Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Патоморфологические изменения при криптоспоридиозе поросят

11а правах рукописи

УДК 619: 616.493. I .636.4 КОДМЫКОВЛ ККЛШ'ИПЛ ВЛАДИМИРОВНА" Г Б ОЙ

МЛТОМОРФО.Ю! ПЧКСК'ПК Ш.МКПКНПЯ

111*11 кч'шгккиорпдпо я; моросят

16. 00. 02 патология, онкология и морфолотия жинотпых

А в I о р с ф с р л 1 диссертации па соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Саранск 2(100

Работа выполнена на кафедре наганатомии, инфекционных и инвазионных болезней животных Мордовского государственного университета имени 11. П. Огарева.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук Сковородин Е. П., док-гор веюринарных наук Васильева В. А. ^

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Исаенков Е. Л. (Ивановская ГСХЛ),

заслуженный ветеринарный врач Российской Федерации, кандидат ветеринарных наук Денисов В. Г. (Мордовская республиканская станция но борьбе с болезнями животных).

Ведущая организация — Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия.

Защита состоится « 2000 г. в -/О часов на

заседании диссертационного сов/га К.063.72.07 в Мордовском государственном университете имени Н. П. Огарева.

Адрес университета: 430000, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мордовского государственного университета имени Н. П. Огарева.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь

диссертационно!о совета, доцент _ШашановИ. Р.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Криптоспоридиоз сельскохозяйственных животных - широко распространенное и малоизученное паразитарное заболевание, встречающееся у млекопитающих, птиц, рептилий и рыб на всех континентах земного шара. Возбудителями криптоспоридиоза являются паразитические простейшие (кокнидии) рода Cryptosporidium. Они обладают широкой хозяинной специфичностью в пределах классов позвоночных хозяев (I. Pavlasek, V. F. Nikitin, 1983; Н. Moon et al., 1986; Т. В. Бейер, 1988, 1998; Я. П. Литвинский, 1992; Т. А. Шибалова И. Ф. Павласек, Н. В. Касаткина, 1993; С. A. Acedo et al., 1995; И. И. Бочкарев, Т. А. Шибалова, 1996; А. М. Запруднов, Л. Н. Мазанкова, 1997; В. А. Васильева, 1999).

Достаточно хорошо изучена биология возбудителей криптоспоридиоза, клиническое течение болезни, эпизоотология этого протозо-эза у птиц и телят. У поросят же аналогичные сведения в доступной штературе представлены недостаточно (A. Pospichil et al., 1984; С). Taylor, 1985; H. Schirrmeier, 1987; П. И. Пашкин с соавт., 1988;

3. Koudela et al., 1990; I. Arnault et al., 1994; И. Павловик,

4. Ерски-Бильчиек, 1995; M. Quilez et al., 1996).

Хотя знания о патогенезе и патоморфогенезе криптоспоридио-ia у поросят имеют большое теоретическое и практическое значение, ¡ведения о патоморфологических изменениях этого протозооза в ли-гературе также представлены недостаточно (A. Bracarense, . L. Sinhorini, 1996; В. А. Васильева, 1998). Это определило цель и ¡адачи нашей работы.

Цель работы. Изучить клинико-морфологические изменения 1ри криптоспоридиозе поросят.

Задачи исследований.

1. Изучить динамику симптомокомплекса и патоморфологиче-:ких изменений в органах и тканях поросят при экспериментальном гриптоспоридиозе.

2. Выяснить диагностическую ценность патоморфологических вменений при криптоспоридиозе поросят.

'азработать экспериментальную модель заболевания на белых мылах.

3. Определить основные патоморфологические изменения в же-удочно-кишечном тракте, паренхиматозных органах, надпочечниках, имусе, селезенке и лимфоузлах у белых мышей при эксперимен-альном заражении С. parvum.

4. С помощью копрологических и пагогистологических методок установить терапевтический эффект тинидазола и шшлииа (в виде эмульсии) при экспериментальном криптоспоридиозе мышей.

Научная новизна настоящей работы заключается в том, чтс впервые с помощью комплекса паразитологических, клинических гематологических и биохимических методов исследования прослежена динамика развития криптоспоридиоза поросят при экспериментальном заражении. На разных уровнях исследования (макроскопический, микроскопический, гистохимический, ультраструктурный) подробно описана динамика патоморфолопгческих изменений органов i тканей при криптоспоридиозе поросят. На основании клинико морфологического анализа расширены представления о патогенезе i патоморфогенезе заболевания.

Экспериментально воспроизведено заражение С. parvum белы> мышей 1-14-суточного возраста с последующим изучением патолого-гистологических изменений в кишечнике, паренхиматозных органах сердечно-сосудистой, эндокринной и иммунной системах. Впервые испытаны препараты тшшдазол и щшлин (в виде эмульсии) с после дующим патоморфологическим исследованием внутренних органов i систем экспериментальных животных.

Результаты проведенного патоморфологического исследования определения содержания гликогена и липидов в надпочечниках ш различных стадиях болезни позволили (с учетом анализа литератур ных данных) раскрыть ряд вопросов патогенеза криптоспоридиоза ; поросят.

Практическая ценность работы. Проведенная нами расшиф ровка патоморфологических и гистохимических изменений позволил; расширить существующие представления о патогенезе криптоспори диоза поросят, что имеет не только теоретическое, но и пракгическсм значение. Проведен клинико-морфологический анализ и определен; диагностическая ценность пагогистологических изменений.

Белые мыши в возрасте от 1 до 14 суток могут быть рекомендо ваны для использования в качестве экспериментальной модели npi изучении криптоспоридиоза свиней и испытании современных тера певтических препаратов.

Результаты проведенных нами исследований могут быть исполь зованы при подготовке учебной литературы по патологической ана томии, паразитологии и инвазионным болезням сельскохозяйствен ных животных, а также при чтении лекций и проведении лаборатор но-практических занятий по этим дисциплинам в высших учебны:

аведениях.

Апробация работы. Основные материалы были доложены, об-:уждены и получили положительную оценку на научно-фоизводственной конференции по итогам научно-исследовательских >абот Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии ;а 1999 год (Ульяновск, 1999), на XXVII и XXVIII Огаревских чтени-IX Мордовского госуниверситета(Сараиск. 1998, 1999), на Региональ-юй научно-практической конференции «Критические технологии в )егионах с недостатком природных рес>рсов» (Саранск, 1999), рас-пиренном заседании кафедры паганатомии, инфекционных и инвази-)нных болезней животных (протокол № 1 от 4 февраля 2000 г.).

Публикации. Положения диссертационной работы достаточно юлно отражены в двух научных статьях и автореферате.

Внедрение результатов исследований. Методы копрологиче-:кого исследования и патоморфологической диагностики криптоспо-шдиоза свиней, изложенные в диссертационной работе, используют-;я в работе Саранской городской станции по борьбе с болезнями жи-ютных. Материалы диссертации используются при чтении лекций и фоведении лабораторно-практических занятий на кафедре патанато-,ши, инфекционных и инвазионных болезней животных Мордовского ■осударственного университета имени Н. П. Огарева, в Ульяновской •осударственной сельскохозяйственной академии, Ижевской государ-¡твенной сельскохозяйственной академии, Казанской государствен-юй академии ветеринарной медицины.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена 1а 130 страницах машинописного текста и состоит из разделов: «06-цая характеристика работы», «Обзор литературы», «Собственные ис-:ледования», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы», (Практические предложения», «Список использованной литературы». 3 ней содержится 7 таблиц, 63 рисунка.

Список использованной литературы включает 173 источников, в -ом числе — 88 иностранных авторов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

!. Одной из причин гастроэнтеритов новорожденных поросят могут быть С. рагушп.

!. Патогенное действие С. ратип на слизистую оболочку кишечника определяется развитием всех эндогенных стадий паразита в зоне мнкроворсинок энтеронитов.

3. Местные альтератнвные процессы приводят к выраженной воспалительной реакции кишечника, изменениям в паренхиматозных органах, иммунной и эндокринной системах организма.

4. Заражение 1 - 14-суточных белых мышей С. раг\ит. полученными ог больных поросят, приводит к развитию заболевания, близкого по своей патоморфологической картине к кринтосноридиозу свиней, что может быть использовано при моделировании этой, патологии.

МАТЕРИАЛ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в период с 1996 по 1999 год на кафедре пата-натомии, инфекционных и инвазионных болезней животных Мордовскою государственного университета имени Н. П. Огарева, а также на базе Саранской городской ветеринарной станции но борьбе с болезнями животных. Проведены две серии опытов на поросятах в возрасте от 1 до 30 суток (37 поросят) и 5 - на белых мышах обоего пола 1 - 14-сугочного возраста (19 мышей).

В первой серии опытов 14 поросят разбили на 2 группы: в первую вошли 7 голов 1 - 10-суточного возраста, зараженных оралыю взвесью ооцист криптоспоридий в дозах 200 тыс. и 400 тыс. Во вторую группу включили 7 голов 13 - 15-дневного возраста, пнвазиро-ванных оралыю смесью ооцист С. рагуит в дозе 600 000. Из 14 зараженных 2 поросенка пали, остальных убили в период начала выделения ооцист, в середине, во время максимальною выделения и в период выздоровления по 3 в каждый срок.

Во второй серии опытов- использовали 23 поросенка 17 - 30-суточного возраста, из которых 18 были инвазированы орально взвесью ооцист С. рагуит в дозе 400 тыс. каждому. Пять живошых составили контрольную группу. По 3 поросенка из опытной группы убили через 5, 6, 8, 10, 12, 16 дней после инвазирования; 3 контрольных поросенка убили перед началом опыта, 2 - в конце.

В ходе опытов на поросятах ежедневно проводили клиничсскпп осмотр с термометрией, измерением пульса, частоты дыхания. Один раз в 3 дня животных взвешивали и брали кровь ятя определения количества эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина по общепринятым методикам (В. Ф. Поляков, 1964; Г1. Д. Кондрахин с соавт, 1985). Ко-прологические исследования проводили за двое и трое суток до заражения, а также через каждые 24 часа после инвази ши вплоть до у боя. Для этого готовили нативные мазки и окрашивали их карбол-фуксином по Цилю - Нильсену.

Для приготовления мазка фекалий на предметное стекло пометали 1 - 2 капли изотонического (0,9%) раствора хлорида натрия и [ебольшой комочек свежих фекалий до получения гомогенной массы, елали тонкий мазок и тщательно высушивали его на воздухе (не ме-¡ее 30 мин). Крупные частицы удаляли скальпелем, после чего мазок шксировали смесью Никифорова (смесь равных частей эфира и 96% тилового спирта) в течение 10 мин и вновь тщательно высушивали а воздухе. Фиксированный мазок быстро 3-5 раз проводили над ламенем горелки, и окрашивали раствором карбол-фуксина 5-20 [ин. После промывания мазка водопроводной водой его обесцвечи-али 5 - 10% раствором серной кислоты 20 - 60 с, вновь промывали одой и подкрашивали в течение 5 мин 5% раствором малахитового еленого в 10% этиловом спирте. В конце процедуры мазок вновь ромывали в воде и тщательно высушивали на воздухе, после чего роводили исследования под микроскопом (с иммерсией).

Ооцисты криптоспоридий окрашивались обычно в ярко-расный цвет с различными оттенками и имели вид округлых образо-аний диаметром до 5 мкм. Внутри некоторых из них удавалось рас-мотреть удлиненные спорозоиты. Сопутствующая микрофлора окашивалась в зеленые тона.

Для изучения стадии развития криптоспоридий в организме бе-ых мышей, последних заражали суспензией ооцист и убивали на - 11-й день от момента заражения. В серии было использовано 19 гивотных, из которых были сформированы 3 опытные группы по 4 1ыши и 2 контрольные - соответственно из 3 и 4 мышей. Животных иытных групп заражали взвесью ооцист криптоспоридий из расчета 00 000 на голову. С этой целью использовали суспензию ооцист parvum. Перед заражением подсчитывали их количество в 0,1 мл в амере Горяева, а затем отбирали нужную дозу.

Суспензия ооцист С. parvum была получена из фекальных масс ольных криптоспоридиозом поросят методом флотации. В качестве дотационных растворов использовали среду Бреза (смесь насыщен-ых растворов сульфата магния, тиосульфата натрия и водопроводной оды в соотношении 3:3:1) и смесь Павласека (хлорид цинка - 220 г, порид натрия - 210 г, водопроводная вода - 800 мл). Их применение озволяет получить изолят ооцист (биомассу возбудителя). В после-утощем собранный материал центрифугировали в десятикратном эъеме дистиллированной воды (1,5 тыс. об/мин в течение 15 мин), гмывали от флотационных растворов. Полученную биомассу сохраняй с добавлением гентамицина.

На 5-й день от момента выделения первых ооцист С. parvum мышам второй и третьей опытных групп вводили орально в виде имульсий соответственно тинидазол и циплин ежедневно в течение 5 дней. Во второй группе одна мышь .пала. Остальных убили на 11-й день с момента заражения. Контрольных мышей убили в начале и конце опыта.

Патогистологически от поросят и мышей исследовали проксимальный и дистальный участки тощей, подвздошной кишки, надпочечники, лимфатические узлы, селезенку, сердце, тимус, печень и почки. Кусочки тканей и органов фиксировали в жидкости Карнуа и и 10% растворе нейтрального формалина. Материал, фиксированный 2 - 3 ч в жидкости Карнуа, помещали в спирты возрастающей крепости, а образцы зафиксированные в 10% водном растворе нейтрального формалина подвергали такому же способу обезвоживания, после промывки в проточной воде. После дегидратации материал по общепринятой методике заливали в парафин, а затем на роторном микротоме, получали срезы и окрашивали их гематоксилин-эозином, азур-эозином по Романовскому - Гимзе. Кроме того, в срезах проводил! гистохимические реакции и выявляли гликоген, нейтральные (гк Мак-Манусу) и кислые (по Стидмену) гликозаминогликаны, нуклео-протеиды по Браше, Эйнарсону. Срезы, полученные на замораживающем микротоме, окрашивали Суданом черным В, Суданом ill не Дадди (А. И. Кононский, 1976).

Электронную микроскопию проводили по общепринятой методике следующим образом. Образцы слизистой оболочки подвздошно! кишки фиксировали в охлажденном 2,5% глютаральдегиде на фосфатном буфере с рН 7,3 с последующей дофиксацией 1 % растворол осмиевой кислоты. Кусочки заливали в эпон-аралдитную смесь. 11о еле получения окраски и микроскопического исследования полутонких срезов блоки окончательно затачивали и готовили ультратонкт срезы, монтировали их на опорные сетки, контрастировали цитраих\ свинца по Reynolds (1963). Электронную микроскопию проводили и; микроскопе ЕМ-100 В.

Полученные количественные и полуколичественные данные об рабатывали статистически с помощью прикладных программ с ис пользованием критериев Сгьюдента, Т-критерия Уайта, Х-критерш Ван-дер-Вардена на персональном компьютере.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Симптомокомплекс болезни при экспериментальном криптоспоридиозе поросят

В настоящее время криптоспоридиоз остается актуальной про-элемой, требующей глубоких исследований в направлении детализации симптомокомплекса, изучения биохимических и иммунологиче-:ких изменений, происходящих в организме при этой болезни, а также выяснения механизмов ее патогенеза.

Многие исследователи убедительно доказали, что в возникновении и обострении желудочно-кишечных заболеваний определенную роль играют паразитические простейшие криптоспоридии ;R. J. Panciera et al., 1971; R. L. Kemp, 1974; V. Me. Donald, 1976; Я. Прокопич, И. Павласек, 1983; Ю. К. Горбов, 1987; Т. А. Шибалова, 1987; И. И. Бочкарев, А. А. Алиев, 1993; В. А. Васильева, 1998, 1999).

В эксперименте по принципу аналогов нами было подобрано 37 поросят 1 - 30-суточного возраста, которых заражали криптоспо-ридиями рода С. parvum в дозе 200 тыс. - 600 тыс. Опыты были проведены в двух сериях. Параллельно велись клинические наблюдения, морфологические и биохимические исследования, проводились ко-прологическне анализы натнвных препаратов.

Проявление клинических пртнаков наблюдали на 3 - 4-й день после заражения. Первым выраженным симптомом болезни была водянистая диарея. Выделения имели гнилостный запах. Иногда в фекалиях обнаруживали кусочки слизистой оболочки кишечника с прожилками крови. Выделение ооцист криптоспоридий начиналось на 3 - 6-е сутки и достигало максимума на 8 - 10-е сутки, продолжалось до 16-го дня болезни. Интенсивность инвазии зависела от дозы заражения, возраста поросят и состояния организма. У поросят 1-10- дневною возраста первой опытной группы, с дозой заражения эт 200 тыс. до 400 тыс. ооцист, интенсивность инвазии наивысшей гочки достигала на 10-й день и составляла до 39 ооцист в 100 полях зрения микроскопа, на 12-й снижалась до 19 ооцист и на 16-й до 3.

У поросят 13 - 15-суточного возраста второй опытной группы, у которых доза заражения составляла 600 тыс., интенсивность инвазии ¡доставляла от максимального показателя 20 до 1 ооцисты на 16-й день исследования. У опытных поросята 17 - 30-суточного возраста, получивших дозу заражения 400 тыс., интенсивность инвазии составляла эт 15 ооцист при максимуме выделения криптоспоридий до 0 в 100

полях зрения микроскопа на 16-й день исследования.

Температура тела животных на 6-е сутки после заражения не значительно повышалась и достигала 40,6° С, сохраняясь на это? уровне в течение трех-четырех дней. Тяжелую форму течения болезш отмечали на 7 - 10-е сутки после заражения. Она сопровождалас прогрессирующим похуданием и обезвоживанием организма. В это период выделение фекалий происходило самопроизвольно. Пали ! поросенка.

При гематологическом исследовании поросят, зараженных оони стами криптоспоридий выявлено, что на 4-й день после инвазирова ния количество эритроцитов уменьшалось до 6,534±0,73 млн/мкл (гк сравнению с контролем), количество лейкоцитов возрастало д< 21,19±0,25 тыс/мкл. Максимальное уменьшение количества эритро цитов отмечали на 6-й день после заражения, когда этот показагел) достигал 5,761±0,58 млн/мкл, а количество лейкоцитов увеличивалос: и достигло 25,53±0,22 тыс/мкл.

На 10-й день инвазии количество эритроцитов резко увеличилс: и составил 7,562±0,76 млн/мкл. Одновременно происходило снижс ние количества лейкоцитов до 15,85±0,25 тыс/мкл.

На 12-й день после заражения отмечено достоверное увеличент в крови уровня лейкоцитов и эритроцитов соответственно д< 17,14±0,49 тыс/мкл и 7,670^0,58 млн/мкл. Количество эозинофилов ] крови подопытных поросят повышалось: на 4-й день этот показател! составил 8,9 %, на 6-й - 10,3, на 8-й - 11,2; на 10-й день оно достига ло максимума - 14,3 %. В последующие сутки количество эритроци тов, лейкоцитов и эозинофилов приближалось к показателям порося контрольной группы.

В качестве теста оценки естественной резистентности порося' было взято содержание гамма-глобулинов в сыворотке крови. За нор му для 1-4 суточных поросят принимались показатели гамма глобулинов 25,0 - 55,1 г% (В. П. Урбан, И. Л. Найманов, 1984). Был< установлено, что экспериментально инвазированные животные до за ражения имели пониженное их содержание (23, 6 г%). На 6-й деш болезни оно составило 20,1 г%, в момент массового выделешп ооцист криптоспоридий, т. е. на 10-е сутки, — 18,5 г%, на 12-й деш — 16,8 г %. После выздоровления поросят, на 21-й день с начала за ражения, количество гамма-глобулинов в сыворотке крови было низ кой и составляло 14,0 г%.

По нашим наблюде!шям, гипогаммаглобинемия способствуе заболеваемости поросят диареями криптоспоридийной этиологии

При таком состоянии поросята болеют 2,7 раза чаще и болезнь у них протекает тяжелее, чем у животных с нормальным содержанием гамма-глобулинов. Между уровнем гамма-глобулинов и заболеваемостью поросят криптоспоридиозом отмечена корреляционная зависимость сильной степени (г = 0,9). Характерно, что после болезни признаки приобретенного иммунодефицита усиливались.

У поросят, зараженных ооцнстами криптоспоридий, начиная с 4-х суток болезни, уменьшалась резервная щелочность, снижалось количеств кальция и фосфора, что свидетельствует об ацидозе и выраженном нарушении электролитного баланса крови.

2. Патоморфологические изменения при экспериментальном криптоспоридиозе поросят и белых мышей

При экспериментальном криптоспоридиозе спонтанная гибель новорожденных поросят регистрировалась на 3-11-е сутки после заражения. Павших и убитых в ходе эксперимента животных подвергали патологоатомическому вскрытию для подтверждения поставленного прижизненного диагноза на крилтоспоридиоз и изучения патоги-стологических и гистохимических изменений органов и тканей.

При осмотре желудочно-кишечного тракта поросят наблюдали развитие катарального воспаления от желудка до прямой кишки. Содержимое кишечника жидкое, иногда с пузырьками газа. На всем протяжении слизистая оболочка гиперемированная, набухшая, покрыта толстым слоем слизи. Слизистая оболочка подвздошной кишки с многочисленными кровоизлияниями, местами изъязвлена. В некоторых случаях наиболее сильное поражение отмечалось в тощей кишке. Брыжеечные лимфатические узлы увеличены, сочные на разрезе, местами покрасневшие. Селезенка без видимых изменений или незначительно увеличена. Печень незначительно увеличена с мелкими кровоизлияниями в капсуле. Сердце увеличено в размере из-за расширения правых полостей. Легкие также увеличены, края притуплены, с кровоизлияниями под плеврой. Отмечалась прямая зависимость между выраженностью патологоанатомических изменений и степенью пораженности кишечника криптоспоридиями.

При патогистологическом исследовании органов животных контрольной группы отмечали, что сердечная мышца была в пределах нормы, изменений со стороны сосудов не выявлено, в печени животных полнокровие сосудов. Хорошо выражена система балок правильного строения, гепатоциты крупных размеров, много двуядерных, ци-

тоилазма несколько разрыхлена. Междольковая соединительная ткань развита слабо. В селезенке красная и белая пульпы отчетливо различимы, рельефно выступают трабекулярный остов и пульпарные артерии. В брыжеечных лимфатических узлах заметных повреждений клеток не выявлено. Центральная часть лимфатических фолликулов состояла из крупных, более светлых лимфобластов, опоясанных зоной более мелких лимфоцитов. Красная пульпа содержала ретикулярные клетей с волокнами, в сети которой располагались лимфоциты, эритроциты. небольшое число эозинофилов. В почках эпителий канальцев сохранен, изменений в них не обнаружено. Эпителиальные клетки крупные, высокие. Почечные тельца довольно больших размеров. Легкие воздушные, малокровные. Вокруг некоторых мелких бронхов имелись лимфатические узелки, составлявшие пакет из 2-3 узелков.

Лимфоциты были представлены клетками приблизительно одной зрелости. Альвеолоциты расположены пристеночно, явлений набухания, слущивания не отмечено. Железисты;'; эпителий бронхов, умеренно секретирующий слизь, имел единичные слущиваюшиеся клетки. В кишечнике лимфатические узелки располагались в подсли-зистом слое. Мышечный слой слизистой без видимых изменений.

Основные патоморфологические изменения у экспериментально зараженных поросят мы обнаружили в тонком отделе кишечника. Через 5 дней после заражения отмечали набухание слизистой оболочки тонкой и подвздошной кишок, обусловленные в различной степени выраженной инфильтрацией собственной пластинки слизистой оболочки лимфоцитами и эозинофилами, с преобладанием последних. В энтероцигах некоторых ворешюк имелись криптоспоридии эндогенных стадий.

В последующем (через 6-8 суток) клеточная реакция усиливалась, Пейеровы бляшки гиперплазированы, просветы крипт нередко расширены, со скоплением распадающихся клеток. Криптоспоридии эндогенных стадий выявляли в ворсинках кишечника. В их млечных сосудах и между железами обнаруживались шизонты и мерозоиты.

К 12-му дню после заражения утолщение слизистой оболочки подвздошной кишки было более выражено, просвет кишечника значительно сужался. Отмечати деформацию ворсинок и гибель желез с замещением их скоплениями из эозинофилов и лимфоцитов, а также массовое поражение эпителия ворешюк и желез макро-, микрогаметами и ооцистами.

При исследовании тканей методом сканирующей электронной микроскопии на поверхности различных отделов кишечника поросят

опытных групп обнаруживали многочисленных развившихся паразитов и атрофию ворсинок слизистой оболочки кишечника.

С помощью трансмиссионного микроскопа на электронограммах экспериментального материала установили все эндогенные стадии развивающегося паразита: трофозоиты, меронты, макро- и микрога-монты, зиготы, ооцисты, включая спорулированную ооцисту. Все развившиеся стадии находились в зоне щеточной каемки энтероцитов. Они не были внедрены в клетку хозяина, а находились в контакте с энтероцитами, у основания микроворсинок, образуя электронно-плотную мембрану, которая служила для паразита питающей орга-неллой. В процессе развития эндогенные стадии криптоспоридий находились внутри паразитофорной вакуоли.

У поросят, убитых через 16 дней после инвазирования, отмечали незначительное восстановление структуры слизистой оболочки кишечника с сохранением в ее отдельных участках небольшого количества укороченных ворсинок и атрофированных желез.

Нами также было выявлено, что в печени, почках, миокарде развиваются дистрофические изменения, вызванные, видимо, нарушением окислительно-восстановительных процессов на почве интоксикации и гемодинамических расстройств. При этом в первые сутки я печени отмечались гемодинамические нарушения. Зернистая дистрофия гепатоцитов наиболее ярко проявлялась на 10-е сутки. Параллельно развивалось ннтерстнциальиое воспаление, вплоть до цирро-тических изменений.

В почках отмечали развитие зернистой, а затем гиалиново-капельной дистрофии, гемодинамические расстройства, а на 16-е сутки — мукоидное набухание стенок кровеносных сосудов, вплоть до фибриноидного некроза.

В сердце на 10 - 12-е сутки после заражения развивались зернистая дистрофия миокардиоцитов, венозная гиперемия и отек межуточной соединительной ткани.

При криптоспорндиозе отмечали гиперплазию лимфоидной тка-шг, десквамацию синусов и на 10 - 16-е сутки проникновение отдельных шизонтов, иногда в состоянии распада, с клеточной макрофа-гальной реакцией и эозинофильной инфильтрацией.

В селезенке первые изменения выявляли на 10-е сутки после заражения. Они проявлялись склеротическими изменениями кровеносных сосудов. В дальнейшем развивались депонация крови и очаговая пролиферативно-гиперпластическая реакция клеточных элементов.

В легких на 6-е сутки появлялись признаки лобулярной альвео-

лярной эмфиземы, что объясняется возрастанием потребности организма в кислороде. Кроме того, характерна пролиферативно-гиперпластическая реакция клеток перибронхиалыюй соединительной ткани. В дальнейшем признаки альвеолярной эмфиземы нарастали, а в бронхах развивалось катаральное воспаление. Во многих тканях и органах находили признаки нарушений крово- и лимфообращения.

Таким образом, криптоспоридиоз поросят необходимо рассматривать не как местный процесс, а как заболевание со сложным сим-птомокомплексом и определенной стадийностью развития. В этиопа-тогенезе участвуют не только криптоспоридин, которые можно рассматривать как инициаторов болезни. Очень важны общая реакция организма, состояние его иммунной и нейроэндокринной систем.

На современном этапе развития науки биологическое моделирование болезней становится важнейшим методом научного познания. Это обусловливает необходимость создания на лабораторных животных таких экспериментальных моделей, которые наиболее адекватно отражали бы механизмы возникновения, развития заболеваний или отдельные их патогенетические звенья, а также механизмы выздоровления (И. В. Давыдовский, 1962; Д. С. Саркисов, 1990). Большинство исследователей в качестве такой модели использовали культуры клеток, что представляет определенные трудности.

Известно, что впервые криптоспоридии были обнаружены у мышей, следовательно, белые лабораторные мыши могут быть использованы для воспроизведения этого заболевания. Вопрос лишь в том, как подобрать оптимальную дозу криптоспоридий, полученных от свиней, и в каком возрасте наиболее ярко проявляется заболевание, вызванное простейшими.

Для уточнения деталей развития болезни, а также апробации новых терапевтических средств нами была разработана экспериментальная модель криптоспоридиоза на белых мышах. Установлено, что изменения в кишечнике и паренхиматозных органах во многом аналогичны процессам, описанным у поросят. Наряду с этим нами было проведено тщательное патоморфологическое исследование тимуса и надпочечников. В тимусе мы наблюдали явления акцидентальной трансформации, которая характеризовалась уменьшением долек ви-лочковой железы. Гистологически это характеризовалось гнездным расположением лимфоцитов вследствие миграции в общий кровоток и начинающимся коллабированием ретикулярной сети долек, инверсией слоев, новообразованием большого количества мелких тимиче-

СКИХ телец.

В надпочечниках отмечали признаки атрофии клубочковой зоны ответственной за выработку мннералокортикоидов, липофанероз и обеднение фосфолипидами эндокриноцитов пучковой зоны, ответственной за синтез глюкокортикоидов, гипоплазию сетчатой зоны и атрофию мозговой части железы. Это свидетельствует о состоянии дистресса.

При использовании с терапевтической целью тинидазола наряду с остаточными явлениями у переболевших криптоспоридиозом животных отмечали выраженную гиперемию в изученных органах; усиленный синтез и выделение альдостерона и стероидных гормонов надпочечников, оптимизирующих воспалительные процессы; явления обеднения коркового вещества тимуса лимфоидной ткани без явлений коллапса долек и новообразования тимических телец, с появлением картины «звездного неба», связанной с пролиферацией лимфоцитов и макрофагов. Это связано с действием тинидазола, который является синтетическим препаратом группы имидазола, обладающим мощным антипротозойным эффектом. Проникая в клетки, он вызывает их па-рушение или угнетение синтеза ДНК. Препарат хорошо всасывется при приеме внутрь, проникает в органы и ткани, преодолевает через гематоэнцефалический барьер и накапливается в печени. Выводится в основном с мочой в неизмененном виде или в виде метаболитов, частично с калом (М. Д. Машковский, 1993).

У животных третьей опытной группы, в которой в качестве терапевтического средства использовали циплин, наряду с незавершенными процессами регенерации органов, венозная гиперемия была выражена слабо. В тимусе преобладала начальная фаза акциденталь-иой трансформации, в лимфатических узлах наблюдачись явления пимфостаза, в селезенке отмечатась депонация крови. На фоне хорошего терапевтического эффекта токсическое действие этого препарата были выражены слабее. Это связано с тем, что при приеме з1гутрь он быстро всасывается, высокие концентрации создаются в точках и легких и выделяется с мочой (М. Д. Машковский, 1993).

Следовательно, схему нагоморфогенеза при экспериментальном фиптоспоридиозе поросят можно представить следующим образом. !ри инвазировании в желудочно-кишечном тракте развиваются все шдогенные стадии паразита в щеточной каемке энтероцитов. При >том развивающиеся стадии мелкие, в основном около 2-6 мкм в шаметре. Большое число генераций шизогоний и существенная всо-гшость аутоинвазии, особенно на фоне иммунодефицита, приводят к

разрушению апикальных частей клеток на значительной поверхности к 3-м суткам после заражения. Это в свою очередь ведет к нарушениям мембранного пищеварения и явлениям диспепсии. По принципу «порочного круга» усиливаются альтерагивные процессы. В ответ на это развиваются защитно-компенсаторные реакции, дистрофические процессы в паренхиматозных органах, возникают адаптивные изменения иммунной и нейроэндокринной систем, которые не всегда адекватны степени тяжести патологического процесса. Эти звенья патогенеза наиболее выражены к 10-м суткам после заражения.

В дальнейшем, если явления прогрессирующего исхудания и обезвоживания не приводят к смерти, начинают преобладать репара-тивные процессы и происходит санация организма. Тем не менее даже после выздоровления и прекращения выделения ооцист С. рагуиш отмечаются осложнения в виде нарушения обмена веществ и приобретенного иммунодефицита.

ВЫВОДЫ

1. Заражение поросят 1 - 30-суточного возраста взвесью С. рагушп приводит к появлению на 3 - 4-е сутки после заражения клинических признаков в виде диареи, а на 7 - 10-е - сутки прогрессирующего исхудания и обезвоживания организма. Это сопровождается ростом выделения ооцист криптоспоридий с достижением максимума на 8 - 10-е сутки.

2. Течение экспериментально!« криптоспоридиоза зависит от дозы возбудителя (количества ооцист, взятых для заражения) и возраста животных. Более тяжело заболевание протекает при заражении поросят в первые десять суток после рождения.

3. Предрасполагающим фактором возникновения и клинического проявления криптоспоридиоза является гипогаммаглобулинемия. Заболеваемость поросят диареями криптоспоридиозной этиологии на фоне иммунодефицита была в 2,7 раза чаще и болезнь протекала более тяжело. У переболевших криптоспоридиозом животных состояние приобретенного иммунодефицита усиливалось.

4. Патоморфологические изменения желудочно-кишечного тракта характеризовались катаральным воспалением, а в подвздошной кишке - многочисленными кровоизлияниями и изъязвлениями слизистой оболочки.

5. При патогистологическом исследовании органов эксперимен-

тально зараженных поросят установили деформацию ворсинок, слизистую дистрофию и разру шения эпителиоцитов тонкого отдела кишечника макро-, микрогаметоцитамн и ооцистами. В паренхиматозных органах развивались дистрофические изменения на почве интоксикации и гемодинамических расстройств. В лимфатических узлах отмечали гиперплазию лимфоидной ткани, де-сквамацию синусов, в селезенке — склеротические изменения кровеносных сосудов, в легких - признаки альвеолярной эмфиземы с последующим развитием катаральной бронхопневмонии, нарушения крово- и лимфообращения развивазьсь в большинстве органов.

6. Электронно-микроскопическое исследование апикальных частей энтерощпов позволило выявить основные стадии развития крип-тоспоридий: спорозоиты, шизонты, мерозоиты, микро- и макро-гаметоциты, молодые ооцисты и сформ!грованные тонкостенные и толстостенные ооцисты.

7. Заражение 1 - 14-суточных белых мышей взвесью С. рап/иш, полученной от поросят, позволяет воспроизвести у них криптоспо-ридиоз. При этом патоморфологическая картина близка к таковой при криптоспоридиозе поросят, что позволяет использовать данную экспериментальную модель для апробации современных препаратов и выяснения вопросов этиопатогенеза болезни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕ^ЮЖЕНИЯ

Полученные нами данные по динамике патоморфологических изменений в органах и тканях при экспериментальном криптоспоридиозе поросят и их зависимости от интенсивности поражения кишечника различными эндогенными стадиями криптоспоридий предлагаем использовать при дифференциальной диагностике протозойных болезней свиней, в научно-исследовательской работе в области протозоологии, а также в учебном процессе при изучении патологической анатомии и паразитологии.

Результаты исследований рекомендуем использовать при подготовке учебной литературы и руководств по патологической анатомии и паразитологии.

Белых мышей можно использовать в качестве экспериментальной модели криптоспоридиоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колмыкова Е. В. Влияние климатических факторов на зараженность животных С. ратин// XXVIII Огаревские чтения: Материалы науч. конф. Морлов. гос. ун-та им. II. П. Огарева. 6-10 декабря 1999 г. - Саранск, 1999. - С. 133 - 134. (В соавторстве с В. А. Васильевой).

2. Колмыкова Е. В. Технология обезврежтвания сточных вод зараженных криптоспоридия.ми// Критические технологии в регионах с недостатком природных ресурсов: Груды научной конф. — Саранск, 2000. С. 98 - 100. (В соавторстве с Васильевой В. А. и Ско-вородиным Е. Н.).

Актуальность темы. Криптоспоридиоз сельскохозяйственных животных - широко распространенное и малоизученное паразитарное заболевание, встречающееся у млекопитающих, птиц, рептилий и рыб на всех континентах земного шара. Возбудителями кр и пто с п о р ид и о за являются паразитические простейшие (кокцидии) рода Cryptosporidium. Они обладают широкой хозяин ной специфичностью в пределах классов позвоночных хозяев (I. Pavlasek, V. F. Nikitin, 1983; Н. Moon et al., 1986; Т. В. Бей ер, 1988, 1998; Я. П. Литвине кий, 1992; Т. А. Шибало-ва, И. Ф. Павласек, Н. В. Касаткина, 1993; С. A. Acedo et al., 1995; И. И. Бочкарев, Т. А. Шибалова, 1996; А. М. Запруднов, Л. Н. Мазанкова, 1997; В. А. Васильева, 1999).

Достаточно хорошо изучена биология возбудителей крип-тоспоридиоза, клиническое течение болезни, эпизоотология этого протозооза у птиц и телят. У поросят же аналогичные сведения в доступной литературе представлены недостаточно (A. Pospichil et al., 1984; D. Taylor, 1985; H. Schirrmeier,1987; Л. И. Пашкин с со а вт., 1988; В. Koudela et al., 1990; I. Arnault et al., 1994; И. Павловик, M. Ерски-Бильчиек, 1995; M. Quilez et al., 1996).

Хотя знания о патогенезе и патоморфогенезе криптоспо-ридиоза у поросят имеют большое теоретическое и практическое значение, сведения о 11 аго м о р ф о л о г и ч е с к и х изменениях этого протозооза в литературе также представлены недостаточно (A. Bracarense, I. L. Sinhorini, 1996; В. А. Васильева, 1998). Это определило цель и задачи нашей работы.

Цель работы. Изучить кл и н и ко- м орфол о ги чес кие изменения при криптоспоридиозе поросят.

Задачи исследований.

1. Изучить динамику симптомокомплекса и патом орфол о -гических изменений в органах и тканях поросят при экспериментальном криптоспоридиозе.

2. Выяснить диагностическую ценность патоморфологи-ческих изменений при криптоспоридиозе поросят.

Разработать экспериментальную модель заболевания на белых мышах.

3. Определить основные патоморфологические изменения в желудочно-кишечном тракте, паренхиматозных органах, надпочечниках, тимусе, селезенке и лимфоузлах у белых мышей при экспериментальном заражении С. рагуит.

4. С помощью копрологических и п ато г и сто л о г и ч е с к и х методов установить терапевтический эффект тинидазола и цип-лина (в виде эмульсии) при экспериментальном криптоспоридиозе мышей.

Научная новизна настоящей работы заключается в том, что впервые с помощью комплекса п ар аз и гол о г и ч е с к и х, клинических, гематологических и биохимических методов исследования прослежена динамика развития криптоспоридиоза поросят при экспериментальном заражении. На разных уровнях исследования (макроскопический, микроскопический, гистохимический, ультраструктурный) подробно описана динамика патом о рфол оI и ч е с к и х изменений органов и тканей при криптоспоридиозе поросят. На основании к л и и и ко - м о р 4) о л о г и ч е с ко г о анализа расширены представления о патогенезе и патоморфогенезе заболевания.

Экспериментально воспроизведено заражение С. раг\ит белых мышей 1 14-суточного возраста с последующим изучением 11 ато л о го -1 и стол о г и ч е с к и х изменений в кишечнике, паренхиматозных органах, с е р д е ч н о - с о с уд истой, эндокринной и иммунной системах. Впервые испытаны препараты тинидазол и ц и пли н (в виде эмульсии) с последующим п ато м о р ф о л о г и ч е -ским исследованием внутренних органов и систем экспериментальных животных.

Результаты проведенного п ато морфологического исследования, определения содержания гликогена и лигшдов в надпочечниках на различных стадиях болезни позволили (с учетом анализа литературных данных) раскрыть ряд вопросов патогенеза криптоспоридиоза у поросят.

Практическая ценность работы. Проведенная нами расшифровка п ато м о р фол о г и ч е с к и х и гистохимических изменений позволила расширить существующие представления о патогенезе криптоспоридиоза поросят, что имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Проведен клинико-морфологический анализ и определена диагностическая ценность патогистоло! ических изменений.

Белые мыши в возрасте от 1 до 14 суток могут быть рекомендованы для использования в качестве экспериментальной модели при изучении криптоспоридиоза свиней и испытании современных терапевтических препаратов.

Результаты проведенных нами исследований могут быть использованы при подготовке учебной литературы по патологической анатомии, паразитологии и инвазионным болезням сельскохозяйственных животных, а также при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по этим дисциплинам в высших учебных заведениях.

Апробация работы. Основные материалы были доложены, обсуждены и получили положительную оценку на научно-производственной конференции по итогам научно-исследовательских работ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии за 1999 год (Ульяновск, 1999), на XXVII и XXVIII Огаревских чтениях Мордовского госуниверсите-та(Саранск, 1998, 1999), на Региональной научно-практической конференции «Критические технологии в регионах с недостатком природных ресурсов» (Саранск, 1999), расширенном заседании кафедры пат анатом ии, инфекционных и инвазионных болезней животных (протокол № 1 от 4 февраля 2000 г.).

Публикации. Положения диссертационной работы достаточно полно отражены в двух научных статьях и автореферате.

Внедрение результатов исследований. Методы копроло-I ического исследования и п ато морф о л о г и ч е с ко й диагностики к р и и то с н о р и д и о з а свиней, изложенные в диссертационной работе, используются в работе Саранской городской станции по борьбе с болезнями животных. Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении лаборагорно-практических занятий на кафедре патанатомии, инфекционных и инвазионных болезней животных Мордовского государственного университета имени 11. П. Огарева, в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, Ижевской государственной сельскохозяйственной академии, Казанской государственной академии ветеринарной медицины.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из разделов: «Общая характеристика работы», «Обзор литературы», «Собственные исследования», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы», «Практические предложения», «Список использованной литературы». В ней содержится 7 таблиц, 63 рисунка.

Список использованной литературы включает 173 источников, в том числе — 88 иностранных авторов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Одной из причин гастроэнтеритов новорожденных поросят могут быть С. рагушп.

Патогенное действие С. рагушп на слизистую оболочку кишечника определяется развитием всех эндогенных стадий паразита в зоне микроворсинок энтероцитов.

Местные алы ератииные процессы приводят к выраженной воспалительной реакции кишечника, изменениям в паренхиматозных органах, иммунной и эндокринной системах организма.

Заражение 1 - 14-суточных белых мышей С. рагчшп, полученными от больных поросят, приводит к развитию заболевания, близкого по своей п ато м о р ф о л о г и ч е с ко й картине к крии-тоспоридиозу свиней, что может быть использовано при моделировании этой патологии.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

Заражение поросят 1 - 30-суточного возраста взвесью С. рагушп приводит к появлению на 3 — 4-е сутки после заражения клинических признаков в виде диареи, а на 7 - 10-е . сутки прогрессирующего исхудания и обезвоживания организма. Это сопровождается ростом выделения ооцист криптоспоридий с достижением максимума на 8 - 10-е сутки.

2.Течение экспериментального к р и п то с п о р и д и о з а зависит от дозы возбудителя (количества ооцист, взятых для заражения) и возраста животных. Более тяжело заболевание протекает при заражении поросят в первые десять суток после рождения.

3.Предрасполагающим фактором возникновения и клинического проявления к р и п г о с п о р и д и о з а является гипогаммаг-лобулинемия. Заболеваемость поросят диареями криитос-поридиозной этиологии на фоне иммунодефицита была в 2,7 раза чаще и болезнь протекала более тяжело. У переболевших криптоспоридиозом животных состояние приобретенного иммунодефицита усиливалось.

4. Патоморфологические изменения желудочно-кишечного тракта характеризовались катаральным воспалением, а в подвздошной кишке - много ч и с л е н н ы м и кровоизлияниями и изъязвлениями слизистой оболочки.

5. При п ато г и сто л о г и ч е с ко м исследовании органов экспериментально зараженных поросят установили деформацию ворсинок, слизистую дистрофию и разрушения эп и тел и оцитов тонкого отдела кишечника макро-, микрогаметоци-тами и ооцистами. В паренхиматозных органах развивались дистрофические изменения на почве интоксикации и гемо-динамических расстройств. В лимфатических узлах отмечали гиперплазию лимфоидной ткани, десквамацию синусов, в селезенке — склеротические изменения кровеносных сосудов, в легких - признаки альвеолярной эмфиземы с последующим развитием катаральной бронхопневмонии, нарушения крово- и лимфообращения развивальсь в большинстве органов.

6. Электронно-микроскопическое исследование апикальных частей энтероцитов позволило выявить основные стадии развития к р и п то с п о р и д и й. спорозоиты, ши зонты, мерозои-ты, микро- и м а к р о г а м е т о ц и г ы, молодые оо цисты и сформированные тонкостенные и толстостенные ооцисты.

7. Заражение 1 — 14-суточных белых мышей взвесью С. рагушп, полученной от поросят, позволяет воспроизвести у них к р и п го с по р и д и о з. При этом пато морфологически я картина близка к таковой при криптоспоридиозе поросят, что позволяет использовать данную экспериментальную модель для апробации современных препаратов и выяснения вопросов этиопатогенеза болезни.

110

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные нами данные по динамике патоморфологических изменений в органах и тканях при экспериментальном криптоспоридиозе поросят и их зависимости от интенсивности поражения кишечника различными эндогенными стадиями криптоспоридий предлагаем использовать при дифференциальной диагностике протозойных болезней свиней, в научно-исследовательской работе в области протозоологии, а также в учебном процессе при изучении патологической анатомии и паразитологии.

Результаты исследований рекомендуем использовать при переподготовке учебной литературы и руководств по патологической анатомии и паразитологии.

Белых мышей можно использовать в качестве экспериментальной модели к р и п то с п о р и д и о з а.