Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммуногенные свойства лизат-антигенов из сальмонелл, эшерихий и стафилококка

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

Московская Государственная академия г- - прикладной биотехнологии

На правах рукописи

Кудрявцев Валерий Васильевич

УДК 619:616.981.49-084:636.4

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ЛИЗАТ-АНТИГЕНОВ ИЗ САЛЬМОНЕЛЛ, ЭШЕРИХИЙ И СТАФИЛОКОККА

Специальность 16.00.03 — ветеринарная микробиология,

вирусология,-эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва 1993

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биотехнологии Московской Государственной академии прикладной биотехнологии в соответствии с темой ГНТП № 7-6-90, задание 0I.03.04M, номер государствен-| ной регистрации 0I9I0049083. -

Научные руководители - доктор ветеринарных наук, профессор

СИДОРОВ М.А.

_ - доктор ветеринарных наук

ТАТАРИНЦЕВ Н.Т.

Официальные оппоненты - доктор ветеринарных наук

шустер бд). ; (нгнки)

- доктор ветеринарных наук БУРЛАКОВ В.А. (МВА)

Ведущее учреждение - ВНИИ экспериментальной ветеринарии им.

Я.Р.Коваленко (г. Москва)

Защита состоится к "-уб—199к года в /¿Г час. на заседании совета по защите диссертаций К.063.46.01 Московской Государственной академии прикладной биотехнологии (МГАПБ) по адресу: I098I8, Москва, Ул. Талалихина, 33. .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАПБ.

Автореферат разослан " fQ " ■ 199 к года.

Ученый секретарь

специализированного совета ЛОГИНОВ И.А.

I. ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Свиноводство в нашей стране является одним из основных источников мяса и жира животного происхождения. Эта отрасль животноводства, в основном, переведена на промышленную основу. На фоне специфических условий и, в частности, в связи с концентрацией большого количества свиней на ограниченных территориях возросла роль болезней, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, в том числе бактериями из рода Salmonella и Escherichia особенно в крупных промышленных комплексах, где поголовье животных достигает 100 тыс. и более (Смирнов H.H., 1985).

Особенность промышленного животноводства заключается не только в том, что в технологические группы подбирают животных однотипных по породе, полу и возрасту, а также в том, что вследствие унификации системы содержания эти групп животных характеризуются однообразием метаболических процессов. У них как бы выравнивается физиологический статус, а значит, и уровень естественной резистентности, а молодые животные в таких комплексах, как правило, отличаются устойчивым иммунодефицитом (Сидоров U.A., Субботин В.В., 1991; Пустовар А.Я., Гай-* дамака A.B. и др., 1989).

Если на эту популяцию животных воздействует какой-либо агент, то он воздействует на всех животных одинаково, и если оказывается превышен предел допустимой нагрузки на организм, т.е. превышен пороговый уровень резистентности, то заболевает, как правило, большое количество животных, а не единицы, как это было бы в разнородной популяции (Ярных B.C., 1985).

Проблема борьбы с сальмонеллезом и колибактериозом свиней в настоящее время стоит особенно остро, так как в условиях крупных комплексов каждая вспышка инфекции приносят значительный экономиче-

ский ущерб. ,

По мнению большинства ученых, наиболее эффективной и экономически целесообразной мерой в борьбе с этими болезнями является специфическая профилактика, т.е. вакцинация (Архангельский И.И.,1960; Жуков Г.В., 1961; Шустер B.D., 1988; pelleria J. ,1980; ivilson. м.к.,1ьао( и многие другие. Однако современные средства специфической профилактики, применяемые на ослабленном иммунодефицитном поголовье свиней в комплексах не всегда оказываются достаточно эффективными.

Инактивированные вакцины проявляют довольно высокую реактоген-ность и не обладают достаточной иммуногенностью. Живые вакцины более иммуногенны, но многократные пассажи аттенуированных вакцинных штаммов на иммунодефицитном поголовье ведут к их реверсии в исходное вирулентное состояние, что нередко заканчивается вспышками болезней на вакцинированном поголовье (Шустер B.D. и др., 1971; Лиходед В.Г. и др., 1973; Сидоров М.А., Субботин В.В., 1991).

В свете изложенного становится очевидной необходимость разработки новых средств специфической профилактики сальмонеллеза и колибак-териоза свиней в условиях промышленного ведения свиноводства.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось изучение антигенной и иммуногенной активности моно- и поликомпонентного лизат-антигенов из сальмонелл, эшерихий и стафилококка, и возможности их использования для профилактики сальмонеллеза и колибактериоза свиней в условиях свиноводческих комплексов.

В связи с этим в задачи исследований входило:

- изучить культуральные, морфологические, ферментативные, вирулентные и антигенные свойства сальмонелл и эшерихий, отобрать штаммы

.для приготовления лизат-антигенов,

- отработать режим получения лизат-антигенов из штаммов сальмонелл, эшерихий и стафилококка,

- изучить иммуногенную и антигенную активность"лизат-антигенов при их раздельном использовании и в сочетании друг с другом и изготовить на их основе препарат, обладающий повышенной иммуногенной активностью,

- отработать оптимальную схему применения препарата в опытах на лабораторных животных (доза, кратность, интервал),

- испытать реактогенность, безвредность и иммуногенность экспериментальной серии препарата на свиноматках и поросятах в условиях неблагополучного хозяйства промышленного типа.

Научная новизна. Разработан режим получения лизат-антигенов из штаммов сальмонелл, эшерихий и стафилококка.

Впервые в ветеринарной практике показана возможность успешного использования лизат-антигенов для изготовления комплексного высоко-имыуногенного препарата, обладающего иммуностимулирующими свойствами. Показана возможность использования лизат-антигенов для изготовления поликомпонентного препарата против сальмонеллеза и колибакте-риоза свиней. Отработана оптимальная схема применения экспериментальных серий препарата, включающая дозу, кратность его применения и интервал между инъекциями для свиней различного возраста.

Практическая значимость. Разработан метод получения и композиция бактериальных лизатов, обладающих повышенной иммуногенностью и показана перспективность конструирования на их основе инактивирован-ных вакцин.

Доказана Солее высокая противоэпизоотическая эффективность поликомпонентного препарата, изготовленного на основе бактериальных лизатов против сальмонеллеза и эшерихиоза свиней в сравнении с вакцинами из штамма ТС-177, ППЦ и формолтиомерсаловой против эшерихиоза (акт от 25 декабря 1992 г., Губкинский свинокомплекс).

Апробация работы. Материалы по теме диссертации доложены на

расширенном заседании кафедры микробиологии и биотехнологии МГАЛБ (1993), на научно-практической конференции "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных" (Москва, БИЭВ,1993).

Публикации материалов исследований. По теме диссертационной работы опубликованы две печатные работы, где изложены основные результаты исследований.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа изложена на 178 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами, 21 рисунком. Список литературы включает 296 наименований, из них 115 зарубежных источников.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы.

В исследованиях были использованы следующие штаммы микроорганизмов: Salmonella typhimutium 415f Salmonella choleraesuis 370, E.coli K87, выделенные сотрудниками кафедры микробиологии МГАПБ от больных поросят и селекционированные в НИИВС им. Мечникова; stphylo-сосав aureus 1991 получен из НИКИ им. Тарасевича. Культуры исследуемых штаммов сохраняли в лиофилизированном состоянии, а при повседневной работе поддерживали на МПА и МПБ.

Лабораторные животные. В опытах использовали 420 белых беспородных мышей массой 14-16 г, 160 кроликов породы шиншилла массой 2-2,5 кг, 120 свиноматок и 1600 поросят породы белая русская.

Биологические препараты. При выполнении экспериментов использовали следующие препараты: корпускулярные антигены всех штаммов для постановки пробирочной РА, лизат-антигены всех штаммов, сальмонел-лезные сыворотки 0, Н монорецепторные и поливалентные, агглютинирую-

щие 0-, Н-, К- колисыворотки, вакцины против паратифа, пастереллеза и диплококковой сиптицемии поросят (ППД), против сальмонеллеза из штамма ТС-177 и формолтиомерсаловая против эшерихиоза (колибактери-оза).

Культурально-морфологические и биохимические свойства штаммов изучали общепринятыми в микробиологии методами, а антигенную структуру сальмонелл и эшерихий - в реакции агглютинации с монорецептор-ными и поливалентными сыворотками.

Вирулентность штаммов изучали на белых мышах живой массой 14-16 г, заражая их внутрибрюшинно 16-18-часовыми агаровыми культурами, выращенными на ША и суспендированными в 0,8^-ном растворе хлорида натрия. Показатель рассчитывали по методу Рида-Менча.

Кровь от кроликов и свиноматок брали из краевой вены уха, а от поросят - из передней полой вены.

Сыворотку молозива получали путем добавления в молозиво от свиноматок сычужного фермента, после чего вьщерживапи в термостате 45 мин при +37 °С и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Сыворотки крови и молозива хранили в замороженном состоянии.

Активность сывороток определяли в пробирочной РА с корпускулярными антигенами, которые готовили из 16-18-часовых агаровых культур путем смыва и трехкратного отмывания 0,8/5-ным раствором хлорида натрия при 3000 об/мин в течение 10 мин. Инактивацию культур осуществляли путем добавления 0,2% формальдегида. Хранили антигены при температуре 4-6 °С во флаконах.

Для изготовления лизат-антигенов использовали селекционированные культуры, не допуская более 3-х пассажей на средах до выращивания их в ферментере. Штаммы культивировали раздельно в бульоне Хот-тингера (рН 7,2-7,4, аминный азот 100-120 мг&) в течение 7-9 часов при постоянной' аэрации и перемешивании. Концентрацию клеток опреде-

ляли по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича.

К выращенным культурам добавляли гидрооксиламин (/а^ОН»НС1), растворенные антигены осаждали, отстаивали в течение суток, надоса-дочную жидкость сливали, а осадок лиофилизировали.

Антигенность моно- и поли- лизат-антигенов изучали в опытах на кроликах, иммуногенность в опытах на белых мышах, свиноматках и поросятах.

Количество белка в сыворотках крови животных определяли рефрактометрически, а белковые фракции - методом электрофореза в полиакрил-амидном геле (ПАГ) согласно методике, прилагаемой к прибору фирмы "Реанал" (Венгрия).

Антигенную активность лизат-антигенов, оптимальную дозу, влияние интервала ревакцинации и дозы препарата первой и второй вакцинации на антителогенез изучали в опытах на кроликах. Иммунизировали животных внутримышечно и в крови определяли, титры агглютининов к антигенам, входящим в состав препарата.

Реактогенность, безвредность и иммуногенность препарата изучали на свиноматках и поросятах'"в условиях Губкинского свинокомплекса Белгородской области. Наблюдение за поросятами вели до 120-дневного возраста, т.е. до передачи на откорм.

Полученный цифровой материал по РА подвергали логарифмированию. Все остальные цифровые материалы представлены в натуральных числах, обработанных по методикам, описанным в "Статистических методах в микробиологических исследованиях" (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Биологические свойства штаммов. Штаммы сальмонелл, эшерихий и стафилококка хорошо росли на МПА и МПБ. В мазках из культур сальмонеллы и эшерихии представляли собой грамотрицательные палочки размером 1-2 х 0,5-0,8 мкм. Они были подвижны, спор и капсул не обра-

зовывэли. На среде Эндо сальмонеллы формировали полупрозрачные бесцветные или бледно-розовые колонии, колонии эшерихий были крупнее и имели малиновый цвет и металлический блеск*

Стафилококки представляли собой грамположительные кокки, диаметром до I мкм, неподвижны, спор и калсул не образовывали. На МПА с крови барана образовывали вокруг колоний зону бета-гемолиза.

Колонии всех штаммов хорошо суспендировались в физиологическом растворе, суспензия при кипячении сохраняла однородность (проба на самоагглвтинацгао отрицательная).

Штамм 370 S.choieraesuis ферментировал глицерин, сорбит, рамнозу, глюкозу, маннозу, фруктозу, маннит, мальтозу, галактозу, разжижал желатин. Не ферментировал лактозу, сахарозу, адонит, араби-нозу, дульцит, инозит, не сбраяивал молоко, но продуцировал индол, не разлагал мочевину.

Штамм № 415 s.typhirautium ферментировал сорбит, арабинозу, дульцит, инозит, рамнозу, маннозу, фруктозу, ксилозу, галактозу, глицерин, выделял сероводород, разжижал желатин. Не ферментировал лактозу, сахарозу, адонит, салицин, не выделял индол, не пептонизировал молоко, не разлагал мочевину.

Штамм К87 E.coli ферментировал лактозу, сахарозу, сорбит, арабинозу, дульцит, маннозу, ксилозу, глицерин, галактозу, пептонизировал молоко, продуцировал сероводород и индол. Не ферментировал инозит, маннозу, фруктозу, не разжижал желатин и не разлагал мочевину.

Етамм 1991 staphyloсоcoos aureus ферментировал сахарозу, фруктозу, медленно по уколу разжижал желатину и на 2-3 сутки пептонизировал молоко. Не разлагал дульцит, салицин и не выделял индола. Коагулировал плазму крови кролика, вызывая бета-гемолиз.

При изучении антигенной структуры штаммов показано, что штамм

Г 37С имеет антигенную формулу 0б,7:НС:1:5 и он относится к группе C-j-, что соответствует серологическому варианту S.choleraesuis Птамм 415 имеет антигенную формулу 04,5,12:Н, ,1,2 и он относится к группе В и соответствует серовару s. typhimurium . Штамм

if 87В.coli имел антигенную формулу 08:К87:К88:Н19.

Показано, что при внутрибршинном заражении мышей jyigQ для s. choloraesuis составила 8 клеток, для s.typhimurium 7 и для

эзернхий 2275 клеток. Следовательно, взятые для исследования штаммы соответствуют видам S. choleraasuis, S. typhimurium, Е. coli и staph.aureus . Штаммы сальмонелл и штамм эшерихий обладают высокой вирулентностью и могут быть использованы для приготовления ли-зат-антигенов.

Приготовление лизат-антигенов. Биомассу из штаммов сальмонелл, эшерихий и стафилококка получали путем раздельного культивирования в лабораторном ферментере емкостью 4 л в бульоне Хоттингера с амин-ным азотом 120-140 мг$ (начальный рН 7,4) и с добавлением 0,5% глюкозы. Культивирование осуществляли при температуре 37 °С, перемешиванием среды (300 об/мин) и аэрации (1,25 л стерильного воздуха в I мин на I л среды) в течение 6-8 ч.

С гелыо ускорения наработки необходимого количества бактериальной массы использовали периодическую полупроточную систему культивирования, т.е. через 4-5 ч, когда концентрация бактерий в среде достигала 25-35 млрд/кл половину культуры сливали, а в оставшуюся добавляли свекую среду с глюкозой, корректировали рН до 7,2-7,3 и продолжали культивирование 5-6 ч (для сальмонелл) и 7-8 ч (для эшерихий) , корректируя рН культуры через I-I,5 ч культивирования.

Этот метод позволил за непродолжительное время (6-8 ч) получить 8 л культуры S.choleraesuis концентрацией 17 млрд/мл, 8 л культуры s.typhimurium с концентрацией 25 млрд/мл, 8 л культуры

s„aureus концентрацией 30 млрд/мл и после 8-часового культивирования 10 л культуры E.coli концентрацией 14 млрд/мл.

Исследования показали, что культуры, выращенные в жедкой питательной среде в ферментере по своим основным свойствам не отличались от культур, выращенных на плотных питательных средах.

В выращенные культуры добавляли порошок гидрооксиламина

в количестве 0,065 мг на I млрд микробных клеток, тщательно перемешивали до растворения порошка и выдерживали в течение 4 сут в термостате при температуре 38-39 °С. Доводили pH смеси до 7,4. Растворенные таким образом антигены осаждали добавлением солей jTa^HPO^ и CaCIg. Образовавшийся комплекс СаНРО^ с адсорбированными антигенами выпадал в осадок (в течение суток). Прозрачную надосадоч-ную жидкость сливали с помощью сифона, а осадок соли, содержащий ли-зат-антигены подвергали лиофильному высушиванию. В I мг сухого nopoi ка лизат-антигена содержались антигены 3-3,5 млрд микробных клеток.

Показано, что лизат-антигены из сальмонелл и эшерихий не токсичны для белых мышей даже в дозе 5 for, что соответствует 15 млрд микробных клеток на голову. Корпускулярные формолантигены из этих же штаммов вызывали заболевание и гибель мышей после внутрибршин» го введения 3-х млрд микробных клеток.

Вероятно это связано с тем, что из корпускулярных антигенов высвобождается эндотоксин, тогда как лизат-антигены лишены эндото* сина вследствие блокады активных центров гидрооксиламином и солям СаНР04.

Изучение антигенной активности лизат-антигенов. Сухие лизат-антигены растворяли в 0,8/о-ном растворе хлорида натрия и вводили внутримышечно кроликам.

Трем кроликам (группа I) ввели по <: ^г антигена S.chuieraesi трем (группа 2) по 2 мг антигена s.typhimuriun , трем

(группа 3) по 2 мг антигена эшерихий, четырем кроликам (группа 4) ввели смесь антигенов S.choleraesuis и s.typhimurium (по I мг каждого), четырем (группа 5) - смесь из антигенов S.choleraesuis, s.typhimurium „ E.coli (По 0,7 мг каждого) и четырем кроликам (группа б) - все четыре антигена по 0,5 мг каждого ( S.choleraesuis, s.typhimurium, E.coli u s.aureus ). общее количество введенных антигенов кроликам всех групп составляла 2 мг на I животное.

Перед введением антигенов, а затем через каждые 7 суток после иммунизации у животных брали кровь и сыворотках крови определяли агглютинины в РА с корпускулярным антигеном каждого штамма.

Установлено, что через 7 дней после иммунизации, титры агглютининов в сыворотках крови кроликов всех групп повысились до уровня к С.холерасуис 7,32-7,82+0,1 лог, к С.тифимуриум - 8,82+0,62 - 9,32+ 0,01, к эшерихиям - 7,32+0,01 - 7,82+0,62, к стафилококку - 7,82+ 0,62 лог. Разница показателей (в 0,5 лог) между группами не существенна (Р< 0,05).-В последующие дни количество агглютининов увеличивалось и достигло максимума к 21 дню. К этому сроку титры агглютининов составляли: к С.холерасуис 10,32+0,01 - 10,82+0,62 лог, к С.тифимуриум 10,32+0,01 - 10,82+0,62, к эшерихиям 9,82+0,62 - 10,32+0,01 и стафилококку 10,32+0,01 лог. Титры агглютининов удерживались на этом уровне до 28 дня, после чего наметилась тенденция к снижению и к 49 дню титры не превышали 6-7 лог.

Анализ динамики титров агглютининов в сыворотках крови кроликов показывает, что несмотря на меньшую дозу каждого антигена, взятого в комплексе с другими антигенами (группы 4,5 и 6), организм кроликов ответил интенсивной выработкой антител против каждого антигена, входящего в комплексный препарат. Это дает основание полагать, что взятые в комплексе моноантигены из сальмонелл, эшерихий и стафилококка усиливают антителогенез к каждому в отдельности антигену,

т.е. они действуют по принципу синергизма и суммацки раздражения иммунокомпетентных клеток организма. Вследствие этого четырехкратное уменьшение дозы моноантигенов в комплексном препарате обеспечивало более интенсивное образование агглютининов.

Определение оптимальной дозы препарата из лизат-антигенов. Для проведения исследований препарат готовили путем смешивания равных весовых количеств сухих лизат-антигенов из сальмонелл, эшерихий и стафилококка.

Комплексный препарат вводили однократно кроликам внутримышечно в дозах 0,1; I, 2, 4, 8 и 16 :.:г (по 4 кролика на дозу).

После иммунизации у кроликов не наблюдалось, каких-либо изменений клинического статуса, хотя наибольшая доза (16 мг) соответствовала содержимому 48 млрд микробных клеток, что свидетельствовало о безвредности испытуемого препарата.

От иммунизированных кроликов брали кровь через каждые 7 суток до 49 суток включительно и в сыворотке крови определяли количество агглютининов в РА и каждому антигену входящему в состав препарата. Установлено, что через 7 суток после иммунизации, титры агглютининов у животных всех 6-ти групп (независимо от введенной дозы препарата) повысились до 7,32+0,01 - 8,32+0,01 лог ко всем антигенам. Однако к 14 дню титры агглютининов у кроликов I группы (иммунизированных дозой 0,1 мг) повысились незначительно до 8,32+0,1 лог к С.холерасу-ис и Ст.ауреус, до 7,82+0,62 к С.тифимуриум, а к Е.коли остались без изменений 7,32+0,1. У животных остальных групп титры составили в среднем 9,32+0,01, что существенно отличалось от I группы (Р>0,05).

Нарастание уровня агглютининов у животных продолжалось до 21 дня. У кроликов I группы (доза 0,1) к этому времени титры составляли 8,32+0,01 - 9,32+0,01 лог тогда, как у всех остальных групп титры в среднем составляли'10,32+0,01 лог (Р > 0,С5). Титры удержива-

лись на этом уровне до 28 дня, после чего наметилась тенденция к снижению и к 49 дню уровень титров агглютининов у 1-й группы кроликов был в среднем 5-6 лог, а у всех остальных групп 7-8 лог (Р-> 0,05).

Таким образом, оптимальной иммунизирующей дозой комплексного препарата для кроликов массой 2-2,5 кг является доза I мг (0,4 мг на I кг массы), что соответствует содержимому 3 млрд микробных клеток. Уменьшение дозы препарата не дает возможности получить высокий уровень титров агглютининов в крови. Увеличение дозы более I мг не приводит к адекватному увеличению титров агглютининов в крови ко всем антигенам, входящим в состав препарата.

Влияние интервала иммунизации на антителогенез. Три группы кроликов (по 4 животных) иммунизировали комплексным препаратом двукратно, внутримышечно в дозе I мг с различными интервалами. Дозу препарата растворяли в I мл стерильного 0,8%-ного раствора хлорида натрия.

Кроликов 1-й группы реиммунизировали с интервалом 7 дней, 2-й - с интервалом 14 дней, 3-й группы - с интервалом 21 день. Перед введением препарата, а также через каждые 7 суток в сыворотках крови кроликов определяли титры агглютининов в РА ко всем антигенам, входящим в состав препарата.

Исследования показали, что в крови кроликов всех групп через 7- дней после первой иммунизации титры агглютининов составляли 7,32+0,01 - 8,32+0,01 лог.

У животных ревакцинированных через 7 сут. титры агглютининов к седьмому дню после реиммунизации (14 дней после начала опыта) достоверно повысились на 2-3 лог и составляли в среднем 10,32+0,01 лог ко всем антигенам. В дальнейшем повышение титров (продолжавшаяся до 35 дней) было незначительным (на 0,5-1 лог), а с 35 дня началось снижение и к 42 дню составляли 9,32+0,01 - 10,32+0,01 лог.

У животных ревакциннрованных через 14 дней (2-я группа) через неделю после ревакцинации титры агглютининов достоверно повысились на 2-3 лог, далее они оставались.на уровне "11,32+0,01 (до 35 дня), после чего началось снижение.

У яивотнчх, резакиинированных через 21 день (3-я группа) вторая вакцинация практически не стимулировала более интенсивный анти-телогенез. Через 7 дне": после ревакцинации повышение уровня агглютининов было незначительно (на 0,5-1 лог), после чего уровень агглютининов удерживался в течение недели без изменений и с 35 дня'стал снижаться. К 42 дню титры составлял;: в среднем 10,32+0,01 лог.

Из этого опыта следует, что оптимальным интервалом между первой и второй инъекциями препарата является 7-14 сут., так как при таких интервалах вторичный иммунный ответ выражен более четко. Интервал 21 сут менее эффективен, так как вторая инъекция практически не оказала заметного влияния на антителогенез.

Определение оптимальных доз препарата на антителообразование при двукратной иммунизации. Кроликов массой 2-2,5 кг иммунизировали внутримышечно, двукратно с интервалом 10 дней, разными дозами препарата. Кроликам 1-й группы ввели препарат в дозе 0,25 мг и I мг, 2-й группы - I мг и 0,25 мг, 3-й группы - I мг и I мг, 4-й группы -I мг и 2 мг. В каждой группе было по 4 кролика.

Также как и в предыдущих опытах сыворотку крови животных исследовали на содержание агглютининов к компонентам препарата через каждые 7 суток (7, 14, 21 и 28 сут.).

В результате установлено, что титры агглютининов в сыворотке крови кроликов I группы, получивших первую дозу 0,25 мг препарата к 10 дню были на 1-2 лог ниже (6,32+0,01 - 7,32+0,01), чем у кроликов других групп, получивших по I мг препарата (7,82+0,62 - 8,82+ 0,62 лог) (Р < 0,05).

После второй иммунизации у кроликов 1-й группы (доза 0,25 + I мг) титры агглютининов также достоверно были ниже (8,32+10,82), чем у кроликов всех остальных груш (10,32+0,01 - 12,32+0,01 лог) (Р< 0,005). Таким образом, уменьшение дозы при второй иммунизации до 0,25 мг (2-я группа), а также увеличение до 2 мг (4-я группа) не оказали существенного влияния на уровень антителогенеза. Следовательно, наиболее целесообразно использовать равные дозы (I + I мг), способствующе более интенсивному антителообразованию.

Изучение иммуногенности препарата на белых мышах. Две группы мышей (по 40 голов) иммунизировали однократно подкопно в область спины комплексным препаратом в дозе 0,5 мкг на мышь.

На 20 день после иммунизации 1-ю группу (40 голов) опытных (вакцинированных) и 2-ю группу (40 голов) контрольных (неиммунизиро-вачных) мышей заразили культурой s.choleraeGuis в д03ах 10,

100; 1000 и 10000 микробных клеток. Культуру вводили мышам внутри-брюпинно, по 10 мышей (опыт и контроль) на каждую дозу.

Аналогично 3-ю группу (40 голов) опытных (иммунизированных) и 4-ю группу (40 голов) контрольных мышей заразили живой культурой s.typhimurium в таких же дозах и таких же объемах. За за-

раженными мышами вели наблюдение в течение 14 дней, отмечая число павлих на каждую дозу заражения. Результаты обрабатывали по Риду-Мен-чу, рассчитывали ДЕвд для иммунизированных и контрольных мышей. Разница мевду этими показателями принимали за показатель иммуногенности препарата.

Было установлено, что Л^о культуры s. cüoleraesuis для иммунизированных мышей составила 80 микробных клеток, а для контрольных - 8 микробных клеток; ЛД^ культуры «.typhimuriuir. для опытной группы мышей составила 50С0 микробных клеток, тогда как для мнг;сй контрольной (неиммунизировакной) группы этот показатель был

равен 80 микробных клеток.

Следовательно, однократная иммунизация мышей препаратом в дозе 0,5 мкг обеспечивает повышение устойчивости к заражению З.с1ю1егае-эихз в 10 раз, а к э^урЫтиг:шт в 63 раза по сравнению с неиммунизированнкми животными.

Изучение реактогенности, безвредности и иммуногенности лизат-препарата на свиноматках и" поросятах. Опыты проводили в свинокомплексе совхоза "Губкинский" Белгородской области.

Для изучения безвредности препарата 5 свиноматкам за 16-17 дней до опороса ввели однократно препарат в дозе 15 мг сухого вещества, что составило 3 прививочные дозы. Десяти поросятам 35-дневного возраста также ввели однократно препарат в дозе 1С мг, что составило также 3 прививочные дозы. Препарат вводили внутримышечно в область шеи, растворив в 0,8^—ном растворе хлорида натрия.

У животных измеряли температуру тела и вели наблюдение в течение Ю дней. Ни у свиноматок, ни у поросят после введения препарата на месте введения ке отмечено воспалительной реакции. В течение первых суток у двух из 5 свиноматок отмечено повышение температуры тела до 40,5 °С. В следующие дни ни у свиноматок, ни у поросят не наблюдали каких-либо отклонений в состоянии здоровья - все кивотнке были активны и хорошо поедали корм.

Все 5 свиноматок опоросились в срок, от них получено по 9-10 поросят, которые не имели никаких видимых отклонений.

Следовательно, 3-х кратные дозы препарата 15 мг (для свиноматок) и 10 мг (для поросят), что соответствует содержимому 45 и 30 млрд микробных клеток, являлись безвредными.

Реактогенность препарата изучали аналогично безвредности, только свиноматкам внутримышечно вврдили 5 мг, сухого препарата (I иммунизирующая доза), а поросятам 3 мг препарата, растворенного в I мл

стерильного раствора хлорида натрия. Наблюдение за животными вели в течение 10 дней. На месте введения препарата не отмечено никакой воспалительной реакции. Температура тела у всех животных была в норме, все кивотные были активны и хорошо поедали корм. Свиноматки опоросились в срок и от них получено по 9-10 здоровых поросят. Следовательно, дозы препарата 5 мг для свиноматок и 3 мг для поросят (что соответствует содержимому 15 и 9 млрд микробных клеток) не вызывает у животных видимой клинической реакции, что указывает на ареактоген-ность препарата.

Изучение иммуногенности препарата на свиноматках и поросятах.

Группе супоросных свиноматок (54 головы) за 16-18 дней до ожидаемого опороса ввели внутримышечно препарат в дозе 5 мг. Препарат разводили в I ил стерильного 0,8%-ного раствора хлорида натрия.

Вторую группу свиноматок (56 голов) того же хозяйства привили трехкратно вакциной ППД (за 35, 25 и 15 дней до опороса) и двукратно (за 25 и 15 дней до опороса) форыолтиомерсаловой вакциной против ко-л;;бактериоза. Из обоих групп были забиркованы по 10 свиноматок для проведения исследований.

Перед вакцинацией и через 16 дней после иммунизации у свиноматок взяли кровь и в сыворотках'крови определили титр агглютининов ко всем компонентам препарата.

Установлено, что титры агглютининов в крови опытных свиноматок пег:?д иммунизацией препаратом были ниже, чем у контрольных и состав-лг.;;п соответственно 1,23+0,01 - 2,72+0,14 лог и 3,21+0,14 - 3,84+ 0,14 лог. Однако после иммунизации препаратом титры агглютининов у оге-Тгнх свиноматок к холерасуис и тиифимуриум существенно повысились и составляли соответственно 7,46+0,28 и 7,88+0,14 лог, тогда как у контрольных титры агглютининов были в пределах 5,00+0,28 и 7,00+0,28 лог.

В день опороса у тех же свиноматок получили молозиво и в РА определили титр молозивных агглютининов. Показано, что в молозиве опытных свиноматок титры агглютининов к антигенам из сальмонелл были значительно выше, чем в молозиве контрольных и составляли соответственно 11,02+0,32 и 11,52+0,21 лог и 6,12+0,21 и 10,7+0,10 лог. Разница более чем существенна (Р ^ 0,05).

Следовательно, однократная иммунизация глубокосупоросных свиноматок препаратом из лизат-антигенов обеспечивает выработку агглютининов в сыворотке крови и молозиве в более высоких титрах,-чем при трехкратной иммунизации контрольных свиноматок вакциной ППД и двукратной формолтиомерсаловой вакциной против колибактериоза ко всем антигенам, входящим в состав вакцины.

Все опытные и контрольные свиноматки опоросились в срок и от них было получено по 8-9 поросят. От опытных свиноматок получено 523 поросенка, из них на одну свиноматку деловых 8,1, слабых 1,3, мертвых 0,3; в контроле соответственно всего 550, деловых 7,9, слабых 1,5, мертвых 0,3.

Приведенные данные свидетельствуют, что применение препарата в последней трети супоросности не оказывает отрицательного влияния на количество и качество получаемого потомства.

После рождения поросят и в течение подсосного периода (35 дней) за поросятами вели наблюдения, отмечая число павших и заболевших в опытной и контрольной группах.

В результате установлено, что заболеваемость и общий отход поросят, полученных от опытных свиноматок был на II и 7,6% ниже, чем в контрольной группе и составлял соответственно 30 и 21,7^ (опыт) и 41 и 29,3$ (контроль) от общего числа поросят. На доращивание передано опытных поросят на 11% больше, чем в контрольной (соответственно 65,35? и 54,2$ от общего числа родившихся поросят).

При вскрытии 70 трупов контрольных и 95 трупов опытных поросят установлено, что в обоих грушах в 37$ и 40$ случаях причиной падежа явились заболевания желудочно-кишечного тракта (гастроэнтериты), в 38$ и 42$ респираторные заболевания (плевропневмонии), асфиксии (задавленность) составили 22$ (контроль) и 21$ (опыт). При бактериологическом исследовании сальмонеллы из органов трупов не выделены, а патогенные эшерихии выделили из органов контрольных поросят в 15 случаях, опытных - в 10 случаях.

В 35-дневном возрасте поросят обоих групп передали на участок дорацивания со средним весом опытных 7,73 кг, контрольных 7,32 кг. На участке доращивания из переданных поросят сформировали 3 группы (I и 2-я опытные и 3-я -. контрольная). Поросят 1-й группы (118 голов) привили поликомпонентным препаратом однократно в возрасте 35 дней, поросят 2-Я группы (217 голов) - двукратно в 35 и 45-дневном возрасте. Эти две группы были сформированы из поросят, полученных от опытных свиноматок. Препарат вводили внутримышечно в дозе 0,4 мкг на I кг массы (3 мг на I голову). Сухой препарат разводили в I мл 0,8$-ного раствора хлорида натрия. Поросят 3-й группы (760 голов), полученных от контрольных свиноматок, вакцинированных по схеме, принятой в комплексе, привили вакциной из штамма ТС-177 в 30-дневном возрасте.

От 10 отобранных и пронумерованных поросят каждой группы перед иммунизацией (в 30-дневном), а затем в 60-ти и 100-дневном возрасте взяли кровь и в сыворотках крови в РА определили титры агглютининов ко всем антигенам, входящим в состав препарата. Кроме того определяли белок и белковые фракции сыворотки.

Показано, что в возрасте 30 дней урове молозивннх агглютининов в крови поросят всех групп был довольно гысокий и составлял 6,49+0,2 - 7,76+0,11 лог в от-^гой группе и 6,02+0,10 - 7,92+0,10

лог в контроле (разница не существенна, так как Р<с 0,05). После иммунизации (в 60-дневном возрасте) титры агглютининов в сыворотках крови поросят 2-й группы к сальмонеллам двух сероваров достигли уровня 9,22+0,21 - 10,52+0,21 лог, тогда как в 1-й группе - 7,82+0,32 -8,12+0,32 лог, а в контроле 5,82+0,21 - 7,42+0,21 лог, т.е. у поро-.сят 2-й группы титр.т были на 2-4 лог выпе, чем у других (Р > 0,05). К 100-дневному возрасту наметилась тенденция к снижению титров, однако соотношение их по группам оставалось прежним: 2-я группа 8,02+ 0,21 - 8,72+0,10, 1-я группа 5,62+0,10 - 6,82+0,2, 3-я группа 4,51+ 0,1 - 6,12+0,10 лог. Таким образом, у поросят 2-й группы титры агглютининов также были на 2-3 лог выше, чем у других (Р ■> 0,05).

Проведенными опытами установлено, что однократное применение поликомпонентного препарата свиноматкам не менее эффективно для формирования у поросят колострального иммунитета, чем 3-х кратное применение вакцины ПЦЦ и двукратное - вакцины против колибактериоза поросят, так как в возрасте 30 дней уровень молозивных агглютининов в крови поросят всех групп (опыт и контроль) был довольно высок, а разница между титрами агглютининов в опытной и контрольной группах не существенна (Р^> 0,05).

Для иммунизации поросят наиболее эффективной оказалась двукратное применение препарата (с интервалом 10 дней). Однократная иммунизация поросят препаратом не приводит к существенному повышения титров агглютининов.

В организме контрольных- поросят после однократной иммунизации вакциной ТС-177 к 60 дню наблюдается значительное снижение титров в сравнении с уровнем молозивных агглютининов, а к 100-дневному возрасту агглютинины обнаруживаются лишь в разведениях 1:20 - 1:40.

Исследования белка и белковых фракций сывороток крови поросят показывают, что в 30-дневном возрасте у поросят всех групп наблюда^-

лась ярко выраженная гипогаммаглобулинемия. Гамма-глобулины в опытной группе составляли 7,98+0,14$, а в группе контроля 7,76+0,12% (Р ^ 0,05). Однако к 60-дневному возрасту у поросят, привитых полй-компонентным препаратом двукратно (2-я группа), уровень гамма-глобу-'линов существенно повысился и составил 20,36+0,15%, тогда как в этом возрасте уровень гамма-глобулинов у поросят, привитых однократно (1-я группа) и контрольных (3-я группа) составлял 11,63+0,33 и 10,0+0,19% соответственно. К 100-дневному возрасту уровень гамма-глобулинов у поросят всех групп существенно повысился и составлял у поросят 1-й группы 23,7+0,20%, у 2-й группы - 25,0+0,48% и 3-й группы 23,0+0,45%.

Эти данные свидетельствуют о том, что после двукратной иммунизации поликомпонентным препаратом из лизат-антигенов, состоящим из двух сероваров сальмонелл, эшерихий и стафилококка в организме поросят стимулируется В-система, вследствие чего усиливается синтез гамма-глобулинов и к 60-дневному возрасту их количество достигает нормы. Наряду с усилением синтеза гамма-глобулинов интенсифицируется выработка специфических агглютининов против всех входящих в состав препарата антигенов.

После передачи поросят на доращивание (35 дней) за ними вели наблюдение до 120 дней (т.е. до передачи на откорм), отмечая число заболевших, павших или выбывших по иным причинам.

Установлено, что за период доращивания заболеваемость в 1-й группе (вакцинированы поликомпонентным.препаратом однократно) составила 67,5%, во 2-й группе (вакцинированы двукратно) - 17,6%, в 3-й груше (вакцинированы TC-I77) - 48,3%. Общий отход по группам за этот период составил в 1-й груше 54,3%, во 2-й - 13,9%, в 3-й -39,6%.

При вскрытии 50 трупов поросят 1-й группы установлено, что ос-

новной причиной падежа явились заболевания желудочно-кишечного тракта (25 голов), падеж по причине плевропнегмонии - 20 голов, поражения сердечно-сосудистой системы обнаружены -у 5 голов. У 25 трупов вскрытых поросят 2-й группы основной-причиной падежа явились болезни, связанные с респираторными заболеваниями (17 голов), гастроэнтерит - 3 гол, поражения сердечно-сосудистой системы у 5 голов. Из обследованных 140 трупов поросят 3-й группы основной причиной падежа являлись заболевания желудочно-кишечного тракта (90 голов), плевропневмонии (40 голов) и нарушения сердечно-сосудистой системы (10 голов).

При бактериологическом исследовании трупов поросят 1-й группы сальмонеллы выделены из органов 4 поросят (6$), патогенные эшерихии от 6 поросят (9$). При исследовании трупов поросят 2-й группы сальмонеллы не выделены, а патогенные эшерихии - в 3-х случаях. При исследовании трупов поросят 3-й группы сальмонеллы выделены в 20 случаях (14$), патогенные эшерихии в 27 случаях (20$).

Анализ сохранности поросят показал, что двукратная иммунизация поликомпонентным препаратом поросят, полученных от свиноматок, привитых однократно тем же препаратом, позволила сохранить в период дора-щивания 86,2$ поросят, что на 24,8$ больше, чем в контрольной группе.

3. В Ы В О Д Ы

I. Штаммы S.choleraesuis К 37ü, S.typhimurium У 415 u E.coli №87, выделенные от больных поросят и селекционированные по признаку вирулентности, обладают стабильными биологическими свойствами и высокой вирулентностью, что делает возможным использовать их для изготовления лизат-антигенов с целью дальнейшего изучения их антигенных и иммуногенных свойств.

Штамм Staph.aureus J,*' 1991, полученный из НИКИ им. Тарасевича, содержит в своем составе до 50$ пептидогликанового комплекса, что

позволило испытать лизат-антигены из этого штамма в качестве неспецифического иммуномодулятора.

2. Лизат-антигены, полученные из указанных штаммов, ареактоген-ны и безвредны для лабораторных животных, свиноматок глубокой супо-росности и поросят 30-35-дневного возраста. Они обладает-высокой антигенной активностью для лабораторных животных и свиней различного возраста как при раздельном, так и при сочетанном использовании.

•3. Сочетанное использование лизат-антигенов в равных количествах не сопровождается в организме антагонизмом по отношении друг к ДРУГУ, а наоборот, показало их взаимодействие по принципу синергизма, что приводит к суммацил антигенного раздранения и стимуляции ан-тителогенеза.

4. Лизат-антигены обладают выраженными иммуногенными свойствами для лабораторных животных и свиней различного возраста,- что проявляется образование?*! достаточно большого количества агглютининов. Оптимальной иммунизирующей дозой для кроликов живой массой 2-2,5 кг является I мг, для поросят в возрасте 30-40 дней - I мг, для супоросных свиноматок - 5 мг на голову.

У мышей, привитых поликомпонентным препаратом из лизат-антигенов устойчивость к заражению S.choleraesuis повышается в 10 раз,

а s.typhimuriixm - в 63 раза.

5. Препарат, приготовленный на основе лизат-антигенов, вызывает наиболее выраженный специфический иммунный ответ при его двукратном применении в равных дозах с интервалом между инъекциями в 7-14 дней.

6. Однократная прививка препаратом супоросных свиноматок за 18-20 дней до ожидаемого опороса обеспечивает образование в организме и накопление агглютининов в сыворотке крови и молозиве в высоких титрах, обуславливая колостральный иммунитет у полученных от этих

свиноматок поросят против эшерихий и сальмонелл.

7. Колостральний иммунитет против эшерихий и сальмонелл у поросят сохраняется до 30-35 дневного возраста. Поэтому активную иммунизацию поросят целесообразно проводить в возрасте 30-35 и 35-40 дней. Такая схема иммунизации обеспечивает защиту поросят до 110-120-дневного возраста (срок наблюдения).

8. Двукратное применение поликомпонентного препарата поросятам с выраженной постнатальной гипогаммаглобулинемией позволяет нормализовать уровень гсг-ма-глобулшов к 60-дневному возрасту, что очевидно связано с иммуномодулирующим действием пепмщоглпкана

Таким образом, препарат, приготовленный на основе лизат-пнтигснов помимо специфического, обладает и неспецифическим иммуностимулирующим действием.

9. Экспериментальная серия препарата при его применении в качества средства профилактики в низких дозах в условиях неблагополучного хозяйства позволила повысить сохранность в опытных группах поросят на 24,8Í? по сравнению с контрольными группами. Эти данные позволяют рассматривать препарат как перспективный для создания Еысокоимму-ногенных, ареактогенннх моно- или поликомпонентных'вакцин для профилактики сальмонеллеза и эшерихиоза.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лизат-антигекы из высоковирулентных штаммов сальмонелл ( a.cho-leraesuis п 370 и s.typhijiuriun ]% 415) ц эшерихий (E.coli

Г" 87), а также пептидогликановый комплекс стафилококка ( ñtaphyiococ-

cua aureus

штамм 1991), получаемые по разработанной технологии, рекомендуется использовать как вакцинный препарат для профилактики сальмонеллеза и колибактериоза и коррекции первичного, иммунодефицита у поросят в хозяйствах и свинокомплексах.

С целью усиления иммуногенности и иммунокоррелирующей активное-

ти лизаг-антигенов, целесообразны дальнейшие исследования по конструированию на их основе вакцины с разными адъювантами.

По теме диссертации опубликиваны следующие работы:

1. Сидоров U.A., Субботин В.В., Кудрявцев В.В., Столяренко В.Т. Специфическая профилактика сальмонеллезов у свиней // Ветеринария, 1992. Р 6.

2. Кудрявцев В.В., Сидоров U.A. Антигенность и иммуногенность бесклеточной вакцины против сальмонеллеза и колибактериоза поросят// "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка": Тезисы докладов научн.-практ.конф. ВИЭВ, апрель 1992.

Заказ 241

Тирах 100

Формат 60x84/16 - 1.5 п.л. - 1.56 уч.-изд.л.

П

"Полиграфе ервис" ,ул.Талалихина, 26