1сли при введении суточной спермы этот показатель был равен в среднем 126, о при введении спермы 3-х часового хранения выход ягнят увеличился до 137.

Таким образом, результаты производственного опыта показали, что реша-эщим фактором в снижении оплодотворяющей способности сохраняемой спер-1Ы являются воздействия на половые клетки барана времени содержания ее при [еблагоприятных условиях. Однако было бы ошибочным полностью ипюри-ювать защитные свойства разбавителей, применяемых при хранении спермы, 'езультаты опыта показывают, что в группе овец, осемененных спермой, сохра-[яемой в течение 3 часов в глюкозо-желточно-фосфатном буфере, оплодотворя-мость составила 64,1 процента и была на 4,7% выше оплодотворяемости «цитатной» группы (59,4%). Использование спермы суточного хранения значительно низило этот показатель, однако и в этом случае оплодотворяемость была ;ыше в «фосфатной» группе (36,3 против 29,5-34,3% в остальных группах).

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что использова-[ие транспортированной спермы, сохраняемой при температуре +2.. .+4°С, начительно снижает оплодотворяемость овец по сравнению с использова-[ием свежей спермы. При этом оплодотворяющая способность половых кле-ок барана снижается, в основном, за счет неблагоприятного влияния ох-[аждения до I - +2.. ,-+4°С и длительности хранения при этой температуре и, [астично, зависит от применяемой среды,

- Кроме того, немаловажное значение, по-видимому, могут иметь вибрация, возникающая при транспортировке, микрофлора, развивающаяся в сперме, бактериостатические вещества, добавляемые в сперму и другие факторы. Изучение их влияния на оплодотворяющую способность спермиев было проверено в научно - производственных опытах.

2.6.1. В научно-производственном эксперименте проверялась оплодотворяющая способность спермы, сохраняемой при температуре +2...+4°С и +16...+18°С и влияние на оплодотворяемость овец бактериостатических веществ, добавляемых при сохранении спермы барана.

Как видно из материалов таблицы 10, оплодотворяемость овец в контрольной группе составила 78,7°/). Оплодотворяемость овец в опытных группах была ниже, чем в контроле и составила у овец, осемененных спермой, сохраняемой в течение 3 часов при ком1 гатной температуре - 72,5 и 77,3%, а у животных, осемененных спермой, сохрашемой в течение 24 часов при температуре +2.. ,+4°С - 51,8 и 58,1 %.

Таким образом, даже кратковременное сохранение спермы влияет отрицательно на биологические свойства половых клеток, что и выражается закономерно в снижении оплодотворяемости маток. Однако разница между процентом оплодотворений овец при введении свежей спермы и спермы, сохраняемой в течение 3 часов при комнатной температуре была незначительной (6,2 и 1,4%) и статистически недостоверной (Т - 0,76 и 0,18).

Таблица 10

Влияние способов и сроков хранения на оплодотворяющую способность спермы барана

Разбавитель, 1 »С Время хранения, ч. Учтено овец, гол Оплодотворилось овец от 1- го осеменения, % Бесплодных,% Эмбриональная смертность, % Получено ягнят на 100 маток от 1 осеменения

Свежеполу-ченная сперма (контроль) 3 50 78,7 5,8 3,6 130

ГЖЦР + 16-+ 18°С 3 58 72,5 6,7 3,9 128 •

ГЖФР+16-+ 18°С 3 67 77,3 6,4 ' " •1,0 '.' 128 '

ГЖЦР +2-+4-С 24 54 51,8 9,6 6,8 119

ГЖФР +2-+4°С 24 60 58,1 10,4 7,1 124

ГЖЦР + 16-+ 18°С, со спермосаном 3 55 69,8 8,4 5,7 128

ГЖЦР +2-+4°С со спермосаном 24 72 48,4 12,3 8,2 123

В то же время, осеменение овец спермой, сохраняемой в течение 3 часов при температуре +2 ... +4°С, снизило оплодотворяемость до 51,8 и 58,1%, что на 26,9 и 20,6%) ниже результатов, полученных при использовании свежей спермы и на 14,4 - 25,5% ниже оплодотворяемости маток, осемененных спермой, сохраняемой прут комнатной температуре в течение 3 часов. Разница была во всех случаях статистически достоверной (Т колебалась от 3,2 до 3,0).

При сравнении результатов опыта в подопытных группах обращает на себя внимание тот факт, что оплодотворяемость овец, осемененных спермой, разбавленной «фосфатной» средой, была во всех случаях несколько выше, чем • 'в «цитратных» группах. Однако разница была статистически недостоверной.

Бесплодие в группах овец, осемененных сохраняемой спермой коррелировало в обратно пропорциональной зависимости от времени хранения спермы. Если в контроле бесплодие составило 5,8%, то в подопытных группах, осемененных «3-часовой спермой», этот показатель был несколько выше (6,7 и 6,4%), а в группах животных, осемененных охлажденной спермой бесплодие составило 9,6 и 10,4%.

Такая же закономерность наблюдалась и при сравнении показателей эмбриональной смертности в контрольной и подопытных группах. Если в контроле эмбриональная смертность составила 3,6%), то в подопытной группе она колебалась от 3,9 до 7,1 %). Выход ягнят в подопытных группах составил от 119до 128 на 100 овцематок, при 130 в контроле. Особенно резко повысилась эмбриональная смертность и снизился выход ягнят у овец, осемененных спермой, сохраняемой в охлажденном состоянии в течение 24 часов в «цитратном» буфере.

Добавление в сперму бактериостатических веществ снизило оплодотворяемость овец, осемененных спермой, сохраняемой при комнатной температуре и температуре +2 ...+ 4°С, соответственно на 2,7 и 3,4%.

В сперме, сохраняемой при комнатной температуре, обменные процессы протекают, естественно, более энергично, чем при хранении спермы при I +2...+4°С. Однако непродолжительная, 3-х часовая выдержка спермы в условиях комнатной температуры не вызывает значительных сдвигов в энергетическом балансе спермиев, чем и объясняется довольно высокая оплодотворяемость овец в подопытных группах, осемененных такой спермой.

Недостоверность различий между оплодотворениями в «фосфатной» и «цит-ратной» группах, непозволяетсполной категоричностью делать вывод о преимуществах фосфатного разбавителя перед цитратным. Тем не менее незначительная разница в пользу «фосфата» закономерно получаемая во всех группах, а также данные первого научно-производствешюго опытаилабораторных исследований, указывают на некоторое преимущество глюкозо-желточноч})осфатного буфера. Касаясь вопроса влияния бактериостатических веществ на сохраняемую сперму, необходимо отметить, что в нашем опыте, проведенном с соблюдением гигиени-

ческих условий при взятии спермы, добавление спермосана не только не повысило, но даже несколько снизило оплодотворяемосгь осемененных овец.

2.6.2. Научно-производственный эксперимент по изучению влияния вибрации, создаваемой при транспортировке, на оплодотворяющую способность половых клеток барана отображен в таблице 11.

Из данных таблицы видно, что вибрация спермы оказывает влияние на оплодотворяемость овец независимо от способов консервации. И в группах подопытных овец, осемененных «трехчасовой» спермой и у животных осемененных спермой суточного хранения, вибрация снизила показатель оплодотворяемое™ на 1,5-14,7%. Если в группе животных (контроль), осемененных разбавленной спермой, сохраняемой в течение 3 часов, оплодотворяемость составила 68,1%, то при использовании вибрированной спермы в полностью заполненных флаконах-ампулах этот показатель был равен 66,9%. Осеменение овец спермой, подверженной часовой вибрации в не полностью заполненных флаконах, снизило оплодотворяемость до 63,8%. То же самое наблюдалось и при использовании охлажденной спермы 24 - часового хранения. Вибрация в полностью заполненных ампулах мало изменила оплодотворяющую способность половых клеток барана. Так, вибрация в полностью заполненных ампулах дала 45,6% оплодотворений при 46,7% в группе овец, осемененных спермой без вибрации. В то же время вибрация, проводимая в наполовину заполненных ампулах, неблагоприятно отразилась на свойствах спермиев, в результате чего оплодотворяемость овец снизилась до 42,1%. В группе животных, осемененных свежей неразбавленной спермой, оплодотворяемость составила 71,4%.

Таблица 11

Влияние вибрации и температуры хранения на оплодотворяющую способность спермы барана

Разбавитель и ГС Срок хранения, ч. Учтено овец, гол Оплодотворилось овец, от 1- го осеменения % Бесплодных,' " % Эмбриональная смертность, % Получено ягнят I. на 100 маток от 1-го осеменения

ГЖЦР без вибрации (контроль) +16-+18°С 3 56 68,1 ' 4,6' 2,1 : " 140 ''

ГЖЦР полный с вибрацией +16-+18°С 3 68 66,9 5,4 3,0 135

Разбавитель и ГС Срок хранения, ч. Учтено овец, гол Оплодотворилось овец, от 1- го осеменения % Бесплодных, % Эмбриональная смертность, % Получено ягнят на 100 маток от 1-го осеменения

ГЖЦР неполный с вибрацией +16-+18°С 3 48 63,8 6,7 3,2 136

Без вибрации (контроль) +2-+4°С 24 52 46,7 6,5 3,9 130

Полный с вибрацией +2-+4Х 24 62 45,6 7,2 4,0 121

Неполный с вибрацией +2-+4°С 24 69 42,1 8,9 5,6 126

Свежеполу-ченная сперма - • 78 71,4 1,9 0,8 140

При анализе других показателей, таких как эмбриональная смертность, бесплодие, выход молодняка, видно, что вибрация не оказала какого-либо влияния. Колебания этих показателей зависят, как и предыдущих, от времени и способа хранения спермы. Это подтверждает данные лабораторных исследований о механическом повреждении спермиев при вибрации за счет образования пузырьков воздуха (кавитации). На биологические свойства спермиев, оставшихся неповрежденными, вибрация не оказала существенного влияния.

Таким образом, данные научно-производственного опыта полностью подтвердили выводы лабораторных экспериментов и электронно-микроскопических исследований о неблагоприятном влиянии вибрации, возникающей при транспортировании спермы. Особенно отчетливо это влияние выражено при перевозке спермы в не- полностью заполненных флаконах.

Результаты собственных лабораторных и научно-производственных экспериментов явились одной из предпосылок проведения комиссионной проверки эффективности осеменения овец при различных способах хранения разбавленной спермы барана.

Комиссия, созданная в соответствие с распоряжением по Министерству сельского хозяйства СССР, провела проверку 5 способов кратковременного хранения спермы барана.

Данные по результатам ягнения в подопытных и контрольной группах представлены в таблице 12.

Таблица 12

Результат ягнения подопытных овцематок при производственной проверке

№ Группы Учтено овец при окоте, гол Оплодотворилось маток от 1- го осеменения, %

1 2-3 часовое хранения спермы при 1+16... + 18°С в глюкоэо-цитратной среде 151 65,1

2 2-3 часовое хранения спермы при 1 +16... +18°С в глюкозо-фосфатной среде 126 71,7

3 24-часовое хранения спермы при ( +2... +4°С в глюкозо-цитратно-жепточной среде. 150 44,6

4 12-часовое хранения спермы при 1 +2... +4°С в глюкоэо-фосфатно-цитратно-желточной среде. 136 47,0

5 12-часовое хранения спермы при ( +2... +4°С в глюкозо-цитратно-жепточной среде. 133 53,0

6 Контроль (свежая неразбавленная сперма) 102 74,7

Да1 и те таблицы 12 показывают, что лучшие результаты по учету оплодотво-ряемосги получены при использовании спермы, сохраняемой в глюкозо-желточ-но-фосфатном разбавителе при комнатной температуре в течение 2-3 часов.

Таким образом, результаты комиссионной проверки полностью подтвердили данные наших исследований.

2.7. Изучение влияния факторов внешней среды на выживаемость зародышей у овец. Многолетняя практика овцеводства показывает, что оплодотворяемость овец, определяемая по перегулу, всегда бывает выше по сравнению с результатами ягнения. При этом разница в показателях может колебаться в широком диапазоне, достигая иногда 30 и более процаггов. Объясняется это гибелью эмбрионов на ранних стадиях их развития. Причины этого нежелательного явления выяснены пока недостаточно, но можно полагать, что в их основе лежат как эндогенные, так и экзогенные факторы биотического и абиотического происхождения.

Гибель зародышей после их имплантации диагаосцируется обычно по отсутствию приплода у овец, не перегулявших в период осеменения, и сравнительно реже по удлинению полового цикла у маток, повторно приходящих в состояние охоты. В связи с этим высокая эмбриональная смертность всегда коррелирует со снижением оплодотворяемости и повыше! шем бесплодия, что в свою очередь приводит к унификации мероприятий по борьбе с этими негативными явлениями.

Приведенные выше исследования показали, что причиной эмбриональной смертности могут служить разнообразные факторы, нарушающие отработанный эволюцией тонкий механизм взаимодействия мужской и женской половых клеток и дальнейшего развития зародыша. Далеко не последним в ряду этих причин могут оказаться и факторы бактериального и микозного воздействия на половые клетки и развивающийся зародыш.

Опыты по изучению микрофлоры в различных отделах половых путей у

овец проводились на интактных животных и животных с хронической фистулой рога матки.

Исследования показали, что во влагалище овец вне охоты до введения пессариев имелась раз] юобраз! 1ая микрофлора. Из цервикалыгой сгапи выделе1 ю меньшее число микробов как в видовом, так и в количественном отношении. Среди них встречались виды, обнаруженные во влагалище. Это указывает на проникновение микробов в последнюю складку шейки матки из влагалища.

Выделенная из половых путей микрофлора была разнообразна, что, очевидно, можно связать с непостоянством состава микробов в помещениях, где содержались овцы. Процентное содержание микроорганизмов, выделенных из полового аппарата овец, представлено следующим образом:

Bact. Azureum 17,8

Urobact. psychrocarterium -13,3

Bact. Alcalencens -11,1

Urobact. amilovorum . - 8,9

Bact. Mesentericus vulgaris - 8,9

Sarcina lutea et luteola - 6,7

Oidium lactis - 6,6

Micrococcus ureae - 4,4

Bact. Terminalis - 4,4

Staphylococcus cereus albus - 3,1

Другие микробы встречались с частотой по 0,2-2%. Следует отметить, что большинство выделенных микробов (73,31%) составляли палочковидные, из них 28,8% были спорообразующими. Остальные микроорганизмы встречались значительно реже (различные сочетания кокков - 20%, оидии - 6,7%). Обращает на себя внимание тот факт, что го рога матки были выделены только палочковидные микроорганизмы, обладающие способностью к поступательному движению.

Для выявления причин бесплодия производился выборочный забой выбракованных овец. Забой проводился как в условиях хозяйства, так и на мясокомбинате. После забоя проводилось патологоанатомическое вскрытие с подробным осмотром всех органов. Сразу же после извлечения половых органов из брюшной полости, из различных частей полового аппарата брались пробы для бактериологического и микологического исследования. Половые органы, имеющие заметные отклонения от нормы, подвергались гистологическим исследованиям. Всего было исследовано 83 бесплодных овцы.

Обследование общего состояния и состояния наружных половых органов у бесплодных овец практически не выявило каких-либо отклонений от нормы. При осмотре влагалища с помощью влагалищного зеркала были отмечены следующие аномальные изменения:

- вагинит - 7 случаев (около 1%);

- гнойные абсцессы - 2 (0,3%):

- сужение просвета и уплотнение стенки матки - 5 (0,7%);

- инфантильное влагалище - 2 (0,3%);

- наличие мацерированного плода - 3 (0,5%).

Патологоанатомическое вскрытие, произведенное после забоя бесплодных, показало, что при отсутствии каких либо отклонений при внешнем осмотре, у большинства исследованных овец были обнаружены те или иные изменения в гениталиях. Лишь у 10 овец (около 12%) половые органы были без видимых отклонений. Остальные имели различные патологические отклонения от нормы, являющиеся большей частью результатом имевшихся ранее воспалительных процессов деструктивного характера, ограниченных одним или несколькими органами, либо генерализоваш1Ыми на весь половой аппарат овцы.

Анализ бактериологических и микологических исследований показал, что в 100% случаев посевы из влагалища давали обильный рост микроорганизмов как в количественном, так и в качественном отношении. Видовое разнообразие микроорганизмов во влагалище яловых овец практически не отличалось от такового здоровых овец. В количественном отношении число микробов резко возрастало при наличии у бесплодных овец цервицитов и вагинитов.

В то же время, в посевах из других отделов гениталий было получено незначительное число прорастаний. При этом из пораженных органов выделялись и бактериальные и грибковые микроорганизмы.

В составе выделе! п шх микрооргш шзмов встречаются аэробы, в oci iobi юм палочковидные (В. faecaüs alailigenes. В. azureum, В. chriseum, В. auranticum, В. subtiphosum, Е. coli, Urobacter amilovorum, В. recti, Azotobacter croococcum, Proteus vulgaris, Вас. subtilis и др.) и реже кокковые (Staphylococcus albus, citreus, albicans, cereus, Sarcina lutea et luteola, Micrococcus urea и др.). Из грибковых микроорга! помов чаще встречались Candida albicana, Asp. aureum, fumigatus, fia vus, niger, Licht, çaumbifera, Pénicillium, Fusarium и др. Многие из выделенных микробов обладали подвижностью.

Некоторые микроорганизмы способны к капсулообразованию и спорообразованию (Azotobacter croococcum, Bac.subtilis и др.). На мясопептонном бульоне образуют пленку 5 видов (В. cremoiges, В. auranticum, Azotobacter croococcum, В. denitrificans aqilis, Вас. subtilis). Свертывание молока вызывают 6 видов (Staph, albus, citreum, aureus, E. coli, Proteus vulgaris, Вас. subtilis). Почти все микроорганизмы вызывают помутнение среды. Глюкозу и галактозу сбраживают 5 видов (Staph, albus, citreus, aureus, Вас. subtilis, Proteus vulgaris).

Сероводород образуют 3 вида круглых (Staph, albus, citreus, aureus и 4 вида палочковидных (В. faecaüs alcaligenes, В. cremoides, E. coli, Вас. subtilis).

3 вида (Staph, aureus, В. coli, Proteus vulgaris) образуют индол, a 7 - нитраты (В. faecaüs alcaligenes, В. coli, В. alboprecípitans, Azotobacter croococcum, Proteus vulgaris, Вас. subtilis).

Таким образом, полученные результаты в отношении заселенности мик-оорганизмами влагалища и глубже лежащих органов генитального аппара-а бесплодных овец показывают, что при 100% росте микробов в посевах из лагалища, в глубоко лежащих органах -яичниках, рогах матки, шейке матки стречаются лишь единичные случаи роста.

Как видно из приведенных нами данных по изучению причин эмбриональ-ои смертности и бесплодия у овец и обзора имевшейся в нашем распоряже-ии литературы, проблема бесплодия очень сложна и ее разрешение не может граиичиться какой-либо одной точкой зрения. При изучении причин эмбри-нальной смертности и бесплодия необходимо принимать во внимание все эти-логические факторы: бактериальные и микозные, физиологические, патологи-еские, гормональные и генетические. Одновременно совершенно исключн-глыюе значение для возникновения и распространения бесплодия имеют орга-изационно-хозяйствепные аспекты, связанные с содержанием и кормлением ивотных, с подготовкой и проведением случки и окота.

3. ВЫВОДЫ

Эпидидимальная сперма, получаемая от баранов с хронической фистулой спермиопровода, отличается от эякулированной по морфологическим и химическим свойствам. В нем имеется до 60% спермиев с цитоплазмати-ческой капелькой на шейке и теле, концентрация спермы достигает 5 млрд. в мл, содержание фруктозы, активность окислительных ферментов и ка-талазы понижены на 10-20%.

Входящие в состав плазмы секреты придаточных половых желез обладают специфическим биологическим действием на половые клетки эякулированной спермы, сообщая им повышенную резистентность к гешггальным секретам самки. В связи с этим переживаемость эякулированной спермы в цервикапьном канапе охотных овец по сравнению с эпидидималыюй возрастаете 8-16 до 2629 часов, что приводит к соответствующему повышению оплодотворяемости маток при фронтальном их осеменении.

Изотонический глгокозо-цитратиыи буфер при тысячекратном разбавлении спермы оказывает неблагоприятное действие на биоло-гические свойства спермиев барана. Последнее проявляется в биохимических сдвигах, не отражающихся на оплодотворяющей способности спермиев, но приводящих к гибели 75% возникающих зигот на ранней стадии их развития.

В отличие от цитрата изотонический глюкозо-фосфатный разбавитель при том же титре разбавления не вызывает улавливаемых цитохимических изменений в протоплазме спермиев и не нарушает их способности к оплодотворению яйца и детерминации нормального развития возникающих зигот.

Тартратный, сульфатный, щавелево-винный, содово-углекислый изо-

тонические разбавители и инактивированпая сыворотка крови овец по сво ему действию оказались сходными с глюкозо-цитратным буфером.

6. При трехкратном разбавля ши спермы и цервикальном введе] ши 150 мга I. спер миев четкого влияния упомянутых разбавителей на оплодотворяющую спо собность спермы установить I к удалось. Последнее объяа шется компе! гсируга щим эффектом избытка семенных клеток при повышенной элиминации боле слабых и некоторым снижением переживаемосги основной массы спермиев з; счет неблагоприяпюго действия разбавителя.

7. При снижении дозировки вводимой спермы со 150 до 50 млн. спермиев то есть при устранении компенсирующего эффекта, действие разбавителе] проявляется более рельефно, В этом случае оплодотворяющая способност спермы, разбавленной фосфатным буфером, сохраняется на уровне кош роля (0,05 мл неразбавленной спермы), тогда как при разбавлении сперм! цитратом данный показатель снижается на 15%.

8. Уменьшение дозировки до 30 млн. спермиев не предотвращает снижени оплодогворяемости овец даже при разбавлении спермы фосфатным буферо\

9. Положительное действие глюкозо-фосфатного буфера на переживаемост и оплодотворяющую способность спермы сохраняется и при добавке в пег желтка куриного яйца, что обеспечивает возможность осеменения ове уменьшенными дозами спермы.

10. При использовании испытуемых синтетических сред для хранения сперм1 барана при температуре +2... +4°С показатели активности, резистентности живучести спермиев особенно заметно снижаются в первые 4-5 часов храш ния. В дальнейшем происходит постепенное ухудшение качества показат< лей, которые через 12 -часов снижаются до 70-75, через сутки - до 60-70, а концу вторых суток - до 40-50%> от исходных величин.

11. Люминесцентный метод оценки как свежен, так и сохраняемой сперм! дает более точные результаты по сравнению с обычной оценкой в связи возможностью установления функциональных повреждений спермиев.

12. Транспортировка спермы в незаполненных флаконах приводит к мех; ническим повреждениям 10-15%> спермиев. При этом, главным образос наблюдается отрыв головки от шейки, разрывы в области акросомы, ра: рывы тела и хвоста спермиев. Транспорт спермы в заполненных флакош вызывает повреждения лишь у 3-5% спермиев.

13. Бактериальная загрязненность спермы в первые часы хранения зн; чителыю снижается за счет бактерицидного действия спермы. Если в 1 м свежеполученной спермы содержится от 123 до 212 тысяч микробов, л уже через час количество микробных тел снижается до 76-80 тысяч в 1 м. достигая минимума к 4-5 часам хранения.

14. В производственном опыте оплодотворяемость овец, осемененных спе]

мой* сохраняемой в течение суток при температуре +2... +4° С, составила 29,5 -34,3%. Уменьшение срока хранения при этой температуре до 3-х часов повысило показатель оплодотворяемости до 59,4-64,1%. 15. Лучшие результаты в производственных условиях достигнуты при осеменении овец спермой, сохраняемой при комнатной (+16... +18°С) температуре в течение 3-4 часов в глюкозо-желточно-фосфатном разбавителе. Оплодотворяемость овец при этом составила 77,8% и практически не отличалась от оплодотворяемости овец, осемененных свежей спермой.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Проведенные исследования позволяют рационализировать метод искусственного осеменения овец за счет трехкратного уменьшения дозировки спермы, разбавленной глюкозо-желточно-фосфатным изотоническим буфером. Внедрение этого метода в производство позволяет в три раза повысить число маток, осемененных за сезон спермой каждого производителя и тем самым значительно ускорить темпы качественного совершенствования овцепоголовья.

2. Для повышения оплодотворяемости овец, осемененных перевозной спермой, целесообразно использовать сперму баранов, сохраняемую в течение 2-3 часов в глюкозо-фосфатном разбавителе при температуре +16... + 18°С.

3. С целью предохранения транспортированной спермы от механических повреждений, возникающих при кавитации, следует перевозить сперму в полностью заполненных флаконах.

5. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Желтобрюх H.A., Логинова Н.В., Мануйлов И.М. О физиологической роли секретов добавочных половых желез. Овцеводство, №9,1966 г.

2. Лопырин А.И., Мануйлов И.М. Биологическая проверка разбавителей для спермы барана. Овцеводство, №9, 1966 г.

3. Мануйлов И.М., Сипко А.И. Скорость продвижения сперматозоидов в половом тракте овец. Овцеводство, №6, 1967 г.

4. Лопырин А.И., Мануйлов И.М. Осеменение овец уменьшенными дозами семени. Овцеводство, №,1968 г.

5. Мануйлов И.М. Влияние секретов добавочных половых желез и различных синтетических сред на биологические свойства семени баранов. Сборник аспирантских работ, ВНИИОК, Вып. 1,1968 г.

6. Мануйлов И.М. Осеменение овец уменьшенными дозами спермы. Тезисы докладов на научно-производственной конференции ВНИИОК, 1968 г.

7. Мануйлов И.М. Динамика продвижения сперматозоидов в яйцеводы овец. Сборник аспирантских работ. ВНИИОК, 1968 г.

8. Лопырин А.И., Мануйлов И.М. Действие различных разбавителя на биологические свойства спермы баранов. Доклады советских ученых к 4 Международному конгрессу по размножению и искусственному осеменению. М., 1968 г.

9. Мануйлов И.М., Рак Л .П. Какой разбавитель лучше? Сельские зори, №8,1968

10. Мануйлов И.М. Больше приплода от ценных производителей. Овцеводство, №9, 1969 г.

И. Логинова Н.В., Желтобрюх H.A., Мануйлов И.М. Методы наложения фистулы на семяпровод барана, Труды ВНИИОК, вып. 29, т.1,1969 г.

12. Желтобрюх H.A., Мануйлов И.М., Тутов И.К. Микробиологические исследования гениталий овец с синхронизированной охотой. Животноводство, № 9, 1970 г.

13. Мануйлов И.М., Желтобрюх H.A., Тутов И.К. Микрофлора родополовых путей овец при синхронизации охоты. Тр. ВНИИОК, вып. 30,1970 г.

14. Желтобрюх H.A., Мануйлов И.М., Тутов И.К. Динамика микрофлоры родовых путей при синхронизации охоты. Тр. ССХИ, 1970 г.

15. Мануйлов И.М. Эпектронно-микроскопические исследования сохраняемого семени барана. Тр. ССХИ, 1971 г.

16. Мануйлов И.М., Рак Л.П. Влияние разбавителей на биологические свойства семени барана, сохраняемого при 0-2°С. Тр. ВНИИОК, 1972 г.

17. Мануйлов И.М. Изучение вероятных источников микозов и микотокси-козов. СГПИ. Природные ресурсы Северного Кавказа. 1973 г.

18. Мануйлов И.М. Сравнительная характеристика люминесцентного и глазомерного методов определения качества семени, сохраняемого в различных разбавителях. Тр. ВНИИОК, 1974 г.

19. Ретроспективная оценка результатов осеменения овец уменьшенньми дозами семени. Овцеводство, № 8, 1975 г.

20. МануйловИ.М. Вопросы щпогенешки размножения овец. Тр. ВНИИОК, 1976

21. Мануйлов И.М. Эмбриональная смертность овец микозного происхождения. СГПИ. Природные ресурсы Северного Кавказа, 1978 г.

22. Мануйлов И.М. Качественная оценка семени методом лиминесценции. СГПИ, 1980 г.

23. Мануйлов И.М. Методика проведения опытнической работы в овцеводстве. Тр. СГПИ, 1980 г.

24. Мануйлов И.М., Виноградский С.А. Изучение бактериального содержимого спермы при акропоститах. Овцеводство, № 10, 1980 г.

25. Мануйлов И.М., Виноградский С.А. Изменение бактериальной микрофлоры в процессе хранения спермы барана. Овцеводство, № 9,1982 г.

26. Мануйлов И.М. Динамика количественного и качественного состава спермы при глубоком замораживании. Тр. ВНИИОК, 1983 г.

27. Мануйлов И.М. Ороли секретов добавочных половых желез. Тр. СГПИ, 1984г.

28. Мануйлов И.М. Влияние микроорганизмов и бактериостатических веществ на переживаемость и оплодотворяющую способность семени барана при разных способах хранения спермы. Овцеводство, №8,1985 г.

29. Мануйлов И.М., Немирова Л.С. К вопросу натуралистической и опытнической подготовки учащихся к работе в овцеводстве. «Школа и педагогика», АПН СССР, 1988 г.

30. Мануйлов И.М. Изучение влияния различных разбавителей на оплодотворяющую способность семени баранов и выживаемость зигот. Сб. «Генетики и селекционеры Ставрополья - производству», Ставрополь, 1990 г.

31. Мануйлов И.М. Влияние абиотических и биотических факторов на биологические свойства половых клеток. Тр. СГПИ, 1995 г.

32. Мануйлов И.М. Причины яловости овец и меры ее профилактики. СГУ. Проблемы развития биологии на Севером Кавказе, 1997 г.

33. Мануйлов И.М. роль неспецифической микрофлоры в экологии растений и животных. Вестник Ставропольского государственного университета. Естественные науки, № 12, 1997 г.

34. Мануйлов И.М. Динамика численности и качественного состава микрофлоры семени барана в процессе хранения. Тр. ВНИИОК, 1997 г.

35. Мануйлов И.М. К этиологии эмбриональной смертности и яловости овец. Тр. ВНИИОК, 1997 г.

36. Мануйлов И.М. Некоторые аномалии развития гениталий у овец. СГУ. Проблемы развития биологии на Северном Кавказе, 1998 г.

37. Мануйлов И.М. Микозный фактор в этиологии эмбриональной смертности у овец. СГУ. Проблемы развития биологии на Северном Кавказе, 1998 г.

38. Мануйлов И.М. К изучению роли абиотических факторов в биотехнологии размножения овец. СГУ. Проблемы развития биологии на Северном Кавказе, 1998 г.

Изд. лиц. № 020061 от 9.10.96 Подписано в печать 16.1.98 Формат 60х84У16 Усл. печ.л. 2,55 Уч.-изд.л. 2,01

Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ 164

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1