Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Подкожный овод крупного рогатого скота в Западном регионе Российской Федерации

На правах рукописи

Маврин Николай Анатольевич

ПОДКОЖНЫЙ ОВОД КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ЗАПАДНОМ РЕГИОНЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (БИОЛОГИЯ, МЕРЫ БОРЬБЫ)

16 00 06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза 03 00 19 - паразитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

аоз164215

Москва - 2008 г

003164215

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор

Непоклонов Анатолий Александрович (ВНИИВСГЭ)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Кононенко Галина Пантелеевна

(ВНИИВСГЭ)

доктор ветеринарных наук, профессор

Косминков Николай Евгеньевич (МГУПБ)

Ведущая организация. Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина

Защита состоится «12» марта 2008 г в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук Д 006 008 01 во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии по адресу 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН

Автореферат разослан «& » февраля 2008 г Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Е.С Майстренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Гиподерматоз - паразитарное заболевание крупного рогатого скота, вызываемое личинками подкожного овода отряда Díptera Hypoderma hneatum (HL) и Hypoderma bovis (HB) Это заболевание зарегистрировано более чем в 55 странах мира (ФАО, 1984) и представляет большую проблему для стран Европы, Средней Азии и Китая Известны случаи вспышек гиподерматоза в Австралии и Южной Африке, связанные с импортом пораженного оводом крупного рогатого скота (Tarry D W , 1991).

В Российской Федерации после 1991 года, в связи с началом перестроечных процессов в сельском хозяйстве, прекратилось целевое государственное финансирование борьбы с гиподерматозом В два раза сократилсч объем противооводовых мероприятий, вследствие чего заболеваемость среди контролируемого поголовья (около 53%) возросла в 1014 раз (до 2,8 - 4,5%), а среди 47% поголовья, не подвергаемого противооводовым обработкам, достигает 30 - 70% (Непоклонов А А , 2002)

Ущерб, причиняемый личинками подкожного овода, складывается из потерь молока и мяса, порчи кожевенного сырья Ежегодные потери молока составляют 80 - 200 л от каждой больной гиподерматозом коровы, мяса - от 13 до 18 кг, кожевенного сырья - 8% площади заготовленных шкур По экспертным оценкам общие потери о г гиподерматоза в России оцениваются в сумме око то 6,5 млрд рублей в год (Андрунакиевич А Г , Непоклонов А А , Цуканова Г В, 2004) Вызываемая гиподерматозом иммунодепрессия животных способствует развитию бактериальных, вирусных и паразитарных болезней, ущерб от которых чрезвычайно трудно подсчитать (Tarry D W, 1991) Для населения гиподерматоз опасен тем, что при употреблении молока и мяса животных, пораженных личинками овода, в организм человека может попадать вырабатываемое личинками высокотоксичное вещество гиподермотоксин, способное оказывать неблагоприятное влияние на здоровье людей (Непоклонов А А , 2002)

В СССР, современной России и за рубежом проведена большая работа по изучению ги по дерматоза крупного рогатого скота Удалось выяснить основные особенности биологии подкожных оводов, предложить новые средства и методы борьбы с этими паразитами

Несмотря на это. многие вопросы биологии и экологии возбудителя, выбора средств лечения и профилактики болезни в приграничных областях Российской Федерации, в частности, в Западном регионе (Брянская и Смоленская области) остаются недостаточно изученными Существует большая вероятность заражения и перезаражения крупного рогатого скота в приграничных районах подкожным оводом от неблагополучных по гиподерматозу соседних стран Поэтому, выяснение особенностей биологии, экологии, распространения, а также выбор эффективных средств борьбы с паразитом в приграничных регионах поможет правильно осуществлять противооводовые мероприятия на данной территории, способствуя снижению заболеваемости животных и получению экологически чистых продуктов животного происхождения.

В последние годы предложены различные способы диашостики подкожнооводовой инвазии крупного рогатого скота реакции непрямой гемагглютинации, внугрикожной пробы, кольцепреципитации, латекс-агглютинации и двойной диффузии в агаровом геле (Белецкая НИ, 1999, Степанова Е А, Якубовский М В , 2004) Однако, эти методы не обладают достаточно высокой чувствительностью и специфичностью. Кроме того, они не всегда пригодны для рутинных исследований Поэтому, за рубежом широкое распространение получил иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения личинок I стадии Hhneatum и Н bovis в организме животного (Sinclair, I, Wassail DA, 1983, Boulard С, 1985 и др) Существует коммерческий набор «Elisa hypodermosis serum screening» (институт «Pourquier», Франция) на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для выявления антигел к возбудителю гиподерматоза в сыворотках крови крупного рогатого скота. Создание высокоэффективной отечественной

тест-сисгемы поможет решить проблему ранней диагностики гиподерматоза в Российской Федерации

Цель и задачи исследования. Изучение распространения, биологии и экологии подкожных оводов в Западном регионе (Брянская и Смоленская области) Российской Федерации, разработка и апробация средств лечения, диагност ики и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи

1 Изучить видовой состав и особенности распространения подкожных оводов крупного рогатого скота

2 Изучить сроки лета оводов, динамику подхода личинок под кожу животных, выпадение личинок па окукливание

3 Провести сравнительною оценку эффективности средств лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота

4 Разработать технологию получения и очистки антигенов возбудителя гиподерматоза крупного рот атого скота

5 Изучить возможность применения этих антигенов в иммуноферментном анализе для выявления анттел к Н bovis и Н hneatum

6 Разработать диагностическую тест-систему на основе непрямого иммуноферментного анализа для выявления антител к возбудителю гиподерматоза крупного poiатого скота

Научная иовизиа работы. Изучены особенности распространения, биологии и экологии подкожных оводов в Западном регионе России видовой состав, сроки начала и окончания лета имаго, динамика паразитирования личинок в организме крупного рогатого скота, выпадение личинок на окукливание Проведен сравнительный анализ эффективности средств лечения и профилактики заболевания на данной территории

На основе очищенных антигенов из личинки I стадии ff hneatum разработан отечественный метод ранней диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота на основе непрямого твердофазного

иммуноферментного анализа В сравнительных исследованиях показана высокая чувствительность и специфичность разработанного метода и установлена положительная корреляция результатов с коммерческим набором «Elisa hypodermosis serum screening» (институт «Pouiquier», Франция)

Практическая значимость исследований. Результаты изучения особенностей распространения, биологии и экологии подкожных оводов в Западном регионе России, выбора эффективных средств борьбы с паразитом позволят правильно организовать противооводовые мероприятия на данной территории, способствуя, тем самым, получению экологически чистых продуктов животного происхождения

Разработанная тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа может быть использована в исследовательских учреждениях и лабораториях для ранней диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота

Основные положения, выносимые на защиту Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения

- результаты изучения распространения, биологии и экологии подкожного овода в Западном регионе России.

- результаты сравнительной оценки эффективности средств лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота,

- результаты разработки и оценки иммуноферментной тест-системы для выявления антител к возбудителю гиподерматоза крупного рогатого скота

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИВСГЭ (2006, 2007 гг) и межлабораторном совещании сотрудников ВНИИВСГЭ (2007 г )

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три научные работы

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 стр машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и меюдов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы и приложения Материалы диссертации иллюстрированы 17 таблицами и 22 рисунками Список литературы включает 148 источников отечественных и зарубежных авторов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа выполнена в 2004 - 2007 гг в группе по изучению инсектицидов^ микробиологического синтеза лаборатории санитарной микробиологии ГНУ ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН (г Москва), а также в хозяйствах Брянской и Смоленской областей

Анализ распространения подкожных оводов крупного рогатого скота в Западном регионе осуществлен на базе данных отчетности государственных ветеринарных учреждений области и районов за 2004 -2007 гг, а также ежегодных научных отчетов группы по изучению инсектицидов микробиологического синтеза лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГЭ Распространение гиподерматоза и определение степени поражег ности животных личинками подкожных оводов проводили путем обследования крупного рогатого скота в хозяйствах Брянской и Смоленской областей в период клинического проявления инвазии (апрель - май)

Видовой состав подкожных оводов и соотношение численности видов устанавливали путем сбора и определения вида личинок третьей стадии, извлеченных из свищевых капс>л у животных Видовая принадлежность личинок оводов определялась по методике Грунина К Я (1962) Было собрано и определено до вида 363 личинки III стадии

Изучение динамики образования личинками свищевых капсул под кожей у крупного рогатого скота и экстенсивность поражения животных личинками проводили на 185 коровах и 34 телятах из хозяйств Брянской

области, и на 161 коровах и 51 телятах 1-2 летнего возраста из хозяйств Смоленской области Появление свищевых капсул определяли путем осмотра и пальпации спины, поясницы, крестца, корня хвоста, холки, шеи, затылка и боковых частей груди и живота животных

Изучение сроков выпадения личинок на окукливание проводили в СГЖ «Нива» Красногорского района Брянской области и в СПК «Дорогобужский» Дорогобужского района Смоленской области Применяли ловушки, которые представляли собой марлю, склеенную в виде колпачка Ловушки прикрепляли к животным с помощью клея и проверяли на наличие выпавших личинок ежедневно утром и вечером После определения видовой принадлежности личинки высаживали в садки, которые были размещены под открытым небом Для сбора имаго ячейки садков накрывали марлевыми колпачками, натянутыми на проволочные каркасы

Сроки лета оводов определяли по времени вылета мух из куколок в садках, по появлению в стадах животных «зыка», а также по пораженности личинками оводов новорожденных телят, которых в разные сроки (июль -сентябрь) начинали выпасать на пастбищах

Испытания противогиподерматозных прспараюв (гиподектин инъекционным, гиподектин накожный, новомек, аверцид инъекционный и аверцид накожный, абамек инъекционный и абамек накожный) проводили в хозяйствах Брянской и Смоленской областей. Эффективность препаратов и методов их применения изучали как при ранней химиотерапии гиподерматоза, так и в период клинического проявления болезни Учет результатов применения препаратов осуществляли по методике Непоклонова А А и Таланова Г А (1966)

Антигены получали из личинок I и III стадий Н hneatum, выделенных из слизистой обо почки пищеводов пораженных животных, а также с тущ пораженных животных, поступивших на мясокомбинат Для получения лизата, личинки I и III стадий промывали фосфатно-солевым буферным раствором (pH 7,2 - 7,4) и гомогенизировали в пробирке Грифитса с 0,1 М

карбона гно-бикарбонатным буфером, рН 9,6 У личинок III стадии подкожного овода предварительно удаляли хитиновую оболочку Гомогенат обрабатывали ультразвуком и центрифугировали при 10000 g и +4°С Полученный надосадок использовали как антиген

Специфичные иммуноглобулины класса G (IgG) получали путем осаждения положительных на гиподерматоз сывороток крови (по клиническим признакам) равным объемом 20% раствора полиэгиленгликоля (М=6000 Да) и последующей ионно-обменной хроматографией надосадка на диэтиламиноэтил сефарозе 4В (DEAE-сефароза) (Pharmacia Fine Chemicals АВ, Швеция) Фракцию IgG элюировали 0,01 М раствором Трис-НС1 + 0,15 М NaCl, рН 8,6

Аффинно-очищенный антиген из чизата личички I и / или III стадий Н Imeatum получали с помощью иммуносорбента на основе агарозы, активированной бромцианом (BrCN-агароза) BrCN-агарозный иммунособент, содержащий фракцию IgG из пула положительных на гиподерматоз сывороток крови крупного рогатого скота, изготовляли по методике фирмы-производителя (Pharmacia, Швеция) Осветленный лизат личинки I и / или III стадии, диализовали против 0,1 М раствора Трис-НС1 + 0,15 М NaCl (рН 8,0) и инкубировали с уравновешенным тем же раствором иммунос орбентом при +4°С в течение 2 часов при перемешивании Целевой продукт элюировали содержащим глицин буферным раствором (0,1 М глицин 0,1 М NaCl, рН 2,5) и нейтрализовали полученный продукт 8 М раствором NaOH до рН 7,0

Антигены, очищенные ионообменной хроматографией из лизата чичинки 1 стадии Н Imeatum почучали по модифицированному методу Lecroisey А & Boulard С, Keil В (1979) Осветленный лизат личинки I стадии диализовали против 0,1 М раствора Трис-HCl (рН 7,5) и наносили на уравновешенную тем же буфером DEAE-сефарозу 4В Применяли ступенчатую хроматографию, последовательно злюируя фракции 0,1 М

буферным раствором Трис-HCl (рН 7,5), содержащим 0,20 М, 0,25 М, 0,3 M и 0,4 M NaCl

Иммунохимическую активность полученных продуктов определяли в условиях непрямого иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга с положительными и отрицательными сыворотками крови крупного рогатого скота

Непрямой иммунофермснтный анализ (ИФА) выполняли по общепринятой методике Объем вносимых в лунки планшета реагентов составил ] 00 мкл Антигены сорбировали на поверхность ячеек планшетов в 0,1 M КББ (карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,5) и инкубировали в течение 18 ч при +4°С Исследуемые пробы сыворотки крови крупного рогатого скога вносили в лунки планшета в разведении 1 20 Применяли меченые пероксидазой антитела к иммуноглобулину G (H+L) быка (филиал ГУ НИИЭМ им H Ф Гамалеи «Медгамал», Россия) и субстратный раствор перекиси водорода с 3,3',5,5'-тетраметилбензидином Для учета реакции использовали спектрофотометр, снабженный фильтром на длину волны 450 нм (Labsystems Multiscan Plus, Великобритания) Наличие антител к возбудителю гиподерматоза в исследуемой сыворотке крови крупного рогатого скота определяли по величине коэффициента связывания конъюгата (Ксв) сывороточными антителами, которую вычисляли по формуле

JJ- _ ( - AtwK - up) X20Q где - (А450 ИСф), (A,i50 К*ср) и (А«0 К,р) - среднее

(AwK * ср. — Л440К - tp )

(из двух повторов) арифметическое значение оптической плотности (Адзо) Для каждой исследуемой сыворотки (ИС), проб К* и проб К

Иммуноблоттинг использовали для определения специфичности получаемых антигенов Белки после электрофоретического разделения переносили на нитроцеллюлозную мембрану «Immobilon-NC» (Milhpore, США) в «полусухой» буферной системе (J Kyhse-Andersen, 1984) на приборе «Multiphor И» (LKB, Швеция) при постоянной силе тока 200 мА в течение 1 часа при комнатной температуре Иммунохимическое окрашивание

полученных реплик осуществляли с помощью непрямого варианта иммуноферментного анализа с соблюдением всех его стадий

Гомогенность полученных препараюв проверяли методом ДСН-ПААГ электрофореза в буферной системе Laemmli U К (1970)

Концентрацию белка в растворах определяли с использованием коммерческого набора "Micro ВСА Protem Assay Kit" фирмы "Pierce" (США) В качестве испытуемых проб использовали сыворотки крови крупного рогатого скота, полученные из хозяйств Московской, Смоленской и Брянской областей Сыворотку крови получали общепринятым способом и хранили при -20°С Всего было получено и исследовано 300 проб сывороток

При проведении сравнительных исследований по оценке эффективности разработанной тест-системы и подтверждении специфичности выделенного IgG использовали коммерческий ИФА-набор «Elisa hypodermosis sérum screening» института Pourquier (Франция), предназначенный для выявления антител к возбудителю гиподермаюза Постановку реакции, учет и интерпретацию полученных результатов проводили согласно инструкции по применению, рекомендованной фирмой-производителем

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программы Microsoft Excel для Windows Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала Вероятность различии считалась существенной при Р < 0,05 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. - Видовой состав подкожных оводов

Опыты, проведенные по изучению видового состава подкожных оводов, показали, что на территории Западного региона России распространены два вида подкожных оводов крупного рогатого скота — H bovis (строка) и H lineatum (пищеводник) В животноводческих хозяйствах Брянской и Смопенской областей строка является доминирующим видом —

81,05% и 79,1% Пищеводник в Западном регионе России распространен меньше - 18,95% (Брянская область) и 20,9% (Смоленская область)

2. Распространение подкожных оводов в Западном регионе Российской Федерации

Результаты ветеринарной отчетности о пораженности крупного рогатого скота личинками подкожного овода по районам в Брянской области за 2004 - 2006 гг свидетельствуют, что больные гиподерматозом животные регистрируются практически во всех районах области

Средняя экстенсивЕюсть поражения крупного рогатого скота подкожным оводом по районам (2004 - 2006 гг), граничащим с Украиной и Курской областью, составляет 1,7%, с Белоруссией — 1,6%, с Орловской областью - 1,3%, с Калужской и Смоленской областями, соответственно, -0,4% и 1,3% В то же время, средняя экстенсивность поражения животных гиподерматозом в центральных районах области составляет 0,9%

С республикой Беларусь граничит Красногорский район Брянской области Нами установлено, что процент пораженности крупного рогатого скота гиподерматозом в этом районе составил 4,0 % (5488 голов), а уровень инвазии среди животных, принадлежащих индивидуальным владельцам, значительно превосходит средний по району и составляет 20% (обследовано 131 животное) Причем, в некоторых хозяйствах процент пораженное™ скота гиподерматозом составлял 5,4 - 9,4% (СПК «Северный», «Труд», «Палужский», «Рубеж»), интенсивность инвазии 1 - 7 личинок на животное

Причиной распространения гиподерматоза в Красногорском районе является неполный охват осенними противооводовыми обработками всего поголовья скота, особенно животных частного сектора В благополучные по гиподерматозу хозяйства подкожные овоца заносились в личиночной стадии скотом, приобретенным у местного населения в этом же районе

Кроме этого, возможен занос овода с территории соседней республики В частном фермерском хозяйстве «Вернигор» из 30 закупленных в Белоруссии бычков 25 животных были больны гиподерматозом

Севский район Брянской области граничит с республикой Украина По данным районной ветеринарной отчетности, больных гиподерматозом животных в 2005 году не отмечено Однако, при обследовании 1099 животных из хозяйств данного района 82 были поражены личинками подкожного овода (7,5%) Гак в хозяйстве СПК «Тимирязевскии» все 50 ю ¡юв (48 коров и 2 быка) были поражены оводом с интенсивностью инвазии 1 - 9 личинок на животное В СПК «Подывотье» уровень инвазии составил 7,2% с интенсивностью инвазии 1-10 личинки, в СПК «Юрасовский» уровень инвазии - 4,9%, а интенсивность инвазии - 1-6 личинки на одно живошое Осмотр скота (57 голов) частного сектора в селе «Хинель» также выявил больных животных с уровнем инвазии 15,7% и интенсивностью 1-2 личинки Установленные нами неблагополучные хозяйства близко расположены к границе с Украиной

В центральных районах Брянской области (Выгонический и Дятькоьский районы) обследования крупною рогатого скота на пораженность подкожным оводом показали отсутствие больных животных или болге низкий уровень инвазии

Исследования, проводимые нами в течение 3-х лет в хозяйствах Смоленской области, показали, что в 105 хозяйствах из 25 районов области из обследованных 22104 животных выявлено пораженных подкожным оводом в 2005 году - 166 I олов (4,1 %), в 2006 I оду - 99 голов (1,0%) и в 2007 году - 48 голов, (0,6%) Гиподерматоз не регистрируется в четырех районах области (Хиславичский, Смоленский, Кардымовский, Руднянскии) Пораженность на уровне 1% и выше выявлена в хозяйствах Сычевского и Новодуг инского районов Гакой низкий уровень инвазии объясняется тем, что в области разработана и успешно реализуется программа оздоровления крупного рогатого скота от гиподерматоза

3 Изучение динамики образования свищевых капсул и сроков выпадения личинок на окукливание

Изучение динамики образования свищевых капсул показало, что среди молодняка больные гиподерматозом животные выявляются в конце января, а у коров - с первой декады февраля Образование свищевых капсул у животных продолжается у молодняка 5 месяцев - с III декады января до конца мая, а у коров - с I декады февраля до конца июня (тоже 5 месяцев)

В хозяйствах Брянской и Смоленской областей массовое образование свищевых капсул у животных наблюдали со второй декады апреля до начала июня В дальнейшем, за счет частичной гибели личинок и выпадения их на окукливание, число желваков снижалось Общий период клинического проявления подкожнооводовой инвазии крупного рогатого скота длится с конца января по июль

Выпадение личинок Hhneatum на окукливание происходит на 8 - 12 дней раньше личинок Н bovis Период выпадения личинок обоих видов оводов в Западном регионе составляет у коров - 105 дней (с 25 апреля по 5 июля), у молодняка - 88 дней (с 25 апреля по 24 июня)

Массовый выход личинок во внешнюю среду у Н hneatum наблюдается в I половине мая, а Н bovis — с конца мая по июль месяц У молодняка личинки пищеводника выпадали со II декады апреля по май У отдельных животных личинки строки III стадии в небольшом количестве покидали тело хозяина в первых числах июля Общий период выпадения личинок продолжается в течение 42 дней, а массовое выпадение - с мая по июль

4. Сроки лета имаго оводов Начало массового лета оводовых мух в хозяйствах Западного региона России наблюдается с середины июня, а окончание лета - в конце сентября месяца

Выплод оводовых мух в садках в Западном регионе России продолжался пищеводника с 15 июня по 17 июля, а строки с 20 июня по 22

августа, что подтверждает данные о начале лета имаго овода, полученные нами при визуальном наблюдении.

5. Сравнительное изучение средств и методов борьбы с подкожными оводами в Западном регионе Российской Федерации

Эффективность гиподектина инъекционного при ранней химиотерапии гиподерматоза крупного рогатого скота изучали на 50 взрослых животных и на 40 головах молодняка 10-12 месячного возраста в СПК «Дубенецкий» Красногорского района Брянской области Препарат, примененный подкожно в дозе 3 мл на животное массой более 200 кг и 2 мл на животное массой до 200 кг, показал 100% эффективность Высокая эффективность гиподектина инъекционного была подтверждена и при клинической форме заболевания

Изучение эффективности гиподектина накожного на мигрирующих в организме животных личинок 1 стадии проводили в СПК «Большевик» на 50 коровах и на 30 головах молодняка 1 - 2 летнего возраста в СПК «Яловка» Красногорского района Брянской области методом поливания на спину по позвоночнику от холки до крестца в дозах животным до 150 кг - 10 мл, более 150 кг - 15 мл В контрольной группе животных весной обнаружили 8 пораженных теля г и 21 корову Появившихся весной в контрольной группе больных животных также обработали шподектином накожным Гиподектин накожный оказался очень эффективен против личинок I - III стадий подкожного овода, гибель которых составила 100%

11репарат новомек, примененный внутрикожно в дозе 0,4 мл на голову двумя инъекциями по 0,2 мл, показал 100% эффективность как при ранней химиотерапии гиподерматоза, так и при клиническои форме заболевания Опыт проводился в СПК «Родина» Красногорского района Брянской области на 56 коровах и 39 телятах 12 месячного возраста Контрольная группа состояла из 35 коров и 22 телят В опытных группах пораженных животных не наблюдалось, в контрольной группе 95% животных были больны гиподерматозом

Препаративные формы на основе авермектина и абамектина были испытаны в хозяйствах Смоленской области Препараты представляют собой 0,01% действующего вещества в растворителях

Высокая экстенсэффективность (ЭЭ - 100%) и интенсэффективность (ИЭ - 100%) препаратов аверцида инъекционного и абамека инъекционного (аналоги гиподектина инъекционного) была установлена в опытах на 106 животных в МУСП «Заря» Хиславичского района Смоленской области Препараты вводили коровам подкожно в дозе 3 мл на животное В контрольной группе было оставлено 75 коров, из которых весной было поражено 26 животных

Эффективность препаратов аверцида накожного и абамека накожного (аналоги гиподектина накожного) устанавливали при ранней химиотерапии гиподерматоза крупного рогатого скота У обработанных осенью животных (221 корова, ЗАО «Рассвет» Хиславичский район Смоленской области) препаратами аверцид и абамек методом однократного нанесения на волосяной покров крупного рогатого скота вдоль позвоночного столба в дозе 15 мл на животное весной не было обнаружено личинок III стадий подкожного овода Среди 100 животных в контрольной группе 20 оказались больны гиподерматозом Таким образом, препараты аверцид накожный и абамек накожный показали высокую эффективность (ЭЭ - 100%, ИЭ - 100%) при ранней химиотерапии гиподерматоза крупного рогатого скота

6. Выделение, очистка и характеристика антигенов, предназначенных для использования в иммуноферментном анализе для ранней диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота Лизат аичинки I стадии Н НпеаШт Лизат личинки 1-й стадии содержал три белка с молекулярной массой 23 кДа, 24 кДа и 31 кДа (рис 1)

Выход белка от исходной биомассы составил 2,5% Результаты иммуноферментного анализа и иммуноблотинга показали возможность использования лизата личинки I стадии в качестве антигена в

разрабатываемой иммуноферментной тест-системе для выявления антител к возбудителю гиподерматоза крупного рогатого скота.

31,0 к Ja

9-J/K:ia бб,: кЪ'

4 5,0 к Ja

1 5 /у "/л

j

s а

s

Рис. 1. SDS-мектрофорез антигенов H.lineatum в 12% полиакриламидном геле: 1 -маркеры молекулярной массы белков; 2 - гомогенат личинки Iii стадии; 3 аффинно-очищеютй АГ из личинки Hi стадии; 4 - аффинно-очищенный АГ из личинки ! стадии; 5 - гомогенат личинки I стадии; 6 - 8 очищенный ионообменной хроматографией антигены ;ш<шнкк I стадии (фракция, элюированная трис-буферным раствором pH 7,6 с 0,30 М NaCl (6); с 0,40 М NaCl (7); 0,25 М NaCl (S).

Лизат личинки III стадии H.lineatum. Осветленный лизат личинки III стадии содержал большое количество разнородных белков с молекулярной массой от 12 кДа до 60 кДа, и, практически, не содержал характерных для личинки I стадия компонентов (рис.1). Результаты иммуноферментного анализа и иммуноблотинга показали, что основные белки, содержащиеся в гомогенате личинки III стадии, не специфичны. Они взаимодействуют как с положительными, гак и с отрицательными сыворотками крови крупного рогатого скота. Из результатов исследований следует, что лизат личинки III стадии H.lineatum нельзя использовать в иммуноферментной тест-системе для выявления антител к возбудителю гиподерматоза крупного рогатого скота.

Аффинно-очищенный антиген из лизата личинки III стадии H.lineatum. Анализ очищенного белка элюированиого с сорбента 0,! М раствором глицина + 0,1 М NaCl, pH 2,5 показал, что антиген имеет молекулярную массу 24 кДа (рис.1). Анализ антигена в иммуноблотинге и в непрямом иммуноферментном анализе с разведенными в 500 раз IgG из пула

положительных на гиподерматоз сывороток крови крупного рогатого скота и отрицательной сывороткой показал, что этот аффинно-очищенный белок обладает антигенной специфичностью Для получения достоверных результатов иммуноферментного анализа необходимо его наносить на планшет в концентрации не менее 10 мкг/мл, что практически совпадает с результатами, полученными для аффинно-очищенного антигена из личинки I стадии Однако, несмотря на принципиальную возможность аффинной очистки антигена из личинки III стадии и применения его в иммуноферментном анализе, использование его для разработки иммуноферментной тест-системы на антитела к возбудителю гиподерматоза нецелесообразно из-за низкого содержания его в личинке (0,05% от исходной биомассы)

Аффинно-очищенный антиген га лизата личинки I стадии НкпеаШт Концентрация белка аффинно-очищенного антигена из лизата личинки I стадии Н кпеаПип составила 1,3 мг/мл (0,12% от исходной биомассы), что значительно превышает его концентрацию при аффинной очистке антигена из гомогената личинки III стадии Очищенный целевой продукт, проверенный в ДСН-ПААГ электрофорезе, содержал две полосы, соответствующие молекулярной массе белка 23 кДа и 24 кДа (рис 1) Специфичность очищенного антигеьа подтверждена методом иммуноблогинга и непрямого иммуноферментного анализа с положительной и отрицательной на гиподерматоз сыворотками крови крупного рогатого скота

Антигены, очищенные ионообменной хроматографией из лизата личинки I стадии Н кпеаШт Было получено три белковых фракций Антигенная активность и специфичность очищенных ионообменной хроматографией белков подтверждена методом непрямого иммуноферментного анализа с положительной и отрицательной сыворотками крупного рогатого скота (рис 2) и иммуноблоттингом с ^О из пула положительных сывороток

0jS • од -

02 ■ О •

юывфстга

10 3,3 1.1 О А 0.12 0 /34 Антиген, мкг/мл

|,е

1.41.5

1 ™ о.е

0.4

\

-«—{♦'сьворсига

м ю з.з м о Л 0.1 Антиген, мкгЛиш

1 А

1 г

§ ** =: 0.6

■ • »СЫВфОТИ ■ -1 СИЕ::.[';Г ki

10 33 1,1 0,4 0.12 0,0а Антиген, мкг/мл

Рис. 2. Взаимодействие положительной и отрицательной на гилодерматоз сывороток крови крупного рогатого скота с фракциями антигена, полученными при его очистке ионообменной хроматографии. А - фракция, элгаированная грис-буфером с 0,25 М NaCl;, В - фракция, элюированная трис-буфером с 0,30 М NaCl; С - фракция, этоированная трис-буфером с 0,40 М NaCl;

С IgG реагируют фракции всех трех белковых пиков, но наибольшей активностью обладают фракции, элюированные трис-буферньш раствором, содержащим 0,3 М NaCl. Анализ очищенных ионообменной хроматографией фракций проводили методом ДСН-Г1ААГ электрофореза (рис.1). Молекулярная масса очищенных белков составила 23 кДа, 24 кДа и 31 ¡сДа, что соответствует массе гиподермина В, С и A (Webster К.А., Giles ML, Dawson С., 1996).

7. Разработка непрямого твердофазного иммуноферментного анализа для выявления антител к возбудителю гиподерматоза крупного

рогатого скот а

Получение и характеристика положительного и отрицательного контропей. Для получения положительного и отрицательного коитролей были проведены исследования сывороток крови (п=92), полученных от клинически здоровых и больных животных, направленные на определение

специфических антител к возбудителю гиподерматоза (Н hneatum и Н bovis) с помощью ИФА-набора «Elisa hypodermosis serum screening» института Pourquier (Франция) Таким образом, были получены контрольные образцы, представляющие собой сыворотки крови, содержащие и не содержащие специфические антитела, соответственно

Условия сенсибилизации лунок антигеном v оптимального разведения антивидового конъюгата При отработке условий постановки иммуноферментиого анализа для фиксации антигена рабочие разведения контролем и антивидового коньюгата определяли в предварительных экспериментах методом «шахматного» титрования, делая последовательные разведения компонентов rio горизонтальным и вертикальным рядам одной микропанели (табл 1) В качестве ферментного коньюгата использовали антитела диагностические против IgG (H+L) быка, меченые пероксидаюй хрена (филиал ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи «Медгамал», Россия) Для фиксации антигена на поверхность ячеек полистироловой микропанели использовали 0,1 М карбонатно-бикарбонатный буфер при 18 часовой инкубации при +4°С Оптимальной концентрацией антигена и рабочими разведениями компонентов гест-системы счшали их конечные значения, обеспечивающие в лунках с положительным контролем оптическую плотност ь (ОГ1) 450 > 1,0, а в лунках с отрицательным - < 0,2

Исходя из представленных в таблице 1 результатов выбрана концентрация антигена - 10 мкг'мл, рабочее разведение сывороток - 1/20, а антивидового конъюгата - 1/2000

Оптимальным буфером для промывки лунок является фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,1% Tween 20 Для разведения проб сывороток использовали фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,1% поливинилпирролидона, а для разведения антивидового коньюгата -фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,5 % бычьего сывороточного альбумина В буферы для разведения проб сыворотки и коньюгата добавляли и 5% сыворотки крови лошади

Таблица 1

Результаты титрования антигена и антивидового коныогата в ____разрабатываемом методе___

Разведение чконыогата Концен\ антигена (мкг/мл) \ 1 500 1 1000 1 1500 1 2000 1 4000

ОГ1450 положительной / отрицательной пробы*

40 2,84/0,41 2,53/0,35 2,43/0,27 1,77/0,20 0,94/0,15

20 2,34/0,33 2,31/0,33 2,23/0,25 1,50/0,18 0,78/0,15

10 2,21/0,34 2,1/0,22 2,16/0,23 1,16/0,15 0,630/0,11

5 1,99/0,3 1,91/0,23 1,66/0,21 1,01/0,15 0,68/0,12

2,5 1,86/0,3 1,76/0,21 1,60/0,19 0,98/0,11 0,66/0,11

1,25 1,76/0,26 1,62/0,2 1,56/0,19 0,75/0,13 0 54/0,11

Примечание - положительные и отрицатетьные сыворотки крови крупного рогатого скота использованы в разведении 1 20

При соблюдении этих условий и использовании специфических реагентов в следующих концентрациях (разведениях) антигена - 10 мкг/мл, контролей — 1 20 н конъюгата — 1 2000 при 60 минутной инкубации на каждом эгапе, неспецифическое взаимодействие компонентов исключалось, а показатели ОП 450 в лунках с положительными и отрицательными пробами были > 1,1 и < 0,2 соответственно

Оптимизация условий проведения шшуноферментпого анапиза при исследовании проб в одном разведении Были проведены исследования по определению закономерностей распределения значений ОП 450 и коэффициента связывания (Ксв) отрицательных и положительных (содержащих антитела к возбудителю гиподерматоза) сывороток, т е значения позитивно-негативного порога (ПНП), разграничивающего положительную и отрицательную реакции Проведенные исследования показали, что для получения достоверных результатов в разработанной тест-системе испытуемые пробы сывороток крови крупного ро!атого скота необходимо исследовать в разведении аналогичном контролям, те 1 20

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что при значении ОП 450 положительного и отрицательного контролен 1,0 - 1,3 и 0,10 - 0,15, соответственно, величина ОП 450 всех заведомо отрицательных проб была в пределах 0,13 - 0,40, при этом значения Ксв составляли от 0 до 25%.

О Отрицательные сыворотки ш Положительные сыворотки ' ;

I

е во

о

о- /0 О

ш 60

<? 50

§ 40

§ 30

| 20

§ 10 * о

| О 5 10 15 20 25 30- 40- 50- 60- 70- 80- >85

1 35 45 55 65 75 85

Коэффициент связывания

Рис. 3. Распределение количества отрицательных и положительных сывороток в зависимости от Ксо

Для заведомо положительных сывороток крови значение ОП 450 превышало 0,40, а значения Ксв - от 25% до 163%.

Таким образом, как следует из представленных на рисунке 3 результатов, пороговое значение Кс„ - 25%, т.е. в диапазоне значений Ксв меньшем 25% проверяемые сыворотки сероиегативны, выше 25% -серопозитивны. Исходя из этого, величина ПНП для Ксв, являющаяся критерием дифференциации положительных и отрицательных проб и при котором минимально количество ложноположительиых и ложноотрицательных результатов, составляет 25%.

Оценка диагностических параметров разработанной

иммуноферментной тест-системы. Основными параметрами всех диагностических тест-систем является их чувствительность и специфичность. С целью оценки чувствительности и специфичности разработанной тест-системы результаты иммуноферментного анализа сопоставляли с таковыми,

полученными при использовании зарубежного коммерческого набора. Были исследованы сыворотки крови крупного рогатого скота (300 проб), предварительно охарактеризованные на наличие антител к возбудителю гиподерматола ИФА-набором «Elisa hypodermosis serum screening» (Франция). Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Сравнительная оценка результатов разрабо танной тест системы и

зарубежного ИФА-н_або]эа______

Результат тест-системы института Pourquier (Франция), количество проб: положительных отрицательных

_______________________________(п=97)____ (п=203)__

Результаты в положительных 94

разработанной _______________

тест-системе, отрицательных 3 _количество проб:__________

Анализ полученных данных показал положительную корреляцию результатов по определению сывороточных антител к возбудителю гиподерматоза, полученных с помощью разработанного иммуноферментного анализа, и коммерческого набора института Роищшег (г=0,93; Р<0,05) (рис.4), сходимость результатов составила 97,7%.

4

199

Рис. 4. Корреляция результатов анализа сывороток крови крупного рогатого скота набором «Elisa hypodermosis serum screening» и разработанной тест-системой (г-0,93; Р<0,05).

Диагностическая чувствительность разработанной нами иммуноферментной тест-системы по отношению к коммерческому ИФА-набору составила 96,9%, специфичность - 98,8%

Таким образом, разработанная тест-система может быть использована для широких производственных испытаний

Выводы

1 Установлены биологические особенности подкожного овода крупного рогатого скота связанные с его экологией в Западном регионе Российской Федерации

- в Западном регионе России обитают два вида подкожных оводов крупного рогатого скота — Нуройегта Ьоун Ое О ее г (строка) и Нурос1егта 1теаЫт Ое Кг// (пищеводник),

- период клинического проявления гиподерматоза крупного рогатого скота в Западном регионе России составляет 5 месяцев - с первой декады февраля по июль,

- лет оводов продолжается с середины июня до начала октября Личинки III стадии выпадают на окукливание у пищеводника с 25 апреля по 14 июня, у строки с 2 мая по 5 июля Период выпадения личинок обоих видов оводов составляет у коров 105 дней, у молодняка — 88 дней,

- одной из причин распространения гиподерматоза в Западном регионе России является ее приграничное расположение и неполный охват поголовья животных осенними профилактическими обработками

2 Препараты накожного применения шподектин накожный (на основе ивермектина), аверцид накожный (на основе авермектина) и абамек накожный (на основе абамектина) обладают высокой эффективностью (ЭЭ -100%, ИЭ - 100%) при применении методом поливания на спину в дозе 15 мл на животное для ранней химиотерапии гиподерматоза и при клинической форме заболевания

3 Инъекционные препараты гиподектин инъекционный (на основе ивермектина), аверцид инъекционный (на основе авермектина) и абамек

инъекционный (на основе абамектина) обладают высокой эффективностью (ЭЭ - 100%, ИЭ - 100%) при введении подкожно в дозе 3 мл на животное массой более 200 кг и 2 мл на животное массой менее 200 кг с целью ранней химиоп ерапии и при клинической форме гиподерматоза

4 Подтверждена высокая эффективность внутрикожного применения препарата новомек в дозе 0,4 мл (0,2 х 2 мл) с целью профилактики и терапии гиподерматоза

5 Получены и изучены иммуноспецифичные антигены из личинок 1 и III стаций Hlineatam Установлено, что в личинках I стадии содержание активного антигена к антителам возбудителя гиподерматоза составляет 0,14 -2,5% от биомассы, в личинках III стадии этот антиген отсутствует или его содер» ание существенно ниже (0,05% от биомассы)

6 Разработана иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю гиподерматоза (Н hneatum и Н bovis) в сыворотках крови крупного рогатого скота Установлена оптимальная иммобилизирующая конци трация антигена — 10 мкг/мл Определен критерий дифференциации положительных и отрица1ельных результатов иммуноферментного анализа (Ксв) равный 25%

7 Диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к референтному ИФА-набору «Elisa hypodermosis serum screening» (Inst Pourquier, Франция) составляет 96,9%, специфичность -98,1%, сходимость результатов — 97,7%

Практические предложения

Разработанная тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа может быть использована в исследовательских учреждениях и лабораториях для ранней диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота

Разработаны и утверждены методические рекомендации по ранней диагностике гиподерматоза на основе непрямого иммуноферментного

анализа (ИФА) (Утв Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 24 января 2008 г)

Препаративные формы на основе авермектина и абамектина в виде 0,01% раствора могут быть использованы для ранней химиотерапии и лечения гиподерматоза крупного рогатого скота

Список опубликованных работ

1 Маврин, Н А Антигены из личинок Hypoderma Imeatum и возможность их использования в иммуноферментном анализе для выявления специфических антител в сыворотке крови крупного рогатою скота, больного гиподерматозом /НА Маврин, А А Непоклонов, В С Богданова // Ветеринария - 2007 г - № 9 - С 11-14

2 Маврин, Н А Иммуноферментный анализ для ранней диагностики гиподерматоза крупного рогатого скога /НА Маврин, А А Непоклонов, В С Богданова, О А Верховский // Ветеринария - 2007 г - № 11 -С 9-11

3 Mavnn, N A Purification of Hypoderma imeatum antigens and opportunity of their application for diagnostic of cattle hypodermosis / NA Mavnn, A A Nepoklonov // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of NI Vavilov 20 - 22 September 2007, Kyiv, Ukraine

ВНИИВСГЭ, 2008 г Москва, Звенигородское ш, 5 Заказ 276/3 Тираж 80 экз

Гиподерматоз — паразитарное заболевание крупного рогатого скота, вызываемое личинками подкожного овода отряда Diptera: Hypoderma lineatum (HL) и Hypoderma bovis (HB). Это заболевание зарегистрировано более чем в 55 странах мира (ФАО, 1984) и представляет большую проблему для стран Европы, Средней Азии и Китая. Известны случаи вспышек гиподерматоза в Австралии и Южной Африке, связанные с импортом пораженного оводом крупного рогатого скота. Распространение этого заболевания в неотропической области (Аргентина, Бразилия, Чили, Эквадор и Сальвадор) и Японии также связано с переносом возбудителей крупным рогатым скотом, импортируемых из других стран, в частности, из США [144].

В Российской Федерации после 1991 года, в связи с началом перестроечных процессов в сельском хозяйстве, прекратилось целевое государственное финансирование борьбы с гиподерматозом. В два раза сократился объем противооводовых мероприятий, вследствие чего заболеваемость среди контролируемого поголовья (около 53%) возросла в 10 -14 раз (до 2,8 - 4,5%), а среди 47% поголовья, не подвергаемого противооводовым обработкам, достигает 30 - 70%.

Ущерб, причиняемый личинками подкожного овода, складывается из потерь молока и мяса, а также порчи кожевенного сырья. Ежегодные потери молока составляют 80 - 200 л от каждой больной гиподерматозом коровы, мяса - от 13 до 18 кг, кожевенного сырья - 8% площади заготовленных шкур. По. экспертным оценкам общие потери от гиподерматоза в России оцениваются в сумме около 6,5 млрд. рублей в год [2]. У животных ухудшаются племенные качества, хозяйства несут лишние затраты кормов, средств и рабочей силы, а также на организацию и проведение лечебно-оздоровительных мероприятий. Кроме того, вызванная гиподерматозом иммунодепрессия животных способствует развитию бактериальных, вирусных и паразитарных болезней, ущерб от которых чрезвычайно трудно подсчитать [144].

Для населения гиподерматоз опасен тем, что при употреблении молока и мяса животных, пораженных личинками овода, в организм человека может попадать вырабатываемое личинками высокотоксичное вещество гиподермотоксин, способное оказывать неблагоприятное влияние на здоровье людей.

Поэтому вполне естественно неослабевающее внимание исследователей к этой болезни и ее возбудителю.

В СССР, современной России и за рубежом проведена большая работа по изучению гиподерматоза крупного рогатого скота. Удалось выяснить основные особенности биологии подкожных оводов, предложить новые средства и методы борьбы с этими паразитами.

Несмотря на это, многие вопросы биологии и экологии возбудителя, выбора средств лечения и профилактики болезни в приграничных областях Российской Федерации, в частности, в Западном регионе (Брянская и Смоленская области) остаются недостаточно изученными. Существует большая вероятность заражения и перезаражения крупного рогатого скота в приграничных районах подкожным оводом от неблагополучных по гиподерматозу соседних стран. Поэтому, выяснение особенностей" биологии, экологии, распространения, а также выбор эффективных средств'борьбы с паразитом в приграничных регионах поможет правильно осуществлять противооводовые мероприятия на данной территории, способствуя снижению заболеваемости животных и получению экологически чистых продуктов животного происхождения.

Диагностику гиподерматоза в животноводческих хозяйствах нашей страны проводят по обнаружению у животных личинок II и III стадий паразита в течение весенних и летних месяцев (клинические признаки болезни), или по экспертизе подкожных тканей и органов животного (вскрытие). Это не позволяет диагностировать болезнь на ранней стадии заболевания. Предлагавшиеся для ранней диагностики болезни реакции непрямой гемагглютинации, внутрикожной пробы, кольцепреципитации, латексагглютинации и двойной диффузии в агаровом геле не лишены недостатков и в повседневной практике почти не используются. Эти методы не обладают достаточно высокой чувствительностью и специфичностью. Кроме того, они не всегда пригодны для рутинных исследований. Поэтому, за рубежом широкое распространение получил иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения личинок I стадии H.lineatum и H.bovis в организме животного. Существует коммерческий набор «Elisa hypodermosis serum screening» (институт «Pourquier», Франция) на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для выявления антител к возбудителю гиподерматоза в сыворотках крови крупного рогатого скота. Создание высокоэффективной отечественной тест-системы поможет решить проблему ранней диагностики гиподерматоза в Российской Федерации.

В этом связи актуальность решения вышеперечисленных вопросов не вызывает сомнений, что и послужило основанием выполнения наших исследований.

Цель работы. Изучение распространения, биологии и экологии подкожных оводов в Западном регионе (Брянская и Смоленская области) Российской Федерации, разработка и апробация средств лечения, диагностики и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота.

Основные задачи исследований:

1. Изучить видовой состав и особенности распространения подкожных оводов крупного рогатого скота.

2. Изучить сроки лета оводов, динамику подхода личинок под кожу животных, выпадение личинок на окукливание.

3. Провести сравнительную оценку эффективности средств лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота.

4. Разработать технологию получения и очистки антигенов возбудителя гиподерматоза крупного рогатого скота.

5. Изучить возможность применения этих антигенов в иммуноферментном анализе для выявления антител к H.bovis и H.lineatum.

6. Разработать диагностическую тест-систему на основе непрямого иммуноферментного анализа для выявления антител к возбудителю гиподерматоза крупного рогатого скота.

Научная новизна работы.

Изучены особенности распространения, биологии и экологии подкожных оводов в Западном регионе России: видовой состав, сроки начала и окончания лета имаго, динамика паразитирования личинок в организме крупного рогатого скота, выпадение личинок на окукливание. Проведен сравнительный анализ эффективности средств лечения и профилактики заболевания на данной территории.

На основе очищенных антигенов из личинки I стадии H.lineatum разработан отечественный метод ранней диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота на основе непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. В сравнительных исследованиях показана высокая чувствительность и специфичность разработанного метода и установлена положительная корреляция результатов с коммерческим набором «Elisa hypodermosis serum , screening» (институт «Pourquier», Франция).

Практическая значимость исследований.

Результаты изучения особенностей распространения, биологии и экологии подкожных оводов в Западном регионе России, выбора эффективных средств борьбы с паразитом позволят правильно организовать противооводовые мероприятия на данной территории, способствуя, тем самым, получению экологически чистых продуктов животного происхождения.

Разработанная тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа может быть использована* в исследовательских учреждениях и лабораториях для ранней диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота.

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения: результаты изучения распространения, биологии и экологии подкожного овода в Западном регионе России;

- результаты сравнительной оценки эффективности средств лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота;

- результаты разработки и оценки иммуноферментной тест-системы для выявления антител к возбудителю гиподерматоза крупного рогатого скота.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета ВНИИВСГЭ (2006, 2007 гг.), на межлабораторном совещании сотрудников ВНИИВСГЭ (г. Москва, 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 17 таблицами и 22 рисунками. Список литературы включает 148 источников отечественных и зарубежных авторов.

6. выводы

1. Установлены биологические особенности подкожного овода крупного рогатого скота связанные с его экологией в Западном регионе Российской Федерации:

- в Западном регионе России обитают два вида подкожных оводов крупного рогатого скота — Hypoderma bovis De Geer (строка) и Hypoderma lineatum De Vill (пищеводник);

- период клинического проявления гиподерматоза крупного рогатого скота в Западном регионе России составляет 5 месяцев - с первой декады февраля по июль;

- лет оводов продолжается с середины июня до начала октября. Личинки III стадии выпадают на окукливание: у пищеводника с 25 апреля по 14 июня, у строки с 2 мая по 5 июля. Период выпадения личинок обоих видов оводов составляет у коров 105 дней, у молодняка - 88 дней;

- одной из причин распространения гиподерматоза в Западном регионе России является ее приграничное расположение и неполный охват поголовья животных осенними профилактическими обработками.

2. Препараты накожного применения гиподектин накожный (на основе ивермектина), аверцид накожный (на основе авермектина) и абамек накожный (на основе абамектина) обладают высокой эффективностью (ЭЭ - 100%, ИЭ -100%) при применении методом поливания на спину в дозе 15 мл на животное для ранней химиотерапии гиподерматоза и при клинической форме заболевания.

3. Инъекционные препараты гиподектин инъекционный (на основе ивермектина), аверцид инъекционный (на основе авермектина) и абамек инъекционный (на основе абамектина) обладают высокой эффективностью (ЭЭ - 100%, ИЭ - 100%) при введении подкожно в дозе 3 мл на животное массой более 200 кг и 2 мл на животное массой менее 200 кг с целью ранней химиотерапии и при клинической форме гиподерматоза.

4. Подтверждена высокая эффективность внутрикожного применения препарата новомек в дозе 0,4 мл (0,2 х 2 мл) с целью профилактики и терапии гиподерматоза.

5. Получены и изучены иммуноспецифичные антигены из личинок I и III стадий H.lineatum. Установлено, что в личинках I стадии содержание активного антигена к антителам возбудителя гиподерматоза составляет 0,14 -2,5% от биомассы, в личинках III стадии этот антиген отсутствует или его содержание существенно ниже (0,05% от биомассы).

6. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю гиподерматоза {H.lineatum и H.bovis) в сыворотках крови крупного рогатого скота. Установлена оптимальная иммобилизирующая концентрация антигена - 10 мкг/мл. Определен критерий дифференциации положительных и отрицательных результатов иммуноферментного анализа, (Ксв.) равный 25%.

7. Диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по. отношению к референтному ИФА-набору «Elisa hypodermosis serum screening» (Inst.Pourquier, Франция) составляет 96,9%, специфичность - 98,1%, сходимость результатов — 97,7%.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанная тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа может быть использована в исследовательских учреждениях и лабораториях для ранней диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота.

Разработаны и утверждены методические рекомендации по ранней диагностике гиподерматоза на основе непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) (Утв. Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 24 января 2008 г.).

Препаративные формы авермектина и абамектина на виде 0,01% раствора могут быть использованы для профилактики и лечения гиподерматоза крупного рогатого скота.