Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Вульвовагиниты, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, у пациенток репродуктивного возраста: этиология, клиника, диагностика и терапия.

На правах рукописи

ШАТАЛОВА АННА ЮРЬЕВНА

ВУЛЬВОВАГИНИТЫ, ВЫЗВАННЫЕ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ, У ПАЦИЕНТОК РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА: ЭТИОЛОГИЯ, КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА И ТЕРАПИЯ

14.01.10 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 6 МАЙ 2011

Москва, 2011 г.

4847547

Работа выполнена в отделе инфекций, передаваемых половым путем, Федерального государственного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук,

Доцент Рахматулина Маргарита Рафиковна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

Профессор Дубенский Валерии Викторович

Кандидат медицинских наук Плахова Ксения Ильинична

Ведущее научное учреждение:

Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва

Защита диссертации состоится « /¿Г» ¿ао/ес/> 2011 года на заседании Диссертационного совета (Д 208.115.01) при Федеральном государственном учреждении «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздравсоцразвития России по адресу. 107076, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан « // » /^С/Т/Я 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова

Общая характеристика работы Актуальность проблемы Одной из важнейших медико-социальных проблем в настоящее время является инфекционная патология репродуктивной системы женщины. Ведущее место в структуре данной патологии занимают воспалительные процессы, вызванные условно-патогенными микроорганизмами. Так, по данным разных авторов, частота бактериальных инфекций урогениталышго тракта достигает 80% среди патологических состояний женской половой сферы (Кира Е.Ф., 2001 г., Тютюник В.Л., 2001 г., Яковлев С.В., 2002 г., Пестрикова Т.Ю. с соавт., 2009 г.).

Многочисленными исследователями установлен полимикробный характер вульвовагинитов, ассоциированных с энтеробактериями, колиформными бактериями, стафилококками и стрептококками. При этом, в большинстве исследований была продемонстрирована роль условно-патогенных микроорганизмов как моновозбудителей воспалительных процессов урогениталыюго тракта (Мазорчук Б.Ф., 2007, Фофанова И.Ю., 2008).

Известно, что возникновению воспалительных процессов вульвы и влагалища способствуют нарушения трофики тканей урогенитального тракта, вызванные эндогенными и экзогенными причинами. Так, установлена корреляционная связь между дисбактериозом, обусловленным кишечной и влагалищной микрофлорой (Савичева A.M., 1996 г., Кира Е. Ф., 2001 г.). Ряд авторов отводит существенную роль снижению иммунологической реактивности организма и неблагоприятному влиянию гиперэстрогении на баланс биотопа урогенитального тракта, но до настоящего времени значение гормонального фона женщины в изменении микрофлоры урогенитального тракта не определено (Newton E.R., 2001 г., Levinson W. , 2004 г.). Объектом дискуссий также является и возможность половой трансмиссии условно-патогенных микроорганизмов (Воронова O.A., 2004 г., Mumtaz S., 2008 г.).

На сегодняшний день лабораторная диагностика вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, включает микроскопический и культуральный методы исследования (Анкирская A.C., 2000 г., Воропаева Е.А., 2005 г.). Однако культуральный метод сложен, трудоемок, длителен по времени выполнения. Решение проблемы быстрой идентификации бактериальной микрофлоры возможно путем использования передовой технологии ДНК-чипов, позволяющей выявлять микроорганизмы непосредственно в материале соскоба из влагалища, минуя стадию культивирования и выделения чистой культуры. (Степанова Ю.Н., 2003 г., Атрошкина М.Е., 2009 г., Липова Е.В., 2009 г., Palka-Santini М„ 2009 г.).

Лечение вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, часто проводится без учета этиологических факторов, что приводит к рецидивам заболевания через непродолжительный период времени и росту резистентности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Так, Johnson L. в 2008 г. была отмечена высокая устойчивость микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae к препаратам группы фторхинолонов, которые широко используются в терапии

вульвовагинитов. При этом в настоящее время отсутствуют единые подходы и рекомендации по терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста.

Цель исследования Оптимизировать тактику ведения женщин репродуктивного возраста с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, на основании определения факторов риска возникновения заболеваний, изучения состава вагинального микробиоценоза, оценки клинической значимости современных методов лабораторной диагностики и анализа показателей чувствительности инфекционных агентов к антибактериальным препаратам.

Задачи исследования

1. Изучить факторы риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста.

2. Исследовать качественный и количественный состав вагинального микробиоценоза у женщин репродуктивного возраста с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами и определить возможность использования ДНК-чипов для оценки состояния вагинального микробиоценоза.

3. Изучить чувствительность условно-патогенных микроорганизмов -этиологических агентов вульвовагинитов к антибактериальным препаратам.

4. Оценить эффективность различных методик терапии пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

5. На основании полученных данных разработать алгоритм ведения пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

Основные положения, выносимые на защиту

I. Основными факторами риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста являются: раннее начало половой жизни; большое количество половых партнеров; применение в сексуальной практике нетрадиционных форм половых контактов при отсутствии барьерной контрацепции или нерегулярном ее использовании; нерациональное и бесконтрольное применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия; нарушение правил личной и/или половой гигиены; гормональный дисбаланс, связанный с гиперэстрогенией и гиперпролактинемией; наличие дисбактериоза и других заболеваний кишечника.

II. Состав вагинального микробиоценоза у женщин с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, характеризуется преобладанием в структуре Corynebacterium spp. (91,4%), Escherichia coli (54,5%), Enterococcus faecalis (54,0%), Staphylococcus saprophiticus (29,3%), Klebsiella pneumoniae (18,2%), Streptococcus anginosus (18,2%), Streptococcus agalactiae (16,2%) в количестве более 102- 104 КОЕ/мл и облигатных анаэробов

Bacteroides spp. (10,1%), Fusobacterium nucleatum (8,6%), Propionibacterium spp. (8,1%) в ассоциациях 4 и более микроорганизмов.

Состав вагинального микробиоценоза здоровых женщин характеризуется преобладанием в структуре облигатно-анаэробных Lactobacillus spp. (89,4%) и Corynebacterium spp. (42,4%).

При вульвовагинитах, вызванных условно-патогснными микроорганизмами, происходит замещение облигатно-анаэробных видов лактобактерий на факультативно-анаэробные.

ДНК-чип является современным методом этиологической диагностики вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, позволяющим осуществлять одновременную идентификацию большого числа как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов непосредственно в биологическом материале, минуя стадию культивирования, что значительно сокращает время обследования пациентов.

Применение технологии ДНК-чипов имеет экономическое преимущество перед микробиологическими исследованиями: стоимость комплексной диагностики состава вагинального микробиоценоза с использованием ДНК-чипов в 1,9 раза меньше себестоимости микробиологических методов исследования.

Чувствительность и специфичность метода ДНК-чипов для идентификации возбудителей ИППГ1 (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и Mycoplasma genitalium) является максимальной (100%). Для идентификации непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Lactobacillus spp., Escherichia coli, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Gardnerella vaginalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus anginosus) установлена высокая чувствительность метода ДНК-чипов (97,2-100,0%).

III. Препаратами выбора при лечении вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, являются амоксициллин/клавулоновая кислота, нитрофураны и цефтриаксон. Препараты группы фторхинолонов в терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, необходимо назначать только при подтверждении чувствительности к ним выделенных культур микроорганизмов.

IV. Терапию вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, следует проводить индивидуально с учетом результатов чувствительности выделенных культур микроорганизмов. Целесообразно сочетать системную антибактериальную терапию с назначением местного поликомпонентного антимикробного препарата широгого спектра действия.

Научная новизна При изучении факторов риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста установлено, что гормональный дисбаланс, представленный гиперэстрогенией и гиперпролактинемией способствует нарушению нормоценоза вагинального биотопа.

Определена роль условно-патогенных микроорганизмов в развитии вульвовагинитов у женщин репродуктивного возраста. Продемонстрировано клиническое значение СогупеЬас1епит хрр., представителей семейств ЕМегоЬаМепасеае, Мкгососсасеае и облигатно-анаэробных микроорганизмов (Вас1его1(к$ $рр., РюоЬаШг'шт пискаШт, РгорютЬас1епит $рр.) в ассоциации 4 и более инфекционных агентов.

Впервые показана максимальная чувствительность и специфичность метода ДНК-чипов для идентификации возбудителей ИППП и высокая чувствительность (97,2-100,0%) для идентификации непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Впервые изучена экономическая эффективность использования ДНК-чипов для оценки вагинального микробиоценоза, при этом установлены преимущества метода ДНК-чипов по сравнению с микробиологическими методами.

Систематизированы данные по чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам у женщин с вульвовагинитами, при этом установлена высокая чувствительность инфекционных агентов к амоксициллин/клавулоновой кислоте (чувствительны 93,4%-100,0% штаммов), цефтриаксону (чувствительны 93,6%-100,0% штаммов) и нитрофуранам (чувствительны 92,4%-100,0% штаммов).

Показана более высокая эффективность сочетанного применения системного антибактериального препарата с комбинированным антимикробным препаратом местного действия по сравнению с монотерапией, проводимой системным антибактериальным препаратом (р=0,039) или комбинированным антимикробным препаратом местного действия (р=0,005).

Практическая значимость На основании результатов проведенных исследований разработан алгоритм ведения пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

Внедрение в практику метода ДНК-чипов позволяет осуществлять одновременную идентификацию большого числа патогенных, условно-патогенных и непатогенных микроорганизмов непосредственно в биологическом материале, минуя стадию культивирования, что значительно сократит время обследования пациентов и повысит экономическую эффективность исследования.

Результаты изучения чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам позволят оптимизировать схемы терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами.

Внедрение результатов в практику Результаты исследования внедрены в практику работы Консультативно-диагностического центра ФГУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России.

По результатам исследования подготовлены Медицинские технологии «Вульвовагиниты, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, у пациенток репродуктивного возраста: диагностика и терапия» и «Применение

технологии ДНК-чипов в комплексной диагностике инфекций, передаваемых половым путем» (Москва, 2011 г.).

Разработан патент «Способ и ДНК-чип для комплексной диагностики инфекций, передаваемых половым путем» (номер заявки 2009140661 от 05.11.09 года).

Апробация работы Результаты проведенного исследования доложены на:

1. X Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, октябрь 2008г.).

2. Научно-практической конференции ФГУ «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий» (Москва, май, 2009 г.).

3. XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Екатеринбург, октябрь, 2010 г.).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, 5 глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации, заключение, список литературы. Работа иллюстрирована 38 таблицами и 19 рисунками. Список литературы содержит 133 источника, в том числе 85 отечественных и 47 зарубежных авторов.

Содержание работы Материалы и методы исследования В отделе ИППП ФГУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России было проведено клинико-лабораторное обследование 264 женщин в возрасте от 18 до 45 лет, из них I группа - 198 (75,0%) пациенток с клиническими и лабораторными признаками вульвовагинита; II группа (группа сравнения) - 66 (25,0%) клинически здоровых женщин.

С использованием ДНК-чипа было проведено исследование биоматериала, полученного от 123 пациенток, в том числе 99 (80,5%) пациенток I группы и 24 (19,5%) пациенток II группы. ДНК-чип представлял собой стеклянный микроскопный слайд, содержащий 12 эрреев (от англ. array - ограниченная зона на слайде, стекле) с набором из 41 олигонуклеотидного зонда. В качестве генов-мишеней для амплификации использовали ген 16S РНК.

Изучение уровня чувствительности 190 выделенных культур условно-патогенных микробных агентов проводилось к цефтриаксону, амоксициллин/клавулоновой кислоте, ципрофлоксацину, клиндамицину, нитрофуранам, левофлоксацину, офлоксацину. Антибактериальная чувствительность определялась к микроорганизмам, наиболее часто выявляемым у пациенток с вульвовагинитами: Е. faecalis, Е. coli, Staph, saprophiticiis, Str. agaJactiae, Str. anginosiis, Klebsiella pneumonia. Исследование чувствительности проводилось с помощью автоматического

микробиологического анализатора Vitek 2 (BioMeriex, Франция) и с помощью диско-диффузионного метода в соответствии с МУК 4.2.1890-04. - М., 2004 «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

Для оценки эффективности различных методик терапии 99 пациенток I группы были разделены на подгруппы: 1а подгруппа - 33 пациентки, которым проводилась терапия антибактериальным препаратом системного действия, lb подгруппа - 33 пациентки, которым проводилась терапия антибактериальным препаратом системного действия в сочетании с местным комбинированным антимикробным препаратом широкого спектра действия, 1с подгруппа - 33 пациентки, получавшие терапию местным комбинированным антимикробным препаратом.

Для изучения возможности половой трансмиссии условно-патогенных микроорганизмов было обследовано 50 мужчин - половых партнеров женщин с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

Комплекс лабораторных исследований включал в себя: проведение микроскопического и культурального исследований для идентификации патогенных {N.gonorrhoeae, T.vaginalis) и условно-патогенных микроорганизмов с их количественным определением и определением чувствительности к антибактериальным препаратам. Идентификация С. trachomatis и М. genitalium проводилась методом ПЦР.

С целью изучения влияния гормонального фона на состав вагинального микробиоценоза было проведено исследование методом иммуноферментного анализа уровня фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, эстриола, эстрадиола, тиреотропного гормона, трийодтиронина, тироксина, пролактина, тестостерона, прогестерона.

Статистическая обработка данных в работе осуществлялась с помощью программного пакета SPSS версии 19.0.0 (IBM). Проверка гипотез о различиях между несвязанными выборками производилась с помощью критерия Хи-Квадрат Пирсона или, если не выполнялись условия применения критерия, -точный критерий Фишера (Exact Test пакета SPSS).

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ факторов риска развития и клинические особенности вулъвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста.

Согласно результатам исследования, средний возраст пациенток I группы составил 29,7 лет, пациенток II группы - 29,3 лет. Основная часть пациенток I группы (51,0%) находилась в возрасте от 26 до 35 лет.

Наиболее частой причиной обращения пациенток I группы за медицинской помощью являлись патологические выделения из половых путей (у 66,2% обследованных), зуд (у 24,8% обследованных) и жжение (у 13,6% обследованных) в области наружных половых органов. Часть пациенток I группы (14; 7,1%) жалоб ка момент обследования не предъявляли, однако имели объективные клинико-лабораторные признаки вагинита: патологические выделения в заднем своде влагалища, гиперемию и отечность в области наружных половых органов, кровоточивость слизистой оболочки наружных половых органов, увеличение количества полиморфноядерных лейкоцитов более 10 в поле зрения при микроскопическом исследовании.

При анализе возможных факторов риска особое внимание уделяли изучению анамнестических данных пациентов (таблица 1).

Таблица 1

Факторы риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-

патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста

I группа II группа

Анализируемые факторы риска (п=198) (п=66) Р

абс % абс %

Применение антибактериальных препаратов 164 82,8 6 9Д <0,001

широкого спектра действия в анамнезе

Нарушение микрофлоры вагинального биотопа в 88 44,4 25 37,9 0,351

анамнезе:

Бактериальный вагиноз 27 13,6 5 7,6 0,191

Кандидоз вульвы и вагины 38 19,2 14 21,2 0,721

Заболевания, вызванные генитальными микоплазмами 58 29,3 12 18,2 0,089

Неспецифический вульвовагинит 19 9,6 - - 0,009

Патология желудочно-кишечного тракта: 37 18,7 7 10,6

Дисбактериоз кишечника 17 8,6 - - 0,009

Другая патология ЖКТ (хронический гастрит, полипы 24 12,1 7 10,6 >0,999

кишечника, синдром раздраженного кишечника и др.)

Наличие очагов хронической инфекции различной 33 16,7 9 13,6 0,56

локализации

Нарушение правил личной и/или половой гигиены 176 88,9 15 22,7 <0,001

Установлено, что большинство (164; 82,8%) пациенток I группы, в отличие от пациенток II группы (6; 9,1%), регулярно получали системные антибактериальные препараты по причине различных инфекционных заболеваний (р<0,001).

У 37 (18,7%) пациенток I группы регистрировались различные заболевания желудочно-кишечного тракта, в том числе и дисбактериоз, при этом у 17 (8,6%) женщин, вульвовагинит, вызванный условно-патогенными микроорганизмами, протекал на фоне дисбактериоза кишечника.

У большинства (176; 88,9%) пациенток основной группы с наибольшей достоверностью (р<0,001) были отмечены нарушения личной и половой гигиены (использование для ежедневной интимной гигиены косметических средств, не предназначенных для ухода за слизистыми оболочками половых органов; чрезмерная интимная гигиена более 2 раза в день; отказ от барьерной контрацепции, либо неправильное ее использование, особенно в практике орально-генитально-анальных контактов; регулярная обработка половых органов различными антисептиками).

При анализе акушерско-гинекологического анамнеза было установлено, что у пациенток как I, так и II группы, имел место высокий процент медицинских прерываний беременности (38,4% и 50,0% соответственно). В анамнезе у пациенток обеих групп наблюдались фоновые заболевания шейки матки: у 62 (31,3%) и 17 (25,8%) обследованных 1 и II группы соответственно. Второе место

в структуре гинекологической патологии занимал сальпингоофорит - у 14 (7,1%) и 6 (9,1%) обследованных соответственно. При этом статистически достоверной разницы в частоте гинекологической патологии среди пациенток сравниваемых групп выявлено не было.

Исследование гормонального фона продемонстрировало, что у 77,4% пациенток 1 группы вульвовагиниты, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, протекали на фоне гиперэстрогеновой активности, а у 54,7% пациенток - на фоне повышения уровня пролактина.

Анализ данных сексуального анамнеза показал, что у пациенток I группы достоверно чаще (р<0,001), чем у пациенток II группы регистрировался ранний возраст полового дебюта (до 18 лет) и большое количество (более 5) половых партнеров в течение сексуальной практики (116; 58,6%). Пациентки I группы чаще (89,4%) практиковали нетрадиционные формы половых контактов, чем пациентки II группы (53,0%), при этом пренебрегая барьерной контрацепцией или используя ее нерегулярно (85,3%) (рисунок 1). Таким образом, представляется возможным предположить возможность контаминации условно-патогенными микроорганизмами несвойственных для их существования привычных экологических ниш, что приводит к воспалительным процессам нижних отделов урогенитального тракта. !

) 47 о% 50,0%

|| 40>9% 36,4%

Ю,6% I „пп/ ■ 12,1%

_*!_]______________________и_____________________________________________Мо_........_

генитальные генитально-оральные генитально-анальные все формы

■ Группа I (п- 198) □ Группа И (п=66) ...............

Рисунок 1. Формы половых контактов, практикуемые пациентками I и II групп (п=264Х р<0,001

При изучении клинической картины вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, было установлено, что наиболее частыми объективными проявлениями заболевания у пациенток являлись патологические выделения: сливкообразного (113; 57,1%) и слизисто-мутпого характера (77; 38,9%), а также гиперемия (129; 65,2%) и кровоточивость (37; 18,7%) слизистых оболочек наружных половых органов. Значение рН вагинального отделяемого у 114 (57,6%) пациенток I группы превышали 4,5. У пациенток группы сравнения выделения в заднем своде влагалища в основном носили характер скудных слизистых прозрачных (у 59 (89,4%) обследованных), рН варьировала в пределах нормы (100,0%).

Результаты изучения качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза у пациенток исследуемых групп

При микроскопическом исследовании вагинального и цервикального экссудата у пациенток I группы достоверно чаще (у 151; 76,3% обследованных

во влагалище и у 134; 67.7% - цервикальном канале) было выявлено увеличение количества полиморфноядерных лейкоцитов более 10 в ноле зрения, увеличение количества эпителиальных клеток и слизи, которое чаще носило умеренный характер (у 72,7% обследованных во влагалище и у 56,1%-в цервикальном канале), нежели обильный (у 18,7% обследованных во влагалище и у 12,6% - в цервикальном канале), изменение соотношения полиморфноядерных лейкоцитов к эпителиальным клеткам более чем 1:1 (у 148; 74,8% обследованных). Обильная коккобациллярная микрофлора была выявлена у большинства пациенток I группы, при этом отмечалось преобладание грамотрицательной бациллярной (71,2%) и грамположителыюй кокковой (59,6%) микрофлоры, которая достоверно чаще выявлялись у пациенток 1 группы в обильном количестве (р<0,001).

У большинства (49; 74,2%) пациенток II группы отмечалось преобладание грамположительной лактобациллярной микрофлоры.

При анализе качественного соотношения условно-патогенных микроорганизмов было показано, что наиболее часто у пациенток I группы выделялись Corynebacterium spp. (181; 91,4%) в обильном и умеренном количестве. Следующими по частоте выявления являлись представители семейства Enterobacteriaceae: E.coli (108; 54,5%), KJebs.pneumoniae (36; 18,2%) и семейства Micrococcaceae: E.faecalis (107; 54,0%), S.saprophiticus (58; 29,3%), S.epidermidis (53; 26,8%), Str.anginosns (36; 18,2%), Str.agalactiae (32; 16,2%). Рост прочих представителей данных семейств (S.aureus, Str.eptococcus constellatus, Str.mitis, Klebs.oxitoca, E.aerogenes, Citrobacter freimdii, Proteus mirabilis, Serratia marcescense, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, E.faecium, Sir.pyogenes, и др.) регистрировался реже (у 0,5% - 4,5% пациенток). Из представителей анаэробной микрофлоры у пациенток I группы в наибольшем проценте наблюдений выделялись микроаэрофилы (G.vaginalis - у 24; 12,1% пациенток) и облигатные неспорообразующие микроорганизмы (Bacteroides spp. - у 20; 10,1% пациенток, Propionibacterium spp. - у 16; 8,1% пациенток, Fusobacterium nuclealum - у 17; 8,6% пациенток, Clostridium spp. - у 6; 3,0% пациенток).

У 66 (100,0%) пациенток группы сравнения идентифицировались Lactobacillus spp.. Следующими по частоте выявляемое™ микроорганизмами являлись Corynebacterium spp. (28; 42,4%). В незначительном числе наблюдений в биоматериале, полученном у пациенток И группы, выявлялись S.epidermidis (10; 15,2%), E.faecalis (6; 9,1%), S.saprophiticus (3; 4,5%), E.coli (3; 4,5%), Str.agalactiae (2; 3,0%).

У большинства обследованных пациенток отмечался рост микроорганизмов в ассоциации, при этом были определены достоверно значимые различия между исследуемыми группами (р<0,001) (рисунки 2,3).

У 168 (84,9%) пациенток 1 группы микробные ассоциации были представлены 4 и более условно-патогенными микроорганизмами, при этом доминировали представители семейств Enterobacteriaceae и Micrococcaceae (168; 84,9%) и Corynebacterium spp. (158; 90,0%).

37,4 47,5 40,9

14,1 1 - 11

......i£! Ш В 1,5 0,0

I группа (n= 198)

II группа (n=66)

■ рост микроорганизмов в монокультуре

О рост 2-3 микроорганизмов

■ рост 4-5 микроорганизмов

0 рост 6 и более микроорганизмов

Рисунок 2. Частота выявления микробных ассоциаций у пациенток I и II групп (%), р<0,001

28,3

0,0

60,6

1

36,4

3,0

I группа (п=198)

II группа (п=66)

83 Облигатные анаэробы

О Аэробы, микроаэрофилы, факультативные и облигатные анаэробы ■Аэробы, микроаэрофилы и факультативные анаэробы

Рисунок 3. Варианты микробных ассоциаций у пациенток I и II групп (%), р<0,001

Ассоциации представителей факультативной и облигатной микрофлоры наблюдались у 54 (32,1%) обследованных. У 28 (14,1%) пациенток выявлялся сочетанный рост 2-3 микроорганизмов, который также в большинстве наблюдений (26; 92,9%) был представлен ассоциацией различных аэробов, а у 2 (6,9%) пациенток - факультативных и облигатных микроорганизмов. Рост микроорганизмов в монокультуре отмечался у 2 (1,0%) пациенток и был представлен Е. coli и Ent.faecalis.

Видовая структура условно-патогенных микроорганизмов, выделенных у пациенток группы сравнения, оказалась менее разнообразной, чем у пациенток I группы и была в основном представлена облигатно-анаэробными лактобактериями в монокультуре (40,9%), либо в ассоциации 2-3 микроорганизмов (57,6%), весомую долю которых также составляли облигатно-анаэробные лактобактерии (60,6%).

Рост факультативно-анаэробной лактобациллярной микрофлоры регистрировался у 61 (30,8%) пациентки I группы, в отличие от пациенток II группы, у которых чаще (59; 89,39%) выявлялись облигатно-анаэробные Lactobacillus spp. и только у 7 (10,6%) - факультативно-анаэробные. Таким образом, установлено, что при вульвовагинитах, вызванных грамвариабельными аэробными условно-патогенными микроорганизмами, количество лактобациллярной микрофлоры снижается и/или происходит

замещение облигатно-анаэробных видов лактобацилл на факультативно-анаэробных их представителей.

Анализ количественного содержания выявленных микроорганизмов продемонстрировал, что при росте микробных агентов в ассоциации 4 и более условно-патогенные микроорганизмы выделялись не только в количестве более 104 КОЕ/мл, но и в количестве 102-104 КОЕ/мл: Corynebacterium spp. -41,9%, Enterococcus faecalis - 24,2%, Escherichia coli - 18,2%, Staphylococcus epidermidis - 16,2%, Staphylococcus saprophiticus - 15,7%, Streptococcus agalactiae - 8,6%, Streptococcus anginosus - 7,1%, Klebsiella pneumoniae - 5,6% (таблица 2). При этом достоверной разницы в клинической картине и результатах микроскопического исследования у пациенток исследуемых групп выявлено не было, что свидетельствует о клинической значимости условно-патогенных микроорганизмов в количестве 102-104 КОЕ/мл при ассоциации 4 и более инфекционных агентов.

Таблица 2

Результаты количественного определения условно-патогенных

микроорганизмов

Анализируемые Ассоциации микроорганизмов

4 и более 2-3 I

>104 102-104 >104 юМо4 >104 юМо4

микроорганизмы КОЕ/мл КОЕ/мл КОЕ/мл КОЕ/мл КОЕ/мл КОЕ/мл

абс./% абс./% абс./% абс./% абс./% абс./%

Corynebacterium spp. 77/38,9 83/41,9 11/5,6 10/5,1 - -

Escherichia coli 64/32,3 36/18,2 4/2,0 3/1,5 1/0,5 -

Enterococcus faecalis 52/26,3 48/24,2 4/2,0 2/1,0 - 1/0,5

S.saprophiticus 24/12,1 31/15,7 2/1,0 1/0,5 - -

Klebsiella pneumoniae 23/11,6 11/5,6 - 2/1,0 - -

Str. anginosus 20/10,6 14/7,1 1/0.5 1/0,5 - -

Staph, epidermidis 17/8,6 32/16,2 - 4/2,0 - -

Str. agalactiae 11/5,6 17/8,6 1/0,5 3/1,5 - -

Согласно задачам исследования было проведено клинико-лабораторное обследование 50 мужчин - половых партнеров 50 женщин с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами. При культуральном исследовании уретрального отделяемого наиболее часто отмечался рост E.faecalis (у 22,0% мужчин), E.coli (у 20,0% мужчин), Str.agalactiae (у 10,0% мужчин), Klebs.pneumonia (у 6,0% мужчин), Streptococcus spp. (у 2,0% мужчин). У 27 (54,0%) сексуальных пар было установлено, что состав микрофлоры уретры пациента соответствовал составу микроценоза их половых партнерш, на основании чего можно предполагать возможность половой трансмиссии условно-патогенных микроорганизмов. Однако достоверных различий между парами, у которых состав микробиоценоза урогенитального тракта являлся идентичным и различайся, выявлено не было (рисунок 4).

; микрофлора половых путей : партнеров не совпадает ; микрофлора половых путей : партнеров совпадает

Рисунок 4. Результаты лабораторных исследований половых партнеров

Результаты изучения возможности использования ДНК-чипов для оценки состояния вагинального микробиоценоза.

Согласно поставленным задачам исследования были определены этапы исследования.

1 этап заключался в определении спектра микроорганизмов для включения в состав ДНК-чипов. На основании результатов проведенного клинико-лабораторного обследования пациенток исследуемых групп, для включения в состав ДНК-чипа, предназначенного для оценки вагинального микробиоценоза был определен спектр патогенных (N.gonorrhoeae, С.trachomatis, М.genitalium), условно-патогенных (E.coli, Ent.faecalis, Str.anginosus, Streptococcus spp., Bact.caccae, Bad. fragilis, Bact.vulgatus, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus curtisii, Bact.stercoris, Porphyromonas asacchoralytica, Fusobacterium nucleatum, Ent.faecium, Bact.uniformis, Bact.distasonis, Bact.eggerthii, G.vaginalis, M.hominis, U.urealyticum, Clost.ramosum, S.aureus, Veillonella parvila, Prev.bivia, Moraxella catarrhalis, Prev.disiens, Prev.meianogenica, Actinobac.adinomycetemcomitans, Peptostreptvcoccus anaerobius, Bact.merdae, Bact.ovatus, Bact. thetaiotaomicrori) и непатогенных (Lactobacillus spp., L.gasseri, L.vaginalis, L.plantarum, L.salivarius, L.brevis, L.fermentus) агентов, включающий в себя 41 микроорганизм.

Включение в ДНК-чип большого количества облигатно-анаэробных микроорганизмов обусловливалось трудностью их культивирования.

На II этапе исследования были подобраны олигонуклеотидные зонды для идентификации микроорганизмов.

На III этапе были оценены результаты, полученные при исследовании методом ДНК-чипов. Установлено, что у пациенток I группы наиболее часто выявлялись ассоциации микроорганизмов в количестве 3-5 (55; 55,6%). Ассоциации из 6-10 микроорганизмов выявлялись у 27 (27,3%) пациенток, более чем из 11 микроорганизмов — у 10 (10,1%) пациенток. В структуре аэробных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов были выделены: E.faecalis (59,6%), E.coli (51,5%), Str.anginosus (19,2%), Streptococcus spp. (6,1%), E.faecium (3,0%), S.aureus (1,0%). Среди анаэробных микроорганизмов выявлялись представители рода Bacteroides: B.distasonis (11,1%), В.сассае (6,1%), B.eggerthii (7,1%), В. fragilis (6,1%), B.thetaiotaomicron (5,1%), В.vulgatus (4,0%), B.merdae (3,0%), B.stercoris (3,0%), B.uniformis (3,0%) и B.ovatus (1,0%). Так же были идентифицированы Peptostreptococcus anaerobius (20,2%), Mobiluncus mulieris (19,2%), Fusobacterium nucleatum

(18,2%), Prev.melanogenica (13,1%), Prev.bivia (11,1%), Porphyromonas asacchoralytica (8,1%), Mobiluncus curtisii (7,1%), Prev.disiens (6,1%), Veil/onella panila (4,0%), Moraxella catarrhalis (3,0%), Act. actinomycetemcomitans (2,0%), Clostridium ramosum (2,0%). Микроаэрофилы (G. vaginalis) были выявлены у 19 (19,2%) пациенток.

У 14 (58,3%) пациенток группы сравнения методом ДНК-чипов достоверно чаще выявлялись ассоциации 1-2 микроорганизмов, основную долю которых составили представители лактобактерий (Lactobacillus spp., Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum). У 10 (41,7%) пациенток были выявлены ассоциации 3 и более микроорганизмов, в составе которых были идентифицированы Е. coli и Ent.faecalis. (таблица 3).

Статистически чаще (р<0,001) у пациенток II группы были выявлены Lactobacillus spp.. При этом в частоте выявления отдельных представителей семейства Lactobacteriaceae характерных различий выявлено не было, следовательно, не удалось определить доминантное значение какого-либо конкретного представителя семейства лактобациллярной микрофлоры в поддержании колонизационной резистентности вагинального биотопа.

Таблица 3

Спектр микроорганизмов, идентифицированных методом ДНК-чипа, у

пациенток исследуемых групп (п=123)

№ Анализируемые микроорганизмы I группа (n=99) абс./% II группа (n=24) абс./% № Анализируемые микроорганизмы I группа (n=99), абс./% II группа (n=24) абс./%

1. Lactobacillus spp. * 79/79,8 24/100 19. Bact. uniformis 3/3,0 -

2. Lact, gasseri 43/43,4 9/27,5 20. В. thetaiotaomicron 5/5,1 1/4,2

3. Lact, vaginalis 15/15,2 3/12,5 21. Bact. ovatus 1/1,0 -

4. Lact, plantarum 19/19,2 6/25,0 22. Bact. stercoris 3/3,0 -

5. Lact, salivarius 15/15,2 6/25,0 23. Bact. distasonis 11/11,1 3/12,5

6. Lact, brevis 24/24,2 4/16,7 24. Prevotella bivia 11/11,1 -

7. Lact, fermentus 10/10,1 2/8,3 25. Veillonella parvila 4/4,0 -

8. E. coli* 51/51,5 2/8,3 26. Мог. catarrhalis 3/3,0 1/4,2

9. E. faecalis* 59/59,6 1/4,2 27. G. vaginalis 19/19,2 1/4,2

10. E. faecium 3/3,0 - 28. Prev. disiens 6/6,1 -

11. Str. anginosus* 19/19,2 - 29. Prev. melanogenica 13/13,1 1/4,2

12. Staph, aureus 1/1,0 - 30. Bact. vulgatus 4/4,0 -

13. Streptococcus spp. 6/6,1 - 31. Bact. eggerthii 7/7,1 3/12,5

14. P.asacchoralytica 8/7,1 1/4,2 32. Fusob.nucleatum 18/18,2 3/12,5

15. Pept. anaerobius 20/20,2 4/16,7 33. Act.actinomycetem. 2/2,0 -

16. Bacteroides fragilis 5/5,1 - 34. Mobiluncus mulieris 19/19,2 5/20,8

17. Bacteroides caccae 6/6,1 - 35. Mobiluncus curtisii 7/6,2 1/4,2

18. Bact. merdae 3/3,0 - 36. Clostr.amosum 2/2,0 -

*р<0,05

На IV этапе исследования был проведен анализ чувствительности и специфичности метода ДНК-чипа относительно культурального метода

15

исследования. Чувствительность ДНК-чипа для идентификации микроорганизмов оценивали отдельно для группы патогенных, непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов. С целью изучения специфичности метода ДНК-чипов в исследование дополнительно были включены 14 женщин, у которых при обследовании выявлялись возбудители ИППП: N.gonorrhoeae - у 2 (14,3%) пациенток, С.trachomatis - у 11 (78,6%) пациенток, M.genitalium - у 3 (21,4%) пациенток. У 8 (57,1%) пациенток была выявлена U.urealyticum.

Согласно результатам исследования, установлена максимальная (100,0%) чувствительность метода ДНК-чипов для идентификации возбудителей ИППП и высокая (97,2-100,0%) чувствительность для выявления ряда непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов (таблица 4).

Таблица 4

Результаты оценки чувствительности и специфичности метода ДНК-

чипов

Анализируемые микроорганизмы ДНК-чип Культура-льн.метод Специфичность Чувствительность

Neisseria gonorrhoeae 1,5% 1,5% 100,0% 100,0%

Chlamydia trachomatis 8,0% 8,0% 100,0% 100,0%

Mycoplasma genitalium 2,2% 2,2% 100,0% 100,0%

Lactobacillus spp. 78,8%o 47,5% 60,2% 100,0%

Gardnerella vaginalis 15,3% 14,6% 95,2% 100,0%

Escherichia coli 40,1% 40,1% 100,0% 100,0%

Enterococcus faecalis 47,4% 45,9% 96,9% 97,2%

Enterococcus faecium 2,2% 2,2% 100,0% 100,0%

Staphylococcus aureus 0,7% 0,7% 100,0% 100,0%

Streptococcus spp. 4,4% 3,6% 83,3% 100,0%

Streptococcus anginosus 14,6% 12,4% 85,0% 100,0%

Fusobacterium nucleatum 16,1% 14,6% 86,4% 99,1%

В связи с тем, что непатогенные и условно-патогенные микроорганизмы идентифицировались с помощью всех примененных методов исследования как у пациенток I группы, так и у пациенток II группы,- интерпретация специфичности определения данных микроорганизмов на ДНК-чипе представляла затруднения. Поэтому специфичность метода оценивалась по отношению к возбудителям ИППП. На основании того, что результаты идентификации патогенных микроорганизмов на ДНК-чипе у 14 пациенток, дополнительно включенных в исследование, полностью совпали с результатами, полученными микробиологическими методами и методом ПЦР, их специфичность была оценена как 100,0%.

На V этапе исследования было проведено изучение экономической целесообразности использования ДНК-чипа для оценки вагинального микробиоценоза в сравнении с микробиологическими методами и методом ПЦР. С этой целью был проведен расчет себестоимости различных методов

исследования в соответствии с «Методическими рекомендациями по расчету себестоимости медицинских услуг в учреждениях здравоохранения».

В результате исследований установлена себестоимость метода ДНК-чипов для оценки вагинального микробиоценоза в размере 713,95 рублей, для микробиологических исследований - в размере 1392,12 рублей, для исследований методом ПЦР - в размере 762,98 рублей.

Экономических преимуществ применения технологии ДНК-чипов перед исследованием методом ПЦР не выявлено, однако в отличие от метода ПЦР использование ДНК-чипов позволяет достичь:

- сокращения в десятки раз времени комплексной идентификации микроорганизмов за счет проведения общей, а не отдельной для каждого микроорганизма реакции амплификации вариабельного района гена 16S РНК, общего для всех микроорганизмов;

- сокращения времени детекции и анализа результатов за счет флуоресцентной детекции и применения программного обеспечения;

- сокращения площади рабочего места, необходимого для выполнения исследования;

- значительного снижения вероятности ошибок, обусловленных «человеческим» фактором и, в связи с этим, более высокого качества проводимых исследований.

Анализ показателей чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

В ходе исследования было установлено, что наибольшую чувствительность выделенные культуры аэробных микроорганизмов (E.faecalis, Ecoli, S.saprophiticus, S.epidermidis, Streptococcus spp., Str.agalactiae, Klebsiella pneumoniae) показали к амоксициллин/клавулоновой кислоте (91,7% - 100,0% штаммов) (таблица 5).

Таблица 5

Чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к _ антибактериальным препаратам__

Процент чувствительных штаммов микроорганизмов Антибактериальные препараты

Амокси цил./ клавул онат Нитро-фураны Цефтри аксон Ципро-флокса цин Лево- флокса цин Офлокс ацин Клинда мицин

Escherichia coli 94,7% 92,4% 93,6% 87,7% 93,8% 92,5% -

Ent. faecalis 93,4% 93,4% 6,4% 58,9% 81,4% 75,0% -

St. saprophiticus 91,7% 83,3% 100% 83,3% 75,0% 100% 83,3%

St. epidermidis 100% 100% 90,9% 100% 75,0% 66,7% 100%

Streptococcus spp. 100% 100% 100% 80,0% - - 60,0%

Str. agalactiae 100% 100% 100% 50,0% 50,0% 66,7% 71,4%

Klebs. pneumonia 100% 0,0% - 50,0% 50,0% 75,0%

К цефтриаксону так же были отмечены высокие показатели чувствительности многих выделенных культур микроорганизмов (93,6% -100,0% штаммов), за исключение,м культур E.faecalis, у которых был выявлен наибольший процент (93,6%) нечувствительных штаммов. Так же большинство штаммов E.faecalis оказались нечувствительными к доксициклину (76,2%). К нитрофуран&м в 92,4% - 100,0% была отмечена чувствительность штаммов E.faecalis, E.coli, S.epidermidis, Streptococcus spp,, Str.agalactiae. Однако, 100,0% культур штаммов Klebsiella pneumoniae оказались нечувствительны к препаратам данной группы.

Процент нечувствительных штаммов большинства микроорганизмов к фторхинолонам составил соответственно: к офлоксацину - 7,5%-33,3%, к ципрофлоксацину - 12,3%-50,0% и к левофлоксацину - 6,3%-50,0% штаммов. Ввиду невысокого процента (у 50,0% - 83,3% штаммов) чувствительных к фторхинолонам культур микроорганизмов, назначение этих препаратов для терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными

микроорганизмами, рекомендовано только после определения чувствительности выделенного изолята.

Результаты изучения эффективности различных методик лечения.

Выбор антибактериального препарата системного действия базировался на основании результатов определения чувствительности выделенных культур микроорганизмов к антибактериальным препаратам. У 22 пациенток препаратами выбора являлись амоксициллин/клавулоновая кислота (625 мг 3 раза в день перорально в течение 10 дней), у 22 пациенток - ципрофлоксацин (250 мг 2 раза в день перорально в течение 7 дней), у 22 пациенток - нифурател (200 мг 3 раза в день перорально в течение 10 дней). Из комбинированных противомикробных препаратов местного действия у 66 пациенток использовался неомиции/тернидазол/нистатин/преднизолон, который назначался ежедневно интравагинально по 1 таблетке в течение 10 дней.

Анализ результатов проведенного исследования продемонстрировал эффективность проведенной терапии для 25 (75,8%) пациенток 1а подгруппы, 31 (93,9%) пациентки lb подгруппы и 22 (66,7%) пациенток 1с подгруппы, у которых при контрольном обследовании отсутствовали клинико-лабораторные признаки вульвовагинита, а микробиоценоз был представлен в основном Corynebacterium spp., S.epidermidis, S.saprophiticus в количестве, не превышающем 102 КОЕ/мл, и Lactobacillus spp. - в количестве более 104 КОЕ/мл. Однако у 8 (24,2%) пациенток 1а подгруппы после проведенной терапии были выявлены клинические и лабораторные признаки кандидозного вульвовагинита. У 2 (6,1%) пациенток lb и 11 (33,3%) 1с подгрупп лечение было расценено как неэффективное (сохранение клинико-лабораторных признаков вульвовагинита, идентификация условно-патогенных микроорганизмов (E.coli, E.faecalis, Klebsiella pneumoniae, Str.agalactiae и др.) в количестве более 104 КОЕ/мл и при ассоциации 3 и более микроорганизмов).

Наибольшая клиническая эффективность была достигнута у пациенток lb подгруппы (93,9%), в отличие от пациенток 1а (75,8%) и 1с (66,7%) подгруппы.

Микробиологическая эффективность также была наиболее высокой (97,0%) у пациенток lb по сравнению с пациентками подгруппы 1а (75,8%) и 1с (66,7%) подгрупп. Таким образом, лечебные мероприятия, применяемые в lb подгруппе, оказались наиболее эффективными в отличие от терапии, проведенной в 1а (р=0,039) и 1с (р=0,005) подгруппе.

В связи с тем, что определение чувствительности штаммов микроорганизмов к антимикробным препаратам проводится только к наиболее вирулентным и патогенным микроорганизмам из присутствующих в ассоциациях, то целесообразно сочетать системную антибактериальную терапию с назначением местного поликомпонентного антимикробного препарата широкого спектра действия.

На основании результатов проведенного исследования разработан алгоритм обследования и лечения пациенток с вульвовагинитами, вызванными аэробными условно-патогенными микроорганизмами (рисунок 5).

Выводы

1. У женщин репродуктивного возраста установлены факторы риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, к которым относятся: раннее (до 18 лет) начало половой жизни (р<0,001); большое количество (более 5) половых партнеров в течение сексуальной практики (р<0,001); применение нетрадиционных форм половых контактов при отсутствии барьерной контрацепции и нерегулярном ее использовании (р<0,001); нерациональное и бесконтрольное применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия (р<0,001); нарушение правил интимной гигиены (р<0,001); гормональный дисбаланс, связанный с гиперэстрогенией и гиперпролактинемией (р<0,001); наличие дисбактериоза и других заболеваний кишечника (р=0,009).

2. Качественный и количественный состав вагинального микробиоценоза у женщин репродуктивного возраста с вульвовагинитами характеризуется преобладанием Corynebacterium spp. (91,4%), Escherichia coli (54,5%), Enterococcus faecalis (54,0%), Staphylococcus saprophiticus (29,3%), Klebsiella pneumoniae (18,2%), Streptococcus anginosus (18,2%), Streptococcus agalactiae (16,2%) в количестве lOMü4 КОЕ/мл и облигатных анаэробов Bacteroides spp. (10,1%), Fusobacterium nucleatum (8,6%), Propionibacterium spp. (8,1%) в ассоциациях 4 и более микроорганизмов, а также замещением облигатно-анаэробных видов лактобактерий на факультативно-анаэробные.

ДНК-чип является современным методом этиологической диагностики вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста, обладающим максимальной (100,0%) чувствительностью и специфичностью для идентификации возбудителей ИППП и высокой (97,2-100,0%) чувствительностью для выявления непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Установлено экономическое преимущество (в 1,9 раза) технологии ДНК-чипов перед микробиологическими исследованиями.

3. Доказана наиболее высокая чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к амоксициллин/клавулоновой кислоте (93,4% - 100,0%), нитрофуранам (92,4% - 100,0%) и цефтриаксону (93,6% - 100,0%), что определяет возможность использования их в качестве препаратов выбора для лечения вульвовагинитов.

4. Установлено, что наиболее эффективным методом лечения вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, является сочетание системного антибактериального препарата с комбинированным антимикробным препаратом местного действия.

5. Разработан и внедрен в практику алгоритм ведения пациенток с вульвовагинитами, вызванными аэробными условно-патогенными микроорганизмами.

Практические рекомендации

Тактика диагностики вульвовагинитов, вызванных аэробными условно-патогенными микроорганизмами, определяется комплексной оценкой анамнестических данных, с учетом факторов риска, и клинико-микробиологического обследования.

При наличии клинических признаков и лабораторных критериев вульвовагинита, необходимо проводить культуральное исследование с определением качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза.

Необходимо оценить характер ассоциаций представленных условно-патогенных микроорганизмов.

Клинически значимым является рост условно-патогенных микроорганизмов в количестве более 102-104 КОЕ/мл при ассоциации 4 и более микроорганизмов.

Этиотропная терапия пациенток с данной патологией должна проводиться индивидуально с учетом результатов определения чувствительности аэробной микрофлоры к антибактериальным препаратам.

В условиях, когда культуральное исследование с определением уровня чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам провести невозможно, препаратами выбора в лечении вульвовагинитов, вызванных аэробными микроорганизмами, могут являться амоксициллин/клавулоновая кислота, препараты группы нитрофуранов и цефтриаксон.

В целях профилактики рецидивов заболевания пациенткам необходимо рекомендовать соблюдение правил интимной гигиены, использование барьерного метода защиты особенно в практике генитально-анальных и орально-генитально-анальных контактов, обследование полового партнера.

Рисунок S. Алгоритм ведения пациенток с нульвовагинитамн

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рахматулина М.Р. Современные инновационные технологии в диагностике и выборе лечения нсспецифических воспалительных заболеваний мочеполовой системы / М.Р. Рахматулина, Н.В. Фриго, А.Ю. Шаталова и др. // Вестник дерматологии и венерологии. - 2008. - №5. -С.77-85.

2. Рахматулина М.Р. Терапия неспецифических вульвовагинитов: обоснование выбора антибактериальных препаратов / М.Р. Рахматулина, H.H. Цыликова, А.Ю. Шаталова // Тез. науч. работ. X Всероссийского съезда дерматовенерологов. М. - 2008. - С. 72.

3. Рахматулина М.Р. Современные представления о микробиоценозе вагинального биотопа и его нарушениях у женщин репродуктивного возраста (обзор литературы) / М.Р. Рахматулина, А.Ю. Шаталова // Вестник дерматологии и венерологии. - 2009. - № 3. - С.38-43.

4. Лихарева В.В. Разработка ДНК-чипа для комплексной диагностики инфекций, передаваемых половым путем / В.В. Лихарева, Н.В. Фриго, А.Ю. Шаталова и др. // Вестник дерматологии и венерологии. - 2009. -№ 4. - С.49-57.

5. Шаталова А.Ю. Современные подходы к терапии условно-патогенных микроорганизмов у женщин репродуктивного возраста с воспалительными заболеваниями нижних отделов урогенитального тракта / А.Ю. Шаталова /'/ Вестник последипломного медицинского образования. - 2009. - №2. - С.29-31.

6. Шаталова А.Ю. Значение условно-патогенных микроорганизмов в развитии неспецифических воспалительных процессов урогенитальной системы женщин репродуктивного возраста / А.Ю. Шаталова // Тезисы научных работ III Всеросс. конгр. дерматовенер. М. - 2009. - С.91.

7. Рахматулина М.Р. Опыт применения ДНК-биомикрочипов в диагностике неспецифических воспалительных процессов урогенитальной системы женщин репродуктивного возраста/ М.Р. Рахматулина, Н.В. Фриго, А.Ю. Шаталова // Тез. науч. работ. IV Российская научно-практическая конференция Санкт-Петербургские дерматологические чтения. - 2010. -С.120-121.

8. Рахматулина М.Р. Новые возможности терапии заболеваний, ассоциированных с условно-патогенными микроорганизмами/ М.Р. Рахматулина, А.Ю. Шаталова// Тез. науч. работ. XI Всерос. съезд дерматовенерологов и косметологов. Екб. - 2010. - С. 86-87.

9. Шаталова А.Ю. Анализ показателей антибиотикорезистентности условно-патогенных микроорганизмов - этиологических агентов воспалительных процессов нижних отделов мочеполовой системы/ А.Ю. Шаталова // Тез. науч. работ.Х1 Всеросийский съезд дерматовенерологов и косметологов. Екб. - 2010. - С. 92-93.

Список сокращений

ИППП - инфекции, передаваемые половым путем

БВ - бактериальный вагиноз

КВВ - кандидоз вульвы и вагины

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ИФА - иммуноферментный анализ

КОЕ/мл - колониеобразующих единиц на миллилитр

АМП - антимикробные препараты

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

ДДМ - диско-диффузионный метод

ПМЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

МПК - минимальная концентрация антимикробного препарата, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма

Чувствительные к АМП штаммы - штаммы, у которых определяется МПК конкретного препарата, не превышающие МПК для чувствительных штаммов Умеренно-резистентные к АМП штаммы - штаммы, у которых определяется МПК конкретного препарата, превышающая МПК для чувствительных штаммов, но не превышающая МПК для резистентных штаммов Резистентные к АМП штаммы - штаммы, у которых определяется МПК конкретного препарата, превышающая МПК для умеренно-резистентных штаммов

Нечувствительные к АМП штаммы - штаммы, у которых определяется МПК конкретного препарата, превышающие МПК для чувствительных штаммов; данный термин объединяет группу умеренно-резистентных и резистентных к АМП штаммов

Подписано в печать:

10.05.2011

Заказ № 5489 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы

Одной из важнейших медико-социальных проблем в настоящее время является инфекционная- патология» урогенитального тракта женщины. Ведущее место в структуре данной патологии занимают воспалительные процессы, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами- (УПМ). Так, по данным разных авторов, частота бактериальных инфекций урогенитального тракта достигает 80% среди патологических состояний женской половой сферы (Кира Е.Ф., 2001 г., Тютюник B.JL, 2001 г., Яковлев C.B., 2002 г., Пестрикова Т.Ю. с соавт., 2009 г.).

Особенностью' нормальной микрофлоры урогенитального тракта является многообразие видов облигатных и факультативных анаэробов, и, в значительно меньшей степени, аэробов. По данным Andru В. и соавт. (1998 г.), в составе микробиоценоза могут присутствовать не менее 6 Г фенотипа микроорганизмов, но их набор остается' относительно постоянным, если женщина остается здоровой на протяжении значительного времени. В исследованиях многих ученых показано, что анаэробы в женских половых путях значительно преобладают над аэробами и факультативными анаэробами в течение всей жизни женщины, при этом отношение анаэробных лактобацилл к аэробным в репродуктивном возрасте в среднем составляет 10:1 (Валышев A.B. с соавт., 1999 г., Евсеев A.A., 2007 г., Макаров. О.В. с соавт., 2007 г.). По данным Анкирской A.C. (1999 г.) и Башмаковой М.А. с соавт. (1995 г.), у здоровых женщин в репродуктивном возрасте грамположительные лактобациллы являются доминирующими бактериями влагалищной среды и составляют 95-98% ее биотопа.

Долгое время этиологию неспецифических вагинитов связывали с каким-либо одним условно-патогенным микроорганизмом (Wilson R. et al, 1999 г.). Однако, присутствие многих микроорганизмов в биотопе влагалища практически здоровых женщин позволило ученым' опровергнуть теорию моноинфекции и считать актуальным полимикробный характер инфекционных'воспалительных заболеваний влагалища (Анкирская A.C. с соавт., 2005 г., Воропаева Е.А. с соавт., 2005 г., Тихомиров A.JI. с соавт., 2005 г., Макаров О.В. с соавт., 2007 г., Фофанова И.Ю., 2008 г.).

Рядом авторов (Анкирская A.C., 2000 г., Кира Е.Ф., 2001 г.,

Тихомиров, А.Л., 2006 г.) отмечено, что среди факультативных анаэробов, строгих аэробов и микроаэрофилов наиболее патогенными являются-микроорганизмы кишечного происхождения» (энтеробактерии и проблемные колиформные бактерии). Аналогичные свойства имеют неферментирующие бактерии (синегнойная палочка), а также грамположительные кокки (золотистый и эпидермальный стафилококки, стрептококки, микрококки, пневмококки). Однако, Bacteroides fragilis, одно время считавшийся актуальным возбудителем воспалительных процессов, по последним данным, встречается всего лишь в 5% случаев, что свидетельствует о вариабельности патогенности микроорганизмов (Мазорчук Б.Ф., 2007 г.). Обращает на себя внимание, что в большинстве исследований была продемонстрирована роль условно-патогенных микроорганизмов как моновозбудителей воспалительных процессов урогенитального тракта, несмотря на то, что данные заболевания, как правило, носят полимикробный характер. Таким образом, в настоящее время отсутствует единое мнение исследователей о наиболее значимых клинических ассоциациях условно-патогенных микроорганизмов в развитии вагинитов у женщин репродуктивного возраста.

Известно, что возникновению воспалительных процессов способствуют нарушения трофики тканей урогенитального тракта, вызванные эндогенными и экзогенными причинами (G.G.G.Donders et al. 2002 г.). Так, в исследованиях Савичевой A.M. (1996 г.) и Кира Е.Ф. (2001 г.), была установлена корреляционная связь между дисбактериозом кишечной и влагалища, состояние микрофлоры • которых является интегральным показателем здоровья и общей реактивности организма. Кроме того, некоторые авторы (Newton2E.Rt ! et al.,, 2001 г., Levinson W., 2004 г.) отводят существенную роль, снижению иммунологической реактивности организма. Bt их исследованиях было продемонстрировано и неблагоприятное влияние гиперэстрогении на баланс биотопа урогенитального? тракта; но до настоящего временит влияние гормонального фона1 женщины на изменения микрофлоры урогенитального тракта изучено недостаточно.

В этиологии неспецифических бактериальных вульвовагинитов, по данным ряда, авторов, немаловажную роль играет половая; трансмиссия условно-патогенных микроорганизмов-; В мировой литературе дискутируется вопрос о клиническом значении передачи УИМ половым путем. На этот счет существует две крайние точки зрения: одни авторы» считают возможным сексуальную трансмиссию (Curzik D., 2001 г., Воронова O.A., 2004 г.), другие — ее отрицают. (Macsween K.F. et al 1998 г., Levinson W.,. 2004 г., Mumtaz S. et al 2008 г.). Таким образом, роль многих факторов риска развития вульвовагинитов f остается- недостаточно изученной.

В настоящее время лабораторная диагностика1 вульвовагинитов; вызванных условно-патогеннымиг микроорганизмами, базируется на основании результатов, микроскопического и культурального методов исследования (Анкирская A.C. 2000 г., Воропаева Е.А. и др., 2005 г.). Однако культуральный метод представляет собой сложную, трудоемкую процедуру, длительную по времени? выполнения; Для проведения адекватного бактериологического исследования« необходимо строгое соблюдение условий^ получения клинического материала, ограничение времени доставки биоматериала в лабораторию, наличие специальных сред для культивирования, создание определенных условий инкубации, высокая квалификация специалистов.

Быстрое осуществление идентификации микроорганизмов в микробном сообществе, определение их фенотипических и генотипических свойств возможно с помощью методов, позволяющих выявить микроорганизмы. непосредственно в материале соскоба из урогенитального тракта, минуя стадию культивирования и выделения чистой культуры. На сегодняшний день решение проблемы идентификации бактериальной микрофлоры возможно путем использования передовой технологии, ДНК-чипов. В настоящее время; представляется перспективным изучение чувствительности. и специфичности метода ДНК-чипов; для дальнейшего совершенствования диагностики вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными-микроорганизмами.

На сегодняшний день в медицине не существует единых подходов и рекомендаций по лечению вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными. микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста (Di Stefano, L. 2003 г., Воронова O.A. 2004 г.). Одним из основных принципов лечения является назначение антибактериальной: терапии. В настоящее время лечение больных вульвовагинитами, вызванными УПМ, часто проводится без учета этиологических факторов,- что нередко приводит к рецидивам заболевания через непродолжительный период времени и неуклонному росту резистентности условно-патогенных микроорганизмов к традиционно применяемым антибактериальным препаратам. Таким образом, на сегодняшний день не существует четких и эффективных алгоритмов по ведению пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, недостаточно изучены факторы риска вульвовагинитов и роль различных ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов в их развитии, остается открытым вопрос о выборе препаратов для лечения. Все вышеизложенное обусловливает актуальность настоящего исследования. Цель исследования.

Оптимизировать тактику ведения женщин репродуктивного возраста с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, на основании определения факторов риска возникновения заболеваний, изучения состава вагинального микробиоценоза, оценки клинической значимости современных методов лабораторной диагностики и анализа показателей чувствительности инфекционных агентов к антибактериальным препаратам. Задачи исследования

1. Изучить факторы, риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста.

2. Исследовать качественный и количественный состав вагинального микробиоценоза у женщин репродуктивного возраста с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами и возможность использования ДНК-чипов для оценки состояния вагинального микробиоценоза.

3. Изучить показатели чувствительности условно-патогенных микроорганизмов — этиологических агентов вульвовагинитов к антибактериальным препаратам.

4. Оценить эффективность различных методик терапии пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

5. На основании полученных данных разработать алгоритм ведения пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

Научная новизна,

При изучении факторов риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста установлено, что гормональный дисбаланс, представленный гиперэстрогенией и гиперпролактинемией способствует нарушению нормоценоза вагинального биотопа.

Определена роль условно-патогенных микроорганизмов в развитии вульвовагинитов у женщин репродуктивного возраста. Продемонстрировано клиническое значение Corynebacterium spp., представителей семейств,. Enterobacteriaceae, Micrococcaceae и облигатно-анаэробных микроорганизмов (Bacteroides spp., Fusobacterhim nucleatum, Propionibacterium spp.) в ассоциации;4 и более инфекционных агентов.

Впервые показана максимальная* чувствительность и специфичность метода ДНК-чипов* для идентификации возбудителей ШИШ ш высокая^ чувствительность (97,2-100,0%) для идентификации непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Впервые изучена экономическая эффективность использования ДНК-чипов для оценки вагинального микробиоценоза, при этом установлены преимущества метода ДНК-чипов по сравнению с микробиологическими методами:

Систематизированы данные по чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам у женщин с вульвовагинитами, при этом установлена высокая- чувствительность инфекционных агентов к амоксициллин/клавулоновой кислоте (чувствительны 93,4%-100,0% штаммов), цефтриаксону (чувствительны 93,6%-100,0% штаммов) и нитрофуранам (чувствительны 92,4%-100,0% штаммов).

Показана более высокая эффективность сочетанного применения системного антибактериального препарата с комбинированным антимикробным препаратом местного действия по сравнению с монотерапией, проводимой системным! антибактериальным препаратом (р=0,039) или комбинированным антимикробным препаратом местного действия (р=0,005). Практическая значимость

На основании результатов проведенных исследований разработан алгоритм ведения пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

Внедрение в практику метода ДНК-чипов позволяет осуществлять одновременную идентификацию большого' числа патогенных, условно-патогенных и непатогенных микроорганизмов непосредственно в биологическом материале, минуя стадию культивирования, что значительно сократит время обследования пациентов и повысит экономическую эффективность исследования.

Результаты изучения чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам позволят оптимизировать схемы терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Внедрение результатов диссертации в практику

Результаты исследования внедрены в практику работы Консультативно-диагностического центра ФГУ «ГНЦДК»

Минздравсоцразвития России и Бюджетного учреждения здравоохранения Омской области «Клинический кожно-венерологический диспансер».

По результатам исследования подготовлены Медицинские технологии «Вульвовагиниты, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, у пациенток репродуктивного возраста: диагностика и терапия» и «Применение технологии ДНК-чипов в комплексной диагностике инфекций, передаваемых половым путем» (Москва, 2011 г.).

Разработан патент «ДНК-чип для комплексной диагностики инфекций, передаваемых половым путем» (номер заявки 2009140661 от 05.11.09 года). Основные положения, выносимые на защиту

I. Основными факторами риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста являются: раннее начало половой жизни; большое количество половых партнеров; применение в сексуальной практике нетрадиционных форм половых контактов при отсутствии барьерной контрацепции или нерегулярном ее использовании; нерациональное и бесконтрольное применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия; нарушение правил личной и/или половой гигиены; гормональный дисбаланс, связанный с гиперэстрогенией и гиперпролактинемией; наличие дисбактериоза и других заболеваний кишечника.

II. Состав вагинального микробиоценоза у женщин с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, характеризуется преобладанием в структуре Corynebacterium spp: (91,4%), Escherichia coli (54,5%), Enterococcus faecalis (54,0%), Staphylococcus saprophiticus (29,3%), Klebsiella pneumoniae (18,2%); Streptococcus anginosus r\ Л

18,2%), Streptococcus agalactiae (16,2%) в количестве более 1(Г- 10" КОЕ/мл и облигатных анаэробов Bacteroides spp. (10,1%), Fusobacterium- nucleatum (8,6%), Propionibacterium spp. (8,1%) в ассоциациях 4 и более микроорганизмов.

Состав вагинального микробиоценоза здоровых женщин характеризуется преобладанием в структуре облигатно-анаэробных Lactobacillus spp. (89,4%) и Corynebacterium spp. (42,4%).

При вульвовагинитах, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, происходит замещение облигатно-анаэробных видов лактобактерий на факультативно-анаэробные.

ДНК-чип является современным методом этиологической диагностики вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, позволяющим осуществлять одновременную идентификацию большого числа как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов непосредственно в биологическом материале, минуя стадию культивирования, что значительно сокращает время обследования пациентов.

Применение технологии ДНК-чипов имеет экономическое преимущество перед микробиологическими исследованиями: стоимость комплексной диагностики состава вагинального микробиоценоза: с использованием ДНК-чипов в 1,9 раза меньше себестоимости микробиологических методов исследования.

Чувствительность и специфичность метода ДНК-чипов для идентификации возбудителей ИППП {Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и Mycoplasma genitalium) является максимальной (100%). Для идентификации непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов {Lactobacillus spp., Escherichia coli, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Gardnerella vaginalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus anginosus) установлена высокая чувствительность метода ДНК-чипов (97,2-100,0%).

III. Препаратами выбора при лечении вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, являются амоксициллин/клавулоновая кислота, нитрофураны и цефтриаксон. Препараты группы фторхинолонов в терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, необходимо назначать только при подтверждении чувствительности к ним выделенных культур микроорганизмов.

IV. Терапию вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, следует проводить индивидуально с учетом результатов чувствительности выделенных культур микроорганизмов. Целесообразно сочетать системную антибактериальную терапию с назначением местного поликомпонентного антимикробного препарата широгого спектра действия.

Апробация работы

Результаты проведенного исследования доложены на:

1. X Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, октябрь 2008г.).

2. Научно-практической конференции ФГУ «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий» (Москва, май, 2009 г.).

3. XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Екатеринбург, октябрь, 2010 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 - в научных изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ (Вестник дерматологии и венерологии 2008 - №5; Вестник дерматологии и венерологии 2009 - № 3; Вестник дерматологии и венерологии 2009-№4).

Структура и объем диссертации

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Тактика диагностики- вульвовагинитов, вызванных аэробными условно-патогенными микроорганизмами, определяется комплексной оценкой анамнестических данных, с учетом факторов риска, и клинико-микробиологического обследования:

При наличии клинических признаков, и лабораторных критериев вульвовагинита,. необходимо проводить культуральное исследование с определением« качественного и количественного состава вагинального, микробиоценоза.

Необходимо оценить характер ассоциаций представленных условно-патогенных микроорганизмов.

Клинически значимым является рост условно-патогенных

2\ 4 микроорганизмов В1 количестве более 10,-10" КОЕ/мл при- ассоциации 4 и более микроорганизмов.

Этиотропная терапия пациенток с данной патологией должна проводиться индивидуально с учетом результатов определения чувствительности аэробной микрофлоры к антибактериальным-препаратам.

В условиях, когда культуральное исследование с определением уровня чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам провести невозможно, препаратами выбора в лечении вульвовагинитов, вызванных аэробными микроорганизмами, могут являться амоксициллин/клавулоновая кислота, препараты группы нитрофуранов и цефтриаксон.

В целях профилактики рецидивов заболевания пациенткам необходимо рекомендовать соблюдение правил интимной гигиены, использование барьерного метода защиты особенно в практике генитально-анальных и, орально-генитально-анальных контактов, обследование полового партнера.