Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Оптимизация условий лиофилизации M. bovis и их биологические свойства

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЗИНА НАУЧНО-ИССЛВДСОАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.КОВАЛЕНКО

ВСЕСОЮНСЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕШ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В.И.ЛЕНИНА

На правах рукописи

СОСНИЦКИЙ Александр Иванович

ОЛТИШЗУВДЯ УСЛОВИЯ ЛИОШИЗДЩ И.ВОПЗ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВСЙСТГВА

16.00.03 - ветеринарная шкробиология, вирусология, эпизоотология, токология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1991

' / )

1 ..•

Работа выполнена в лабораториях эпизоотологии, диагностики и профилактики туберкулеза и паратуберкулеза и физико-хишческих методов исследований Всесоюзного ордена Ленина научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко.

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук Н.П.Овдиенко

кандидат ветеринарных наук В.А.Горбатов.

Официальные оппоненты:

1. Кузин А.И. - доктор ветеринарных наук, профессор

(Вологодский молочный институт)

2. Устинова Г.И. - кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник (ВИЭВ).

Ведущее учреждение - Всесоюзный научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных (г.Омск).

Защита диссертации состоится /"ОН^О 1991 г.

в /^-£?(9часов на заседании специализированного совета Д 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузыинки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомься в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан " (ЛХг I®9* 14

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

в.Г.Терешков

"ЛСЕча»?

.ЛШ 2

I. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность те*«. Борьба с туберкулезом сельскохозяйственных животных невозможна без всестороннего знания биологических свойств возбудителя болезни. Противоэпизоотические мероприятия в значительной мере осиовиваются на своевременной и дос*. товерной диагностике заболевания, выявлении и удалении из стада зараженных животных (Вишневский П.П., 1937; Поддубский И.В., 1957; Юсковец М.К., 1967; ЩуревскйЯ В.Е., 1982; Кассич Ю.Я., 1964, и Др.).

При изучении биологии возбудителя туберкулеза и патогенетических реакций макроорганизма возникает необходимость в создании коллекщи живых культур жкобактерий, где бы в стабилизированном виде сохранялись биологические свойства изучаема стыъ иэв.

Основным способом поддержания живых культур возбудителя туберкулеза является метод пересевов и хранения на искусственных питательных средах. Общеизвестно изменение вирулентности шко-баятерий туберкулеза при длительных пассажах на питательных средах. •

Лио^илизация является наиболее современным и совершенным способом стабилизации всего комплекса нативных биологических" свойств «мкроорганизмов на длительное время (Харрис Р., 1956; Субботина Ю.А., 1958; Соколов М.М., 1960; Спит 0., 1963; Доли-нов К.Е., Токарик Э.®., 1978; Идельчик М.С., 1984).

В настоящее время недостаточно разработаны условия тофи-лизации культур Н.Ъот1о и на изучена сохраняемость морфологических, тинкториальных, культуральных свойств и вирулентности лиофильновысушенных культур возбудителя туберкулеза бычьего вида.

Изучение этих вопросов особенно актуально дня оценки эффективности новых средств диагностики, специфической профилактики болезни, требующие использование эталонны* штаюлов со стабилизированной вирулентностью для экспериментального воспроизведения туберкулеза у животных.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение биологических свойств лиофильновысушенных М.Ьот1в •и патогенетических реакций м&кроорганизма при различных методах заражения морских свинок и крупного рогатого скота. Для выполнения этой цели перед нами били поставлены следующие задачи:

- изучить морфологические, тинкториальные, культуральные свойства и вирулентность м.Ьот1в штамма ЦВ-1 в сравнении с ттаммакм 8 , 622 и УиПае;

- оптимизировать условия лиофилизации культур возбудителя туберкулеза бычьего вида;

- изучить влияние лиофилизации на морфологические, тинкториальные и культуральные свойства М.Ьоу1«;

- определить оптимальные заражающие дозы лиофилизировашой культуры М.Ьс71в при экспериментальном воспроизведении туберкулеза у мирских свинок и телят.

1.3. Научная новизна. Впервые изучены морфологические, куль-тураж ные свойства п вирулентность ыт&мма ЦВ-1 в сравнении с одашиш 8, 62Г: и Уы11еэ возбудителя туберкулеза бычьего вида,

Экспц имчиталы1г< отработаны и научно обоснованы оишмальни« усЛ'-шп, Лакфшкшции к} ль тур Ц.Ьиуае.

йиервпр иаучени Эиолсч ичгекие < ьойсч'на наживной и лиофилн--> ианьо!» «¿льгуры и.1ю/1* инамма ЦВ-1. Усшноеяеш ¿аттик»: п. нп.исги инЬ-к1|>»:><11.;| V прицосси /,» ini.ii! куиыууи штАькгириП т/~

б(Н'1,> Ч, *»>.!.' "И ВИН«, l-l.pt |1СЛС1>« ЧГит-ГЬ.ШК' ;н(1ахг»..р|$' .пош

лиофилизированной культуры Jl.borla штамма ЦВ-I при эксперт: <ь тальном воспроизведении туберкулеза у морск: свинок и телят.

1.4. Практическая пенность. Полученныеэкспериментальные данные позволили подготовить методические рекомендации "Лисели-зация иякобактерий туберкулеза бычьего вида", предназначенных . для применения в научно-исследовательской работе, а такяе для сохранения штаммов a.bovl« при изготовлении биологических препаратов и в музеях кивнх культур.

1.5. Апробация работы. Материалы диссертации долояены и одобрена на:

- конференции молодых ученых ЕИЗВ (Москва, 1989);

- Ученей Совете ВИЭВ (Носква, 1989);

- межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЗВ (Москва, 1991).

1.6. Публикация. По иате риалам диссертации опубликованы тря научна» статьи я изданы методические рекомендации.

1.7. Объем и структура рдботн. Диссертация изложена на 192 страницах кагаяописного текста и включает: введение, -обзор литература, еатеряалн и методы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список' литература. Работа содержит 26 таблиц. Список использованной литературы включает 334 источника, из них 70 иностранных.

, 2. Собственные исследования 2.1. Материала и методы

Работа выполнена в 1966-1969 гг. в лабораториях эпизоотологии, диагностики и' профилактики туберкулеза и паратуберкулеза; физяко-хнютесних методов исследования и патологической анатомии

а

ВИЭВ; на опытной базе ВИЭЬ о.Лисий.

В работе использовали urravMj M.bovia : ЦВ-I« выделенный к.в.н, В.И.Косенко, * 622, вцпеленный к.в.н. А.М.Кадочкиныы, * 8 и Vallée - референтные, эталонные.

Выращивание культур указанных штадаов микобактерий проводили на картофельной среде Павловского, среде Левенштейна-Йен-сена, безбелковых средах Сотона и ВКЛ. Посевы культивировали в термостате при 37-38°С в течение 4-6 недель.

Из выросшей бакмассы после бактериоскопического контроля чистоты готовили суспензию культуры в сахароэо-желатиновой среде, разливали ее в ампулы или флаконы, замораживали при -37°С не менее 24 часов и сублишровали в течение суток на установке "Лиовак КТ-2" (ФРГ).

После запайки ампул определяли остаточную влажность препаратов ускоренным методом.

Изучение жизнеспособности яиофилизированных адкобактерий туберкулеза проводили путем посевов разных разведений культуры на среду Левенштейна-Йенсена, с последущим подсчетом выросших колоний и расчетом количества жизнеспособных бактериальных клеток в I мг бакмассы по математическим формулам, определенных методикой ВОЗ (Серия технических докладов, 1979).

Культурально-морфологические свойства нативных и лиофильно-высушенных культур изучали на элективных питательных средах. Мазки из выросших культур окрашивали по Циль-Нильсену.

Вирул нтность нативных и лиофильнэвысушеншх культур изучали на iwpci их свинках, кроликах и телятах. Культуры вводили морским свинкам подкожно в области паха, кроликам - внутривенно в краевую вену уха, телятам - внутривённо и алиментарно.

Морских свинок и кроликов исследовали через каждые 30-45

дней туберкулиновой, а телят - симультанной пробой с К/М. С э-временно у телят брали пробы крови для серологических исследований сывороток в РСК с комплексным туберкул'-чым антигеном УНИИЭВ (КГАУШИЭВ).

От павших или убитых лабораторных животных и телят биоматериал исследовали бактериологически и гистологически, согласно "Наставлению по диагностике туберкулеза животных", утвержденного Главным управлением ветеринарии Гоcarpoпрома СССР 25 февраля 1966 г.

Всего исследовали биоматернал от 344 лабораторных животных и 32 телят.

У выделенных культур изучали и описывали свойства по схеме:

- сроки появления первичного роста;

- характеристика колоний - величяна, форна, поверхность, консистенция, цвет, эцульгируекость в физиологическом растворе;

- интенсивность роста - слабый, умеренный, хороший, обильный;

- морфология кпгобактерий;

- окраска по Цяжь-йяяьсену. • • •

Гистологическое исследование биоматера ада от опытных животных проводили совместно с кащшдаташ ветнаук О.В.Якугаевой и В.С.Сугоропка.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Сравнительное изучегае культурально-морфологичесгах свойств и вирулентности различных таймов a.bone

Изучали культуры свежвэцпелейного нташа a.borle ЦВ-I в сравнении с культура*« птаымов 622, 8 и Tall««.

На глицериновом картофеле Павловского исследуемые атаммы давали пышный рост в течение месяца в виде светло-серого плотно-

го, с шероховатой поверхностью, бородавчатого наложения бактериальной массы на ломтике картофеля и светло-серой пленки на поверхности глицериновой воды, формирующейся через 2 недели роста, .сначала тонкой, нежной, превращаясь по мере роста в толстую пет, 'левидчую с бородавчаты»« выростами пленку, подымавдейсл на стенки сосуда.

При осторожном внесении крупных пластов на поверхность жид-крй элективной среды (Сотона, ВКД), пласт не тонет и дает через 4-6 недель сплошной поверхностный рост.

На среде Левенштейна-Йенсена исследуете штамму показали неоднородные ростовые свойства. Штам*ад № 622 и Vallée- проявля-

«м* 1

ли ицпивидуальный аффинитет, а штаммы > 8 и ЦВ-1 постепенно адаптировались к условиям культивирования на яичной среде. При первом пересеве культуры с глицеринового картофеля Павловского или среды Сотона на среду Левенштейна-Йенсена, штат! 8 и ЦВ-I не давали типичного роста, а единичные колонии появлялись только через 2-3 месяца после посева в отдельных пробирках. При дальнейших пассажах происходит адаптация к условиям адаптирования. Рост щташов Vallée и 622 ранее поддерживался не только на среде Павловского, но и среде Левенштейна-Йенсена. При пересеве с яичной на жидкие среды росли очень медленно и формировали поверхностную пленку в течение 3-4 месяцев. Напротив, культуры штам-m -8 адаптировани к жидкой среде и при пересевах в течение 4 недель на жидких средах формировали толстую морщинистую пленку светло-серого ^вета.

При микроскопии шкобактерии всех исследуемых шташов одинаково воспринимали окраску' по Циль-Нильсену и имели сходную морфологическую структуру.

Вирулентность и способность индуцировать гиперчувствитель-

ность замедленного типа изучали на морских свинках и кролик* . Каждым штакмом заразили по 5 морских свинок и по 2 кролика.

Через 30 дней после заражения животных исследовали ППД-ту-беркулином для илекопитащих. Еивотные, зараженные штакыат ЦВ-1, 8 и 622, реагировали интенсивнее» чем зараженные штакмом Talloe..

После учета реакция на туберкулин все животные были убиты.

При вскрытии у морских свинок и кроликов, зараженных штаы-ыаш 8, 622 и ЦВ-I, обнаружили патологоанатокмческие изменения внутренних органов, типичные для туберкулеза. У морских свинок, зараженных птакмоы Tallee , патологоанатоютческие изменения выражены слабее, а у кроликов, зараженных этим ае птамглзм, -внутренние органы оказались без видимых патологических изменевдй.

При бактериологической исследовании патологического материала от зараженных юрских станок п кроликов, во всех случаях пцяеляла возбудителя туберкулеза.

Пра гистологическом исследовании биоматериала животных, за-раяешшх штаммами 8, 622 п ЦВ-I, обнаруяили специфическую клеточную реакцию какроорганизва в годе пролифератов и формирования специфических гранулем, преобладали активно выраженные алъ-теративные изменения, а от животных, зараженных штампом Talle«, выявига вяло протекавший продуктивный процесс.

Тазпш образом, вирулентность H.borls была неодинаковой. Ыикобактёрим штампов 8, 622 и ЦВ-I обладали более выраженной вирулентностью для морских сшнок и кроликов и были высокоактивны в индукции гиперчувствительности замедленного типа (ГЧЗТ), Микобахтерии штамма Tallee оказались менее вирулентными для лабораторных животных и недостаточно активны в индукции ГЗТ. В дальнейшей работе атот шташ микобакториЯ наш не использовался.

Изучение инфекционного'процесса у телят, зараженных a.bovia

У '

штаммами ЦВ—1, 8 и 622, проводим ы» трех группах животных. В опыте использовали 6-7-месячных телят, по 3 головы в группе. Те-, дят заражали внутривенно по I г бактериальной культуры одного из указанных ытьшов.

Об иммунной перестройке организма телят судили по развитию ■ ГЗТ, которую выявляли внутрикожной пробой ППД-туберкулином для ылекопитащих и НАМ,- и ннфекционноцу антителогенезу, определяемому в РСК с КТА УНИИЭВ. Исследования проводили через I, 3 и 6 иес. после заражения. Результаты аллергических исследований телят представлены в таблице I.

Внутрикожные реакции на ПЦД-туберкулин для ылекопитавдих наиболее выражены через ьяэсяц после заражения. В дальнейшем их интенсивность постепенно спивается. Реакции на КЛН непостоянны и вырааены слабее.

Результаты серологических исследований показали, что диагностические титры антител выявляли, в основном, в разведении 1:20.

Через 6 иес. после зарааения телят убили. При послеубойноы осмотре не обнаружили патодогоанатомических изменений. При гистологическом исследовании установит! первичный туберкулезный процесс в легких и лимфатических узлах. Бактериологическим исследованием выделены исходные культуры и.Ьоу!о в 7 из 9 случаев. При биологическом исследовании биоматериала у морских свинок во всех и учаях установлена генерализованная форма туберкулеза.

В другом опыте двух телят (М 8710, 8715) заразили м.Ьот!в штаммом ЦВ-1 внутривенно по 5 г и трех телят ( № 6707, 8714 и 2883) - но 10 г. В первые дни после заражения у телят отмечено повышение температуры на 1,6°С, на третий день появился кашель. При исследовали через 30 дней после зар^ения сицультанной про-

Таблица I

Результаты аддаргичаских исследований толят, зараденшх внутривенно I г

Отешу, }Инвенгар-{

Утолщение кожной складки в мм при исследовании через:

''* шо. после заражения 13 иес. посла заражения !б мес. после заражения ! !_на:_!_на:_!_на:_

для за-, раяекнл}

| ППД-илэх. \ Ш | ППД-млеа. } КМ [ ППД-млчк. ; КАМ

87£5 20 6 5 4 4 8

8750 15 3 9 4 . 3 0

8733 13 5 9 4 3 8

и± 16,0+2,94 4,67+0,83 7,93±1,6б 4,0+0 3,33+0,63 5,93+2,61

8797 4 0 7 0 7 0

8792 4 0 ■ б 2 5 0

6800 5 2 4 0 5 3

Ц± 4,33+0,57 - 5,66*1,41 - 5,66+1,44

8759 5 0 5 . 2 X X

8702 9 2 X X X X

ЦВ-1

622

В

Примечание: ЩД-ылак. - ППД-туберкудин для млекопитащих;

КД - кошлексный аллерген из атипичных «¿икобшггериЯ.

бой животные интенсивнее реагировали на ППД-туберкулин для илек лтавдих, чем на КАЫ. В РСК с КТА УШИЭВ получили положительные показания в титре 1:20. Четыре теленка пали: J? 8707 - через 17 дней, Р 8714 - 28, № 8710 - 33, № 8715 - через 43 дня после заражения. Один теденсн (Jf 2883) был убит через 3 нес. после заражения.

При вскрытии не обнаружили видимых патологоанатошческих изменений. При гистологическом исследовании во всех случаях выявили в легких многочисленные, диффузно расположенные в паренхиме и на поверхности органа узелки. В лимфатических узлах обнаружены обширные участки "ползущих" творожистых некрозов - "лучистый казеоз", выражена аналлазил лиьфоидной ткани; в селезенке -многочисленные участки творожистых некрозов; в печени - диффузно расположенные узелки с казеознш некрозом в центре, окруженные неширокой зоной перифокального воспаления. В препаратах, окг рашенных по Циль-Пильсену, в узелках выявили большое количество микобактерий туберкулеза.

Бактериологическим исследованием во всех случаях вцаелены на среде Левенштейна-Йенсена культуры возбудителя через 4-6 недель культивирования. При биологическом исследовании у морских свинок развился генерализованный туберкулез.при введении им материала от каждого теленка.

Таким образом, внутривенное введение телятам 5 или 10 г бактериальной массы М.bovis штамма ЦВ-I обусловливает развитие (в течение 4-8 недель) туберкулезного сепсиса и гибель животного.

2.2.2. i птимизация условий лиофилизации культур м.bovis штамма ЦВ-1

Для оптимизации условий лиофилизации м.bovis отрабатывали в иксперименте следующие параметры: характер питательной среды

при выращивании культуры, длительность инкубирования в термостатных условиях при'37-38°С, густота бактериальной взвеси, химический состав защитно-суспензионной среды высушивания. Остальные параметра лиофилизации - глубина и длительность замораживания, время сублимации и испарения остаточной влаги, содержание остаточной влажности - оставили без изменений, как в методике лио-^яьной сушки вакщнного штата ЕЦД.

Ыикобактерии туберкулеза бычьего вида штамма ЦВ—I выравдва-ли на элективных питательных средах - Левенштейна-Иенсена, Павловского и ВКЛ при 37-38°С в течение 2, б, 12 и 18 недель.

Бактериальные взвеси в среде высушивания готовили в концентрация 1 мг, 100 мг, 200 мг, 300 мг и 400 мг в I мл.

В качестве сред высушивания использовали физиологический раствор, нop¡íaльнylй сыворотку крупного рогатого скота, обезжиренное молоко, 1,5% раствор хелатины в воде и сахарозо-желатино-вус среду.

Зашраживание проводили в низкотемпературном холодильнике при -35°С в течение 24 чао., а высушивание - в камере сублимационной установки "Лиовак-1Т-2" (ЙТ).

Всего было высушено 240 опытных серий по 5 ампул в каждой серии.

Главным критерием технологической эффективности является выживаемость шкобактерий туберкулеза в конечном продукте лиофилизации (табл.2). Результаты исследований показали, что наиболее технологичным, дапцим до 80^ выживаемости шкобактерий, является высушивание из замороженного состояния в вакууме 4-8-недельных культур шкобактерий туберкулеза бычьего вида, снятых со среды Павловского в концентрации бактериальной взвеси 100-200 мг/мл и суспендированных в сахарозо-желатиновой среде,

Выживаемость при лиофилизации 6-недельной культуры

Таблица 2

(в %)

суспензи-} онные среды ] I мг/мл | 100 мг/мл I | 200 мг/мл 300 мг/мл I ! 400 мг/мл

Л-Й |Павл.| вкл } Л-й |Павл.{ ВКЛ; Л-Я ¡Павл.| ВКЛ Л-Я ¡Павл.1 вкл; Л-Й |Павл.; ВКЛ

Физ. р-р 18 18 17 24 2В 25 25 27 26 24 25 24 21 24 23

15%' сыв. 22 23 24 36 38 39 31 35 31 25 2В 29 24 25 24

Обезжир. молоко 23 24 24 39 39 42 34 38 34 28 29 32 29 28 27

Т% ЖЕЛАШНА 23 23 25 36 07 36 30 31 30 24 24 25 22 24 24

с* 56 58 57 80 82 81 80 81 80 60 63 62 59 61 62

11 +■

28,4+6,96 29,4+7,05 44,8+9,5 40,0+10,1 40,2+10,03 33,8+7,35 31,0+7,13 27,6*9,68 29,2+7,28 43,0+9,6 44,6+9,54 42,4+9,81 32,2+6,99 34,3+7,05 32,4+7,19

Примечание: виз. р-р - физиологический раствор;

С& - сахарозо-желатиновая среда; Л-й - среда Левенштейна-Йенсека; Павл. - среда Павловского.

2.2.3. Изучение инфекционного процесса у морских свинок, заражению: лиофидизированными

культуралм П.bovis

Бактериальную культуру И. bovis штамма ЦВ—I лиофиллзирова-ли в концентрации микробной суспензии I мг/мл, 100 мг/мл, 200 мг/мл, 300 мг/мл и 400 мг/мл в сахарозо-желатиновой среде. Сразу посла лиофилизацш и через 12 мес. после хранения а условиях холодильника при 4°С, реактивированныш в физиологическом растворе указанные концентрациями шкобактерий в дозе по I мл заражали по б морских свинок. Аналогично заразили нативныш K.bovie штамма ЦВ—I в той же дозе и концентрации по б морских свинок. Животных содержали в течение 3-х месяцев. Через месяц после заражения свинок исследовали ППД-тубернулииом для млекопитающих. Все животные реагировали на внутрикожное введение туберкулина. При вскрытии павших ига убитых морских свинок во всех случаях устанопили генерализованный туберкулез. Таким образом установлено, что лио-филизацця не влияет на вирулентность II.bovis и способность их индуцировать гитзрчувствительность замедленного типа. Отмечено, что заражение морских свинок Ц.bovis в дозе ЗС0-400 мг обусловливает интоксикацию и иммунодепрессию при сглаживании патолого-анзтошческнх изменений.

2.2.4. Изучений инфекционного процесса у телят, зараженных внутривенно лиофилизировоннкмк

культура!.« и.bovis

В эксперименте находилось 6 телят 6-7-месячного возраста. Трех телят (К? 8729, 8728 и В726) заразили внутривенно по I г яиофилизированных: и реактивированных в 20,0 мл физиологического раствора U.bovia штамма ЦВ-1. Других: 3-х телят (!?.¥ 872'?, 0724 и 8725) .-заразили внутриэешо пи 5 г аналогичной культуры. Живот-

них содержали в течение 6 мес. В течение 10 дней после заражения у животных измеряли температуру, через I, 3 и б мес. животных исследовали симультанной пробой с KAM и сыворотки крови в РСК с КТА УНИИЭВ. Через 6 мес. телят убили, провели осмотр туш и внутренних органов, биоматериал исследовали бактериологически и гистологически.

В результате комплексных исследований показано, что у телят после заражения происходило повышение температуры на 1,1°С. Из клинических признаков у телят отмечали одышку, кашель, постепенное истощение. При каждом аллергическом исследовании животные реагировали на ППД-туберкулин для млекопитающих. Внутрикожные реакции на К/И отмечали не у всех животных. Их интенсивность была менее выражена, чем на туберкулин. Положительные показания РСК отмечали, в основном, в диагностическом титре - 1:20 (++++). При послеубойном осмотре у телят, зараженных в дозе по I г, не обнаружили видимых патологоанатошческих изменений, а у телят, зараженных.в дозе по 5 г, в паренхиме легких выявили множественные, диффузно расположенные мелкие узелки.

При гистологическом исследовании ¿иоматериала у всех животных выявили первичный.туберкулезный процесс, а бактериологическим исследованием выделены культуры и."Ъот1» через 1,5 - 2 мес. культивирования на среде Левенштейна-Йенсена. У морских свинок, зараженных биоматериалом от калдзого теленка, развился генерализованный туберкулез.

В целом, лиофилизированные культуры и.borle при внутривенном введении оказывают на организм телят такое же биологическое действие, как и нативные.

2.2.5, Изучение инфек^ониого процесса у телят, зараженных алиментарно лиофилизированншм и нативными культурами и.bovis

Изучение проводили на 12 телятах б-7-месячного возраста, разделенных на 4 группы по 3 головы в каждой. Телят заражали на-тивной и лиофилизированной культурами М. bovis штамма ЦВ-I алиментарно с молоком.

1 группу телят (!№ 7461, 0808 , 8809) заразили четыре раза с интервалом 5-7 дней и пятый раз - через 30 дней после последнего заражения, по I г бактериальной массы нотивной культуры

И.bovis . Суммарная доза заражения составила 5 г бпкмасси.

2 группу телят № 8803, 8Q06, 8810) заразили аналогично лиофилизированной культурой M.bovia.

3 группу телят 8804, 0802, 0805) заразили четыре paja с интервалом 5-7 дней и пятый раз - через 30 дней после последнего заражения, по I ыг бактериальной массы иативной культуры U.bovia . Суммарная доза заражения составила 5 мг бакмассы.

4 группу телят ((?№ 8801, 7983, 8807) заразили аналогично 3 группы лиофилизированной культурой Ц,bovis.

Животных содержали в течение 6 мое. и через 1, 3 и 6 мес. исследовали симультанной пробой с KAM, серологически методом РСК с КТА УВШЭВ. Через 6 мес. телят убили, провели осмотр туш и внутренних органов, взятый послеубойный материал исследовали бактериологически и гистологически.

Результаты исследований показали, что у телят после заражений не повышалась температура тела; но проявляли клинических признаков болезни; постоянно реагировали на 1И1Д-туоеркулин для млекопитающих; некоторые телята реагировали и на ¡Ш, но интенсивность внутрикожных реакций была, как правили, слабое, ч-зм на туберкулин. Интенсивность реакций не зависела от величии лара-

жапдей дозы и физического состояния культуры u.bovie (нативная или лиофилиэирована), но снижалась при последующих исследованиях. В РСК. диагностические титры антител устанавливали в разведении 1:20 (++Ч-).

При послеубойном осмотре не выявляли видишх патологоана-тошческих изменений, но гистологическим исследованием в легких и регионарных лимфатических узлах установили участки первичного туберкулезного процесса.

Бактериологическим исследованием биоматериала от убитых телят выпалены культуры M.borie в 7 из 12 случаев. У морских свинок, зараженных биоматериалом телят, во всех случаях развился генерализованный туберкулез.

Таким образом, исход алиментарного заражения в большей степени зависит от кратности введения культуры, а не от дозы и фи- \ зического состояния культуры возбудителя туберкулеза.

3. Выводы

Г. Оптимизация условий лиофилизации культур *.Ъот1в включает использование 4-6-недельной бактериальной суспензии в концентрации 100 мг/мл, применение сахарозо-желатиновой среды высушивания, замораживание в течение 48 часов и последующую сублимацию в течение 24 часов.

2. Микобактерии штамма ЦВ-I, как и штатов в и 622, обладают типичными для И.borie морфологическим!, тинкториальтам, культуралькши овойствами, вирулентны и активны в индукции гиперчувствительности замедленного типа. Микобактерии штамма таи«« слабо вирулентны и менее активны в индукции ГЗТ.

3. Лиофилизация культуры К.Ъот1а штампа ЦВ-I и их последующее хранение при 4-6°С не изменяет морфологические, тинктори-

альные, культуральные свойства и вирулентность ьикобактерий (срок наблюдения 12 мес.).

4. При экспериментальном воспроизведении туберкулеза у морских свинок оптимальной заражающей дозой лиофилизированной культуры U.boTia штамма ЦВ-I при подкожном введении является I мг

. бактериальной массы. Доза 100 мг вызывает аналогичные патолого-анатомческие изменения, а дозы 300-400 мг обусловливавт интоксикацию и иимунодепрессию при сглаживании патологоанатомических изменений.

5. При внутривенном заражении телят к.bovis штамма ЦВ-I установлена зависимость тяжести инфекционного процесса от дозы культуры. При введении I г бактериальной массы в течение 6 мес. развивается первичный туберкулезный процесс в легких и лимфатических узлах, а введение 5 или 10 г обусловливает развитие (в течение 4-8 недель) туберкулезного сепсиса и гибель животного. При алиментарном заражении телят такая зависимость не проявлялась.

6. Исход алиментарного заражения в большей степени зависит от кратности введения культуры возбудителя. При пятикратном заражении телят лиофилизированными и нативными культурами М.bovis штамма ЦВ-I в разовой дозе I г в течение б мес. развивается первичный туберкулезный процесс в легких и регионарных лимфатических узлах, характеризующийся отсутствием выраженных патологоана-тонических изменений и выявляемый гистологическим и бактериологическим исследованиями.

7. У зараженных U.bovis телят -внутрикожшэ реакции на Г1Г1Д-туберкулин для млекопитающих наиболее выражены череп месяц после заражения; в дальнейшем их интенсивность постепенно снижается. Реакции на KAM в симультанной пробе непостоянны и выражены слабео.

8. Оптимальной заражающей дозой лиофилизированной культуры И.Ьот1в штамма ЦВ-1 при экспериментальном еоепроиэведении туберкулеза у теллт является I г бактериальной массы при внутривенном введении.

4. Практические предложения

1. Лиофилиэацив культур микобактерий туберкулеза рекомендуем применять в целях:

- сохранения штаммов микобактерий туберкулеза для производственных целей при изготовлении биологических препаратов и в музеях живьк культур;

- консервации эталонных штаммов с известным* стабилизированным) вирулентными свойствами.

2. При изыскании новых средств диагностики, специфической профилактики и оценке их эффективности использовать экспериментальное воспроизведение туберкулеза на морских свинках и телятах, применяя бактериальную массу *.Ъотг1» штамма ЦВ-1.

3. Составлены методические рекомендации "Лиофмлизация м<хо-бактерий.туберкулеза бычьего вида", рассмотренные и одобренные методической комиссией ВИЭВ 7 нюня N89 г., протокол » 8.

5. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сосницкий А.И. Адаптация кужътур Я»Ъот1а к питательным. средам/ТБюлл.ВДЭВ. Вып.64. 1987. С.43-46.

2. Сосницкйй А.И. Влияние желатиною! суспензиошю-протек-тивной среды на биологические свойства И.Ъот!» //Актуальные проблемы туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйетвект« животных: Сб.науч.тр./ВАСХНИЛ. Сиб.отд.ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1989.

С.71-74'.