Автореферат и диссертация по медицине (14.00.35) на тему:Возрастная динамика цитологических показателей симпатических нейронов в условиях воздействия нитритов и нитратов

на правах рукописи

ДЗАХОВА Галина Аузбиевна

ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИМПАТИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ НИТРИТОВ И НИТРАТОВ

03.00.25 - ГИСТОЛОГИЯ, ЦИТОЛОГИЯ, КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» и в Севе-ро-Осетинской государственной медицинской академии

Научный руководитель:

Научный консультант:

доктор медицинских наук, академик РАМН ЯРЫГИН Владимир Никитич

доктор медицинских наук, профессор БИБАЕВА Лариса Владимировна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

ДУБОВАЯ Татьяна Клеониковна

доктор медицинских наук, профессор ЯЦКОВСКИЙ Александр Никодимович

Ведущая организация - Российский университет Дружбы Народов

Защита состоится «_»_2005 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Минздрава России (117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Минздрава России

Автореферат разослан «о^"» ¿.¿¿-¿З/^»?*-«^? 2005 года.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

А.И. ЩЁГОЛЕВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время широкое применение во многих отраслях хозяйства и в быту химических соединений способствует появлению новых заболеваний, возникновению и накоплению мутаций, что оказывает негативное влияние на здоровье человека. Опасность во многом заключается в том, что часть химических веществ, которые находят применение в повседневной жизни, мы перестаём воспринимать как вредные и, тем самым, используем в количествах, которые при попадании в организм оказывают отрицательное действие. Другие, даже при поступлении в небольших дозах, но вследствие способности образовывать прочные соединения, накапливаются в организме и вызывают всевозможные нарушения здоровья.

Одним из источников таких негативных влияний на здоровье человека могут быть кислородсодержащие соединения азота (нитриты и нитраты), чьи химические свойства позволяют легко образовывать соли, широко используемые в сельском хозяйстве, в пищевой и фармацевтической промышленности (Жутова Г.Ф., Филина СЛ., Зайцев А.Н., 1991; Ильницкий А.П., 1991; Опопель Н.И., 1991).

Точки приложения действия нитритов в организме различны. В желудке они взаимодействует с соляной кислотой с образованием азотной кислоты и оксида азота, способного вызывать раздражение и отечность клеток слизистой оболочки, увеличение внутриклеточного содержания натрия (Avila MA., 1997; Rockey D.C., Chung J.J., 1997; Chu G.K., Tator C.H., 2001). Нитриты, являясь сильными окислителями, превращают гемоглобин в метгемоглобин, что приводит к нарушению транспорта кислорода и тканевого дыхания, развитию гипоксии, особенно у детей грудного возраста. Кроме того, нитриты, образуя активные формы кислорода, способствуют истощению антиоксидантного фонда клетки, возникновению множественных нарушений цитоплазматических мембран. Соединение нитритов с аминами и амидами белков образует нитрозамины и нитрозамиды, которые подавляют иммунитет, оказывают мутагенное и канцерогенное действия (Субботин Ф.Н., Волкова Н.В., 1998; Greenlund L.J., Deckwerth T.L., Johnson E.M., 1995; Doblander C, Lackner R., 1996). Имеются отдельные данные (Rees H.D., Bonsall K.W., Michael R.P., 1986; Aim P. et al., 1995; Krizsan-Agbas D., Smith P.G., 2002) о том, что нитриты ускоряют рост и

3

половое созревание крысят, а N0' радикал способен образовать пероксинитрит, индуцирующий апоптоз.

Таким образом, кислородсодержащие соединения азота оказывают влияние, как на отдельные органы и системы, так и на весь организм. Однако в научной литературе сведений об их действии на нервные клетки симпатического отдела периферической нервной системы, мы не встречали, что и послужило основанием для изучения данной темы.

Целью работы явилось систематическое комплексное изучение влияния умерено- и высокотоксичных доз азотсодержащих соединений (нитритов и нитратов) на динамику ряда цитологических показателей симпатических нейронов в онтогенезе крыс.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. В условиях хронической интоксикации умеренотоксичными дозами нитрита и нитрата натрия провести на крысах разных возрастов (ювенильного, зрелого репродуктивного и старческого) исследование количества нейроцитов краниального шейного симпатического ганглия (КШСГ) и для групп крыс ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов порядок изменений указанного параметра по прошествии десяти месяцев.

2. В условиях трёхнедельного введения крысам разных возрастов умереноток-сичных доз нитрита и нитрата натрия провести изучение средних размеры перикарионов нейроцитов КШСГ и проследить через десять месяцев за динамикой изменений, если таковы возникают.

3. В условиях введения крысам в онтогенезе умеренотоксичных доз исследуемых соединений в течение трёх недель, исследовать матричную активность ДНК нуклеоплазмы, ядрышка и суммарную активность ядра нейроцитов КШСГ с регистрацией исследуемых параметров по прошествии десяти месяцев.

4. В условиях трёхдневного введения высокотоксичных доз нитрита и нитрата натрия на крысах разных возрастов провести изучение количества нейронов КШСГ, размеров их перикарионов и матричной активности ядер, в том числе оценить состояние перечисленных показателей через десять месяцев для группы крыс ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов.

5. Для выяснения влияния азотсодержащих соединений на степень интоксикации организма и функции почек провести исследование содержания метге-моглобина в крови, уровня белка в плазме крови, экскреции мочевины и показателей основных процессов мочеобразования (скорости клубочковой фильтрации и объёма канальцевой реабсорбции воды).

Научная новизна работы состоит в том, что впервые проведено комплексное изучение влияния разных дозировок и продолжительности приёма (три недели умеренотоксичные дозы и три дня высокотоксичные) азотсодержащих соединений (нитрита и нитрата натрия) на: динамику изменений количества и размеров нейронов, транскрипционную активность нуклеоплазмы, ядрышка и суммарную активность ядра нейронов КШСГ у крыс разных возрастов (ювенильного, зрелого репродуктивного и старческого возрастов); степень интоксикации (по содержанию в крови метгемоглобина и уровню белка в плазме крови); водо-и азотовыделительную функции почек (по экскреции мочевины, диурезу, скорости клубочковой фильтрации и объёму канальцевой реабсорбции воды). Впервые показана корреляция между возрастом и реакцией симпатических нервных клеток на хроническое введение умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений (снижение количества нейроцитов, но увеличение их размеров и матричной активности синтеза РНК у ювенильных крыс; уменьшение всех исследуемых показателей у крыс старческого возраста; усиление активности синтеза РНК у крыс зрелого репродуктивного возраста). Кроме того, впервые установлены отдалённые (через десять месяцев) последствия хронической и острой интоксикации нитритом и нитратом натрия при воздействии в ювенильном и зрелом репродуктивном возрасте. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Трёхнедельная интоксикация крыс разных возрастов умеренотоксичными дозами нитрита и нитрата натрия не оказывает влияние на количество нейроцитов КШСГ у крыс зрелого репродуктивного возраста, но снижает их число у крыс старческого и ювенильного возрастов; по прошествии десяти месяцев после воздействия у крыс ювенильного возраста отмечается более выраженное снижение.

2. Умеренотоксичные дозы азотсодержащих соединений не оказывают влияние на средние размеры перикарионов нейроцитов КШСГ крыс зре-

лого репродуктивного возраста, увеличивают у ювенильных крыс и снижают у крыс старческого возраста; через десять месяцев размеры перика-рионов симпатических нейронов крыс, получавших нитрит и нитрат натрия в ювенильном возрасте, ниже соответствующего возрастного контроля.

3. Хроническое введение умеренотоксичных доз нитрита и нитрата натрия повышает матричную активность нуклеоплазмы, ядрышка и суммарную активность ядра у крыс ювенильного возраста, но по прошествии десяти месяцев матричная активность у них ниже контрольных значений. У крыс старческого возраста отмечается снижение матричной активности хроматина.

4. Трёхдневная интоксикация высокотоксичными дозами не оказывает влияние на количество клеток в КШСГ, средние размеры перикарионов и интенсивность транскрипции в ядрах нейронов у крыс всех возрастных групп. Вместе с тем, у крыс ювенильного возраста по прошествии десяти месяцев отмечается снижение числа клеток, а также средних размеров перикарионов и транскрипционной активности ядер.

5. Умеренстоксичные дозы азотсодержащих соединений увеличивают в крови содержание метгемоглобина и снижают уровень белка в плазме крови. При этом увеличивается диурез. Высокотоксичные дозы вызывают резкое угнетение водо- и азотовыделительной функции почек. Теоретическая и практическая значимость. Проведенные исследования носят экспериментальный характер, а полученные результаты относятся к области фундаментальных знаний, так как показывают ранее неизвестные факты влияния азотсодержащих соединений на динамику цитологических показателей нейронов краниального шейного симпатического ганглия у крыс в онтогенезе.

Материалы исследования имеют не только теоретическое, но и практическое значение, в частности для врачей-токсикологов. Они демонстрируют влияние нитритов и нитратов на нервные клетки у крыс разных возрастных групп и с отдалёнными результатами, что следует учитывать при лечении пациентов, подвергшихся интоксикации азотсодержащими соединениями.

Полученные в работе результаты используются в учебном и научном процессах на кафедрах биологии, гистологии, военной подготовки (курс токсикологии), педиатрии и ЦНИЛ Северо-Осетинской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов» г.Астрахань, 2000; XVIII Всероссийском съезде физиологов. г.Казань, 2001; межрегиональной конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной морфологии». г.Томск, 2002; итоговой научной сессии сотрудников Северо-Осетинской государственной медицинской академии. г.Владикавказ, 2003; V международной конференции «Устойчивое развитие горных территорий: проблемы и перспективы интеграции науки и образования» г.Владикавказ, 2004.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 работ. Объём и структура работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследований», двух глав собственных данных, заключения и общих выводов. В работу включены 5 таблицы и 28 рисунков. Список использованной научной литературы содержит 156 работ, из которых 42 отечественных и 112 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВНИЙ Изучение влияния азотсодержащих соединений на нейроны КШСГ и некоторые биохимические показатели крови и функции почек, которые являются органами-мишенями для этих веществ, проводили на 156 крысах-самцах линии разных возрастов, разделённых в соответствии с общепринятой классификацией (Западнюк И.П., Западнюк В.И., 1983) на: ювенильных (1 месяца), зрелых репродуктивных (12 месяцев) и выраженного старческого возраста (2224 месяцев). Во время опытов все крысы содержались на стандартном рационе, состоящем из хлеба, злаков, овощей и воды, доступ к которым был свободен в течение суток. Световой режим соответствовал естественному.

Нитрит и нитрат, в качестве которых мы использовали натриевые соли этих соединений (нитрит натрия №N02 и нитрата натрия №N0), вводили крысам через зонд в желудок в разных дозировках. Интоксикацию умереноток-сичными дозами (нитрит 5 мг/кг массы тела, нитрата 500 мг/кг) проводили ежедневно в течение трёх недель, а высокотоксичными (нитрит 20 мг/кг массы тела, нитрата 2000 мг/кг) - в течение трёх дней. В качестве контроля были взяты интактные крысы (отдельно для каждой возрастной группы), которые получали раствор хлористого натрия с содержанием натрий в количестве эквивалентном в нитрите и нитрате натрия.

При исследовании функции почек крысам вводили водную нагрузку водопроводной водой, составляющую 2% массы тела и помещали их на два часа в специальные клетки для сбора мочи, в которой определяли содержание эндогенного креатинина, с последующим расчётом скорости клубочковой фильтрации и уровня канальцевой реабсорбции воды. В плазме крови определяли содержание креатинина, мочевины и уровень общего белка, в крови - содержание метгемоглобина.

Для достижения поставленной цели были проведены следующие серии и варианты опытов на крысах разных возрастов:

1. Исследование нейронов КШСГ (световая микроскопия и морфометрия, транскрипционная активность хроматина), некоторых биохимических показателей крови (содержание в крови метгемоглобина, уровень белка и мочевины в плазме крови) после трёхнедельной интоксикации умеренными дозами нитрата и нитрита натрия. Функции почек (водо-и азотовыделительная) исследовали только у крыс зрелого репродуктивного возраста.

2. Проведение всех выше перечисленных исследований нейронов КШСГ, некоторых биохимических показателей крови и функции почек после интоксикации высокотоксичными дозами нитрита и нитрата натрия.

3. Исследование последействия, оказанного азотсодержащими соединениями на изучаемые параметры у крыс ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов через десять месяцев после их интоксикации умеренными и высокотоксичными дозами азотсодержащих соединений.

Все использованные в работе биологические материалы были получены у контрольных и экспериментальных крыс в одинаковых условиях после забоя под эфирным наркозом.

Определение количества нейроцитов в краниальном шейном ганглии и их морфометрический анализ проводили после фиксации в жидкости Карнуа, парафиновой заливки и приготовления серийных срезов толщиной по 7-8 мкм, и их окрашивания 0,1% раствором метиленового синего. Подсчет клеток проводили на каждом пятом срезе, а полученные данные суммировались. С помощью винтового окуляр-микрометра МОВ-1 при увеличении микроскопа в 1500 раз измеряли наибольший и наименьший диаметры клетки, которые затем перемножали и получали значение профильного поля нейрона в относительных единицах. В обоих случаях для исследования выбирали срезы перикарионов, содержащие ядрышко. Профильное поле нейрона оценивали как среднее для 50 измеренных клеток от каждой крысы.

Транскрипционную активность хромосом исследовали авторадиографическим методом по активности РНК-полимераз в фиксированных клетках (Moore G.R.M., 1966), что позволяет избежать сложности, связанные с мечени-ем РНК из-за отсутствия зависимости от транспорта предшественников в клетку, их захвата во внутриклеточные пулы, а также то, что вновь синтезированные молекулы РНК остаются на матрице ДНК. Гистокриотомные срезы толщиной в 7-8 мкм в течение 5 минут фиксировали в смеси, состоящей из равных долей этанола и ацетона, а затем высушивали на воздухе и наносили на них инкубационную смесь. После чего срезы помещали на 30 минут в термостат при температуре +37°С, прекращали реакцию, промывая дистиллированной водой, и фиксировали в течение 30 минут в смеси этанола и уксусной кислоты (3:1). Затем препараты при температуре +4°С на 15 минут помещали в 5% раствор трихлоруксусной кислоты для удаления невключившихся предшественников и тщательно промывали проточной водой. Авторадиографический отпечаток получали после покрытия стекла эмульсией типа М, экспонировали 14 дней, а затем проявляли фотографическим способом и окрашивали 0,1% раствором ме-тиленового синего. Для возможности сравнения полученных результатов в разных возрастных группах экспозицию всех препаратов проводили одновременно. Уровень матричной активности хроматина оценивали, подсчитывая количе-

ство зёрен восстановленного серебра отдельно над ядрышком и нуклеоплазмой в 50 нейроцитов от каждого животного.

Содержание белка в плазме крови и моче определяли по методу Лоури, а содержание креатинина в плазме крови и моче определяли по методу Поппера (Рябов СИ, Наточин Ю.В., Бондаренко Б.Б., 1979). Метод определения метге-моглобина в крови основан на фотометрическом определении разницы светопо-глощения растворов окси- и метгемоглобина.

Полученные результаты обрабатывались параметрическим методом сравнения средних величин с помощью t - критерия Стьюдента по компьютерной программы «STADIA», где М - средняя арифметическая, т± - коэффициент достоверности средней арифметической, р - вероятность ошибки или достоверность ошибки, п - общее число вариантов. Для расчетов и построения графиков использовалась программа «Prizma 2.01».

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование влияния азотсодержащих соединений на возрастную динамику цитологических показателей нейронов КШСГ у крыс мы начали с оценки их среднего количества. При этом необходимо отметить, что использование различных методик подсчета в значительной степени сказывается на получаемых результатах. Кроме того, отмеченные многими авторами колебания от 1013 тысяч (Smith P.G., 1990), 18-21 тысяч (Borglhini N.. 1991) и до 34-42 тысяч (Dibner M.D., 1977, 1978; Gabella G., 1986) во многом зависят от возраста и пола крыс, выбора единицы учета (тело клетки, ядро, ядрышки), количества анализируемых срезов и способов коррекции.

Проведенные нами исследования показали, что количество нейронов контрольных животных для разных возрастов (24364±786 для ювенильных, 22864±1108 для крыс зрелого репродуктивного возраста и 20365±846 для старых крыс) не являются абсолютными значениями. Однако, вследствие того, что в работе всегда использовался один и тот же метод их подсчета, мы можем сравнивать результаты, полученные в норме у интактных крыс, к соответствующим данным крыс после интоксикации различными дозировками и продолжительностью введения нитрита и нитрата натрия.

Однонедельная интоксикация умеренотоксичными дозами азотсодержащих соединений (табл.1) вызывала у ювенильных крыс в КШСГ тенденцию к снижению количества нервных клеток, усилившуюся при продолжении экспериментов ещё в течение двух недель, особенно у нитритных крыс, у которых, по сравнению с соответствующим контролем, количество нейроцитов снизилось на 9,5% (р<0,05), а у нитратных крыс - на 6%.

Наименьшее влияние оказали исследуемые соединения азота на количество нейронов КШСГ крыс зрелого репродуктивного возраста, у которых только через три недели интоксикации наметилась тенденция к снижению (табл. 1).

Таблица № 1. Количество нейроцитов краниального шейного симпатического ганглия у крыс разного возраста после трёхнедельного введения умеренотоксичных

Условия опыта стат. 1 пока- Ювенильные затели I Зрелые Старые

контроль

Интактные крысы М±ш | 24 364±786 | 2286411108 | 20365±846

нитраты

Введение в течение одной недели М±ш 23 312± 1160 2165511265 1871411265

Р * * *

Введение в течение трёх недель М±т 22672±1064 209851947 172051893

Р * * <0,05

Через 10 месяцев после трёхнедельного введения нитрата М±т 18344±872 1975211450

Рз <0,02

Рс *

нитриты

Введение в течение одной недели М±т 22 8681904 210081861 1721811104

Р * * <0,05

Введение в течение трёх недель М±т 212871820 2067711282 1618511216

Р <0,05 * <0,02

Через 10 месяцев после трёхнедельного введения нитрита М±т 1776011008 192161923

Рз <0,02

Рс *

* - отсутствие достоверных изменений к контролю своей возрастной группы

Рз - достоверность изменений к контролю для крыс зрелого репродуктивного возраста

Рс - достоверность изменений к контролю для крыс старческого возраста

Скорее всего, это связано с тем, что крысы этого возраста более устойчивы к внешним воздействиям. В то же время у крыс старческого возраста трёхнедель-

ная интоксикации снизила общее число нейроцитов в наибольшей степени - на 17,2% (р<0,05) после нитрата натрия и на 22,5% (р<0,02) после нитрита. Трёхдневное введение высокотоксичных доз, превосходящих умеренные в четыре раза, не оказало особого влияния на количество нейронов КШСГ крыс, независимо от их возраста (рис.1).

Исследования проведенные на крысах зрелого репродуктивного и старческого возрастов, которым десятью месяцами ранее, когда они, соответственно, были ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов и им ежедневно в течение трёх недель вводили умеренотоксичные дозы азотсодержащих соединений, а в дальнейшем они больше не подвергались интоксикации, показали, что количество нейроцитов КШСГ у крыс зрелого репродуктивного возраста было достоверно (р<0,02) снижено. Одновременно у них была сокращена максимальная продолжительность жизни (18 месяцев у нитратных и 16,4 месяца у нитритных крыс). Высокотоксичные дозы, не оказавшие влияние на общее число нейроцитов сразу после их введения, по прошествии десяти месяцев также снизили их число (рис.1).

Б^нитраты у зрелых крыс через 10 месяцев ^Энитриты у зрелых крыс через 10 месяцев

Рис. 1 Количество нейроцитов и их динамика у крыс разных возрастов после интоксикации их в течение трёх дней высокотоксичными дозами нитрата и нитрита

У крыс же старческого возраста, независимо от продолжительности и дозировки приёма азотсодержащих соединений в зрелом репродуктивном возрасте, количество нейронов КШСГ не отличалось от результатов контроля. Кроме того, у них не сократилась средняя продолжительность жизни (22 месяца).

При исследовании влияния умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений на размеры перикарионов и их колебания у крыс ювенильного возраста, было выявлено, что однонедельная интоксикация не оказала какого-нибудь воздействия. Так, количество мелких нейронов, имеющие профильное поле менее 25000 отн.ед. после введения нитрита натрия уменьшилось на 3%, но на столько же увеличилось число крупные клетки, имеющих размеры свыше 40000 отн.ед. (рис.2). Количество средних клеток не изменилось. В то же время, продолжение интоксикации ещё в течение двух недель привело к увеличению количества крупных клеток, что, по всей видимости, могло быть обусловлено не только ростом крупных нейроцитов КШСГ у крыс молодого возраста, отмеченным многими исследователями, но и возможной активизацией компенсаторных процессов, вследствие способности нитритов нарушать тканевое дыхание, с образованием активных форм кислорода и N0" радикала, способных ускорять гибель клетки. Введение высокотоксичных доз в течение трёх дней, по сравнению с контролем, не меняло размеры перикарионов нейронов, что, однако, можно расценивать как угнетение, так после недельной интоксикации умеренными дозами рост перикарионов нейронов КШСГ продолжался.

У крыс зрелого репродуктивного возраста введение умеренотоксичных доз вызывало тенденцию к увеличению размеров перикарионов нейроцитов КШСГ (рис.2), причём за счёт крупных клеток, имеющих размеры свыше 40 отн.ед. и, только после трёхнедельной интоксикации, что, скорее всего, могло быть компенсаторной гипертрофией, так как естественного роста нервных клеток у крыс в этом возрасте не происходит. Высокотоксичные дозы не вызвали каких-либо изменений размеров перикариона.

Наибольшее влияние умеренотоксичные дозы оказали на размеры нейронов КШСГ крыс старческого возраста (рис.2). У них уже через одну неделю появилась тенденция к уменьшению, а у тех, кто получал нитрит натрия снижение размеров имело достоверное (р<0,05) отличие от контроля. Продолжение интоксикации еще в течение двух недель усилило снижение размеров перика-

рионов нейроцитов, что имело большую степень отличия (р<0,002) от уровня контроля. Одновременно, при уменьшении общего количества нейроцитов, отмечалось достоверное (р<0,05) снижение крупных и средних клеток. Введение высокотоксичных доз не оказывало влияния на размеры перикарионов нейронов КШСГ.

При изучении последействия, отсроченного на десять месяцев после трёхнедельного введения умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений крысам ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов, было отмечено, что у 1-месячных крысы, достигших годовалого возраста, средние размеры перика-рионов нейроцитов были меньше результатов контроля на 12% (р<0,01) при введение нитратов и на 17% после нитритов, что было в первую очередь обусловлено снижением количества крупных клеток, имеющих размеры среднего поля нейроцитов больше 40000 отн.ед.

При аналогичном сопоставлении результатов, полученных у зрелых крыс на момент достижения ими 22-х месяцев, можно констатировать факт незначительного, по сравнению с контролем, снижения размеров перикарионов нейро-цитов (на 5,4% при введении нитритов и 2,2% после нитратов), обусловленного уменьшением крупных и средних клеток.

Таким образом, ежедневное введение в течение трёх недель умеренотоксичных доз нитрита и нитрата натрия вызывала у крыс ювенильного возраста увеличение средних размеров перикарионов нейроцитов КШСГ, однако через десять месяцев это приводило к снижению их размеров. Хроническая интоксикация азотсодержащими соединениями не оказывала влияние на размеры перикарионов нейроцитов у крыс зрелого репродуктивного возраста, как сразу, так и по прошествии времени, а у крыс старческого возраста она вызывала уменьшение средних размеров. Высокотоксичные дозы, вводимые в течение трёх дней, не оказывали влияние на средние размеры перикарионов нейронов КШСГ крыс.

Рис.2 Процентное соотношение размеров перикарионов нейроцитов краниального шейного симпатического ганглия у крыс разных возрастов после трёхнедельного введения умеренотоксичной дозы нитрита нагрия и результаты, отсроченные на десять месяцев у крыс ювенильного и зрелого репродуктивного возраста

О влиянии азотсодержащих соединений на интенсивность транскрипции в нейронах КШСГ мы судили по матричной активности нуклеоплазмы и ядрышка, а также по суммарной активности хроматина ядра, которая у контрольных ювенильных крыс была в 1,59 раза меньше, чем у зрелых репродуктивных крыс и в 1,18 раза меньше результатов, полученных у крыс старческого возраста. При этом в нуклеоплазме транскрипционная активность у крыс зрелого репродуктивного возраста была на 52% больше, чем у крыс ювенильного возраста и на 21,2% больше, чем у крыс старческого возраста, а в ядрышке, соответственно, на 41 % и 9%. Очевидно, это обусловлено тем, что у крыс зрелого репродуктивного возраста синтез белков идёт более активно, чем у крыс ювенильного возраста, у которых он сформулирован не в полном объёме, а у крыс старческого возраста - более заторможен.

Хроническая интоксикация умеренотоксичными дозами нитрита и нитрата натрия на транскрипционную активность синтеза РНК в ядре нейроцитов КШСГ у крыс ювенильного возраста оказывала усиливающее действие. Введение нитрата натрия достоверно (р<0,05) повышало матричную активность в нуклеоплазме, а нитрит натрия оказывал более значимо (р<0,01) влияние, увеличивая исследуемый параметр не только в нуклеоплазме, но и в ядрышке (р<0,02). При этом отмеченные изменения сопровождались увеличением количества сильномеченых клеток, имеющих 50 - 60 зерен восстановленного серебра, и снижением доли слабомеченых (до 30 зерен восстановленного серебра) в нуклеоплазме и ядрышке, особенно при введении нитрита натрия. Трёхдневное введение высокотоксичных доз азотсодержащих соединений не отразилось на интенсивности мечения ядерных структур.

У крыс зрелого репродуктивного возраста введение умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений также усиливало транскрипционную активность хроматина. В результате повышения числа зёрен восстановленного серебра в нуклеоплазме на 19%, а ядрышке с 12,6±0,64, результата контроля, до 21,44±1,73 после введения нитрита натрия, интенсивность суммарной транскрипционной активности в ядре повысилась на 31%. Это повышение в первую очередь происходило за счёт увеличения количества клеток со слабым мечени-ем зёрен восстановленного серебра как в нуклеоплазме, так и в ядрышке. Одно-

временно уменьшалось число сильномеченных клеток. Высокотоксичные дозы не оказывали влияние на матричную активность клеток.

У крыс старческого возраста интенсивность синтеза РНК после ежедневного введения в течение трёх недель умеренотоксичных доз нитрита и нитрата в исследуемых компонентах ядра, снижалась. При этом увеличивалось количество клеток, содержащих небольшое количество восстановленного серебра. Высокотоксичные дозы азотсодержащих соединений не оказали влияния на интенсивность транскрипционной активности ядра.

Таким образом, трёхнедельное введение умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений повышала матричную активность нуклеоплазмы и ядрышка нейронов КШСГ у крыс ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов и снижала у крыс старческого возраста.

При изучении возможного последействия трёхнедельной интоксикацией на активность хроматина в ядрышке и нуклеоплазме было определено, что спустя десять месяцев после введения крысам ювенильного возраста нитрита натрия, активность синтеза РНК в нуклеоплазме и ядрышке была сниженной (на 12,6% суммарно в ядре). В тоже время, транскрипционная активность у крыс зрелого репродуктивного возраста, получавших нитрит натрия за десять месяцев до исследований, особо не претерпела изменений.

Азотсодержащие соединения, в зависимости от вводимой дозы, оказывали разное влияние на общее состояние и некоторые биохимические показатели крови и функции почек крыс. Вначале у животных, подвергавшихся интоксикации умеренотоксичными дозами, отмечалась повышенная активность, которая, по мере продолжения введения этих соединений азота, сменялась угнетённым состоянием. Дыхание становилось частым и поверхностным, а видимые кожные покровы и слизистые оболочки - синюшными. При введении высокотоксичных доз появлялись кровянистые выделения из носа, фибриллярные подергивания отдельных мышц и судороги, непроизвольное мочеиспускание, особенно у ювенильных крыс, что, возможно, связано со слабым развитием у них защитно-адаптационной системы.

Проведенные биохимические исследования крови у крыс зрелого репродуктивного возраста показали, что введение умеренотоксичных доз в течение одной недели приводило к повышению в крови содержание метгемоглобина по

сравнению с уровнем контроля в 2,01 раза после введения нитрита натрия и в 1,7 раза после нитрата. Введение высокотоксичных доз увеличивало содержание метгемоглобина в крови более значимо (в 2,21 и 1,93 раза, соответственно). Умеренотоксичные дозы азотсодержащих соединений вызвали снижение содержания общего белка в плазме крови (р<0,05), а высокотоксичные дозы не оказывали особого влияния. Содержание в плазме крови мочевины, как одного из показателей обмена азота, уже через одну неделю интоксикации начало повышаться, но только к концу третьей недели экспериментов уровень мочевины превосходил контроль в 1,7 и 1,57 раза после введения нитрита и нитрата натрия. Высокотоксичные дозы, особенно нитриты, также повышали содержание мочевины, но без достоверного отличия.

Таким образом, полученные нами результаты влияния азотсодержащих соединений на содержание в крови метгемоглобина, мочевины и белка соответствуют данным литературы о большей агрессивности нитритов.

Поступающие в организм человека и животных азотсодержащие соединения подвергаются клиренсу в нефроне и выделяются с мочой. Исследование диуреза и основных процессов мочеобразования крыс показало, что их недельная интоксикация умеренотоксичными дозами не вызвала каких-либо изменений основных процессов мочеобразования и количества мочи, собранной за три часа после нагрузки водопроводной водой, составляющей 2% от массы тела. Однако к моменту окончания экспериментов, особенно у крыс, получавших нитрит натрия, диурез превосходил уровень контроля в 1,77 раза, что было обусловлено снижением (р<0,001) канальцевой реабсорбции воды. Одновременно в плазме крови достоверно повысилось (р<0,02) содержание креатинина, а экскреция мочевины снизилась (р<0,001).

Введение высокотоксичных доз оказывало выраженное тормозящее действие на количество мочи, которое за три часа после интоксикации нитритом натрия уменьшилось в 2,48 раза и в 2,14 раза после введения нитрата натрия. Такое изменение было обусловлено как снижением клубочковой фильтрации (р<0,01), так и канальцевой реабсорбции воды (р<0,001). Содержание креати-нина в плазме крови в этом случае повысилось почти в два раза, а экскреция мочевины снизилась.

Таким образом, негативные проявления при интоксикации азотсодержащими соединениями, вследствие их способности к катаболизму и экскреции продуктов их расщепления, зависят не только от длительности потребления, но и дозы вводимых соединений.

ВЫВОДЫ:

1. Введение крысам разных возрастов (ювенильного, зрелого репродуктивного и старческого) умеренотоксичных доз нитрита и нитрата натрия в течение трёх недель не оказывает влияние на количество нейроцитов КШСГ у крыс зрелого репродуктивного возраста, но вызывает снижение их числа у крыс старческого и ювенильного возраста. По прошествии десяти месяцев наблюдаемое снижение у крыс ювенильного возраста усиливается.

2. Высокотоксичные дозы нитрита и нитрата натрия, вводимые в течение трёх дней, не оказывают влияние на общее количество нейроцитов КШСГ. Однако по прошествии десяти месяцев у крыс ювенильного возраста отмечается снижение этого параметра.

3. Хроническая интоксикация умеренотоксичными дозами азотсодержащих соединений не оказывает влияние на размеры перикарионов нейроцитов КШСГ у крыс зрелого репродуктивного возраста, увеличивает у крыс юве-нильного возраста, а у крыс старческого возраста - снижает. По прошествии десяти месяцев размеры перикарионов нейронов КШСГ у крыс зрелого репродуктивного возраста не меняются, а у крыс ювенильного возраста - отмечается их снижение. Высокотоксичные дозы, независимо от возраста крыс, не оказывают влияние на средние размеры перикарионов нейронов КШСГ.

4. Хроническое введение умеренотоксичных доз нитрита и нитрата натрия вызывает у крыс ювенильного возраста усиление интенсивности транскрипционной активности нуклеоплазмы, ядрышка и суммарную активность ядра нейроцитов КШСГ, а по прошествии десяти месяцев отмечается снижение этого параметра. У крыс зрелого репродуктивного возраста азотсодержащие

соединения также усиливают матричную активность синтеза РНК, однако в дальнейшем, по прошествии десяти месяцев, эти изменения не закрепляются. У крыс старческого возраста отмечается снижение транскрипционной активности нуклеоплазмы, ядрышка и суммарной активности ядра нейронов КШСГ.

5. Высокотоксичные дозы, вводимые в течение трёх дней, независимо от возраста крыс, не оказывают влияние на интенсивность транскрипционной активности в нейронах КШСГ.

6. Умеренотоксичные дозы азотсодержащих соединений, вводимые крысам зрелого репродуктивного возраста увеличивают в крови содержания метге-моглобина и снижают уровень белка в плазме крови. Одновременно, вследствие угнетения канальцевой реабсорбции воды, увеличивается диурез. В тоже время, высокотоксичные дозы вызывают резкое угнетение водо- и азо-товыделительной функции почек.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты, относящиеся к области фундаментальных исследований, показывают ранее неизвестные факты и отдалённые результаты влияния азотсодержащих соединений на динамику цитологических показателей нейронов краниального шейного симпатического ганглия, имеют не только теоретическое, но и практическое значение, и в первую очередь в практике врачей-токсикологов, особенно детского возраста, когда нитритно-нитратная интоксикация по прошествии времени приводит к снижению количества и размеров перикариона нейроцитов КШСГ, а также к уменьшению интенсивности транскрипционной активности нуклеоплазмы, ядрышка и суммарной активности ядра.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Джиоев И.Г., Бибаева Л.В., Дзахова Г.А., Таболова Л.С. Влияние нитрита и нитрата натрия на морфофункциональные показатели почек // Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. -Астрахань, 2000. -С.52-53.

2. Дзугкоева Ф.С., Кабоева Б.Н., Беликова Л.Р., Бибаева Л.В., Дзахова ГА. Экспериментальное изучение влияния азотсодержащих экологических факторов на функции почек // Тезисы докладов XXVIII Всероссийского съезда физиологов. -Казань, 2001. -С.ЗЗЗ.

3. Дзахова Г.А., Бибаева Л.В., Джиоев И.Г. Влияние азотсодержащих соединений на количество и размеры нейронов шейного ганглия // Вестник международной академии экологии и безопасности жизнедеятельности. -С.-Петербург, 2004, -Т.9, №4 (76). -С.28-33.

4. Бибаева Л.В., Дзахова ГА Влияние азотсодержащих соединений на транскрипционную активность ядер нейронов краниального шейного симпатического ганглия // Морфология. -2004. -Т. 126, №4.2004. -С. 19.

5. Дзахова ГА., Бибаева Л.В., Ярыгин В.Н. Влияние азотсодержащих соединений на количество нейронов краниального шейного симпатического ганглия // Морфология. -2004. -Т.126, №4. -С.41.

6. Бибаева Л.В., Дзахова Г.А Влияние азотсодержащих соединений на динамику транскрипционной активности ядер нейронов краниального шейного симпатического ганглия // Морфологические ведомости. -2004. -№1-2.-С. 12.

7. Дзахова ГА, Бибаева Л.В. Влияние азотсодержащих соединений на динамику количества нейронов краниального шейного симпатического ганглия // Морфологические ведомости. -2004. -№ 1-2. -С.ЗЗ.

8. Дзахова Г.А. Транскрипционная активность ядер нейронов краниального шейного ганглия и динамика их изменений у крыс в онтогенезе под

влиянием азотсодержащих соединений // Устойчивое развитие горных территории: проблемы и перспективы интеграции науки и образования. -Владикавказ, 2004. -С.358-359.

Информационно-издательский отдел Северо-Осетинской государственной медицинской академии Подписано в печать 30.03.0Sr. Тираж 100 экз. Формат издания 60x84 Усл. печ.л. 1,0.

Заказ №43

\

V

к

22 АПР 2005

■V «

891

Актуальность темы. В настоящее время широкое применение во многих отраслях хозяйства и в быту химических соединений способствует появлению новых заболеваний, возникновению и накоплению мутаций, что оказывает негативное влияние на здоровье человека. Опасность во многом заключается в том, что часть химических веществ, которые находят применение в повседневной жизни, мы перестаём воспринимать как вредные и, тем самым, используем в количествах, которые при попадании в организм оказывают отрицательное действие. Другие вещества, даже при поступлении в небольших дозах, но вследствие способности образовывать прочные соединения, накапливаются в организме и вызывают всевозможные нарушения здоровья.

Одним из источников таких негативных влияний на здоровье человека могут быть кислородсодержащие соединения азота (нитриты и нитраты), чьи химические свойства позволяют легко образовывать соли, широко используемые в сельском хозяйстве, в пищевой и фармацевтической промышленности (Жутова Г.Ф., Филина С.А., Зайцев А.Н., 1991; Ильницкий А.П., 1991; Опопель Н.И., 1991).

Точки приложения действия нитритов в организме различны. В желудке они взаимодействует с соляной кислотой с образованием азотной кислоты и оксида азота, способного вызывать раздражение и отечность клеток слизистой оболочки, увеличение внутриклеточного содержания натрия (Avila M.А., 1997; Rockey D.C., Chung J.J., 1997; Chu G.К., Tator C.H., 2001). Нитриты, являясь сильными окислителями, превращают гемоглобин в метгемоглобин, что приводит к нарушению транспорта кислорода и тканевого дыхания, развитию гипоксии, особенно у детей грудного возраста. Кроме того, нитриты, образуя активные формы кислорода, способствуют истощению антиокси-дантного фонда клетки, возникновению множественных нарушений цито-плазматических мембран. Соединении нитритов с аминами и амидами белков образуются нитрозамины и нитрозамиды, которые подавляют иммунитет, оказывают мутагенное и канцерогенное действие (Субботин Ф.Н., Волкова

H.В., 1998; Greenlund L.J., Deckwerth T.L., Johnson E.M., 1995; Doblander С., Lackner R., 1996; Kanapatskaia I.A., Zyrianova T.N., Lavrova V.M., 1998).

Оксид азота, образующийся в организме человека и животных при распаде нитритов, обладает способностью в гладкомышечных клетках стенок сосудов образовывать цГМФ, ослабляющий связи между актином и миозином (Soderberg L.S., Flick J.Т., 1997).Токсический эффект оксида азота связан как с прямым угнетающим действием на железосодержащие и митохондри-альные ферменты, снижением выработки АТФ, так и, совместно с перокси-нитритом, со способностью тормозить репликацию ДНК. Оксид азота, как нейромедиатор и регулятор церебрального кровотока, имеет большое значение для центральной нервной системы. Синтез и выделение оксида азота происходит практически в любом участке тела и отростков нейронов.

Таким образом, кислородсодержащие соединения азота оказывают влияние, как на отдельные системы, так и на весь организм. Однако в научной литературе сведений об их действии на нервные клетки симпатического отдела периферической нервной системы, мы не встречали. Имеются лишь отдельные данные (Rees H.D., Bonsall K.W., Michael R.P., 1986; Alm P. et al., 1995; Krizsan-Agbas D., Smith P.G., 2002) о том, что нитриты ускоряют рост и половое созревание крысят, а N0' радикал способен образовать пероксинит-рит, индуцирующий апоптоз. Сказанное послужило основанием к выбору объекта исследования настоящей работы.

Целью работы явилось систематическое комплексное изучение влияния умерено- и высокотоксичных доз азотсодержащих соединений (нитритов и нитратов) на динамику ряда цитологических показателей симпатических нейронов в онтогенезе крыс.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. В условиях хронической интоксикации умеренотоксичными дозами нитрита и нитрата натрия провести на крысах разных возрастов (ювениль-ного, зрелого репродуктивного и старческого) исследование количества нейроцитов КШСГ и для групп крыс ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов порядок изменений указанного параметра по прошествии десяти месяцев.

2. В условиях трёхнедельного введения крысам разных возрастов умере-нотоксичных доз нитрита и нитрата натрия провести изучение средних размеов перикарионов нейроцитов КШСГ и проследить через десять месяцев за динамикой изменений, если таковые возникают.

3. В условиях введения крысам в онтогенезе умеренотоксичных доз названных выше азотсодержащих соединений в течение трёх недель, исследовать матричную активность ДНК нуклеоплазмы, ядрышка и суммарную активность ядра нейроцитов КШСГ с регистрацией исследуемых параметров по прошествии десяти месяцев.

4. В условиях трёхдневного введения высокотоксичных доз нитрита и нитрата натрия на крысах разных возрастов провести изучение количества нейронов КШСГ, размеров их перикарионов и матричной активности ядер, и оценить состояние перечисленных показателей через десять месяцев для групп крыс ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов.

5. Для выяснения влияния азотсодержащих соединений на степень интоксикации организма и функции почек провести исследование содержания метгемоглобина в крови, уровня белка в плазме крови, экскреции мочевины и показателей основных процессов мочеобразования (скорости клубочковой фильтрации и объёма канальцевой реабсорб-ции воды).

Научная новизна работы состоит в том, что впервые проведено комплексное изучение влияния разных дозировок и продолжительности приёма (три недели умеренотоксичные дозы и три дня высокотоксичные) азотсодержащих соединений (нитрита и нитрата натрия) на: динамику изменений количества и размеров нейронов, транскрипционную активность нуклеоплазмы, ядрышка и суммарную активность ядра нейронов КШСГ у крыс разных возрастов (ювенильного, зрелого репродуктивного и старческого возрастов); степень интоксикации (по содержанию в крови метгемоглобина и уровню белка в плазме крови); водо-и азотовыделительную функции почек (по экскреции мочевины, диурезу, скорости клубочковой фильтрации и объёму каналь-цевой реабсорбции воды). Впервые показана определенная корреляция между возрастом и реакцией симпатических нервных клеток на хроническое введение умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений (снижение количества нейроцитов, но увеличение их размеров и матричной активности синтеза РНК у ювенильных крыс; уменьшение всех исследуемых показателей у крыс старческого возраста; усиление только активности синтеза РНК у крыс зрелого репродуктивного возраста). Кроме того, впервые установлены отдалённые (через десять месяцев) последствия хронической и острой интоксикации нитритом и нитратом натрия при воздействии в ювенильном и зрелом репродуктивном возрасте.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Трёхнедельная интоксикация крыс разных возрастов умеренотоксич-ными дозами нитрита и нитрата натрия не оказывает влияние на количество нейроцитов КШСГ у крыс зрелого репродуктивного возраста, но снижает их число у крыс старческого и ювенильного возрастов; по прошествии десяти месяцев после воздействия у крыс ювенильного возраста отмечается более выраженное снижение.

2. Умеренотоксичные дозы азотсодержащих соединений не оказывают влияние на средние размеры перикарионов нейроцитов КШСГ крыс зрелого репродуктивного возраста, увеличивают этот показатель у крыс ювенильного возраста и снижают у крыс старческого возрастов; через десять месяцев размеры перикарионов симпатических нейронов крыс, получавших нитрит и нитрат натрия в ювенильном возрасте, ниже соответствующего возрастного контроля.

3. Хроническое введение умеренотоксичных доз нитрита и нитрата натрия повышает матричную активность нуклеоплазмы, ядрышка и суммарную активность ядра у крыс ювенильного возраста и по прошествии десяти месяцев матричная активность ниже контрольных значений, еели обработку препаратами проводили в ювенильном возрасте, и соответствует контролю при обработке в зрелом возрасте. У крыс старческого возраста отмечается снижение матричной активности хроматина.

4. Трёхдневная интоксикация высокотоксичными дозами не оказывает влияние на количество клеток в КШСГ, средние размеры перикарионов и интенсивность транскрипции в ядрах нейронов у крыс всех возрастных групп. Вместе с тем, у крыс ювенильного возраста по прошествии десяти месяцев отмечается снижение числа клеток, а также средних размеров перикарионов и транскрипционной активности ядер.

5. Умеренотоксичные дозы азотсодержащих соединений увеличивают в крови содержание метгемоглобина и снижают уровень белка в плазме крови. При этом увеличивается диурез. Высокотоксичные дозы вызывают резкое угнетение водо- и азотовыделительной функции почек.

Теоретическая и практическая значимость. Проведенные исследования носят экспериментальный характер, а полученные результаты относятся к области фундаментальных знаний, так как показывают ранее неизвестные факты влияния азотсодержащих соединений на динамику цитологических показателей нейронов краниального шейного симпатического ганглия у крыс в онтогенезе.

Материалы исследования имеют не только теоретическое, но и практическое значение, в частности для врачей-токсикологов. Они демонстрируют влияние нитритов и нитратов на нервные клетки у крыс разных возрастных групп, а также отдалённые результаты такого воздействия, что следует учитывать при лечении пациентов, подвергшихся интоксикации азотсодержащими соединениями.

Полученные в работе результаты используются в учебном и научном процессах на кафедрах биологии, гистологии, военной подготовки (курс токсикологии), педиатрии и ЦНИЛ Северо-Осетинской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов» г.Астрахань, 2000; XVIII Всероссийском съезде физиологов г.Казань, 2001; межрегиональной конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной морфологии» г.Томск, 2002; итоговой научной сессии сотрудников Северо-Осетинской государственной медицинской академии г.Владикавказ, 2003; V международной конференции «Устойчивое развитие горных территорий: проблемы и перспективы интеграции науки и образования» г.Владикавказ, 2004; совместном заседании сотрудников кафедр биологии, гистологии и ЦНИЛ Северо-Осетинской государственной медицинской академии.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 работ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследований», двух глав собственных результатов, заключения и общих выводов. В работу включены 5 таблиц и 28 рисунков. Список использованной научной литературы содержит 156 работ, из которых 42 отечественных авторов и 112 иностранных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Введение крысам умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений в течение одной недели приводит к увеличению в крови содержания метгемоглобина и уровня мочевины в плазме крови, которые нарастают по мере продолжения интоксикации, особенно нитритом натрия. Высокотоксичные дозы, вводимые в течение трёх дней, оказывают более выраженное повышение этих показателей.

2. Ежедневное введение в течение одной недели умеренотоксичных доз нитрита и нитрата натрия приводит к снижению содержания общего белка в плазме крови. Трёхдневная интоксикация высокотоксичными дозами не оказывает влияние на уровень белка в крови.

3. Введение умеренных доз азотсодержащих соединений, особенно нитритов, в течение трёх недель крысам взрослого репродуктивного возраста, вследствие снижения канальцевой реабсорбции воды, приводит к увеличению диурез и снижению экскреция мочевины.

4. Введение высокотоксичных доз в течение трёх дней способствует резкому угнетению диуреза вследствие снижения клубочковой фильтрации и повышения канальцевой реабсорбции воды. Одновременно отмечается уменьшение экскреции мочевины с мочой.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследование влияния азотсодержащих соединений на возрастную динамику цитологических показателей нейронов КШСГ у крыс мы начали с оценки их среднего количества. При этом необходимо отметить, что использование различных методик подсчета в значительной степени сказывается на получаемых результатах. Кроме того, отмеченные многими авторами колебания (от 13 до 45 тысяч) во многом зависят от выбора единицы учета (тело клетки, ядро, ядрышки), количества анализируемых срезов и способов коррекции. Так, по данным Cardinali D.P., Vacas M.I., Geiman P.V. (1981), КШСГ взрослой крысы содержит около 40 тыс. клеток. Этот же показатель у Gabella G. (1986) достигает 42 тысяч. Существенно меньшее число нейронов у молодых самцов крыс (10-15 тыс.) было обнаружено Smith P.G. с соавт. (1990). Результаты, приближённые к этим значениям (18 тыс.) были получены Жук О.Н. (1991) у интактных одномесячных крыс обоего пола. Такое же количество нейронов у самцов крыс (от 18 до 21 тыс.), было определёно с помощью иммуноцитохимических методов Borglhini N. в 1991 году. Однако Dibner M.D. с соавторами в 1977 году при подсчёте среднего количества нейронов КШСГ у одномесячных крыс без учёта пола животных определили их число в 34842±2355, а с учётом пола самок - 25051 ±1964 (1978).

Полученные нами данные количества нейронов контрольных животных для разных возрастов (24364+786для ювенильных, 22864±1108 для крыс зрелого репродуктивного возраста и 20365+846 для старых крыс) не являются абсолютными значениями. Однако, вследствие того, что в работе всегда использовался один и тот же метод подсчета количества нейронов (см. гл.2.2.1), мы можем сравнивать результаты, полученные в норме у интактных крыс, к соответствующим данным крыс после интоксикации различными дозировками и продолжительностью введения нитрита и нитрата натрия. Это соответствует поставленным задачам исследования.

В большинстве литературных источников приводятся данные об уменьшении клеточной популяции КШСГ в первый месяц постнатального развития. Считается, что количество нейронов у новорожденных крыс больше чем у взрослых на 30-50%, а гибель их происходит на этапе установления связей с органами, то есть при достижении определенной степени зрелости (до 21 дня постнатального онтогенеза) и совпадает по времени с созреванием тканей-мишеней (Wright L.L. et al., 1983; Hendry I.A., Messina A., Bell C., 1992). По другим данным, в КШСГ крыс отмирание нейронов идет особенно интенсивно в первые дни после рождения (между 3-ми и 7-и сутками), когда численность нервных клеток сокращается с 39500 на 49% (Wright L.L. et al., 1983). В работе Beaston-Wimmer P., Smolen A.J. (1991) указывается, что в популяции нейронов КШСГ крыс запрограммированная клеточная гибель начинается с 3-го дня и заканчивается к 15-му дню жизни.

Возможно, что половой диморфизм количества нейроцитов в КШСГ крыс связан с выживанием большего числа симпатических нейронов из-за большего иннервационного ареала (Landmesser L., Pilar G., 1978). Так, масса таких органов-мишеней, как подчелюстная слюнная железа и эпифиз, у самцов выше, чем у самок. Однако окончательные различия в массе тела и массе компетентных органов между самками и самцами крыс устанавливаются после завершения периода апоптоза. Можно предположить, что программа клеточной гибели у самцов замедляется из-за наличия в крови высокой концентрации тестостерона. Действительно, кастрация новорождённых самцов снижала количество нейронов в КШСГ, что, тем не менее, можно предотвратить андрогенным воздействием (Wright L.L., Smolen A.J., 1985а). Так, введение тестостерона новорожденным самцам крыс вызывало к концу первого постнатального месяца увеличение среднего количества нервных клеток КШСГ на 55.6% (Wright L.L., Smolen A.J., 1983). В меньшей степени (на 29%), повысилось общее число нейронов у самок крыс, которым весь первый месяц после рождения делали инъекции тестостерона (Dibner M.D., Black I.E., 1978).

Проведенные нами исследования показали, что однонедельная интоксикация умеренотоксичными дозами азотсодержащих соединений вызывала у ювенильных крыс в КШСГ тенденцию к снижению количества нервных клеток, усилившуюся при продолжении экспериментов ещё в течение двух недель, особенно у нитритных крыс, у которых, по сравнению с соответствующим контролем, количество нейроцитов снизилось на 9,5% (р<0,05), а у нитратных крыс - на 6% (табл.1).

Наименьшее влияние оказали исследуемые соединения азота на количество нейронов КШСГ крыс зрелого репродуктивного возраста, у которых только через три недели интоксикации наметилась тенденция к снижению. Скорее всего, это связано с тем, что крысы этого возраста более устойчивы к внешним воздействиям. В то же время у крыс старческого возраста трёхнедельная интоксикации снизила общее число нейроцитов в наибольшей степени - на 17,2% (р<0,05) после нитрата натрия и на 22,5% (р<0,02) после нитрита.

Трёхдневное введение высокотоксичных доз, превосходящих умеренные в четыре раза, не оказало особого влияния на количество нейронов КШСГ крыс, независимо от их возраста (рис.2)

Исследования проведенные на крысах зрелого репродуктивного и старческого возрастов, которым десятью месяцами ранее, когда они, соответственно, были ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов и им ежедневно в течение трёх недель вводили умеренотоксичные дозы азотсодержащих соединений, а в дальнейшем они больше не подвергались интоксикации, показали, что количество нейроцитов КШСГ у крыс зрелого репродуктивного возраста было достоверно (р<0,02) снижено. Одновременно у них была сокращена максимальная продолжительность жизни (18 месяцев у нитратных и 16,4 месяца у нитритных крыс). Высокотоксичные дозы, не оказавшие влияние на общее число нейроцитов сразу после их введения, по прошествии десяти месяцев также снизили их число (рис.2).

У крыс же старческого возраста, независимо от продолжительности и дозировки приёма азотсодержащих соединений в зрелом репродуктивном возрасте, количество нейронов КШСГ не отличалось от результатов контроля. Кроме того, у них не сократилась средняя продолжительность жизни (22 месяца).

При исследовании влияния умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений на размеры перикарионов и их колебания у крыс ювенильного возраста, было выявлено, что однонедельная интоксикация не оказала какого-нибудь воздействия.-Так, количество мелких нейронов, имеющие профильное поле менее 25000 отн.ед. после введения нитрита натрия уменьшилось на 3%, но на столько же увеличилось число крупные клетки, имеющих размеры свыше 40000 отн.ед. Количество средних клеток не изменилось.

В то же время, продолжение интоксикации ещё в течение двух недель привело к увеличению количества крупных клеток, что, по всей видимости, могло быть обусловлено не только ростом крупных нейроцитов КШСГ у крыс молодого возраста, отмеченным многими исследователями, но и возможной активизацией компенсаторных процессов, вследствие способности нитритов нарушать тканевое дыхание, с образованием активных форм кислорода и N0" радикала, способных ускорять гибель клетки.

Введение высокотоксичных доз в течение трёх дней, по сравнению с контролем, не меняло размеры перикарионов нейронов (рис.6), что, однако, можно расценивать как угнетение, так после недельной интоксикации умеренными дозами рост перикарионов нейронов КШСГ продолжался.

У крыс зрелого репродуктивного возраста введение умеренотоксичных доз вызывала тенденцию к увеличению размеров перикарионов нейроцитов КШСГ, причём за счёт крупных клеток, имеющих размеры свыше 40 отн.ед. и, только после трёхнедельной интоксикации, что, скорее всего, могло быть компенсаторной гипертрофией, так как естественного роста нервных клеток у крыс в этом возрасте не происходит. Высокотоксичные дозы не вызвали каких-либо изменений размеров перикариона нейронов КШСГ.

Наибольшее влияние умеренотоксичные дозы оказали на размеры нейронов КШСГ крыс старческого возраста. У них уже через одну неделю появилась тенденция к уменьшению, а у тех, кто получал нитрит натрия снижение размеров имело достоверное (р<0,05) отличие от контроля. Продолжение интоксикации еще в течение двух недель усилило снижение размеров перикарионов нейроцитов, что имело большую степень отличия (р<0,002) от уровня контроля. Одновременно, при уменьшении общего количества нейро-цитов, отмечалось достоверное (р<0,05) снижение крупных и средних клеток. Введение высокотоксичных доз не оказывало влияния на размеры перика-рионов нейронов КШСГ.

При изучении последействия, отсроченного на десять месяцев после трёхнедельного введения умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений крысам ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов, было отмечено, что у 1-месячных крысы, достигших годовалого возраста, средние размеры перикарионов нейроцитов были меньше результатов контроля на 12% (р<0,01) при введение нитратов и на 17% после нитритов, что было в первую очередь обусловлено снижением количества крупных клеток, имеющих размеры среднего поля нейроцитов больше 40000 отн.ед.

При аналогичном сопоставлении результатов, полученных у зрелых крыс на момент достижения ими 22-х месяцев, можно констатировать факт незначительного, по сравнению с контролем, снижения размеров перикарионов нейроцитов (на 5,4% при введении нитритов и 2,2% после нитратов), обусловленного уменьшением крупных и средних клеток.

Таким образом, ежедневное введение в течение трёх недель умеренотоксичных доз нитрита и нитрата натрия вызывала у крыс ювенильного возраста увеличение средних размеров перикарионов нейроцитов КШСГ, однако через десять месяцев это приводило к снижению их размеров. Хроническая интоксикация азотсодержащими соединениями не оказывала влияние на размеры перикарионов нейроцитов у крыс зрелого репродуктивного возраста, как сразу, так и по прошествии времени, а у крыс старческого возраста она вызывала уменьшение средних размеров. Высокотоксичные дозы, вводимые в течение трёх дней, не оказывали влияние на средние размеры перикарионов нейронов КШСГ крыс.

О влиянии азотсодержащих соединений на интенсивность транскрипции в нейронах КШСГ мы судили по матричной активности нуклеоплазмы и ядрышка, а также по суммарной активности хроматина ядра, которая у контрольных ювенильных крыс была в 1,59 раза меньше, чем у зрелых репродуктивных крыс и в 1,18 раза меньше результатов, полученных у крыс старческого возраста. При этом в нуклеоплазме транскрипционная активность у крыс зрелого репродуктивного возраста была на 52% больше, чем у крыс ювенильного возраста и на 21,2% больше, чем у крыс старческого возраста, а в ядрышке, соответственно, на 41% и 9%. Очевидно, это обусловлено тем, что у крыс зрелого репродуктивного возраста синтез белков идёт более активно, чем у крыс ювенильного возраста, у которых он сформулирован не в полном объёме, а у крыс старческого возраста - более заторможен.

Хроническая интоксикация умеренотоксичными дозами нитрита и нитрата натрия на транскрипционную активность синтеза РНК в ядре нейроци-тов КШСГ у крыс ювенильного возраста оказывала усиливающее действие. Введение нитрата натрия достоверно (р<0,05) повышало матричную активность в нуклеоплазме, а нитрит натрия оказывал более значимо (р<0,01) влияние, увеличивая исследуемый параметр не только в нуклеоплазме, но и в ядрышке (р<0,02). При этом отмеченные изменения сопровождались увеличением количества сильномеченых клеток, имеющих 50 - 60 зерен восстановленного серебра, и снижением доли слабомеченых (до 30 зерен восстановленного серебра) в нуклеоплазме и ядрышке, особенно при введении нитрита натрия.

Трёхдневное введение высокотоксичных доз азотсодержащих соединений не отразилось на интенсивности мечения ядерных структур.

У крыс зрелого репродуктивного возраста введение умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений также усиливало транскрипционную активность хроматина. В результате повышения числа зёрен восстановленного серебра в нуклеоплазме на 19%, а ядрышке с 12,6±0,64, результата контроля, до 21,44±1,73 после введения нитрита натрия, интенсивность суммарной транскрипционной активности в ядре повысилась на 31%. Это повышение в первую очередь происходило за счёт увеличения количества клеток со елабым мечением зёрен восстановленного серебра как в нуклеоплазме, так и в ядрышке. Одновременно уменьшалось число сильномеченных клеток.

Высокотоксичные дозы не оказывали влияние на матричную активность клеток.

У крыс старческого возраста интенсивность синтеза РНК после ежедневного введения в течение трёх недель умеренотоксичных доз нитрита и нитрата в исследуемых компонентах ядра, снижалась. При этом увеличивалось количество клеток, содержащих небольшое количество восстановленного серебра. Высокотоксичные дозы азотсодержащих соединений не оказали влияния на интенсивность транскрипционной активности ядра.

Таким образом, трёхнедельное введение умеренотоксичных доз азотсодержащих соединений повышала матричную активность нуклеоплазмы и ядрышка нейронов КШСГ у крыс ювенильного и зрелого репродуктивного возрастов и снижала у крыс старческого возраста.

При изучении возможного последействия трёхнедельной интоксикацией на активность хроматина в ядрышке и нуклеоплазме было определено, что спустя десять месяцев после введения 1 месячным крысам нитрита натрия, активность синтеза РНК в нуклеоплазме и ядрышке была сниженной (на 12,6% суммарно в ядре). В тоже время, транскрипционная активность у крыс зрелого репродуктивного возраста, получавших нитрит натрия за десять месяцев до исследований, особо не претерпела изменений.

Азотсодержащие соединения, в зависимости от вводимой дозы, оказывали разное влияние на общее состояние и некоторые биохимические показатели крови и функции почек крыс. Вначале у животных, подвергавшихся интоксикации умеренотоксичными дозами, отмечалась повышенная активность, которая, по мере продолжения введения этих соединений азота, сменялась угнетённым состоянием. Дыхание становилось частым и поверхностным, а видимые кожные покровы и слизистые оболочки - синюшными. При введении высокотоксичных доз появлялись кровянистые выделения из носа, фибриллярные подергивания отдельных мышц и судороги, непроизвольное мочеиспускание, особенно у ювенильных крыс, что, возможно, связано со слабым развитием у них защитно-адаптационной системы.

Проведенные биохимические исследование крови у крыс зрелого репродуктивного возраста показали, что введение умеренотоксичных доз в течение одной недели приводило к повышению в крови содержание метгемог-лобина (на 38,1% после введения нитрита натрия и на 28,8% после нитрата), которое после завершения интоксикации уже было больше контроля в 2,01 и 1,7 раза. Введение высокотоксичных доз увеличивало содержание метгемог-лобина в крови более значимо (в 2,21 и 1,93 раза, соответственно).

Умеренотоксичные дозы азотсодержащих соединений вызвали снижение содержания общего белка в плазме крови (р<0,05), а высокотоксичные дозы не оказывали особого влияния.

Содержание в плазме крови мочевины, как одного из показателей обмена азота, уже через одну неделю интоксикации начало повышаться, но только к концу третьей недели экспериментов уровень мочевины превосходил контроль в 1,7 и 1,57 раза после введения нитрита и нитрата натрия. Высокотоксичные дозы, особенно нитриты, также повышали содержание мочевины, но без достоверного отличия.

Таким образом, полученные нами результаты влияния азотсодержащих соединений на содержание в крови метгемоглобина, мочевины и белка соответствуют данным литературы о большей агрессивности нитритов.

Поступающие в организм человека и животных азотсодержащие соединения подвергаются клиренсу в нефроне, выделяясь с мочой, что обусловило закономерный интерес к изучению их влияния на функции почек. Исследование диуреза и основных процессов мочеобразования крыс показало, что недельная интоксикация умеренотоксичными дозами не вызвала каких-либо изменений основных процессов мочеобразования и количества мочи, собранной за три часа после нагрузки водопроводной водой, составляющей 2% от массы тела (табл.5). Однако к моменту окончания экспериментов, особенно у крыс, получавших нитрит натрия, диурез превосходил уровень контроля в 1,77 раза, что было обусловлено снижением (р<0,001) канальцевой реабсорбции воды. Одновременно в плазме крови повысилось (р<0,02) содержание креатинина, а экскреция мочевины снизилась (р<0,001).

Введение высокотоксичных доз оказывало выраженное тормозящее действие на количество мочи, которое после интоксикации нитритом натрия за три часа уменьшилось в 2,48 раза, а после нитрата - в 2,14 раза. Это было обусловлено одновременным снижением (р<0,01) клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции воды (р<0,001). Содержание креатинина в плазме крови повысилось почти в два раза, а экскреция мочевины снизилась.

Таким образом, негативные проявления при интоксикации азотсодержащими соединениями, вследствие их способности к катаболизму и экскреции продуктов их расщепления, зависят не только от длительности потребления, но и дозы вводимых соединений.

1. Введение крысам разных возрастов (ювенильного, зрелого репродуктивного и старческого) умеренотоксичных доз нитрита и нитрата натрия в течение трёх недель не оказывает влияние на количество ней-роцитов КШСГ у крыс зрелого репродуктивного возраста, но вызывает снижение их числа у крыс старческого и ювенильного возраста. По прошествии десяти месяцев наблюдаемое снижение у крыс ювенильного возраста усиливается.

2. Высокотоксичные дозы нитрита и нитрата натрия, вводимые в течение трёх дней, не оказывают влияние на общее количество нейроци-тов КШСГ. Однако по прошествии десяти месяцев у крыс ювенильного возраста отмечается снижение этого параметра.

3. Хроническая интоксикация умеренотоксичными дозами азотсодержащих соединений не оказывает влияние на размеры перикарионов нейроцитов КШСГ у крыс зрелого репродуктивного возраста, увеличивает у крыс ювенильного возраста, а у крыс старческого возраста -снижает. По прошествии десяти месяцев размеры перикарионов нейронов КШСГ у крыс зрелого репродуктивного возраста не меняются, а у крыс ювенильного возраста - отмечается их снижение. Высокотоксичные дозы, независимо возраста крыс, не оказывают влияние на средние размеры перикарионов нейронов КШСГ.

4. Хроническое введение умеренотоксичных доз нитрита и нитрата натрия вызывает у крыс ювенильного возраста усиление интенсивности транскрипционной активности нуклеоплазмы, ядрышка и суммарную активность ядра нейроцитов КШСГ, а по прошествии десяти месяцев отмечается снижение этого параметра. У крыс зрелого репродуктивного возраста азотсодержащие соединения также усиливают матричную активность синтеза РНК, однако в дальнейшем, по прошествии десяти месяцев, эти изменения не закрепляются. У крыс старческого возраста отмечается снижение транскрипционной активности нуклеоплазмы, ядрышка и суммарной активности ядра нейронов КШСГ.

5. Высокотоксичные дозы, вводимые в течение трёх дней, независимо от возраста крыс, не оказывают влияние на интенсивность транскрипционной активности в нейронах КШСГ.

6. Умеренотоксичные дозы азотсодержащих соединений, вводимые крысам зрелого репродуктивного возраста увеличивают в крови содержания метгемоглобина и снижают уровень белка в плазме крови. Одновременно, вследствие угнетения канальцевой реабсорбции воды, увеличивается диурез. В тоже время, высокотоксичные дозы вызывают резкое угнетение водо- и азотовыделительной функции почек.