Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические свойства парновируса собак, лабораторная диагностика болезни

ч Г. р » * г

министерство сельского хозяйства российской федерации всероссийския научно- исс лышательския институт контроля, стандартизации и сертификация ветеринарных препаратов

На правах рукописи.

УДК 619: 618. 98: Б78. 822. 2: Б76.077. Э: 635. 7

РАХЫАШША (Ьргерига ИихаЛлоша.

бкогогкческкв свойства парвовкрусд собак,

лабораторная диагностика болезни

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, апивоотология, микология и иммунология

АВТОРЕгКРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Иэсква - 1993.

Работа выполнена в лаборатории контроля и стандартивации препаратов, применяемых в звероводстве, Всероссийского государственного научно - исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов ДОХ 1 .¡сийской Федерации.

Научные руководители: sacлуженный деятель науки РСФСР,

доктор ветеринарных наук, профессор А. В. Селив-чов, ' доктор ветеринарных наук

- в. И. Улаоов.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Б. Г. Орлянкин (ВИЭВ), кандидат ветеринарных наук ЕИ. Смоленский (ВГНКИ).

Ведущая организация - научно - исследовательский институт пушного авероводства и кролиководства им. В. А. Афанасьева.

Защита состоится С/^ОЛ'^ 1993 г. в "_" часов

на заседании Специализированного совета Д. 120.86.01 при Всероссийском научно-исследовательском инс-чтуте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов МЗХ Российской Федерации по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, Б, ВГНКИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ.

Автореферат равослан «/К ¡/¿Ус2^£- 1993 г. Ученый секретарь

Специализированного совета П. А. Козырев

ОБЩАЯ XAPAKTEPIiCTl^ Л РАБОТЫ.

Агсгуалы гость кемы. Пар^овкрусный энтерит - одно иэ наиболее распространенных инфекционных ваболеваний собак. Первые вспышки геморрагической диареи щзнят с высокой (до 8D X) смертностью были варегиатрироввны Eugester и war in в Ii. J г. в США (штат Техас). Парвовирус собак, явившийся причиной этой инфекции,' иыл впервые выделен в Америке в 1978 г. - Appel, Eugester et al. Распространение болевни носило характер пандемии и в период с 1978 по 19В1 год охватило все континенты мира. В нашей стране парвовирусннй энтерит регистрируется с 1980 года. Тогда жэ Сулимовым А. А. и др. был получен в культуре клеток его возбудитель,этими кг учеными положено начало в отечественном изучении штодоа диагностики и профи—лтики болевни.

Имеющиеся к настоящему времени данные иностранной ли-ipa-туры не дают полной информации о культуральни, антигенных, фкз: пда- ки/г ¡чо с ких свойствах вируса, а иногда содержат противоречивые сведеюш. Так например, оспаривается чувствительность р.-'льтурк клеток ШЖ к парвовирусу собак, неодковначиы сведения, об антигенном отличии этого вируса от парвовирусов других ливотнкх, его способности сохранять инфекцмонностъ при хранении а рвэличных условия™ и т.д. 1'э решн ряд вопросов в отношении лабораторных методов диагностики болевни: не определены условия длительного хранения испольэуешк в РТГА эритроцитов. Пэ известен порог чувствительности электронной и кммуяноалектрон-пой мииросгапии. ■ Налоиэучэка возможное ь приданвши иммуннофэ-рмэнткаго метода. Отечественные публикации, посвящь..лкэ решению этих проблем, единичны. В натай стране нет набора ддл диагностики парвоЕирусного энтерита.

Тшай! образом, несмотря на широтоэ распространение болэо-

ни, она изучена недостачио, чем и вызвана необходимость исследования биологических свойств парвовируса собак, поиска оптимального метода его идентификации и создания диагностического кого набора.

Цель рабсггы. Изучение некоторых биологических свойств парвовируса собак и поиск оптимальных методов диагностики пар-вовирусного энтерита собак.

Задачи ксследапаикя. 1. Идентифицирован и выделить в культурах клеток 2-4 иэолята парвовируса от собак из различных регионов страны.

2. Изучить некоторые биологические свойства получонкьи: пэолятов парвовируса:

- спектр гемагглпмгинирущэй активности,

- устойчивость к фиеико-химнческим факторам,

- чувствительность некоторых видов лабораторных кивотньвс,

- антигенное родство изолягов между собой и другим! парвовирусами плотоядных в перекрестной РТГА,

- возмоляост. культивирования в различных первично трип-синизированных и перевиваемых культурах "поток.

3. Разработать аффективный меход получения специфических сывороток.

4. Провести сравнительные исследования чувствительности раеличных методов диагностики парвовирусного энтерита собак ( РГА, РТГА, электронной и иммунноэлектронной микроскопии, выделения вируса в культурах клеток, ИФА ), предложить оптимальный и разработать нормативно-техническую документацию. '•

Научная новизна. Изучена возможность применения для диагностики парвовирусного энтерита собак РГА и РТГА, электронной и иммунноэлектронной микроскопии, выделения вируса в культурах клеток, ИФА.

Определены оптимальные условия хранения испольвуемых в РТГА нативных свиных эритроцк эв и возможность их фиксации формалином или глутаровым альдегидом, а также лиофиливации.

разработана эффективная схема получения высокоактивных в РТГА диагностических сывороток. '

Исследована чувствительность некоторк" первичных и перевиваемых культур клеток к парвовирусу собак.

Установлено влияние сывороточных компонентов ростовых сред на рзпродукцига в чувствительных культурах клеток антиген-но родственных парвовирусов собак, кошек и норок.

Практическая цешшеть работы. Равработана и утверждена ГУВ НЗХ СССР нормативно.- техническая документация на " Набор для диагностики парвовкрусных инфекций плотоядных в РТГА".

Предложено испольвование в РГА и РТГА фиксированных формалином или глутвровьы альдегидом, а также лиофшшеированншс эритроцитов свиней. -

Отработана аффективная схема гипериммуниэации кроликов и ков малыми доэаыи антигена с использованием эффэ'"^а "иммунной памяти". . '

Внесены изменения и дополнения в наставления по изготовлении вакцины против энтерита, ботулизма и псэвдомоноаа корок V вакцины протиз аденовирусных инфекций и парвовирусного энтерита собзк, учитывающк влияние сьшороточного 1«эмпонента в составе ростовых кудьтуралькшс сред на интенсивность накопления геизгглютининов в культурах клеток.

Дпрсбщлз рзЛотн. Проведены комиссионные испытания: в ВГНКй .-польвованга <*ормалиниэированных эритроцитов свиней для диагностики парвовирусиого энтерита собак в РТ'Лг На. базе А. О. "Д. 1&эай"( г. Москва) к М. П. "Про: ресс"(г. Армавир) - испо-

дьзования неактивных в РТГА сывороток для культивирования пар-вовирусов плотоядных в промышленных условиях.

Материалы исследований доложены и обсуждены на

1. XI конференции молодых ученых (г.Москва,ВГНКИ, 01.1989 г.),

2. XII конференции молодых ученых ( г. Ыосква, ВГНКИ, 01.1990 г.),

3. Всесоювной научной конференции (г.Шсква, 14-16.05.1991 г.),

4. Ill Всесоювной конференции по эпивоотологии (г.Новосибирск, 24-26.09.1991 г.),

_/

6. XIII конференции молодых ученых ( г. Москва, ВГНКИ, 1692 г.), 6. Ыетодкоыиссии (г.Москва,ВГНКИ, 12.1992 г.), Публикации: По Материалам диссертации опубликовано Б статей. О&ьек п структура ряВты Диссертация наложена на IMS страницах печатного текста и состоит, из разделов: введение, обаор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложе-зкение. Работа содержит 14 таблиц,. 11 графиков, 6 фотография. Список литературы включает 253 наименования источников в т.ч. 232 зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. ЖГЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ С целью обнаружения и идентификации паржлшруса собак было исследовано 12Б проб кала от больных и 27 пр_5 содержимого кишечника от павших собак из различных регионов нашей страны. Патматериал исследовали в РГА и РТГА с эритроцитами свиней, фосфатно-буферным раствором рН 6,6 и специфическими сыворотками, полученными на кроликах.

Наряду с пятью выделенными в процессе исследований йволя-тами парвовируса собак в работе были использованы штаммы: пар-вовируса собак "Дан", панлейкопении кошек "Ганнибал", энтерита корок "Береговой" и "Родники".

- Б -

-"ЗУЧШа ШОШГИЧЕСЯНХ СВОЙСТВ ПЛРШШ{РУСА COEAÍL РакгзгиатяЕирувгадя активн-от* вирусов изучали с эритроцитами свиньи, зелзкоЛ мартышки, быка, барана, ковы, кошки, нутрии, норки, песца, хорька, собаки, белой крысы, кролика, человека.

При изучении культуралынкг свойств парвовируса собак использовали первнчнэ тркпсиниэкроваякыэ к су' /льтуры клеток фи-броблйстов эмЗризкоз кур и перепелов, почек эмбрионов ■•виньи и коровы, почек крольчат, котят, щгтгаз, селезенки котенка, .тосглпулээ бкса и перевизезтга линии клэток: 1DCK (почки собаки), 1SE2Í (почхл Скка), Ш (легкого норкет^, CrFK (почки котенка), Varo (паяли евлзкэй м&гтьссш).

ИоссадоБй..;: пригодность д.т.л культивирован!..! парвовируса ooZs?: розтачп?г: оыворо?гк (а егсойки: - количество серий)! крупного рогатого скота (10), пло^оз короз (12), беэмолозивн^с те-т:-т (3), ¡-¡¡да (Г), еэверк^: оленей (8), овец (7), суягнш: овец (О), rzs.-pn от.=ц (7), пупозккы ъмовегс. (2).

^зсиявльнозть той нп: иной культура клеток i: вирусу кэ урйвг.д нвиоплэккл в ней г&магглкс;,: "нов. Ероводл .tmz-Ji отСс-" пг-оЗ, кэучзхя динамику каиопхенк* гемагглгатн-югпз a ксэгок почэк чэтеюи г. ш при заражзшкк

в ёусгакзгз keí-io-í пря яосадкг к на юноохэЛ. 5-л?Зэяционяу» е::-T.T9r*KST» вируса устанавливал: мэто^оы пггровакк: в пробирочзю «?упгуг5Х íttixr:; гэчзк котехкз, 2ЛЭСК, CrFK, Vero.

?а2чз£*£якзг?-> Ыфзгаа к хяороЗор^у опрздэязш! по методу Uí-уг и 022-21(1031), к е£::ру - Ftovesso и Eurkí (1973), pH сроду -Miyr(197?). P£fsí"icT0K?KO2Tb к действу» температур - прк зсршге-шп! каттакь.. сорусов в темпэратурпих ре киках - кинус 20°С и Stl°С а тэчэшга года, 18*2»С и 87°С - суток, Бб'С ¡ ЗОсС - часа, Определяли нзмэнетк активности (а РГА) и инфекционное?«

- 6 - . (по отношению к MOCK) штамма "Дан" и иэолятов парвовируса под действием указанных факторов , a также после мик~ ^фильтрации проб черев ^ильтры "Миллипоу" с диаметром пор 25 нм.

Опыты по изучению амтиге ото родства пяти выделенных изолятов парвовируса собак с вышеуказанными штаммами парвови-русов плотоядных проводили в перекрестной РТГА с гипериммунны-)я сыворотками, полученными на каждый ив штаммов и иэолятов вируса на кроликах.

При определении чувствительности лаборатории гаакижьи н глЯриагюа к парвовирусу собак исполъвоволи 02 собаки, 69 кошек, 120 кроликов, 100 морских свинок, 200 белых крыс, SCO белых мышей, а также, куриные -эмбрионы 10-11 -дневные - 60 штук. Вирус, полученный в культуре клеток почек котенка (титр в РГА 1:1024) вводили животным одним из способов: орально, внутримышечно, внутрибрюшинно, кроме того, кошкам и собакам внут-рикишечно, собакам и кроликам - внутривенно в доаах:0,3 мл белым мышам, 0, Б мл белым крысам, 1,0 мл морским свинкам, 2,0 мл кроликам, 3,0 мл к кам и 3,0-5,0 мл собакам. Трехкратно еженедельно брали пробы крови животных для исследования в РГГА и ежедневно - кала для исследования г РГА и РТГА. Куриные эмбрионы заражали в аллантоисную полость и на хориаллантоисную оболочку по общепринятым метода. Черев 48 и 72 чр-'а инкубирований их при 37°С определяли накопление гемагглютининов. в аллантоис-ной жидкости и наличие поражений на хориаллантоисной оболочка.

РАЗРАБОТКА 1ШШ02ШГГ03 НАБОРА ДЛЯ даГЕОСПйШ ЛАРВОЗИРУСЗйК ННйКНЦНЙ ПЛОТОЯДНЫХ В РГА Л РТГА.

В качестве продуцентов сывороток крови использовали кроликов и' коэлов. Антиге1гОЫ служил культуральный парвовирус собак, который вводили одной группе кроликов еженедельно внутри-

мышечно v ткрехкратно, и еще черев неделю - внутривенно, другой группе - двукратно с HHTej._1ал<-ч 6 недель, испольвуя"эффект имунной памяти". Контрольным животным проивводили аналогичные инъекции культуральной жидкости без вируса. Коблов иммунизировали двукратно с интервалом 2 месяца.

Были изучены некоторые условия станда иэации РГА и РТГА. Фиксацию эритроцитов свиней проводили путем диализа прс ив форма "ина или глутарового альдегида, а лиофиливацию - на предложенных длг: этого В. И. Юга ом (ЕЙЭВ) сахароэожелатиновой и саха-poso - поливинилпирролидоновой средах высушивания.

Дквгшстизгу паг>Еожфусипт,о энтерита ссбая осуществляли методами РТГА (с применением приготовленного нами набора"'. электронной к иммушгаэдектраиной ьякраскопки, ИФА и выделения вируса культурах клеток почек котенка и MDCK. Еьши исследованы 40 образцов патматериала, полученного от собак, использованных в опытах по изучению патогенной»! изолятов вируса. Электронная и иммунно'эяектронная микроскопия проведены совместно сь старшим научным сотрудником лаборатории шм рументальньп: методов контроля и лиофилиэации ВГНКЙ Ю. К. Могильным. Применяя метод негативного контрастирова"-ия, исследовали 28 ультрафиль-трованшх шах хлороформобработаиных проб с гемагглвтипируккцэй активностью 1: 4-1: Б24288. При получении отрицательных результатов, материал подвергали ультрацзнтрийутированию к повторно исследовали в ITA п под алагарошшм микроокопок. Кммунноэлгк-троннуа микроокопип осуществляли по методу, основанному на по-вытанш иммзпгаоспецифкчвскзй адсорбционной способности пленкя-подхогпм, pi зраОотаикоку ¡1 IL Йэгшаньа: (ВШШ) и В. Г. Орлинкп-пш1 (БЙ32) (ifeiiO f.).

Чкя ендэлэшм вируса испольвопали куяътури клеток почзн

котят и MDCK, которые варажали ультрафильтрованными или хлоро-формобработанными пробами. Результат считали пот жителышм в случае обнаружения специфических гемагглютининов хотя бы в одном из трех последовательных ш. .сажей клеток.

Иммунноферментный анализ проводили на базе лаборатории инструментальных методов контроля и лиофилизации ВГНКИ под руководством ваведующего лабораторией 3, О. Еогаутдинова. Использовали "сендвич" метод. "Чтение" реакций п. оизисдили на фотометре NR-580 "Dynatex" при оптической плотности 4Б0 нм.

При анализе и обобщении результатов исследований делали статистическую обработку по общепринятым б биологии методам. В качестве доверительного интервала был выбран уровень вероятности Р-0,96 (уровень рначимости р-0,05), .Данные, полученные при титрован™ вирусов на культурах клеток обработаны по методу Рида - Мзнча. Учет совпадений результатов, чувствительности и специфичности диагностических методов проводзгли по матоду Foe-child (1968).

р; ультаты исхзяедозашз!

5!де1отфеащия и ицдзлвш» касыютои кзрждагчда! соСшЬ' При исследовании в РГА 152 проб патматериала (табл.1), полученного от подозрительных по заболеванию парвовируснкм энтеритом собак, а БО (32,9%) отмечали отсутствие агглютинации а 10 (11,6%) -титры колебались от 1:4 до 1:64, но при идентификации гемаг-глютинирующис агентов в РТГА получен отрицательный результат, а после обработки этих проб хлороформом титры агглатлнкнрэ во всех 18 образцах снижались и не превышали 1:2. • Выделение вируса в культуре клеток почки котенка из ати;с проб и алектрон-ная микроскопия такке дали отрицательные результаты.

В остальных 84 (ББ,ЗХ) пробах патматериала титры гешглэ-

Таблица 1

Результаты идентификации и выделения в культуре клеток парвовируса с.-баг ив полевого материала ( укавано количество проб).

Метод исследования Исследованный материал РГА Электронная микроскопия Выделение вируса при заражении СККПК

РТГА на монослои в суспэнэию

+ + - +

Пробы кала Пробы содержимого кишечника 71 12 42 13 6 8 20 6 2 2 6 117 1 26 Г 114 3 24

Итого 84 18 60 22 8 9 143 14 138

Всего исследовано 152 30 1Б2 162

тининов колебались от. 1: 8 до 1! Б24288, а геммагглюнитирующий агент был идентифицирован в РТГА как парвовирус. Обработка, этих образцов хлороформом и микрофильтрация не влияли к - их гемагглмтинирующую активность. При электронной микроскопии 22 ио этих 84 проб, имевших титры в РГА 1:8 - 1: 624288, во всех обраецах были обнаружены вирусные частицы размером 20-22 нм, Морфологически сходные о парвовирусом. Попытки в деления парвовируса собак иэ положительно прореагировавших 84 проб патма-териала в культуре клеток почки котенка не всегда были успешны: удалось выделелить 14 иэолятов вируса.

Пять ив иэолятов парвовируса собак, полученных иэ патма-териалв, доставленного иэ городов Львова(иэолят N1), Алма-Аты {иэолят N2), Сортовалы(иэолят N3), Москвы(иэолят N4), Московской области (питомник МВД)-(иэолят N5) наряду со штаммом парвовируса собак "Дан", были испольвованы для изучения биологических СВОЙ! ¿в.

Ангина некоторые эпизоотических данньи, в части :ти, возрастной, половой и породной принадлежности собак, при иссладо-

вании патматериала от которых был подтвержден парвовирусный антерит, показал, что болезнь зарегистрирована в 76 X случаев у щенков -»-6 месячного вовраста. Очевидных вакономерностей в отношении большей чувствителы лти к болезни тех или иных пород и пола животных не установлено.

Широкое распространенна парвовзфушюй инфекции показало проведенное нами исследование в РТГА со специфическим антигенам 240 сывороток крови 2 групп клинически здоровых собши первой - не привитых против парвовируеного витерита (S3 проб)- и второй - бездомных животных, отловленных.и доставленных на ЫЬ-светстанцшо (141 проба). Специфические антитела были, обнаружены у 97 собак первой группы и 107 - второй, титры колебались от 1:4 до 1:6ББ36. Их' минимальные вначения регистрировались у 2-3 месячных собак, интактные п$енки были, выявлены только е этом возрасте.

Изучение спзгетра. геыа1гггоиавц>у1щаЯ шягаашэсхи парвовируса собак показало, что наивысшие титры в РГА он проявлял с- эритроцитами свиньи и зеленой мартышки, несколько ню® - кошки, нутрии, кролика, мало- или неактивны были эритроциты барана, козы, белой крысы, пеоца, норки, хорька, человека, коровы, собаки. Специфичность агглютинаций была подтверждена в РТГА.

Обработка эритроцитов раствором трипсина давала возможность повысить их чувствительность, которая -возрастала по сравнению с исходной на 2-3 log у эритроцитов свиньи и зеленой

2

мартышки; 1-3 log - кошки, нутрии, ковы, норки; однако у кро-2

личьих - снижалась, а крысиные и хорька - самоагглютинировали.

При изучении цультураяьнш свойств парвовируса собак уста-нозили, что сыворотки, примеяемые в качестве компонентов ростовых сред, могут обладать тормовяпрй геммагглютинация актив-

Таблица 2.

Активность в РТГА сывоооток, используемых в качестве компонентов ростс^ых питательных сред.

Вид сыворотки Количество исследованных серий Результат в РТГА

+ Количество серий

Титр Количество серий

Кр„.того рогатого

- скота 10 8,6+0,22 10 -

Северных оленей 3 7,7+0,33 3 -

"годов коров 12 3,3±0,42 6 6

пКОВ Б 3,2+0,37 Б -

Овец 7 1,Б±0,Б0 2 Б

Беэмолозивных телят 3 1,3+0,33 3 . - ■

Суягных овец Б 1,3+0,?'? 3 2

Шюдоа овец 7 - - 7

Пуповины человека 2 — - 2

ностью с антигеном парвовируса собак (та л.2).Она не снижалась после прогревания при БВ°С в течение часа и была наивысшей у всех использованных в опыте серий сывороток крупного рогатого скота и северных оленей, нивкие тиры торможения агглютинации обнаружены в сыворотках яков, ¡вести сериях сывороток плодов коров, трех из пяти исследованных серий сывороток суягных овец, двух из семи серий сывороток овец, сыворотках Севмоло-зявных телят. Не тормозили гемагглютинациш сыворотки плодов коров шести серий, овец - Б серий, суягных овец - двух серий, аса сыворотки плодов овец, пуповины человека. Накопление ге-ыаггдюгшшнов а культурах клеток при заражении их вирусом шгамш "Дан", и. иаолятами было максимальным при использовании сывороток плодов коров, беэмолоэивгчх телят, овец, плодов овец. На происходило накопления гемагглютининов им. их количество было низким в случаях применения сывороток крупного рогатого скота, северных оленей, яков, содержала большие количества акгигеыагглптинйнов. В дальнейшей работа мы использовали неактивные в РТГ '. сшзорот! I.

Накопление вируса на различных культурах клеток было эако-кономерным для Есех исследованных иэолятов. Наибо ъшее накопление гемагглютининов (1:612-1:8192) происходило в первично трипоинивированных и субкульту, ах клеток почек котенка и ШСК, высокие титры гемагглютининов (1:128-ls 2048) подучили в первичной культуре клеток селезенки копки и перевиваемых - CrFK, Vero, меньшее - в культуре клеток почек собаки (1:16-1:32), и невначительное - при заражении культур кав'.ж фибробластов эмбрионов кур и перепелов, почек эмбрионов свиней и эмбрионов коров, тестикулов быка, почек крольчонка, а ив перевиваемых -ШЕК. Видимого цитопатического действия ни в одном случае пар-вовирус не проявлял.

Методом титрования изучаемых иэолятов вируса на культурах клеток почек котят, MDCK, CrFK, Vero определяли их инфэкцион-ность, о которой .судили по накоплению гемагглютининов в соответствующих разведениях (табл. Э).

Таблица 3.

Инфекционнооть парвовируса штамма "Дан" и иэолятов для субкул. .'уры клеток почек котенка и перевиваемых культур клеток ШСК, CrFK, Vero ( ИД 60/мл, lg).

Культура Почек Vero

клеток котенка MDCK CrFK

Иаолят

N1 3,-67 4,67 3,67 2,6

N2 6,0 6,6 3,67 4,0

N3 6,67 6,67 4,76 3,6

N4 4,67 4,67 6,0 3,67

КБ' 6,6 6,0 4,6 4,0

"Дан" 6,6 6,6 4,76 3,6

п - 4.

Иэучение динамики накопления гемагглютининов парвовируса в культурах клеток показало, что при эаразлении их в суспензию нарастание гемагглютининов составляло . 1 в сутки, макси-

- 13 - '

мальное их накопление в кул1 туре клеток почек котенка приходилось на время полного формирования мон "¡лоя (примерно 8 сутки), а в культуре клеток УЗОК увеличивалось и при сформированном моноолое клеток, достигая максимума к 9 дню. При заражении культур клеток на монослой накопление гемагглютининов было ниже на 1-Б1ог .

г

Научение устойчивости парвовируса собак к действию некоторых физико-химических факторов показало, что изменение гем-агглютинирующей и инфекционной активности парвовируса (штамма "Дан" и иволятов) было статистически недостоверным (р < 0,05) после воздействия на него температурного режима минус 20 °С в течение двух лет, 3+1«О - одного года, 1812»С и 37»С - суток, Б6°С - часа (сроки наблюдения),' а также микрофияьтрации через фильтры""Мяллипор" с диаметром пор 2Б нм, обработок лроб хлороформом, эфиром, рН диапазона 3-9. Значительное снижение (на 3-4 инфекцг чной активности происходило после воздействия на вирус в течение часа температуры 80°С, - при этом его

активность в РГА изменилась не так значительно (на 4-6 1ог ).

2

Полученные данные свидетельствовали о. высокой устойчивости вируса к действию указанных факторов и потверидали • принадлежность выделенных иэолятов к роду Рагуоу1Г1(Зае, для представителей которого характерна нечувствительность к действию хлороформа, эфира, широкого диапазона температур и рН среды.

В РТГА установлено близкое антигенное родатво выделенных иаолятов парвовируса собак и штамма "Дан" с парвовкрусами кошек к норок. Во веек случаях отличия средних показателей тит-рсз сывороток с гетерологичными антигенами от титров с гомологичными антигенами были статистически недостоверными.

При изучении чувствительности лабораторный животных и ку-рнкых ам&рионов к парвовирусу собак установлено, что внутримышечное, внутрибрюшинное и оральное введение кулътурального пар-вовируса соба: не вызывало у них клинических проявлений энтерита, однако индуцировало выработку антигемагглютинируших гуморальных антител. Еженедельные исследования сывороток крови животных в РТГА показали, что у кроликов черев неделю после внутривенного вве~эния вируса титр: антител достигали величал (указан диапазон титров в log с равными из&лятами) 8,26+0,25 -

г

9,26+0,6; при внутримышечном и внутрибрпшинном - и,4+0,3 -6,5+0,3, оральном- 6,2Б+0,2Б - 6,2Б+°,Б. В последующие две недели происходило их постепенное снижение на 2-3 log . Ыаксиш-

г

яь:ю<- накопление антигемагглшккинов у белых мышей (10,0i0,7 -12, Б+0,3) и морских свинок (9,75+0,25 - 10,76+0,25) регистровая черев 21 день после -заражения. Сыворотки крови крыс, подученные через неделю после введений вируса имели тигры 6,0+0-8,2Б+0,Б. На п;отя™знии двух последующих недель они снизилась не более, чем на 1 log .При заражении кошек, сыворотки крови которых до введения вируса были активны в РТГА, отмечали в течение первой редели снижение титра антигемагг-иитининоз на

3-Б log , но к 21 дню они снова возрастали на 3-Б log по срав-. 2 2 нению' с исходной величиной. У инлактных животных на 21 сутки

после оаражь..яя титр антител достигал величин 11,2Б±0,Б -11,6+0,3. Вцделения вируса с фекалиями лабораторных животных в РГА не обнаружено. . '

Заражение эмбрионов кур не показало их чувствительности ни • к одному из иволятов пврвсвируса собак, а такта швлшу "Дан". Не происходило накопле ш .емагглэтининов в аплантоионой жидкости, с при заражении на хориаллтоксную оболочку патоютичзо-ких измэнен;... на ней не отмэче..о..'

- 1Б - '

Изучение хязтогсшддс свойств парвовкруса собок. При вараже-нии нативным и культуральньм парвовирусо1' БО собак с титром антител в сыворотках крови 1:64 и выше (РТГА) воспроизвести клинические проявления болезни -не удалось, выделение вируса с калом было нерегулярным (в титре не выше 1: 8 - РГА). К 4-Б дню после ааражэния собак титр гуморальных антител снимался на 2-4 log , к 14 дню он достигал первоначального уровня, а

г

к 21 - превышал его на 1-2 log .

2

четыре щенка, с титрами антигемагглгстининов до еараженш 1:8-1:16 (РТГА), на 4-Б день поело внутривенного введения на-тианого вируса втамма "Дан" и изолятов N 1 к 2 правили слабые клинические признаки болеэки, выражавшиеся в 1-2 - дневном 'недомогании, анорексии, непродолжительной рвоте. Вирус в этот период выделялся с калом в титрах. 1: 8-1: 32 (РГА) в Tt_ .екиэ 2-3 дней. Отмечала первоначальное снижение уровня гуморальных антител в сыворотке к»">ви, но к 21 дню после введения вируса он воарастал до 1:2Б6 - 1:2048 (РТГА).

Заражение £8 ийтактных е^нков во всех случаях Едекло ва собой проявление более или менее вир штанной клинической картина энтерита. Легкое переболеЕание наблюдали у 11. таких щенков, которым внутривенно, оралько ила вкутриЗрмзинно были введены культуралькые Еирусы .лли внутримышечно - катизяые; при этом ьэкоимальиое гыделенне парвовируса о калом не превысило титра 1:128 (РГА)., Уровень антител в сызоротке крови возрастал к 14 дня до 1:128- 1: Б12, а к 21 - 1:512 - 1:2048 (РТГА). Наиболее тяяздо, в 10 случаях со смертельным исходом, болевнь проявилась у 17 ¡ценкоз 2-4 месячного возраста после внутривенного, внутркбржЕияного или внутрикизечного введения натнвного вируса (штамма и всех пяти иэолятов). При остром и подостром течении

болевни парвовирус выделялся с калом в больших количествах,• что установлено в РГА и электронной микроскопией. Максимальные титры вируса(до 1:624288) регистровали в РГА в первый и второй день проявле я диареи, ватем они снижались и при подостром течении к 14 дни болеаии не превышали титра 1: 8. Со рвотными массами вирус выделялся менее интенсивно (< 1:128-РГА). Количество лейкоцитов в крови больных собак снижалось (1700+374). Уровень специфических гуморальных -адтител возрастал до 1:6 -1:266 к седьмому, до 1:266 - 1:1024 к четырнадцатому, и до 1 "512 - 1: 4096 к двадцать первому дню после варажени.

При патологоанатомическом вскрытии собак отмечали характерное для вирусного энтерита катарально - геморрагическое воспаление кишечника, а в трех случаях - миокардов.

Парвовирус обнаруживали в различных органах у 12 павших и эутанаэированных собак, его титр в РГА при исследовании содержимого тонкого отдела кишечника составил (с равными йволятами) 6,8±0,97-11,0+0,б^ог1 толстого - 6,2+0,4-13,7±0,7, селевенки -6,2+0,4-14,4+0,3, меэентериалькых лимфоузлов-4,4+0,4-11,3+0,6, сердца-1,6+0,2-6,6+0,7, желудка-1,6+0,3-3,9+0,3,печени-1,6±0,6 - 2,6+0,3, почек - 0,9+0,6-1,6+0,3, легких - < 1. ..о всех случаях специфичность агглютинаций подтверждена в РТГА.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГЖХЛИКА ПАРЕЗИРУСКОГО ЭЯГГЕРКГА СС'АК.

Получен,. ^ гкнериммуннш сывороток к парвовиру-у собак проводили на кроликах и ковлах. Сыворотки крови кроликов, которым парвовирус вводили еженедельно, имел^ титры в РТГА 1:32-11266. Большую активность (1:1024 -1:8192 в РТГА) проявили сыворои^, • полученные от кроликов, иммунизированных двукратно с двухмесячном интервалом. При 'м>, шэации козлов мы также испольвовали двукратное введение вируса и получили сыворотки о активностью в РТГА 16,7 ЛЗ. (1ое ),

Следующим этапом раСоть- *>ыло изучение сроков сохранения

активности сывороток. Иге консервировали карболовой кислотой,

добавляя ее до конечной концентрации - О.Бл, а также лиофили-

сирсаалп. Хранили при температуре. 3+1 "С и минус 20°С.

Установлено, что снижение титра антигемагглютининов лио-

филиэирсЕанных сывороток в течение двух лет (срек. наблюдения)

ко првЕкпало 0,8 log , нативных - 3 log .

2 £ Сжл-чижна^-га РГА и PIPA при диагностик» лпрншшруского

am'spicía ссСел' и прякнсьгззгз« i'-iSop-л два дзгагкэ-

cxcsi is^forjipycznjro виодгша ягяякэтякьяс a PIFA. Нами устано-зг,гзо, что опгимз-тьнБ}.« уапшшчми хранения эритроцитов является« тгюх&вовезхо 3,0 X раствора • лкмошгагскслого натрия с-добавлением антиС:хтююв, процентное,содержание антикоагулянта ::э нгяео SOX, температурный р-ежы - +3±1 сС, кепельво. jane неплотны:: 2ат::их преСек для укупорка флэисков, и периодическая (с »гггоргалом 4-3 тонсорвиругцего раствора. Цри

сЫлэдешга yKsssiizssz уелоssft пригодность нативных эритроцитов для вссгаиогка РГА'и РТГА увеличивается до 4-6 недель. - Продлять срскя вепсгагсоаяия эритроцитов могпга путем их фиксации ■ ¿•ермалкнем ;iszi гд^тарегьм альдегидом, а также лкофилкэации.

г5п;ствета,'2ассть езекгприготоэлэнкых фиксированных гля-торогш альдегидом ..лая формалином, а так:'© лиофилиэкрован-зых эртарсцятоа, отличалась от чувствительности нативных не

более, чем на 2 los • Стабилизированное эритроциты сохраняли г

активность э РГА и РТГА а течэкко полугода, яри этом чувстви-

телапссгь их снидалпсь не более, чем на 3 Icé; •

2

Как было Е13-Э отмечено, обработка нативных эритроцитов cbi":oí1 раствором трипсина псвыгает ¡я чувствительность к пар-зоЕирусу. Установлено, что она сохраняется после формалинива-

- 10 - . ' ции таких эритроцитов. Обработка раствором трипсина формалини-■ еированных эритроцитов позволяла повысить четкости реакциии устраняла явления их самогглютинации, возникавшей иногда в процессе хранг "ия.

На основании результатов вышеиэложенных исследований нами была разработана НГД на " Набор для диагностики парвовирусных

ч

инфекций плотоядна в РТГА", предназначенный для применения в лабораторной практике для идентификгтщи возбудителя парвовир; -сной инфекции при исследовании патматериала от животных.

Ь ¿го состав включили лиофшшэированные: антиген .полученный А. А. Сулимовым аттенуировакный в"рус панлейкопении кошек), специфические и нормальные сыворотки крови коз,даны рекомендации по хранению и фиксации консервантами натианшс эритроцитов.

Сршзнкгелькоа иаучгшю тажогорьк истодов дагачкитики пар-вощрушетго а:ггврлга собак. Методами РТГА, с применением приготовленного нами диагностического набора, электронной и иы-мунноэлектронной мит-росьопин, выделения вируса в культурах клеток почек котенка и МОСК, иммуннофэрментного анализа быш: исследоь. лы 40 образцов патматериала, полученного от собак, использовавшихся в,опытах по изучению патогенное, л иэолятоъ (табл. 4). -.

В РГА - в 7 случаях отмечал;, отсутствие агглвтина!.. и, I, Б - титры аг лютигошов колебались от 1: 4 до 1:64., чо прк идентификации гемшглотинирующш: агентов в РТГА с гип&риммуииз.'! к парвовирусу собак сывороткой получек отрицатель!;:/,: ргоульга'г. Обработка антибиотиками хлороформом как ышдо&цздредК'- ехкл. О • образцов вала к потере гешгмшгикирук&рй ькпи-пояхи. Прк вдз-«я. энной мюфоокошш в-чх :роб к воштех Ееддеккя шрвойиру--са в культурах меток почек когеака п КХК Сваи гскк> похучвш отрицательно рзвуямаиг. ; •

гезу^

¿егажсжгчэйккя ::JGX2;

i^lil nSTl—XCplü

.от cctís

я к

обпв-

едов .

33 CÜ-

рсОо-тьпг.ке

Р Г A

06p¿3OIA'i проб

хжросирм шш ьыкро-"ашлрация

i - 7 vi

ó 2 3

10 4

11 Б

1?. 6

13 2

14 3

IR 4

IB Б

17 6

lñ 7

19 8

20 9

21 9

22 9

23 10

24- 25 10

26 10

27- 30 11

31- 32 11

33 12

Я4 13

36 16

35- -37 16

ЯЯ 16

39 17

40 19

ультра-цеыгрифу-гпрование

<1 <1 <1 <1 <1 <1 2

3

4 Б В 7 В 9 9 9

10 10 10 11 11 12 13 1В 1в 16 17 19

РТГА los

<1 <1 <1 <1 <1' <1

7

8 в

11 10

13

14 16 17 17 16

17

18 н н н и и в н в н

хлороформ или микро-фильтрация

<1 <1 <1 <1 <1

<1

+

+ + + + + + + * + + + + + + + + +

4-+

¡WpClfiíEil КИКрОО КОПИЯ

обработка проб

JS1

ультра-центрифу-гировонке

1-2 1-6

1-Б 1-0 1-8 1-8

2-8 2-8

мн.

н. з.

П. 3.

П. 3. П. 3. П. 0.

п. э.

П. 3. П. 3.

п. з.

1-Б

ын.

МП.

мя. 1-Б

мн. кн.

МП. UH. кн. мн.

мн. мн.

п.

п. п. п. п. п. п. п. п. п. п. п. п.

и

я .

н

н

н

н

II

н н

вируса в кукьтурах кдэток

Почек кошки

MDCK

+ + + + + + + + + + + + + ' + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + +

67, БХ 1002

100% 100%

Совпадение результатов r1 i 100% 100% 91,3%

Чувствительность методов 0% 10QX Si

100Х 100%,

Специфичность 1002 100%

90%

S0,.. 86,7% 100% 100*

93,5% 90,3% 100%

"-г" - по;:о:с5:тс'лыл£й pp-^y^iiaT

результат - -ла иссл^довSJM 1-Б и. а. -1-6 вирусзьк ЧМТ5Ч а яэде зрения

Ш. п. 8. - ШЮК2СТЕО вирусных частиц в ноле вренил л - гроздьевиднь'!?

ск' -лепил вирусных частиц '

В 28 пробах титры геммаглготкнинов колебались от 1! 4 до • 1: Б24288, а геммаглютккирутоций агент был идекти$. дироаан в РТГА как парвовирус. Обработка этих образцов антибиотиками, хлороформом и тьтрафильтрация не скиж&ли их тктрса в РГА.

Есе электронномикроскопичэскш исследования пвтьгатерггала от ссЬак проводили совместно с И.11. Могильным. Цркъмкпя метод негативного контрастирования, езояздоевхи 23 образцов. При электронной ьсгкросгопии 23 проб с мт-тюки в РГА 1:4 - 1:62422" (позитивных в РТГА) пзргозирускко чэдхида оЗнск-гз^; п 10 обре цззг ^ каиллсшй гви»:зтхяип:;'ру£грй сэттисхг з (1:2049 -1:624283), прк'-хги ноаггзгт&а об^зрг-хьк^х \uctu* гозргсхалэ пропэрц>:он1£Ы1з дозгсшз ткгра х ёк^иглаг ж и лнсь они рсзроекзп;-:о. »и, о- ог (1: 4-1« 1024)

гнтр&ми ГОЬаГГтаГйтациз: Ш01 уптг^;?''

шлэ, г.Озм серого проз г К'А г., г;-:.

С^ЭЙ '. \ГГ] '-*.'. Ь I : . —^ . и'' /у)« 1 ■ С, \

ьгскт к. бит 1-д-чк-пг^кг^з^м » ИГА 1,0 к-рьс г. т^ии

сз5.з трз^!',-."! "г Т: гг;с3 р^у^кй-г;*:

Ггтого« к к-. .р:>:(Соз I ^¡■"^'"гс.гь-

сого уи.хрзд £-2» I. ¡жо-

ра тарпозирус б^л «^»са^ждарогск в" ИГА к при микроскопии, и В - вагпгскз ппрг.смкруса б гохорс: ЬЭ ПОД»-' варудено другп.гл диагь-остпчоскккк мзтод.аюг. Б 1в кз пг, •вавшгх п'зложителЬЕЫэ рзвультвги в РТГА к олекгроккой »жкроска-пи.., наблюдши обравов'-чие парвовкруошгк грэздьвшдааа: скапла-ний виг'*онов,"опуЕзнных" антителами. имцунноалакгропаоя шае-

роскопия i подтвердила вальцом парвовирусов в двух образцах, активных в РТГА и имевших титры т магглю^ининов li 16 и 1:32, а также трех, давших при других методах исследований отрицательные результаты.

Шпытки выделения парвовируса собак в куль-'фах клеток ив патматериала не всегда были успе ты при использовании ростовых сред, содержавших сыворотку крупного рогатого скота. Поэтому при исследовании 40 обраэцов патматериала использовали суспензионный метод заражения культур клеток и ростовые среды, содержаще неактивные в РТГА сыворотки плодов коров и овец, поскольку такие условия культивирования были, по данным наших опытов, оптимальными. ...

Е ложительным при этом методе исследования считали реэу-льтат, когда наличие парвовируса регистрировалось в РГА и РТГА хотя бы в одном нэ трех последовательных пассажей клеток.

В первом пасса культур клеток почек котят и MDCK удалось выделить парвовирус иэ всех проб патматериала, титр которых в РГА был 1:120'и выше. Кроме того, парвовирус Сьш выделен в MDCK ка пробы, имевшей титр 1:64 (поэитивкой а РТГА) г а иа • СККПК иэ пробы с титром 1:22. Во вторых и третьих -пассажах зараженных культур клеток не было отмечено накопления гемаггли-тишшов ни в одном..случае если вирус не был выделен в первом пассаке.

. В ИВА, прведенном совместно и на базе лаборатории 3.0. Бо-гаутдикова исследовано 22 пробы, позитивно прореарировиих в

РТГА и ЭМ и 9 негативных в этих реакциях. В 20 из первых проб

- ■ >

подтверждено наличие парвовируса. ГЬлученЕные при этом титры КФА не всегда были аналогичны по величине с таковым РГА.

- 22 -

Анализ полученных данных, проведенный по методу Fairchild показал 100% специфичность всех использованных реакций по отношению к РТГА. Совпадение рееультатов с РТГА при электронной микроскопии б ю 100Х, ИЭМ (беэ ультрацентрифугирования). -91,3%, выделении вирусов в той и другой культурах клеток -90%, ИФА - 93,Б%. чувствительность методов была следующей: РТГА и электронной микроскопии (с ультрацентрифугированием) -100%, ИЭМ (без утьгрвцентрифугирс" чния) - 902, выделения Е -руса в культурах клеток - 85,7%, ИФА - 90,9% .

Приведенные исследования ползали возможность пр.....»нения в

лабораторной практике каждого иэ изуенкых нами методов диагностики парвовирусного энтерита собак, но предпочтительно. - в свае" с высокой чувствительностью и простотой постановки -РТГА.

виаоды

1. Парвовирусный энтерит - широко распространенное в нашгй стране заболевание собак.

2. Иэоляты парвовирг'з, выделенные от больных собак разных, регионов страны, проявляли идентичные морфологичзскз, гемаггша-тиякруюме, культуральньга свойства, были патогенны для собак.

3. Парвовирус собак агглютинирует эритроциты неско.а>ких видов животных, но наиболее активно свинка и ведэкой ьЕртылки.

4. Парвовирус собак реплицируется в первично трипзиккг..ровап-иш и субку-^турах клеток почек kotsisua и перевит"etóaz - MDCK, CrFK, Vero, Более активное накопление гвшг^лотшшнов происходит при заражении культур клеток в суспек&ию.

Б. Сыворотки крови, входящие в состав ростовых,-срад при вы^а-• лении парвовирусов плотоядных в культурах клэток должны бить к.лктивны в РТГА: на* *Ч1. в них антигемагглкнининов блокирует реплика'тш вирусов.

6. Парвовирус собак сохрани v инфекционную и гемагглюгиннрую-щую истинность при температуре мзиус 20°г в течение двух 'лет, 3±1°С - одного года, 18±2°С и 37°С - одних суток, 66«О - одног го часа, а также микрофильтрацни.черэв фильтры "Ииллипор" с диаметром пор 2Б нм, воздействии хлороформз и эфира, рН диапазона 3-9. Действие на вирус температуры 80 "С в течение часа снижало его инфекционность на 3-4 lg, а гемагглятинирующую активность' па 4-6 lost .

7. Экспериментальное яоспроиэзедение у собак парвовирусного энтерита всвможно при заведении вируса внутривенно, внутрибрю-плшга или под сероэнуп оболочку тоцэй кипки. ЗЕивотные должны быть интвктны йен иметь' титр гуморальных антител ке быне 1:32 (1ТГА). ' ■

9. Енутркмывечное, анутркбрвиинное и оральное введен.. кудьту-рального парвовируса собак с титром в ?ГА 1:1G24 а дозах 0,3мл белнм мылам, 0,5 мл белым крысам, 1,0 мл морским свинкам, а,О мл кроликам, 3,0 мл конкам не вызывает у них клинических проявлений энтерита; однако индуцирует выработку актигемаггл»-тинирутащк: гуморальных азтитед. Эмбрионы кур кэ чувствительны ■ к парвовирусу собак. • •

9. Шрвовирус собак антигенко родственен первовирусам энтерита порок и панлейкопекии косек. Различия результатов реакций торможения гвмагглвтияацин, поставленных перекрестно с гомологичными и гетерологичными этим вирусам сыворотками не превышали

1 log .

2

10. Иммунизация кроликов и коэ путем введения малых доз парвовируса собак с использованием эффекта "иммунной памяти" позволяет получить сыворотки с активностью в РТГА на ниже 1:1024.

11. РТГА является высокочувствительным и быстрым методом идеи-

- 24 - . .

тификации антигена в патматеркале и культурах клеток. ПарвоЕИ- • русный энтери. собак можно также диагносцировать методами ела-ктронной и иммунноэлектронной микроскопии, ИЩА, путем выделения вируса в культурах клеток почек котенка и ШОК.. 12. Стабильные рееультаты РГА и РТГА можно получить, испольэуи фиксированные формалином или гдутаровым альдегидом, i такие лиофиливированные эритроциты свиней, которые сохраняют активность не мзнсс полугода.

гада. '1ЧШШЕ прадошшя

1. Дш» 1ро1Анлекиого изготовления . и применения в ветеринаркой ■ практике разработана и утверждена ГУВ СССР кориатквко - тз-

хкическая документами ыа набор для диагкоспшТ'шрвошр э-ных инфекций плотоядных в РТГА,

2. Ды1 получения на кроликах и козах диагностических сывороток с высокими титрами в РТГА предлоглнэ иаподьвоьапяэ мзтода аыундаацик животных малыми доиеми антигена о иапмъвов&кк-ем аффекта "иммунной памяти".

3. Разработаны оптимально способы хранения ватшшдс вригроци-тов свиной к методы кя консервации.

4. Внесены кэмзнекия и дополнения в икогрукц$щ пз »таготоздзшю И контролю ВБКЦЯНЫ ПРОТЕЗ СарЕОЕИруСПОГО -птерша, UOXyJUB-

. ма й псевдоыоноза ко- ж и вакцины против чуш, адекэвкрупных икфекчий и парвовирусного витерита собак, касащцоая совершенствования технологии кульишированкя парвовггрусйа.

СЯЕООЕ РАШ, ОШГЕВИОВШЕК "О ТШЗ i. Рахманина Н.Е Выделение парвовируса собак и ксучопш некоторых биологических свойств // Разработка штодое isoiit-роля биологических препаратов и диагностических средств: Сб. науч. тр. /U.! ВГНКИ. ■ - 19Ö9. - О. 114-121. .

2. Рахманина U.U. Лаборатог "ая диагностика парвовирусного энтерита собак. // Биопрепараты, методе' их стандартизации и контроля / Сб. науч. тр. / U. i ВГНКИ . - 1090. - С. 110118. .

3. Рахманина 1£II, Селиванов А. В Дультуральнье свойства пар-

вовируса собак // Совершенствование методов •осударствен-ного контроля ветеринарных nj. паратов : Tee. докл. Все-соювной науч. конф. 11, 1991. - С. Б8-50 .

4. Рахманина U. U., Селиванов А. В. Получение гипериммунных сывороток для серодиагностики парвовирусного витерита собак. // III Всесопенвя конференция по эпизоотологии г Tea. докл. конф. - Новосибирск. - 1991. - О. 242-243.

б. Рахманина 1L 1L , Сулиыов А. А., Селиванов А. В. Биологические свойства парвовируса собак. // Ветеринария. - 1092.- Н 7-8. - С. 21-26.

Подписано в печать 3.05,1993 г. Зак. 763. Формат 60184/16. Тир. 100

Москва. Типография РЛС2Н