Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Микропаразитоценозы при ассоциативных инфекционных болезнях телят

На правах рукописи

ЛОБАНОВА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

МИКРОПАРАЗИТОЦЕНОЗЫ ПРИ АССОЦИАТИВНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЯХ ТЕЛЯТ

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК 2004

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и инфекционных болезней животных института ветеринарной медицины Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет».

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук,

профессор Красиков Александр Пантелеевич

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Новицкий Алексей Алексеевич

доктор ветеринарных наук, профессор Шкиль Николай Алексеевич

Ведущее учреждение:

ФГОУ ВПО Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана

Защита диссертации состоится 23 ноября 2004г в 12 30 часов на заседании диссертационного совета Д 220.050.03 при ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» (644122, г. Омск-122, ул. Октябрьская, 92, тел/факс 24-15-35; 25-05-49).

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке института ветеринарной медицины ОмГАУ.

Автореферат разослан 23 октября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доцент Н. П. Жабин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На современном этапе развития агропромышленного комплекса перед работниками ветеринарной службы ставятся ответственные задачи - а именно профилактика и борьба с болезнями инфекционной этиологии и тем самым обеспечение выпуска высококачественной продукции, безопасной в санитарном отношении. Среди множества инфекционных болезней, которыми поражаются сельскохозяйственные животные, особое место занимают болезни молодняка, многие из которых до настоящего времени изучены недостаточно (G.H.Woode, 1982; D.R. Snodgrass et я1., 1984; H.H Крюков с соавт., 1984).

Большую опасность для животноводства представляют так называемые ассоциативные или смешанные инфекции, которые в настоящее время составляют большую часть среди болезней инфекционной природы. Смешанные инфекции — явление постоянное и установление другого заболевания следует рассматривать как естественную ассоциацию с предшествующим паразитоносительством с учетом возможного его обострения (Д.И. Панасюк, 1984; И.Д. Колесни-ченко и В.П. Иванов, 1987, А.П. Маркевич и В.М. Апатенко, 1995; В.Ф. Никитин, 1997).

Факт обилия паразитирующих форм показывает высокую степень вероятности сочетания нескольких паразитов в одном макроорганизме. Эта вероятность возрастает в свете новых данных о доступности макроорганизма для проникновения различных микробов, которые попав в организм не всегда обуславливают возникновение заболевания, но они могут включаться в состав паразитоценоза. (Смирнов В.В., 1994, Апатенко В.М., 1997).

В некоторых хозяйствах Омской области в последние годы гибнет до 60 - 70% молодняка крупного рогатого скота. При этом, по данным научных сотрудников ИВМ ОмГАУ и ВНИИБТЖ, основными ассоциантами являются микоплазмы, хламидии, пастереллы, кло-стридии, грибы, условно-патогенные энтеробактерии, вирусы инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, парво- и коронавирусы и, возможно, другие, пока не диагностируемые микроорганизмы (Красиков А.П. с соавт., 1998, Петрова М.И. с соавт., 2000).

Исследования микропаразитоценозов при ассоциативных инфекциях должны носить комплексный, всесторонний анализирующе-объясняющий характер с использованием-еовременных_методик со

ответствующих профилей, так как поверхностные исследования, фиксирующие лишь отклонения в клиническом и патоморфологиче-ском проявлении, не дают полной информации о заболевании (В.М. Апатенко, 1985).

Разработка новых методов диагностики, профилактики и борьбы с ассоциативными инфекциями сельскохозяйственных животных и зооантропонозными болезнями будет способствовать повышению сохранности поголовья скота, получению дополнительной продукции животного происхождения, а также позволит снизить риск заболеваемости среди людей.

Цель и задачи исследований: изучить микропаразитоценозы при ассоциативных инфекционных болезнях телят.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Определить роль патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и их ассоциаций при спонтанных инфекционных болезнях у молодняка КРС в хозяйствах Омской области.

• Изучить основные биологические свойства, устойчивость к химиотерапевтическим средствам микроорганизмов, выделенных из патологического материала от телят, а также характер их взаимоотношений внутри бактериальной ассоциации.

• Установить возможность использования серологических тестов РПИФ и РНИФ для индикации и идентификации микроорганизмов и их антигенов при ассоциативных инфекционных болезнях телят.

Научная новизна работы. Установлено, что в хозяйствах Омской области в структуре инфекционных болезней молодняка основное место принадлежит ассоциативным инфекциям респираторного и желудочно-кишечного тракта.

Изучены микропаразитоценозы у спонтанно инфицированных телят. В экспериментальных условиях in vitro и in vivo выявлен си-нергистический и антагонистический характер взаимоотношений между некоторыми сочленами ассоциаций микроорганизмов, участвующих в инфекционном процессе.

Предложены антигены и антитела для экспресс-метода диагностики ассоциативных инфекционных болезней с помощью прямого и непрямого методов РИФ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации дополняют концепцию об искусственной регул я-

ции паразито-хозяинных отношений, а также вносят определенный вклад в развитие науки паразитоценологии об ассоциативных инфекционных процессах. Результаты исследований являются основой для дальнейшего детального изучения микропаразитоценозов отдельных биотопов (систем пищеварения, дыхания, урогенитального тракта и т.д.).

Применение разработанных методов диагностики позволит ветеринарным специалистам иметь развернутый диагноз и разрабатывать меры борьбы с учетом всех эпизоотически значимых сочленов ассоциации, участвующих в инфекционном процессе.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ОмГАУ 1998 -2001гг. (Омск), «Актуальные проблемы инфекционных, паразитарных и незаразных болезней домашних животных и меры борьбы с ними» (Омск, 1998г), учредительной конференции международной ассоциации паразитоценологов (Витебск, 1999г), Межрегиональной научно-практической конференции «Роль инноваций в развитии регионов» в рамках промышленно-инновационного форума «Пром-ТЕХЭКСПО-99» «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных» (Омск, 1999г), «Вклад ученых и специалистов в развитие животноводства и ветеринарии» (Омск, 2001г.); межрегиональной научно-практической конференции «Эпизоотология, патология и ве-теринарно-санитарные мероприятия при инфекционных болезнях животных» (Омск, 2004г, СО РАСХН - ВНИИБТЖ).

Внедрение результатов исследований. Результаты научных исследований использованы при подготовке методических рекомендаций: «Диагностика микропаразитоценозов при ассоциативных инфекционных болезнях телят» (утверждены Ученым Советом ИВМ ОмГАУ, протокол № 1 от 29.09.2004г и секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Министерства сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 8.10.2004г, протокол № 5).

Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии и микробиологии, вирусологии и иммунологии Института ветеринарной медицины и Института повышения квалификации руководителей и специалистов АПК ОмГАУ, а также в курсе лекций Тюменского института переподготовки кадров агробизнеса.

Основныеположения,выносимые назащиту:

1. Роль патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и их различных сочетаний в этиологии и распространении ассоциативных инфекционных болезней у телят в хозяйствах Омской области.

2. Основные биологические свойства, устойчивость к химио-терапевтическим препаратам, характер взаимоотношений внутри бактериальных ассоциаций, выделенных от больных телят.

3. Применение предложенных антигенов и антител для серологических экспресс-методов (РПИФ и РНИФ) диагностики для индикации и идентификации микроорганизмов и их антигенов при ассоциативных инфекционных болезнях телят. Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей и методические рекомендации «Диагностика микропаразитоценозов при ассоциативных инфекционных болезнях телят».

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 16 рисунками. Список литературы включает в себя 143 источника, из них 32 зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы иметоды

Тема диссертационной работы является самостоятельным разделом комплексной государственной программы «Профилактика (диагностика) и меры борьбы с ассоциативными инфекционными и инвазионными болезнями животных и птиц» (№ государственной регистрации 01.2.001100602).

Объектом исследований являлись телята с клиническим признаками поражения респираторного и желудочно-кишечного тракта из различных хозяйств Омской области, неблагополучных по инфекционным болезням молодняка.

Из общих методов исследования использовали осмотр, пальпацию, термометрию, подсчет пульса и количества дыхательных движений.

Для посмертных исследований использовали патологический материал, полученный от павших и вынужденно убитых животных. Отбор патологического материала проводили согласно общепринятым методикам.

В лабораторных опытах использовали морских свинок, кроликов и культуры микроорганизмов, выделенные из патологического материала.

Изучение морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств выделенных микроорганизмов осуществляли согласно общепринятым в бактериологической практике методикам. Микроскопирование проводили при помощи светового микроскопа «Ломо» (х 900).

Серологическую типизацию микроорганизмов проводили агглютинирующими люминесцентными сальмонеллезными сыворотками (типов А, В, D) в реакции прямой иммуннофлуоресценции (РПИФ) и эшерихиозными монорецепторными сыворотками энтеро-токсигенных Е. coli (K-88, K-99, A-20, F-41, 987P) в реакции непрямой иммуннофлуоресценции (РНИФ).

Чувствительность выделенных культур микроорганизмов к хи-миотерапевтическим средствам изучали дискодиффузионным методом.

Вирулентные свойства выделенных культур, а также характер взаимоотношений микроорганизмов в ассоциации определяли в двух опытах на морских свинках, которым внутрибрюшинно вводили по 2 мл взвеси суточной культуры микроорганизмов в концентрации 1,0x109 м.т./мл и 2,0x109 м.т./мл. Животным контрольной (интактной) группы вводили по 2 мл физиологического раствора. Для проведения опытов сформировали 32 группы животных по три головы в каждой. Наблюдение проводили в течение 30 дней. Животных, оставшихся в живых, по истечении срока наблюдения девитализировали с помощью эфира.

Изучение межвидовых взаимосвязей у выделенных микроорганизмов осуществляли на плотной питательной среде методом перпендикулярных штрихов и методом внесения на газонную культуру микроорганизмов культуры предполагаемых антагонистов. В случае если среди испытуемых микроорганизмов имеется штамм-антагонист, то на границе между посевами должен отсутствовать рост микробов. Зона задержки роста может быть различной, но при выра-

женном антагонистическом действии она может достигать величины 20 мм.

Для прижизненной диагностики ассоциативных инфекционных болезней органов дыхания и пищеварения от больных телят брали пробы биоматериала из бронхов и легких методом бронхоальвеоляр-ного лаважа и соскобы со слизистой прямой кишки для исследования в РИФ.

Пробы патологического материала, обработанные антикроличьей люминесцентной сывороткой, просматривали под люминесцентным микроскопом ЛЮМ Р-8 при увеличении в 900 раз.

Изучение возможности использования РИФ для диагностики ассоциативных инфекционных болезней телят проводили с помощью стандартных диагностических агглютинирующих антигенов и сывороток и сывороток, полученных нами после гипериммунизации кроликов.

Статистическую обработку полученных данных проводили на ПК с помощью программы Microsoft Excel 97.

Отдельные исследования выполнены совместно с доцентом кафедры патологической анатомии животных ИВМ ОмГАУ Гичевым Ю.М. и на кафедре микробиологии и вирусологии ИВМ ОмГАУ (зав. каф., д.в.н., проф. Плешакова В.И.).

РЕЗУЛЬТАТЫИССЛЕДОВАНИЙ

Значение микроорганизмов и их ассоциаций в этиологии ассоциативных инфекционных болезней телят

Для изучения распространения ассоциативных инфекций среди молодняка крупного рогатого скота в Омской области провели оценку эпизоотической ситуации по инфекционным болезням в хозяйствах, в которых падеж молодняка по данным отчетности Главного управления ветеринарии Омской области составил более 50% от падежа крупного рогатого скота. Наибольшим этот показатель был в ЗАО «Звонаревкутское» Азовского района - 95,2%, ЗАО «Новоазовское» Азовского района - 84,2%, ФГПУ племучхозе «Камышовский» Любинского района - 88,3%, СПК «Восход» Горьковского района -86,1%.

В отдельных хозяйствах области в 2000-2002гг. падеж молодня-

ка составил 100% от всего количества павшего крупного рогатого скота. При этом в хозяйствах Азовского района этот показатель оставался на данном уровне в течение ряда лет, а за период 2000-2003 гг. в среднем он составил 98,4%. В ЗАО «Новоазовское» и ЗАО «Звона-ревкутское» одноименного района падеж молодняка достигал 89,7% от количества павшего скота.

С целью определения микробного пейзажа было исследовано 467 проб биоматериала от павших и вынужденно убитых, а также от больных респираторными и желудочно-кишечными инфекциями телят в возрасте от двух дней до семи месяцев.

В результате проведенного бактериологического исследования патологического материала от телят микроорганизмы были выделены в виде ассоциаций в 3,1 раза чаще, чем в монокультурах (табл. 1).

Таблица 1

Частота выделения микроорганизмов от телят в хозяйствах Омской

области

ХОЗЯЙСТВО Выделено культур | микроорганизмов

В монокультурах В виде ассоциаций

1 АО «Береговое» 16 83

2 АО «Великорусское» 19 102

3 АО «Заря» 18 30

4 АОЗТ «Цветочное» 35 69

5 ЗАО «Любимовское» 15 29

6 ЗАО «Новоазовское» 16 69

7 «Им. Розы Люксембург» 10 49

8 к/х «им. Карла Маркса» 6 33

9 ТОО «Паутовское» 13 42

10 УОХ «Камышловское» 23 93

всего 171 599

При ассоциативных инфекционных болезнях телят наиболее часто выделяли Е. coli - 56 монокультур и 156 культур в ассоциации (12% и 33,4% соответственно). Наибольшую разницу между выделением в монокультуре и в виде ассоциаций регистрировали у микроорганизмов родов Proteus - 17 (3,7%) в монокультуре и 102 (21,9%) в ассоциации и у Citrobacter семь (1,5%) и 81 (17,3%) соответственно. Другие микроорганизмы также чаще выделяли в виде ассоциаций, за

исключением представителей рода Pasteurella — в монокультурах их выделили семь (1,5%), а виде ассоциаций - пять (1%) культур (табл. 2).

Таблица 2

Количественное соотношение культур микроорганизмов, выделенных при смешанных инфекциях телят

микроорганизмы В монокультуре В ассоциациях

количество % количество %

Е. coli 56 12 156 33,4

Salmonella sp. 46 9,9 118 25,3

Streptococcus sp. 20 4,3 44 9,4

Proteus sp. 17 3,7 102 21,9

Klebsiella sp. 12 2,6 42 9

Staphylococcus sp. 8 1,7 33 7,0

Citrobacter sp. 7 1,5 81 17,3

Pasteurella sp. 7 1,5 5 1

Enterobacter sp. 6 1,3 27 5,8

Pseudomonas sp. з 0,6 8 1,7

Наиболее часто от телят изолировали ассоциацию Е. coli+Salmonella+Proteus - 30 (6,7%) случаев от всех выделенных ассоциаций микроорганизмов.

В 23 (5,3%) случаев выделяли ассоциацию Е. coli+Salmonella. Из монокультур чаще других изолировали Е. coli - 56 (12,8%) случаев индикации.

Проведенные исследования показали, что состав бактериальных ассоциаций, выделенных из респираторного и желудочно-кишечного трактов идентичен, но из желудочно-кишечного тракта чаще изолировали ассоциации энтеробактерий, а из респираторного - ассоциации, состоящие из кокков, пастерелл и синегнойной палочки.

Устойчивость выделенныхкультурмикроорганизмовкхи-миотерапевтическим препаратам

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что практически все выделенные культуры микроорганизмов чувствительны к спектаму и цефаперазону. Большинство энтеробактерий

были высокочувствительны к левотетросульфину и левомицетину. В то же время представители родов Salmonella, Klebsiella и Proteus в 40-60% случаев были устойчивы к действию этих препаратов.

Стрептококки и стафилококки в 90% случаев имели высокую чувствительность к гентамицину, офлоксацину, левотетрасульфину и спектаму, а к мономицину и линкомицину проявили резистентность.

Пастереллы проявили чувствительность к ветофлоку, спектаму и цефазолину и в 30 - 60% случаев к остальным антибактериальным веществам.

Псевдомоны обладали устойчивостью к стрептомицину, эритромицину, мономицину, левомицетину, гентамицину, канамицину и чувствительностью к ветофлоку, левотетрасульфину, спектаму, цефа-золину и цефаперазону.

Изучение межвидового взаимодействия выделенных микроорганизмов в опытах in vitro

Для выяснения типа взаимоотношений между микроорганизмами в условиях ассоциаций провели ряд опытов на плотных питательных средах.

В качестве испытуемых использовали культуры, наиболее часто выделяемые из патологического материала в виде ассоциаций.

На чашке Петри в центр газонной культуры Е. coli нанесли одну каплю взвеси культуры S. dublin. Через 24 часа культивирования по поверхности среды наблюдали сплошной рост микроорганизмов, в центре чашки обнаруживался рост второй культуры. Зона просветления на границе посевов отсутствовала. Аналогичные результаты получены при культивировании Е. coli совместно с P. aeruginosa, E. coli и К. pneumoniae.

При культивировании культуры Proteus mirabilis на газонной культуре S. dublin через 24 часа инкубирования отметили сплошной, роящийся рост протея по поверхности среды. При бактериологическом исследовании выросших культур в посевах преобладала культура Proteus mirabilis.

Исходя из того, что в опыте с газонными культурами явного антагонизма между микроорганизмами не выявили, провели опыт с применением метода перпендикулярных штрихов. По диаметру чашки Петри нанесли культуру Е. coli, перпендикулярно к ней культуры

S. dublin, P. aeruginosa и К. pneumoniae. Результаты исследования показали, что микроорганизмы не оказывали влияния на ростовые качества друг друга, выраженного антагонистического действия не наблюдали.

Изучение патогенности некоторых возбудителей инфекционных болезней и их ассоциаций, выделенных из патологического материала от телят

Для изучения патогенности выделенных культур и выяснения характера поведения микроорганизмов в ассоциации провели два опыта по моделированию моно- и ассоциативной инфекционной болезни на морских свинках.

В первом опыте животных заразили монокультурами выделенных микроорганизмов. В ходе опыта установили, что все выделенные культуры обладали патогенностью для морских свинок. Культуры Е. coli, S. dublin, К. pneumoniae в концентрации 2 млрд.м.тУмл вызвали 100% летальность подопытных животных, а культуры Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis и Streptococcus pneumoniae- у 66,7% животных.

Во втором опыте морских свинок заразили различными ассоциациями микроорганизмов. Животным первой группы внутрибрю-шинно ввели смесь культур Е. coli (K-88) и S. dublin в концентрации 2,0 млрд.м.тУмл, второй группы - эту же смесь культур в концентрации 1,0 млрд.м.т./мл. В обеих группах зарегистрировали гибель 100% животных в течение трех суток.

Животных третьей и четвертой групп заразили взвесью культур Е. coli и P. mirabilis в концентрации 1 млрд.м.т./мл и 2 млрд.м.т/мл соответственно. В третьей группе погибло 66,7%, а в четвертой 100% подопытных животных.

Заражение морских свинок смесью Е. coli, S. dublin и P. mirabilis в концентрациях 1 млрд.м.тУмл и 2млрд.м.т./мл вызвало 100% гибель животных в течение четырех суток.

Животные, зараженные взвесью культур К. pneumoniae и P. mirabilis в концентрации 2,0 млрд.м.тУмл, погибли через восемь дней после заражения, а в концентрации 1,0 млрд.м.т./мл - в течение 14 дней после заражения. В группе морских свинок, зараженных смесью культур S. pneumoniae и S. aureus в концентрации 2,0 млрд. м.т./мл на шестой день после заражения погибло одно животное и два - в тече-

ние 10 суток. При заражении животных смесью вышеназванных культур в концентрации 1,0 млрд.м.т./мл гибель животных не регистрировали.

Морские свинки, зараженные взвесью культур S. pneumoniae, S. aureus и P. aeruginosa в концентрации 2,0 млрд.м.т. /мл погибли в течение 13 дней после заражения. Из группы животных, зараженных взвесью данных культур в концентрации 1,0 млрд.м.т./мл, на 10 день после заражения пало одно животное.

При заражении свинок ассоциацией культур S. pneumoniae, E.coli и К. pneumoniae в концентрации 2,0 млрд.м.т./мл и 1,0 млрд.м.т./мл зарегистрировали 100% гибель животных обеих групп.

Заражение морских свинок взвесью культур P. mirabilis и S. dublin в концентрации 2,0 млрд.м.т./мл вызвало гибель 100% животных на четвертый-шестой день после заражения. При заражении взвесью культур в концентрации 1,0 млрд.м.т./мл на 15 день после заражения погибло одно животное.

Животные, зараженные взвесью культур К. pneumoniae, P. aeruginosa, S. pneumoniae, S. aureus, P. mirabilis в концентрации 1,0 млрд.м.т./мл и 2,0 млрд.м.т./мл, погибли в течение трех суток после заражения.

Патологоанатомическая картина при вскрытии павших животных в целом была схожа и характеризовалась мелкими кровоизлияниями в селезенке, почках, под легочной плеврой, на эндокарде, увеличением печени с множественными некротическими участками, острым расширением сердца, увеличением селезенки, кровоизлияниями в кишечнике, подкожной клетчатке и иногда в стенке мочевого • пузыря.

Результаты проведенных опытов свидетельствуют о том, что при заражении лабораторных животных ассоциациями микроорганизмов в концентрации 2 млрд.м.т./мл летальность выше, чем при заражении монокультурами. Однако при заражении животных ассоциацией культур S. pneumoniae и S. aureus в концентрации 2 млрд.м.т./мл гибель животных не регистрировали, в то время как при заражении культурой S. pneumoniae погибло одно животное. Концентрация взвеси микроорганизмов в 2 млрд.м.т./мл вызвала летальность 66,7% лабораторных животных. Такая же летальность определена при заражении монокультурами этих возбудителей.

При заражении лабораторных животных культурой S. dublin в концентрации 1 млрд.м.т./мл летальность составила 66,7%, а культу-

рой Р. mirabilis - 0%, в то время как заражение ассоциацией этих культур вызвало гибель 33,3%-

Применение серологических экспресс-методов диагностики для индикации и идентификации микроорганизмов при ассоциативных инфекционных болезнях телят

Из 212 выделенных культур эшерихий, чаще всего изолировали штаммы Ecoli с адгезивными антигенами К-88, К-99 и 987-Р, реже -с антигеном А-20 и F-41 (рис. 1.).

К-88 К-99 987-Р А-20 F-41

адгезивные антигены

Рис. 1. Антигенная структура Е. coli, выделенных из биоматериала от больных и павших телят.

В большинстве случаев из патологического или нативного материала одновременно изолировали несколько адгезивных антигенов Е. coli. В 15% случаев культуры Е. coli выделяли только с адгезивным антигеном F-41, а с антигеном К-88 чаще в сочетании с другими антигенами. Сочетание в пробе биоматериала одновременно пяти адгезивных антигенов K-88+K-99+987P+F-41+A-20 зарегистрировано в 5% случаев, сочетание двух антигенов - 987Р и А-20 в 25% случаев. Столько же приходится на одновременное сочетание штаммов К-88 и К-99. В 10% случаев отмечено совместное сочетание антигенов К-88+987P+F-41 и в 5% случаев-K-88+K-99+F-41 (рис.2).

□ 987Р+А-20

□ К-88+99

□ F-41

DK-88+987P+F-41 В K-88+K-99+987p+F-41+A-20 О K-88+K-99+F-20 Ш К-88+А-20

□ 987Р ■ К-99

Рис.2 Сочетания адгезивных антигенов Е. coli, выделенных из биоматериала от телят.

Чаще всего из биологического материала от больных и павших телят изолировали культуры Salmonella типа D - 90% случаев от всех выделенных культур. На культуры сальмонелл типа А и типа В пришлось по 5% случаев индикации.

Для изучения возможности применения экспресс-методов диагностики ассоциативных инфекционных болезней телят параллельно с бактериологическими исследованиями проводили РИФ в прямом и непрямом вариантах.

Для постановки РИФ были получены диагностические сыворотки. Для этого провели гипериммунизацию кроликов выделенными от телят культурами микроорганизмов и вакцинами. Кроликов иммунизировали культурами S pneumoniae и S aureus в различных дозах 4-х кратно с интервалом 3 дня, а также вакциной против «Диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят», «Эмульсин - вакциной против хламидиоза КРС из штамма К-8-К» и сухой живой вакциной ВИЭВ против «ИРТ-ПВ». Иммунизацию осуществляли 3-х кратно с интервалом 3 дня, четвертый раз - через 20 дней. С каждым последующим введением дозу антигена постепенно увеличивали.

Через 7-10 дней после последнего введения антигенов осуществляли взятие крови для приготовления агглютинирующих сывороток.

Стрептококковая антисыворотка, полученная путем гипериммунизации кроликов стрептококками, выделенными от павших и больных телят, в титре 1/5 давала перекрестную реакцию со стафилококками и диплококками, а в титрах 1/10, 1/20 и 1/320 была строго специфична к стрептококкам Наибольшей активностью в РНИФ обладали стафилококковая и стрептококковая сыворотки, которые агглюти-

нировали гомологичные антигены в титре 1:640 и 1:320 соответственно. Диплококковая, хламидиозная и ИРТ-сыворотки обладали достаточной агглютинирующей активностью в разведениях 1:160 и 1:40 соответственно.

Таким образом, можно сделать заключение о том, что антисыворотки, полученные при гипериммунизации кроликов, обладают строгой специфичностью к гомологичным возбудителям в титре 1:10 и выше.

При сравнении бактериологического метода и РИФ в большинстве случаев данные РИФ были коррелятивными с данными бактериологического исследования, а в ряде случаев этот метод оказался даже более чувствительным Кроме этого, в РИФ получены положительные результаты при диагностике вирусных инфекций. Так, при исследовании 158 проб биоматериала на хламидиоз положительный результат получен в 48 пробах, при исследовании на ИРТ - в 41 пробах, на ПГ-3 в четырех пробах.

ВЫВОДЫ

1. Инфекционные болезни телят ассоциативной этиологии широко распространены в хозяйствах Омской области. Основными сочленами бактериальных ассоциаций являются Е. coli, Salmonella sp., Streptococcus sp., Proteus sp., Klebsiella sp., Staphylococcus sp., Citrobacter sp., Pasteurella sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp. В ассоциации микроорганизмы выделяли в 3,1 раза чаще, чем в монокультуре. Наиболее часто среди ассоциантов изолировали Е. coli-33,4%, Salmonella sp. - 25,3%, Proteus sp. - 21,9% и Citrobacter sp. - 17,3%

2. Из 212 выделенных культур Е. coli преобладали эшерихии с адгезивным антигеном К-88 - 50%, К-99 и 987Р- 45%, на долю А-20 приходилось 30% и на F-41 - 25% микроорганизмов. От двух до пяти адгезивных антигенов Е. coli выявляли в 5-25% случаев, с антигеном F-41 - в 15% и в 5% - с антигенами 987Р и К-99.

Из 164 выделенных культур рода Salmonella 90% возбудителей отнесены к типу D, по 5% отнесены к типам А и В.

3. Все выделенные культуры микроорганизмов обладали патоген-ностью для лабораторных животных, при этом их вирулентность варьировала от 33,3% до 100% в зависимости от дозы и вида возбудителя.

4. Из химиотерапевтических препаратов наибольшую чувствительность микроорганизмы имели к цефоперазону, спектаму и ве-тофлоку.

5. Установлено явление синергизма при моделировании ассоциативного инфекционного процесса на морских свинках между Е. coli и S. dublin, выраженное в увеличении летальности на 33,3% в сравнении с моноинфицированием. При заражении морских свинок ассоциацией микроорганизмов P. mirabilis и К. pneumoniae в концентрации 2 млрд.м.т./мл летальность увеличилась на 100% по сравнению с заражением их монокультурами. Между S. aureus и P. mirabilis установлено явление антагонизма, которое привело к снижению летальности у подопытных животных на 33,3% по сравнению с моноинфицированием. В то же время в опытах in vitro при совместном посеве культур на чашках Петри явного антагонизма не наблюдали.

6. Серологический экспресс-метод диагностики (РПИФ и РНИФ) по простоте и скорости постановки диагноза (15-20 мин в РПИФ и 60 мин для РНИФ на одну пробу), а также возможности прижизненной диагностики и изучения микропаразитоценозов превосходит бактериологический метод, для диагностики вирусных болезней РИФ является одним из перспективных методов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработаны методические рекомендации «Диагностика микропаразитоценозов при ассоциативных инфекционных болезнях телят», утверждены на заседании секции животноводства Центра научного обеспечения АПК Министерства сельского хозяйства и продовольствия Омской области, протокол №5 от 8.10.2004г.

2. Материалы диссертации могут быть использованы:

-в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-

практических занятий по микробиологии, эпизоотологии; -в научно-исследовательских учреждениях ветеринарной медицины при решении вопросов диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней телят.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лобанова, Н.В. Паразитоценозы при микст-инфекциях телят / Н.В. Лобанова, А.П. Красиков // Актуальные проблемы инфекционных, паразитарных и незаразных болезней домашних животных и меры борьбы с ними : материалы юбил. науч.-произв. конф. сотр. и аспир. ИВМ ОмГАУ. - Омск, 1998. - С.205-209.

2. Красиков, А.П. Изучение микробного пейзажа в патологическом материале от павших телят в хозяйствах Омской области с различной эпизоотической ситуацией по инфекционным болезням /

A.П. Красиков, Н.В. Лобанова : тез. докл. Учредит, конф. меж-дунар. ассоциации паразитоценологов. - Витебск, 1999. - С . 198.

3. Проблема ассоциативных инфекций телят в хозяйствах Омской области / А.П. Красиков, О.Н. Иванова, Н.В. Лобанова и др.// Диагностика, лечение и профилактика болезней животных : сб. науч. тр.ИВМ ОмГАУ. - Омск, 1999. - С.59-63.

4. Красиков, А.П. Профилактика и меры борьбы с ассоциативными инфекционными и инвазионными болезнями животных / А.П. Красиков, Н.В. Лобанова // сб. реф. НИР и ОКР : отчет о НИР. -Сельское и лесное хозяйство, 2001. - №5. - Серия 25. - С. 59.

5. Лобанова, Н.В. Этиологическая структура инфекционных болезней молодняка в хозяйствах Омской области / Н.В. Лобанова,

B.Н. Барановский // Вклад ученых и специалистов в развитие животноводства и ветеринарии : материалы науч. конф. ППС и аспирантов ИВМ ОмГАУ. - Омск, 2001. - С. 57-59

6. Лобанова, Н.В. Моделирование ассоциативных инфекционных процессов / Н.В. Лобанова, В.Э. Малошевич // Эпизоотология, патология и ветеринарно-санитарные мероприятия при инфекционных болезнях животных : сб.науч.тр. ВНИИБТЖ. - Омск, 2004.-С. 155-160

Лицензия Р № 5970 от 12 05.94г. Подписано в печать 20 10 2004 Формат 60x84/16 Бумага ксероксная П.л-1,00 Способ печати - оперативный

Тираж 100 экз. Полиграфический центр «БАВ» 644118, г. Омск, ул. 5-я Кордная, 24, к.104

иго 6 4 0

1.2. Общая характеристика работы

Актуальность темы. На современном этапе развития агропромышленного комплекса перед работниками ветеринарной службы ставятся ответственные задачи - а именно профилактика и борьба с болезнями инфекционной этиологии и тем самым обеспечение выпуска высококачественной продукции, безопасной в санитарном отношении. Среди множества инфекционных болезней, которыми поражаются сельскохозяйственные животные, особое место занимают болезни молодняка, многие из которых до настоящего времени изучены недостаточно (G.H. Woode, 1982; D.R. Snodgrass et al., 1984, H.H Крюков с соавт., 1984).

Большую опасность для животноводства представляют так называемые ассоциативные или смешанные инфекции, которые в настоящее время составляют большую часть среди болезней инфекционной природы. Смешанные инфекции - явление постоянное и установление заболевания следует рассматривать как естественную ассоциацию с предшествующим паразитоносительством с учетом возможного его обострения (Д.И. Панасюк, 1984; И.Д. Колесниченко и В.П. Иванов, 1987; А.П. Маркевич и В.М. Апатенко, 1995; В.Ф. Никитин, 1997).

Факт обилия паразитирующих форм показывает высокую степень вероятности сочетания нескольких паразитов в одном макроорганизме. Эта вероятность возрастает в свете новых данных о доступности макроорганизма для проникновения различных микробов, которые, попав в организм не всегда обуславливают возникновение заболевания, но они могут включаться в состав паразитоценоза (В.В. Смирнов, 1994, В.М. Апатенко, 1997).

В некоторых хозяйствах Омской области в последние годы гибнет до 60 - 70% молодняка крупного рогатого скота. При этом, по данным научных сотрудников ИВМ ОмГАУ и ВНИИБТЖ, основными ассоциантами являются микоплазмы, хламидии, пастереллы, клостридии, энтеробактерии, грибы, вирусы инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, парво- и коронавирусы и,, возможно, другие, пока не диагностируемые микроорганизмы (А.П. Красиков с соавт., 1998; М.И, Петрова с соавт., 2000).

Большой интерес представляет изучение закономерностей возникновения ассоциаций, их устойчивость и длительность существования.

Исследования паразитоценозов при ассоциативных инфекциях должны носить комплексный, всесторонний анализирующе-объясняющий характер с использованием современных методик соответствующих профилей, так как поверхностные исследования, фиксирующие лишь отклонения в клиническом и патоморфологическом проявлении, не дают полной информации о заболевании (В.М. Апатенко, 1985).

Разработка новых методов диагностики, профилактики и борьбы с ассоциативными инфекциями сельскохозяйственных животных и зооантропонозными болезнями будет способствовать повышению сохранности поголовья скота, получению дополнительной продукции животного происхождения, а также позволит снизить риск заболеваемости среди людей.

До настоящего времени остаются фактически неизученными вопросы этиологии, способов взаимодействии патогенных агентов, участвующих в процессе возникновения и развития ассоциативных инфекций. В связи с этим весьма актуальным является изучение вопросов диагностики микропаразитоценозов, их роли в развитии 5 инфекционных болезней у телят для разработки мер борьбы и профилактики с учетом всех сочленов ассоциации, участвующих в инфекционном процессе, что и послужило основанием для проведения данных исследований.

Тема диссертационной работы является самостоятельным разделом Комплексной государственной программы «Профилактика (диагностика) и меры борьбы с ассоциативными инфекционными и инвазионными болезнями животных и птиц» и имеет № государственной регистрации 01.2.001100602.

Цель и задачи исследований: изучить микропаразитоценозы при ассоциативных инфекционных болезнях телят.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Определить роль патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и их ассоциаций при спонтанных инфекционных болезнях молодняка КРС в хозяйствах Омской области.

• Изучить основные биологические свойства, устойчивость к химиотерапевтическим средствам микроорганизмов, выделенных из патологического материала от телят, а также характер их взаимоотношений внутри бактериальной ассоциации.

• Установить возможность использования серологических тестов РПИФ и РНИФ для индикации и идентификации микроорганизмов и их антигенов при ассоциативных инфекционных болезнях телят.

Научная новизна работы. Установлено, что в хозяйствах Омской области в структуре инфекционных болезней молодняка основное место принадлежит ассоциативным инфекциям респираторного и желудочно-кишечного тракта.

Изучены микропаразитоценозы у спонтанно инфицированных телят. В экспериментальных условиях in vitro и in vivo выявлен антагонистический и синергистический характер взаимоотношений между некоторыми сочленами ассоциаций микроорганизмов, участвующих в инфекционном процессе.

Предложены антигены и антитела для экспресс-метода диагностики ассоциативных инфекционных болезней с помощью прямого и непрямого методов РИФ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации дополняют концепцию об искусственной регуляции паразито-хозяинных отношений, а также вносят определенный вклад в развитие науки паразитоценологии об ассоциативных инфекционных процессах. Результаты исследований являются основой для дальнейшего изучения микропаразитоценозов отдельных биотопов (систем пищеварения, дыхания, урогенитального тракта и др.)

Применение разработанных методов диагностики позволит ветеринарным специалистам иметь развернутый диагноз и разрабатывать меры борьбы с учетом всех эпизоотически значимых сочленов ассоциации, участвующих в инфекционном процессе.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на научных конференциях профессорскопреподавательского состава и аспирантов ИВМ ОмГАУ 1998-2001гг.

Омск), «Актуальные проблемы инфекционных, паразитарных и незаразных болезней домашних животных и меры борьбы с ними»

Омск, 1998г), учредительной конференции международной ассоциации паразитоценологов (Витебск, 1999г), Межрегиональной научно-практической конференции «Роль инноваций в развитии 7 регионов» в рамках промышленно-инновационного форума «ПромТЕХЭКСПО - 99», «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных» (Омск, 1999г), «Вклад ученых и специалистов в развитие животноводства и ветеринарии» (Омск, 2001г.); межрегиональной научно-практической конференции (Омск, 2004г, СО РАСХН - ВНИИБТЖ).

Внедрение результатов исследований. Результаты научных исследований использованы при подготовке методических рекомендаций: «Диагностика микропаразитоценозов при ассоциативных инфекционных болезнях телят» (утверждены Ученым Советом ИВМ ОмГАУ, протокол № 1 от 29.09.2004г и секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Министерства сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 8.10.2004г, протокол № 5).

Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии и инфекционных болезней животных и микробиологии, вирусологии и иммунологии Института ветеринарной медицины и Института повышения квалификации руководителей и специалистов АПК ОмГАУ, а также в курсе лекций Тюменского института переподготовки кадров агробизнеса.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Роль патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и их различных сочетаний в этиологии и распространении ассоциативных инфекционных болезней у телят в хозяйствах Омской области.

2. Основные биологические свойства, устойчивость к химиотерапевтическим препаратам, характер взаимоотношений внутри бактериальных ассоциаций, выделенных от больных и павших телят.

3. Применение предложенных антигенов и антител для серологических экспресс-методов (РПИФ и РНИФ) диагностики для индикации и идентификации микроорганизмов и их антигенов при ассоциативных инфекционных болезнях телят.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей и методические рекомендации «Диагностика микропаразитоценозов при ассоциативных инфекционных болезнях телят».

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 20 рисунками. Список литературы включает 143 источника, из них 32 зарубежных авторов.

5. ВЫВОДЫ

1. Инфекционные болезни телят ассоциативной этиологии широко распространены в хозяйствах Омской области. Основными сочленами бактериальных ассоциаций являются Е. coli, Salmonella sp., Streptococcus sp., Proteus sp., Klebsiella sp., Staphylococcus sp., Citrobacter sp., Pasteurella sp.t Enterobacter sp., Pseudomonas sp. В ассоциации микроорганизмы выделяли в 3,1 раза чаще, чем в монокультуре. Наиболее часто среди ассоциантов изолировали Е. coli - 33,4%, Salmonella sp. — 25,3%, Proteus sp. - 21,9% и Citrobacter sp. - 17,3%.

2. Из 212 выделенных культур E. coli преобладали эшерихии с адгезивным антигеном К-88 — 50%, К-99 и 987Р- 45%, на долю А-20 приходилось 30% и на F-41 - 25% микроорганизмов. От двух до пяти адгезивных антигенов Е. coli выявляли в 5-25% случаев, с антигеном F-41 — в 15% и в 5% - с антигенами 987Р и К-99.

Из 164 выделенных культур рода Salmonella 90% возбудителей отнесены к типу D, по 5% отнесены к типам А и В.

3. Все выделенные культуры микроорганизмов обладали патогенностью для лабораторных животных, при этом их вирулентность варьировала от 33,3% до 100% в зависимости от дозы и вида возбудителя.

4. Из химиотерапевтических препаратов наибольшую чувствительность микроорганизмы имели к цефоперазону, спектаму и ветофлоку.

5. Установлено явление синергизма при моделировании ассоциативного инфекционного процесса на морских свинках между Е. coli и S. dublin, выраженное в увеличении летальности на 33,3% в сравнении с моноинфицированием. При заражении

120 морских свинок ассоциацией микроорганизмов P. mirabilis и К. pneumoniae в концентрации 2 млрд.м.т./мл летальность увеличилась на 100% по сравнению с заражением их монокультурами. Между S. aureus и P. mirabilis установлено явление антагонизма, которое привело к снижению летальности у подопытных животных на 33,3% по сравнению с моноинфицированием. В то же время в опытах in vitro при совместном посеве культур на чашках Петри явного антагонизма не наблюдали.

6. Серологический экспресс-метод диагностики (РПИФ и РНИФ) по простоте и скорости постановки диагноза (15-20 мин в РПИФ и 60 мин для РНИФ на одну пробу), а также возможности прижизненной диагностики и изучения микропаразитоценозов превосходит бактериологический метод, для диагностики вирусных болезней РИФ является одним из перспективных методов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны методические рекомендации «Диагностика микропаразитоценозов при ассоциативных инфекционных болезнях телят», утверждены на заседании секции животноводства Центра научного обеспечения АПК Министерства сельского хозяйства и продовольствия Омской области, протокол №5 от 8.10.2004г. Материалы диссертации могут быть использованы: в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по микробиологии, эпизоотологии; в научно-исследовательских учреждениях ветеринарной медицины при решении вопросов диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней телят.

2.7. Заключение

Б.Д. Ивасык и О.С. Калинина (1995) при выяснении этиологии диареи у новорожденных телят в 9 хозяйствах Львовской области в РИФ от 72 больных телят 3-10 дневного возраста в 73,6% случаев выявляли антиген ротавируса, в 48,6% - антиген коронавируса, в

41

38,9 % - ассоциацию двух вирусов и в 12,5% - антиген аденовируса. В большинстве случаев заболевание и гибель новорожденных телят с синдромом диареи вызывали ассоциации различных вирусов и бактерий.

Большой интерес для практической ветеринарии представляет изучение микоплазменно-вирусных и микоплазменно-бактериальных ассоциаций. Микст-инфекции, обусловленные микоплазмами и другими бактериальными агентами у сельскохозяйственных животных наблюдал А .Я. Пустовар (1995), при этом микоплазмы телят, как правило, встречаются в сочетании с кокковыми и другими бактериальными, а так же адено-, миксовирусными инфекциями. Так же изучением подобных инфекций занимались: И.Ю. Безрукова (1965); А.С. Серебряков и В.А. Шубин (1969); Т.А. Михальский с соавт. (1972); П.М. Митрофанов с соавт. (1979); Е.В. Андреев и П.П. Фукс (1980).

М.А. Сафин с соавт. (1998) выяснили, что в этиологии инфекционных болезней участвуют эшерихии, протеи, стрептококки и стафилококки. Эти инфекции протекают тяжелее, длительнее и большей частью с осложнениями и высокой летальностью. При этом отмечалось явление синергизма, то есть взаимное или одностороннее усиление действие возбудителя или же независимое развитие двух, трех возбудителей болезни оказывая суммирующие болезнетворное действие на организм.

На смешанный характер протекания болезней молодняка сельскохозяйственных животных указывают и многие другие исследователи (К.В. Арнольди с соавт., 1963; И.П. Лысенко с соавт., 1975; М.С. Гильяров, 1978; П.М. Митрофанов, 1979, 1981; А.А. Ежиков с соавт., 1980; В.М. Апатенко, 1982; J. Wetzke et al,. 1982; М.А. Никишова с соавт, 1983; В.М. Апатенко и М.Г. Ливощенко,

1985; И.Д. Колесниченко с соавт., 1987; А.Т. Марчук, 1988; Б.А.

42

Корж и Я.Д. Злонкевич, 1988; А.А. Конопаткин, 1988; В.А. Мищенко с соавт., 1988; F. Marschung, 1988).

Вопросами лечения и профилактики ассоциативных инфекций телят занимались В.И. Терехов (1999), Д.К. Павлов и В.А. Мищенко (2000), А. Мищенко (2001), В.И. Гуменюк и Ф.Е. Евтушенко (1986), В.И. Афанасенко (2000), А.С. Овод (1982), F. Biirki et al. (1986), Т. Murakami et al. (1986), Р.А. Bachman (1983), Н. Gunter et al. (1983).

Смешанные инфекции молодняка наносят огромный ущерб сельскому хозяйству и животноводству в частности. Экономические потери при болезнях молодняка выражаются в замедленном росте, смертности и особенно высокой стоимости лечения больных животных. В основном эти потери возникают в течение первых 2—4 месяцев жизни животных при ярко выраженном преобладании острых кишечных заболеваний в первые 10-15 дней жизни (Д.А. Девришов, Е.С. Воронин, 1988).

В США потери от падежа телят в возрасте до 30 дней составляют от 65 до 175 млн. долларов в год. Диареи молодняка крупного рогатого скота считаются основной причиной этих экономических потерь в США (Г.Ф. Коромыслов, 1980).

В целях полного и всестороннего изучения ассоциированных инфекций необходимо проводить клинико-эпизоотологические, паталого-анатомические, иммуноморфологические, вирусологические, микробиологические и серологические исследования. Нужны объединенные исследования клиницистов, паразитологов, инфекционистов, патоморфологов, проводимые на органном, тканевом, клеточном, субклеточном и макромолекулярном уровнях.

Исследования паразитоценозов должны носить комплексный, всесторонний анализирующее-объясняющий характер с использованием современных методик соответствующих профилей,

43 так как поверхностные исследования, фиксирующие лишь отклонения в клиническом и патоморфологическом проявлении, не дают полной информации о заболевании (В.М. Апатенко, 1985).

Необходимо полное изучение вирусного и бактериального пейзажа в крупных животноводческих комплексах. Важно иметь характеристику на всех партнеров встречающихся ассоциаций не только по видовой принадлежности, но и по характеру их взаимоотношений, по их влиянию на организм хозяина. t

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

Работа проводилась в период с 1997 по 2000 годы в лаборатории микст-инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней животных. Отдельные исследования были выполнены в бактериологической лаборатории ветеринарной станции Омского района и на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМ ОмГАУ (зав. каф. д.в.н., проф. Плешакова В.И.).

Объектом исследований являлись телята, принадлежавшие различным хозяйствам Омской области, неблагополучных по инфекционным болезням молодняка.

Материалом для посмертных исследований служил патологический материал, полученный от вынужденно убитых и павших животных, а именно внутренние органы — печень, почки, селезенка, легкие, сердечная мышца, тонкий и толстый кишечник, синовиальная жидкость суставов.

Прижизненно от животных исследовали бронхиальную жидкость, полученную методом бронхоальвеолярного лаважа.

В лабораторных опытах использовали морских свинок, кроликов, культуры микроорганизмов, выделенные из патологического материала от молодняка и культуры из музея кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМ ОмГАУ — S. aureus 209 Р, Е. coli 147, P. vulgaris.

Клиническое проявление инфекционных болезней молодняка наблюдали в хозяйствах Омской области. Из общих методов исследования использовали осмотр, пальпацию, термометрию, подсчет пульса и количества дыхательных движений.

Вынужденному убою с диагностической целью подвергали животных с выраженными клиническими признаками болезни.

Отбор патологического материала проводили согласно общепринятым методикам.

В процессе выделения чистых культур микроорганизмов изучали их морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и вирулентные свойства.

Изучение морфологических и тинкториальных свойств выделенных микроорганизмов осуществляли при окраске мазков — препаратов по Граму и Романовскому-Гимзе. Наличие спор выявляли по Пешкову, капсул — по Ольту. Подвижность микроорганизмов определяли в препаратах «висячая» и «раздавленная» капли. Микроскопирование проводили при помощи светового микроскопа «Ломо» (х 900).

Культуральные свойства микроорганизмов изучали в процессе выделения и культивирования их на питательных средах. Инкубирование посевов осуществляли в аэробных условиях при 37°С в течение 24-48 ч в термостате. Учитывали скорость и характер роста, форму, рельеф, размер и поверхность колоний, прозрачность и пигментообразование на плотных средах. В жидких питательных средах определяли наличие или отсутствие пристеночного кольца, образование осадка и его характер.

Биохимические свойства микробных культур изучали при посеве на углеводные среды Гисса. Посев производили бактериальной петлей, смоченной в бульонной культуре, уколом в столбик питательной среды. Культивировали в аэробных условиях при 37°С, о ферментации углеводов судили по изменению цвета среды через 24-48 ч.

Для определения образования ацетилметилкарбинола из глюкозы использовали реакцию Фогеса-Проскауэра с 20%-ным раствором едкого калия. К суточной испытуемой культуре на среде Кларка добавляли равный объем 20%-ного раствора едкого калия и помещали в термостат при 37°С. Учет результатов проводили через 4ч и на следующий день. Положительный результат — окрашивание среды в розовый цвет. При отрицательном результате изменения цвета среды не происходило.

На среде Симмонса выявляли способность микроорганизмов утилизировать цитрат натрия. Посев производили бактериальной петлей из суточной агаровой культуры штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик. Инкубировали в термостате при аэробных условиях в течение 18-20 ч. Изменение цвета среды в ярко-синий цвет считали положительным результатом. При отрицательном результате наблюдение продолжали до 72 ч.

Для определения каталазной активности каплю суспензии чистой культуры помещали на предметное стекло и добавляли 3%-ный раствор перекиси водорода. При положительной реакции появлялось газообразование.

Изучение гемолитических свойств исследуемых культур проводили на МПА с содержанием 5% дефибринированной крови барана или кролика. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 24-36 ч. Появление зоны гемолиза вокруг колоний свидетельствовало о наличие у культур гемолитических свойств.

Вирулентные свойства выделенных культур изучали при постановке биологической пробы на морских свинках, которым внутрибрюшинно вводили по 2 мл взвеси суточных культур выделенных микроорганизмов в концентраци 1,0x109 м.т./мл и 2,0х109 м.т./мл по ОСМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Наблюдение проводили в течение 30 дней. Животных, оставшихся в живых, по истечении срока наблюдения девитализировали с помощью эфира.

Трупы вскрывали, из внутренних органов готовили мазки-отпечатки, которые окрашивали по Граму и Романовскому-Гимзе. Параллельно проводили посев на мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон (МПБ), кровяной агар (КА), дифференциально-диагностические среды Эндо, Левина, Плоскирева и висмут-сульфит агар для выделения чистых культур микроорганизмов.

Серологическую типизацию микроорганизмов проводили с агглютинирующими люминесцентными сальмонеллезными сыворотками (типов А, В, D) в реакции прямой иммуннофлуоресценции (РПИФ) и эшерихиозными монорецепторными сыворотками энтеротоксигенных Е. coli (К-88, К-99, А-20, F-41, 987Р) в реакции непрямой иммуннофлуоресценции (РНИФ).

Изучение взаимоотношений между выделенными микроорганизмами осуществляли на плотной питательной среде двумя методами: а) путем внесения предполагаемых микробовантагонистов на газонную культуру микроорганизмов. Для этого из

2-х суточных культур микроорганизмов готовили 2-х млрд. взвеси по оптическому стандарту мутности. Затем по поверхности плотной среды (МПА или КА) рассеивали 0,2 мл взвеси бактерий, чашки с посевами подсушивали в термостате в течение 30 минут, затем извлекали их и в центр посева наносили одну каплю 2-х млрд. взвеси предполагаемого микроба-антагониста; б) методом перпендикулярных штрихов — по диаметру ч. Петри засеивали культуру предполагаемого микроба-антагониста, и, отступая 2 мм от

48 края посева, перпендикулярно к штриху засеивали исследуемые культуры микроорганизмов. Чашки Петри с посевами помещали в термостат при 37-38° С. Учет результатов осуществляли через 24 и 48 ч. О способности культур оказывать антагонистическое воздействие судили по наличию зоны задержки роста между посевами в случае, если среди испытуемых микроорганизмов имеется штамм-антагонист. Зона задержки роста может быть различной, но при выраженном антагонистическом действии она составляет 20 и более мм. В качестве контроля вместо предполагаемых антагонистов засеивали каплю физиологического раствора.

Для прижизненной диагностики эшерихиоза от больных телят с клиническими признаками диареи стерильным ватным тампоном на деревянной палочке из прямой кишки вращательными движениями брали соскоб со слизистой оболочки, затем пробу помещали в стерильную пластмассовую или стеклянную пробирку с физиологическим раствором и доставляли в лабораторию.

В лаборатории содержимое тампона отжимали и давали отстояться в течение 60 мин. Из надосадочной жидкости на предметное стекло наносили по пять капель из каждой пробы. Стекла подсушивали и фиксировали мазки согласно общепринятым методикам. Наличие адгезивных антигенов Е. coli определяли в РНИФ аналогично исследованиям мазков-отпечатков из паренхиматозных органов.

При подозрении на заболевание телят ассоциативными инфекционными болезнями органов дыхания брали пробы биоматериала из бронхов и легких. Для этого использовали направляющий резиновый зонд длиной 35 см и диаметром 7 см со сточенными краями с целью предупреждения травмирования слизистой оболочки носоглотки. Края зонда смазывали глицерином

49 или растительным маслом. Зонд вводили в одну из ноздрей под контролем большого и указательного пальцев. Затем в направляющий зонд вставляли основной зонд длиной 80-90 см, имеющий на конце резиновую канюлю для крепления шприца Жанэ. В качестве основного зонда использовали полистироловую трубочку из системы для внутривенного введения лекарственных препаратов. Контроль правильности введения основного зонда в легкие осуществляли по выдыхаемому воздуху и характерному легочному запаху. Шприцом Жанэ в бронхи и легкие вводили 15-20 мл стерильного физиологического раствора, затем от канюли отсоединяли шприц, подсоединяли другой стерильный шприц Жанэ и, прилагая усилия, отсасывали шприцом экссудат, который помещают в пробирку под давлением шприца. Пробирки с бронхоальвеолярной жидкостью укупоривали и доставляли в лабораторию микст - инфекций для проведения серологических исследований на наличие антигенов возбудителей или антител.

Для постановки РНИФ использовали стандартные диагностические агглютинирующие антигены и сыворотки — «Листериозную I серотип для капельной РА 0-Н», «Лептоспирозную сыворотку серогрупп Помона, Тарасови, Гриппотифоза, Иктерогемморагия, Каникола»; сыворотки, полученные нами после гипериммунизации кроликов вакцинами — хламидиозную кроличью на вакцину против хламидиоза КРС, ИРТ— кроличью на вакцину против ИРТ-ПВ, и стрептококковую, стафилококковую и диплококковую сыворотки, полученные нами после гипериммунизации кроликов соответствующими микроорганизмами, выделенными от больных телят, а также антивидовые люминесцентные сыворотки . против глобулинов кролика, изготовленные НИИЭМ им. Ф.Ф. Гамалеи.