Возможности клинико-иммунологического использования оценки уровня внеклеточных РНК

Турчанинова, Мария Андреевна

Диссертации по медицине → Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Возможности клинико-иммунологического использования оценки уровня внеклеточных РНК

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Турчанинова, Мария Андреевна Москва 2010 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.03.09

Автореферат диссертации по медицине на тему Возможности клинико-иммунологического использования оценки уровня внеклеточных РНК

На правах рукописи

ооздэзь^^

Турчанинова Мария Андреевна

Возможности клинико-иммунологического использования оценки

уровня внеклеточных РНК 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2010

003493634

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Л.П. Алексеев доктор биологических наук Д.В. Ребриков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилин доктор медицинских наук, профессор З.Г. Кадагидзе

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.М. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится «¡J^j» AiWl/V2010 г. в /У часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2. Тел/Факс: (495) 617-10-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан «-// » ,Lg4/б

Т-г

Vv/i-r 2010 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Исследования последних лет показали, что анализ внеклеточных ДНК и РНК, циркулирующих в плазме крови, является многообещающим диагностическим подходом. Качественный и количественный состав внеклеточных нуклеиновых кислот, обнаруживаемых в плазме крови, является системным показателем, способным охарактеризовать ход патологических процессов, независимо от их локализации в организме. В настоящее время циркулирующие в плазме нуклеиновые кислоты уже используют для диагностики рака, в том числе и на ранних стадиях заболевания, когда опухоль еще не различима инструментальными методами анализа, а также при мониторинге беременности, когда на основе анализа нуклеиновых кислот плода, циркулирующих в крови матери, устанавливают пол и резус-фактор ребенка, диагностируют осложнения течения беременности и генетические заболевания плода [Anker P., et al., 2003; Bianchi D.W., 2004; Bremnes R.M., et al., 2005]. Другие области применения данных о внеклеточных нуклеиновых кислотах включают в себя мониторинг посттравматического и постинсультного состояния (в этих случаях количество циркулирующей ДНК коррелирует с обширностью поражения), а также раннюю диагностику криза отторжения трансплантата [Chang C.P.Y., et al., 2003; Lam N.Y.L., et al., 2003; Gadi V.K., et al., 2006].

К настоящему моменту накоплено значительное количество данных, описывающих природу, функции и клиническую значимость внеклеточных ДНК [Тамкович С.Н. и др., 2008]. При этом в области анализа циркулирующих РНК остается множество недостаточно изученных, противоречивых и спорных вопросов. Особый интерес вызывает тот факт, что в составе внеклеточных РНК обнаруживаются тканеспецифичные транскрипты [Chiu R.W.K., et al., 2006; El-Hefnawy Т., et al., 2004; Hamaoui K., et al., 2004]. Это дает основания предположить связь профиля представленности РНК, циркулирующих в плазме, с ходом патологического

процесса непосредственно в очаге его развития. А это в свою очередь означает, что оценка качественного и количественного профиля внеклеточных РНК может стать удобным инструментом для малоинвазивной диагностики, мониторинга и прогнозирования самых разных клинических состояний, в том числе и иммунозависимых патологий. В качестве исследуемых заболеваний были выбраны рак молочной железы и ревматоидный артрит - заболевания с различными формами иммунопатологий. Цель исследования

Оценить возможности анализа качественного и количественного состава внеклеточных РНК плазмы крови в роли инструмента для диагностики иммунозависимых патологий. Задачи исследования

1. Разработать методику количественной оценки внеклеточных РНК плазмы крови.

2. Выбрать модельные гены, уровень представленности внеклеточных РНК которых мог бы отражать функциональное состояние иммунной системы организма.

3. С помощью разработанной методики охарактеризовать профиль представленности транскриптов анализируемых генов в плазме крови «здоровых» доноров крови.

4. Выбрать модельные заболевания, в патогенезе которых иммунная система принимает непосредственное участие, и оценить возможность использования оценки уровня внеклеточных РНК в качестве диагностического инструмента.

5. Охарактеризовать профиль представленности транскриптов анализируемых генов в плазме крови при патологии. Сравнить полученные данные с данными, полученными при исследовании контрольной группы.

Научная новизна

Разработан метод количественной оценки в плазме крови внеклеточных РНК генов, участвующих в реализации иммунного ответа.

Охарактеризован качественный и количественный профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови здорового контроля, больных ревматоидным артритом (РА) и больных раком молочной железы (РМЖ).

Получены данные о повышении уровня представленности РНК IL8, IL18 (относительно референсных генов) в плазме крови больных РМЖ по сравнению с клеточной фракцией крови больных РМЖ и по сравнению с уровнем представленности РНК данных генов в плазме крови здорового контроля. Показано, что количество транскрипта IL8 в плазме крови больных РМЖ коррелирует со способностью опухоли к метастазированию.

Показаны диагностические возможности оценки уровня внеклеточных РНК. Установлено, что при развитии РА изменение профиля представленности РНК цитокинов в плазме повторяет изменение профиля представленности РНК цитокинов в клеточной фракции цельной крови. Совпадение профиля представленности РНК цитокинов в плазме крови с цитокиновым профилем клеточной фракции делает количественную оценку внеклеточных РНК альтернативой определению уровня экспрессии генов клетками периферической крови. Практическая значимость

Разработана простая и эффективная методика количественной оценки внеклеточных РНК плазмы крови, адаптированная к использованию с отечественньм оборудованием. Количественное определение уровня представленности транскриптов генов иммунного ответа в плазме может обеспечить новый подход к диагностике и прогнозированию распространенных нарушений в работе иммунной системы. Разработанная система является хорошей моделью для создания диагностических инструментов, основанных на анализе внеклеточных РНК.

Показано, что качественный и количественный профиль представленности внеклеточных РНК цитокинов является диагностически значимым инструментом при оценке и характеристике таких иммунозависимых патологий, как рак молочной железы и ревматоидный артрит.

Полученные результаты создают предпосылки для использования данного подхода как в научно-исследовательских лабораториях, так и в условиях клиники, что позволяет по-новому подойти к решению проблемы ранней диагностики различных нарушений иммунитета.

Полученные данные об особенностях природы внеклеточных РНК генов иммунного ответа в плазме крови имеют общее иммуногенетическое значение и служат вкладом в развитие фундаментальной иммунологии. Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях, съездах и симпозиумах: VIII Российском конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, Россия, 2007), V Международной конференции «Циркулирующие нуклеиновые кислоты в плазме и сыворотке» (Москва, Россия, 2007), 12 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2008), 6 Международной конференции «Цитокины и воспаление» (Орландо, США, 2008), XX Международном конгрессе по генетике (Берлин, Герипния, 2008), II Российском симпозиуме «Молекулярно-генегическая диагностика злокачественных опухолей человека» (Москва, Россия, 2009).

Основные результаты диссертационной работы отражены в 8 публикациях.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа построена по традиционному плану, изложена на 107 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, разделов, описывающих материалы и методы исследований, 6

результаты, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами, 10 рисунками. Список использованной литературы включает 167 источников, из них 10 отечественных и 157 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материал для исследования

В исследование были включены три группы людей.

Первую группу больных составили 68 женщин с гистологически подтвержденным раком молочной железы. Степень распространения рака молочной железы: 16 пациенток - ранний рак молочной железы; 37 пациенток - размер первичной опухоли составил более 2см, количество пораженных лимфатических узлов не превышало трех; 12 пациенток -местно-распространенный рак молочной железы с поражением более 3 подмышечных лимфатических узлов; 1 пациентка - диссеминированный рак; 2 пациентки - стадия неизвестна в связи с первичной операцией по поводу предполагаемой узловой мастопатии в анамнезе.

Вторую группу больных составили 85 пациентов клиники института ревматологии РАМН с диагнозом артрит: 49 больных - ревматоидный артрит (женщин - 39 (79,6%), мужчин - 10 (20,4%)); 15 больных - ранний ревматоидный артрит (женщин - 12 (80%), мужчин - 3 (20%)); 21 больной -недифференцированный артрит (женщин - 14 (66,7%), мужчин - 7 (33,3%)).

Группу сравнения составляли 50 клинически здоровых добровольцев (31 женщина, 19 мужчин).

2. Получение плазмы и суммарной клеточной фракции крови

Образцы крови забирали в пробирки с ЭДТА. Все дальнейшие процедуры проводились в течение 2 часов после забора крови. Фракционирование цельной крови проводили путем двукратного центрифугирования на низких оборотах (800g). Плазму, свободную от форменных элементов, а также осадок, полученный в результате первого

этапа центрифугирования и образованный суммарной клеточной фракцией крови, сразу использовали для выделения РНК.

3. Выделение РНК

Выделение РНК проводили методом фенольной экстракции по стандартной процедуре [Chomczynski P., et al., 1987]. Полученный препарат РНК сразу использовали для постановки реакции обратной транскрипции.

4. Проведение обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакции «в реальном времени» (ОТ-ПЦР)

Реакцию ОТ проводили с использованием транскрипт-специфичных олигонуклеотидных праймеров. ПЦР для каждого транскрипта (15 цитокинов и 3 нормировочных гена) ставили в отдельной пробирке. Во всех используемых ПЦР тест-системах для избежания коамплификации геномной ДНК праймеры были расположены на стыках экзонов. Визуализацию накопления продуктов ПЦР проводили с использованием линейных разрушаемых проб. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР применяли «горячий старт», который обеспечивался путем разделения компонентов реакции (праймеров и полимеразы) с помощью парафина. Реакцию амплификации проводили в приборе ДТ-96 (производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология») по следующей программе: 1 цикл - 80° С 30 сек, 94° С 1 мин; 50 циклов - 94° С 10 сек, 62° С 20 сек. Регистрацию флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 62° С.

Спектр исследованных цитокинов: интерлейкин-lß (ILlß), интерлейкин-2 (IL2), интерлейкин-4 (IL4), интерлейкин-5 (IL5), интерлейкин-6 (IL6), интерлейкин-7 (IL7), интерлейкин-8 (IL8), интерлейкин-10 (ILIO), интерлейкин-12 a (IL12p35), интерлейкин-12р (IL12p40), интерлейкин-17 (IL17), интерлейкин-18 (IL18), интерферон у (IFNy), трансформирующий фактор роста ß (TGFß), фактор некроза опухолей a (TNFa).

Для расчета нормированных значений в эксперимент были введены три референсных гена: ген бета-2-микроглобулина (В2щ), ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и ген тирозинкиназы (ABL).

5. Статистическая обработка полученных результатов

Уровень экспрессии мРНК цитокинов в образцах считали согласно принципам, предложенным Vandesompele J. Фактор нормировки определяли по экспрессии мРНК генов B2m, HPRT1 и ABL.

NF = ERe/CpRef/E!LCpCy' (1),

где NF - фактор нормировки, ЕКе/ - эффективность амплификации референсного гена, CpRef -значение индикаторного цикла для референсного гена, CpCyt - значение индикаторного цикла для гена цитокина.

Итоговый нормировочный коэффициент рассчитывали исходя из среднего геометрического значения уровня представленности трех референсных генов:

NFumo! = Ср. Геом. (NFB2m, NFHPRZ NFABl) (2),

где NF - фактор нормировки.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием методов непараметрического анализа. Для представления исследованных количественных показателей были использованы: Me -медианы, LQ - 25 процентиль, UQ - 75 процентиль, LD - 10 процентиль, UD - 90 процентиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам был использован U-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при р<0,05. Обработку полученных результатов проводили в программном пакете StatSoft Statistica 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка методики количественного анализа внеклеточных РНК плазмы крови

Плазму крови, свободную от клеточных элементов, было решено получать путем центрифугирования цельной крови на низких оборотах (3000 об/мин, 800g). Центрифугирование крови на высоких оборотах неизбежно ведет к разрушению части клеток и попаданию содержащихся в них

нуклеиновых кислот в плазму. Кроме того, высокоскоростное центрифугирование может приводить к искажению качественного и количественного состава внеклеточных нуклеиновых кислот в результате осаждения вместе с форменными элементами и апоптотического клеточного дебриса, который рассматривается в качестве основной формы существования внеклеточных РНК в плазме.

Для определения уровня представленности транскриптов генов цитокинов было решено использовать метод полимеразной цепной реакции «в реальном времени» в комбинации с методом обратной транскрипции. В области количественной оценки экспрессии генов данная технология обладает множеством преимуществ: ОТ-ПЦР способна работать в широком диапазоне начальных концентраций определяемого траскрипта, не требует дополнительных манипуляций с продуктом реакции после амплификации, обладая высокой чувствительностью, дает возможность определять даже единичные копии специфичного транскрипта в исследуемом объеме, позволяет с высокой достоверностью определять различия в уровне экспрессии генов в 20-30% и регистрировать РНК с почти идентичными последовательностями.

Для синтеза кДНК на матрице РНК было решено использовать транскрипт-специфичные олигонуклеотидные затравки (праймеры). Такой подход способен обеспечить обогащение кДНК по интересующим транскриптам и является наиболее чувствительным и точным при количественном определении уровня представленности транскриптов.

Последовательности праймеров и проб для ПЦР были подобраны с учетом структур экзонов и интронов таким образом, чтобы исключить взаимодействие пробы с геномной ДНК цитокинов и нормировочных генов. Это позволило не использовать дополнительный этап обработки нуклеиновых кислот ДНК-азой.

Для оценки уровня представленности транскриптов РНК цитокинов решено было решено использовать относительный подход, в котором 10

количество РНК цитокинов выравнивалось между образцами с использованием референсных генов.

Разработанная методика количественного анализа внеклеточных РНК включает в себя 5 этапов. Схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.

Получение плазмы

[|мдш|внйа РНК

транскрипция

. . ПЦР "м рояльном

нромонм" ' ..

Анализ .

результатов

Рисунок 1. Этапы количественного анализа внеклеточных РНК.

2 Выбор модельных генов и модельных заболеваний

В качестве генов, уровень представленности внеклеточных РЖ которых мог бы адекватно отражать функциональное состояние иммунной системы, а значит и служить ярким примером клинико-иммунологических возможностей предложенного подхода, были выбраны гены основных цитокинов - главных регуляторов иммунологического гомеостаза в организме.

В качестве патологий, способных послужить удобными моделями для отработки метода, были выбраны два заболевания, в патогенезе которых иммунная система принимает непосредственное участие: рак молочной железы и ревматоидный артрит. Ревматоидный артрит - классическое аутоиммунное заболевание, характеризующееся чрезмерной активацией иммунной системы и, как следствие, нарушением толерантности к собственным структурам организма. Рак молочной железы - типичный пример недостаточности функций иммунной системы, проявляющейся в неспособности обеспечить эффективный ответ на развитие опухоли. Эти два

заболевания представляют собой противоположные края спектра патологий

иммунной системы.

3. Выбор нормировочных генов

Оптимальными для нормировки нами были выбраны три референсных гена: ген бета-2-микроглобулина (В2т), ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и ген тирозинкиназы (ABL).

Стабильность экспрессии указанных генов была показана на основе анализа уровня представленности их транскриптов в клеточной фракции цельной крови. Было продемонстрировано, что эти гены экспрессируются на постоянном уровне во всех образцах вне зависимости от группы (табл. 1).

Таблица 1. Показатели Д Ср между значением индикаторного цикла для референсного гена в образце и минимальным значением индикаторного цикла для референсного гена в выборке.

Группа В2т HPRT ABL

Медиана SD* Медиана SD Медиана SD

Контроль 1,1 0,7 1,0 0,9 1,4 0,3

РА 1,2 0,8 1,6 0,4 2,0 0,5

РМЖ 1,7 0,4 1,9 0,8 1,8 0,6

*SD — среднее квадратичное отклонение

4. Расчет эффективности амплификации для использованных систем

Необходимым условием количественного определения уровня представленности мРНК является либо схожая эффективность амплификации сравниваемых фрагментов, либо использование специальных подходов, позволяющих учесть различия в эффективности амплификации (Е). Расчет эффективности амплификации для использованных систем производился с помощью построения стандартных калибровочных кривых для раститровок образцов с известной концентрацией (табл. 2).

Таблица 2. Эффективность амплификации для использованных ПЦР-систем.

Система E Система E Система E

HPRT 1,96 IL5- 1,91 IL 12b 1,92

B2m 1,90 IL6 1,96 IL17 1,97

ABL 1,92 IL7 1,96 IL18 1,95

ILlß 1,96 IL8 1,98 IFNy 1,98

IL2 1,97 ILIO 1,98 TNFa 1,98

IL4 1,94 IL12a 1,96 Tgfß 1,97

5. Анализ стабильности внеклеточных РНК плазмы вне организма

Для оценки скорости деградации внеклеточных РНК определяли уровень представленности транскриптов референсных генов (B2m, HPRT и ABL) в образцах через 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6 часов после забора крови. Юыло установлено, что в течение 6 часов при инкубации образцов плазмы при комнатной температуре достоверного снижения концентрации внеклеточной фракции РНК не наблюдалось. По всей видимости, этот факт свидетельствует о защищенности внеклеточных РНК от деградации (например, посредством упаковки в апоптотические тельца).

Для проверки влияния на концентрацию внеклеточных РНК циклов размораживания-замораживания образцов определяли уровень представленности транскриптов референсных генов (B2m, HPRT и ABL) в образцах до замораживания плазмы при -70° С и после размораживания. Замораживание плазмы сразу после этапа фракционирования крови вело к снижению концентрации внеклеточных РНК приблизительно в 5 раз. В связи с этим хранение исследуемого материала допустимо только после этапа выделения РНК.

6. Оценка уровня экспрессии мРНК генов цитокинов при нормальном физиологическом состоянии организма

Для определения характерного профиля внеклеточных РНК в норме, профиль представленности РНК 15 генов цитокинов и 3 нормировочных генов был описан нами для группы контроля.

В ходе исследования было установлено, что количество РНК исследованных генов в плазме приблизительно в 1000 раз ниже количества тех же транскриптов в клетках крови. Количество РНК наиболее представленного из исследованных цитокинов (TGFß) в плазме составляет около 20 ООО молекул на 1 мл.

На рисунке 2 приведен профиль представленности РНК цитокинов и трех нормировочных генов (B2m, HPRT и ABL) в клеточной фракции крови здоровых людей (данные приведены только для транскриптов, обнаруживаемых в клетках крови более чем у 50% испытуемых, транскрипты IL5, IL12b, IL 17 выявлялись в клеточной фракции крови менее половины обследуемых).

О Медиана ■ 25%-75%

IL6 1112а IL7 IL18 TNFa TGFß ABL B2m —p л по/ ano/ ILIO IL2 IL4 IFNy IHß 118 HPRT -L- 'V/0-эи/о

Рисунок 2. Профиль представленности РНК цитокинов в клеточной фракции крови здорового контроля (o.e. - относительные единицы).

Все приведенные на рисунке гены можно разделить на три группы: гены

с относительно высоким уровнем экспрессии (ILlß, IL8, TGFß), гены с

низким уровнем экспрессии (IL2, IL4, IL6, IL7, ILIO, IL12a) и гены,

занимающие промежуточное положение (IL18, IFNy, TNF a). Тендерных

различий в экспрессии генов цитокинов в клетках крови выявлено не было

(для р^),05). Полученные нами результаты согласуются с литературными

данными об уровне экспрессии цитокинов клетками периферической крови в

норме [Molina М.А., 2006]. 14

На рисунке 3 приведен профиль представленности РНК цитокинов и нормировочных генов в плазме крови здоровых людей.

ai 5,0000

0,5000

m 0,0500

7 S 0,0050

0,0005

5E-5

IL6 1112а IL7 11.18 TNF» TGFß ABL B2m 1110 IL2 N4 INFy IL1ß ILS HPRT

□ Медиана ■ 25%-75% 1С 10%-90%

Рисунок 3. Профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови здорового контроля (o.e. - относительные единицы).

Из представленных на рисунках 2 и 3 данных видно, что РНК цитокинов, для которых установлена низкая продукции РНК в клетках крови, в плазме практически не выявляется (IL2, IL4, IL6, IL7, ILIO). Исключение составляет IL 12а, транскрипты которого обнаруживаются в плазме более 50% обследуемых. Однако и этот цитокин детектируется в плазме крови на пределе аналитической чувствительности метода.

Профили относительной представленности РНК большинства остальных цитокинов (IL18, IFNy, TNFa, TGFß) в плазме крови и в клетках крови совпадают. Но для двух транскриптов обнаружено существенное изменение уровня РНК в плазме по сравнению с клеточной фракцией крови: IL1 и IL8. Относительное количество транскриптов IL1 и IL8 в плазме крови по сравнению с клеточной фракцией снижено приблизительно в 100 раз. Тендерных различий в уровне представленности РНК цитокинов в плазме крови выявлено не было (для р 20,05).

Обнаруженные различия профиля представленности РНК цитокинов в плазме крови и клетках крови могут объясняться несколькими причинами.

Во-первых, относительные количества РНК цитокинов в гибнущих клетках крови, а, следовательно, и обнаруживаемых в плазме свободных РНК, могут отличаться от цитокинового профиля, демонстрируемого пулом живых клеток. Во-вторых, не только клетки крови могут являться источником внеклеточных РНК в плазме. В этом случае изменение относительного количества транскриптов отдельных генов в плазме по сравнению с клетками крови может отражать уровень общей продукции цитокинов клетками различной локализации.

7. Оценка уровня представленности мРНК генов цитокинов в плазме больных раком молочной железы

На рисунках 4 и 5 приведены результаты сравнительного анализа представленности транскриптов цитокинов в суммарной клеточной фракции крови и плазме крови онкологических больных и здорового контроля.

50000,0000

5000,0000

а> о

500,0000

о.

Щ 50,0000 I-

о О)

5 5,0000 §

0,5000

IL12b IL10 IL2 IL4 IFNy U_1 ß IL8 HPRT IL6 IL12ct IL7 IL18 TNFct TGFß ABL B2m

| Контроль

□ РМЖ

□ Медиана О 25%-75% Ш 10%-90%

Рисунок 4. Сравнение профилей представленности РНК цитокинов в клетках крови больных РМЖ и здорового контроля (o.e. - относительные единицы).

0,0500

Ш 0,0050

т s

Q 0,5000

5,0000

□

| Контроль □ РМЖ

Ьй 0,0005

5Е-5

а Медиана О 25%-75%

IL12b IL10 IL2 IL4 IFNy IL1ß 1L8 HPRT IL6 IL12a IL7 IL18 TN Fa TGFß ABL 82m

ZU 10%-90%

Рисунок 5. Сравнение профилей представленности РНК цитокинов в плазме крови больных РМЖ и здорового контроля (o.e. - относительные единицы).

Для 10 из 15 проанализированных генов (ILlß, IL2, IL4, IL5, IL7, ILIO, IL 17, IFNy, TGFß, TNFa) различий между исследуемой и контрольной группами не было выявлено ни в уровне экспрессии клетками суммарной клеточной фракции, ни в уровне представленности транскриптов в плазме крови.

Для 3 генов (IL6, IL12a, IL12ß) показано увеличение как уровня экспрессии клетками цельной крови, так и уровня представленности транскрипта в плазме у больных с РМЖ. Повышение уровня IL 12а в плазме крови при анализе статистической значимости обнаруженных отличий оказалось недостоверным. Полученные результаты согласуются с литературными данными об уровне экспрессии этих цитокинов при развитии РМЖ. IL6 - мощный провоспалительный цитокин, который, с одной стороны, является элементом противоопухолевого иммунного ответа, с другой - успешно используется опухолевыми клетками в качестве фактора роста. Его синтезируют клетки самой опухоли, клетки окружения опухоли и, по всей видимости, клетки периферической крови. IL 12 - один из главных

активаторов клеточного звена противоопухолевого иммунитета (NK, CD4+, CD8+ клеток) и индукторов синтеза противоопухолевых цитокинов (IL2, IFNg).

Два гена (IL8, IL18) продемонстрировали одинаковый уровень представленности транскрипта в клеточной фракции крови в исследуемой и контрольной группах, однако разный уровень представленности транскрипта в плазме крови для этих же групп. В плазме больных с РМЖ относительное количество РНК IL8 и IL 18 существенно превышало относительное количество РНК этих генов в плазме здоровых людей. Результаты оценки статистической значимости полученных различий приведены в таблице 4. Отличия считались достоверными при р <0,05.

Таблица 3. Анализ статистической значимости отличий, полученных при сравнении уровня представленности РНК цитокинов в клеточной фракции крови и плазме крови больных РМЖ и здорового контроля.

Различия между группами IL6 IL8 IL120C IL12P IL18

Уровень экспресии гена в клеточной фракции крови (РМЖ/здоровые) 0,0259* ,(достоверно) 0,6305 (не достоверно) 0,0157 (достоверно) 0,0043 (достоверно) 0,8749 (не достоверно)

Уровень представленности транскрипта в плазме крови (РМЖ/здоровые) 0,0171 (достоверно) 0,0012 (достоверно) 0,3676 (не достоверно) 0,0132 (достоверно) 0,0054 (достоверно)

*- значения р при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни

Интересно, что, несмотря на меняющийся при патологии профиль представленности РНК цитокинов в клетках, ни для одного из исследованных транскриптов не было показано такой значительной разницы даже в клеточной фракции, как для IL8 и IL18 в плазме.

Оба этих интерлейкина непосредственно вовлечены в патогенез РМЖ. IL 18 - один из основных иммунорегуляторных цитокинов, принимающих участие в местном ответе организма на процесс опухолеобразования. Влияя на продукцию IFNy и активируя клетки моноцитарно-макрофагальной 18

системы, этот цитокин является индуктором противоопухолевой реакции. Возрастание уровня локальной продукции этого цитокина в окружении опухоли свидетельствует о развитии противоопухолевого иммунного ответа.

Провоспалительный цитокин IL8 в больших количествах синтезируется клетками самой опухоли и привлеченными в зону роста опухоли клетками иммунной системы. Действуя аутокринно и паракринно, этот цитокин ингибирует апоптоз опухолевых клеток и стимулирует ангиогенез в очаге опухолеобразования, тем самым способствуя росту опухоли. Кроме того, будучи мощным хемоаттрактантом, IL8 обеспечивает формирование воспалительного инфильтрата, представленного в основном нейтрофилами, и высвобождению факторов роста, продуцируемых этими клетками.

Согласно литературе провоспалительные цитокины не только способствуют росту опухоли, но и стимулируют ее метастазирование. В связи с этим, был проведен сравнительный анализ уровня представленности РЖ IL8 и IL 18 в плазме для двух групп больных РМЖ с крайними проявлениями заболевания. Одну группу составили 16 пациенток с ранним раком молочной железы, другую - 12 пациенток с местно-распространенным раком молочной железы с поражением более 3 подмышечных лимфатических узлов. Результаты сравнительного анализа приведены на рисунке 6.

Q Метастазы _ Минимальные H проявления заболевания

0,0005

□ Медиана

□ 25%-75% 1 10%-90%

IL8 IL18 ABL HPRT B2m Рисунок 6. Профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови больных РМЖ с крайними проявлениями заболевания.

Различий в уровне представленности РНК IL 18 между двумя группами больных РМЖ не обнаружено. Относительные количества РНК IL8 в плазме больных РМЖ с метастазами достоверно превышали относительные количества РНК этого цитокина в плазме больных с опухолью небольшого размера (для р ¿0,05). Известно, что у больных с метастазирующей опухолью молочной железы усиливается продукция IL8 раковыми клетками и клетками стромы. Способность продуцировать IL8 показана даже для метастазирующих опухолевых клеток. Стимулируя ангиогенез и увеличивая количество кровеносных сосудов в зоне роста опухоли, IL 8 способствует распространению метастаз и дистантному распространению самого IL8. Эндотелиальные клетки экспрессируют на своей поверхности оба рецептора к IL8 - CXCR1 and CXCR2. Действуя на эти рецепторы, IL8 повышает экспрессию молекул адгезии, необходимых для взаимодействия с опухолевыми клетками.

Увеличение относительного количества транскриптов генов IL8 и IL 18 в плазме крови онкологических больных свидетельствует, во-первых, о вовлеченности этих цитокинов в патогенез РМЖ, а, во-вторых, говорит в пользу гипотезы о связи профиля представленности РЖ цитокинов в плазме с уровнем продукции цитокинов в зоне роста опухоли.

Обнаруженные отличия в уровне представленности РНК IL8 и IL 18 в плазме крови больных РМЖ и здоровых людей позволяют использовать эти цитокины в дальнейшем в качестве маркеров, ассоциированных с развитием РМЖ. На данном этапе работы говорить о количественной оценке представленности внеклеточных РНК маркерных цитокинов как о самостоятельном инструменте диагностики РМЖ нельзя. Однако полученные нами результаты могут быть использованы в качестве дополнительно исследуемого параметра при диагностике заболевания, мониторинге его течения, оценке степени прогрессии. Для клинической диагностики можно рекомендовать следующие варианты сравнительного анализа: сравнение уровня представленности РЖ IL8 и IL18 с уровнем 20

представленности РНК референсных генов (например, HPRT) в плазме пациентов; сравнение уровней представленности РНК IL8, IL 18 и РНК цитокина, для которого никаких изменений в случае развития заболевания показано не было (например, ILlb).

8. Оценка уровня представленности мРНК генов цитокинов в плазме больных ревматоидным артритом

На рисунках 7 и 8 приведены результаты сравнительного анализа представленности транскриптов цитокинов в суммарной клеточной фракции и плазме крови больных РА и здоровых людей.

о.

с о

IL6 IL12U |L7 IL18 TN Fa TGFß ABL B2m ILIO IL2 IL4 IFN? lL1ß IL8 HPRT

| Контроль

□ PA

□ Медиана

□ 25%-75% X 10%-90%

Рисунок 7. Сравнение профилей представленности РНК цитокинов в клетках крови больных РА и здорового контроля (o.e. - относительные единицы).

I а.

IL6 IL12a IL7 ILIO IL2 I

IL18 TNFa TGFß ABL B2m l IPNy IL1ß IL8 HPRT

Щ Контроль

□ PA

□ Медиана О 25%-75% X 10%-90%

Рисунок 8. Сравнение профилей представленности РНК цитокинов в плазме крови больных РА и здорового контроля (o.e. - относительные единицы).

Для 11 из 15 анализируемых генов (IL2, IL4, IL5, IL7, ILIO, IL12a, IL12ß, IL 17, IL 18, IFNy, TGFß) различий в уровне экспрессии клетками суммарной клеточной фракции крови между исследуемой и контрольной группами выявлено не было. Уровень представленности транскриптов 4 генов (IL1 ß, IL6, IL8, TNFa) в клетках крови больных РА оказался выше, чем в клетках крови здорового контроля, что согласуется с литературными данными об уровне экспрессии цитокинов клетками периферической крови при развитии PA [Firestein GS., 2003].

Между уровнями представленности транскриптов 6 из 10 детектируемых в плазме генов (IL12a, lL12ß, IL17, IL18, IFNy, TGFß) у больных и здоровых различий выявлено не было. 4 гена (IL1 ß, IL6, IL8, TNFa) продемонстрировали более высокий уровень представленности РНК в плазме больных РА по сравнению со здоровым контролем. Результаты оценки статистической значимости полученных различий приведены в таблице 3. Отличия считались достоверными при р <0,05.

Таблица 4. Анализ статистической значимости отличий, полученных при сравнении уровня представленности РНК цитокинов в клеточной фракции крови и плазме крови больных РА и здорового контроля.

Различия между группами ILlß IL6 IL8 TNFa

Уровень экспресии гена в клеточной фракции крови (РА/здоровые) 0,0482* (достоверно) 0,2829 (не достоверно) 0,0178 (достоверно) 0,0045 (достоверно)

Уровень представленности транскрипта в плазме крови (РА/здоровые) 0,0293 (достоверно) 0,0349 (достоверно) 0,0193 (достоверно) 0,0576 (не достоверно)

*- значения р при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни

Для двух из исследованных показателей (уровень 1Ь6 в клетках крови и уровень ЮТа в плазме крови) отличия оказались недостоверными. Тем не менее, в целом профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови больных РА повторяет цитокиновый профиль - клеточной фракции. Возможно, это объясняется тем, что характер и особенности патогенеза 22

Возможно, это объясняется тем, что характер и особенности патогенеза заболевания, выбранного нами для отработки метода, препятствуют свободному попаданию внеклеточных РНК из очага воспаления в циркуляцию. Одним из вероятных факторов ограничения попадания в кровоток генетического материала клеток-участников патологического процесса при РА являются гематоартикулярные барьеры суставов. Кроме того, на элиминацию внеклеточных РНК в значительной степени влияет активность фагоцитов. В случае развития РА в замкнутой полости суставной сумки развивается воспалительная реакция, сопровождающаяся, во-первых, увеличением количества способных к фагоцитозу клеток, а, во-вторых, возрастанием их активности. По-видимому, описанные процессы лимитируют использование предложенного подхода в случае развития РА.

Тем не менее, результаты, полученные с применением разработанного метода, свидетельствуют о том, что использование данного подхода позволяет выявлять изменения циитокинового профиля, характерные для развития РА. Совпадение профиля представленности РНК цитокинов в плазме крови с профилем клеточной фракции делает количественную оценку внеклеточных РНК при данной патологии альтернативой определению уровня экспрессии цитокинов клетками периферической крови. Кроме того, представляется целесообразным исследовать возможность применения разработанного метода при других аутоиммунных заболеваниях, в частности при сахарном диабете I и II типов. При этом, оценивая перспективы использования данного подхода, необходимо принимать во внимание особенности анатомической организации и патогенеза заболеваний, выбранных для отработки модели.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана методика количественного анализа внеклеточных РНК генов, участвующих в реализации иммунного ответа, в плазме крови. Подход удобен, прост в применении и может быть рекомендован для использования

2. Определенный профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови при нормальном физиологическом состоянии организма существует и отличается от цитокинового профиля клеточной фракции.

3. При развитии РМЖ в плазме крови больных возрастают уровни представленности IL12, IL6, IL8 и IL18. В клеточной фракции больных РМЖ возрастает относительное количество только IL 12 и IL6. Уровень РНК IL8 повышен в плазме крови больных с метастазирующим заболеванием по сравнению с больными с минимальными проявлениями заболевания.

4. При развитии РА уровни представленности РНК основных провоспалительных цитокинов возрастают как в плазме крови, так и в клетках крови больных.

5. Количественная оценка внеклеточных РНК цитокинов при развитии рака молочной желёзы может быть использована в качестве дополнительного инструмента при диагностике и оценке степени прогрессии заболевания.

6. Количественная оценка внеклеточных РНК цитокинов при развитии ревматоидного артрита может быть использована в качестве альтернативы определению уровня экспрессии цитокинов клетками периферической крови.

7. Полученные данные говорят в поддержку гипотезы о связи профиля представленности внеклеточных РНК плазмы крови с ходом патологического процесса и служат предпосылкой для изучения возможности применения разработанной методики для изучения особенностей течения и разработки методов диагностики других иммунозависимых заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Турчанинова М.А., Ребриков Д.В. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2009. - №2. - С. 22-24.

2. Турчанинова М.А., Ребриков Д.В, Алексеев Л.П. // Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. 2010. №10. Том 13. С. 3-8.

3. Турчанинова М.А. // Российский аллергологический журнал. 2007. №3. С. 12.

4. Turchaninova М., Rebrikov D. // V International Conference on Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. 2007. Books of abstracts. P. 28.

5. Turchaninova M., Rebrikov D. // 6th Cytokines and Inflammation Conference. 2008. Books of abstracts. P. 324.

6. Turchaninova M., Rebrikov D. // XX International Congress of Genetics. 2008. Books of Abstracts. P. 430.

7. Турчанинова М.А. // Материалы 12й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». 2008. С. 154.

8. Турчанинова М.А., Ребриков Д.В. // Материалы II Российского симпозиума «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека». 2009. С. 31.

Подписано в печать 10.02.10 Формат 60X84/16 Бумага офисная «5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 12 9 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24 1

Оглавление диссертации Турчанинова, Мария Андреевна :: 2010 :: Москва

Список использованных в работе сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Современные представления о происхождении, природе и функциях внеклеточных нуклеиновых кислот

1.1.1 История вопроса

1.1.2 Происхождение внеклеточных нуклеиновых кислот

1.1.3 Формы существования внеклеточных нуклеиновых кислот

1.1.4 Факторы, влияющие на представленность нуклеиновых кислот различных тканей в циркуляции

1.1.5 Представленность в циркуляции различных геномных последовательностей

1.1.6 Функции внеклеточных нуклеиновых кислот

1.2 Клиническое применение внеклеточных нуклеиновых кислот

1.2.1 Внеклеточные нуклеиновые кислоты в диагностике рака

1.2.2 Вирусные нуклеиновые кислоты

1.2.3 Нуклеиновые кислоты плода в циркуляции матери

1.2.4 Внеклеточные нуклеиновые кислоты в травматологии

1.2.5 Внеклеточные нуклеиновые кислоты в диагностике инсульта и острого коронарного синдрома

1.2.6 Внеклеточные нуклеиновые кислоты в диагностике патологий иммунной системы

1.2.7 Внеклеточные нуклеиновые кислоты в трансплантологии

1.3 Цитокины и их роль в поддержании иммунологического гомеостаза

1.3.1 Общая характеристика цитокинов

1.3.2 Цитокины в патогенезе рака молочной железы

1.3.3 Цитокины в патогенезе ревматоидного артрита

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Сведения об исследуемых группах

2.2 Получение плазмы и суммарной клеточной фракции

2.3 Выделение РНК

2.4 Определение уровня представленности транскриптов генов цитокинов методом обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в реальном времени»

2.4.1 Постановка реакции обратной транскрипции

2.4.2 Постановка ПЦР

2.5 Секвенирование продуктов ПЦР

2.6 Приготовление реактивов, входящих в состав набора для обратной траснкрипции и амплификации

2.7 Учет результатов реакции и их статистическая обработка

2.8 Использованное в работе программное обеспечение и базы данных

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Разработка методики количественного анализа внеклеточных РНК

3.2 Выбор модельных генов и модельных заболеваний

3.3 Выбор нормировочных генов

3.4 Расчет эффективности амплификации для использованных систем

3.5 Анализ стабильности внеклеточных РНК плазмы вне организма

3.6 Оценка уровня представленности мРНК генов цитокинов при нормальном физиологическом состоянии организма

3.7 Оценка уровня представленности мРНК генов цитокинов в плазме больных раком молочной железы

3.8 Оценка уровня представленности мРНК генов цитокинов в плазме больных ревматоидным артритом

Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Турчанинова, Мария Андреевна, автореферат

Исследования последних лет показали, что анализ внеклеточных ДНК и РНК, циркулирующих в плазме крови, является многообещающим диагностическим подходом. Качественный и количественный состав внеклеточных нуклеиновых кислот, обнаруживаемых в плазме крови, является системным показателем, способным охарактеризовать ход патологических процессов, независимо от их локализации в организме. В настоящее время показана возможность применения анализа циркулирующих в плазме нуклеиновых кислот для диагностики рака, в том числе и на ранних стадиях заболевания, когда опухоль еще не различима инструментальными методами анализа, а также при мониторинге беременности, когда на основе анализа нуклеиновых кислот плода, циркулирующих в крови матери, устанавливают пол и резус-фактор ребенка, диагностируют осложнения течения беременности и генетические заболевания плода [16, 24, 25, 26, 27, 33]. Другие области применения данных о внеклеточных нуклеиновых кислотах включают в себя мониторинг посттравматического и постинсультного состояния (в этих случаях количество циркулирующей ДНК коррелирует с обширностью поражения), а также раннюю диагностику криза отторжения трансплантата [32, 90, 92, 53].

К настоящему моменту накоплено значительное количество данных, описывающих природу, функции и клиническую значимость внеклеточных ДНК [9]. При этом в области анализа циркулирующих РНК остается множество недостаточно изученных, противоречивых и спорных вопросов. Особый интерес вызывает тот факт, что в составе внеклеточных РНК обнаруживаются тканеспецифичные транскрипты. Это дает основания предположить связь профиля представленности РНК, циркулирующих в плазме, с ходом патологического процесса непосредственно в очаге его развития. А это в свою очередь означает, что оценка качественного и количественного профиля внеклеточных РНК может стать удобным инструментом для малоинвазивной диагностики, мониторинга и прогнозирования самых разных клинических состояний, в том числе и иммунозависимых патологий.

Большой интерес представляет исследование клинических возможностей данного подхода в области диагностики иммунозависимых патологий. Сравнительный анализ уровня представленности в плазме крови внеклеточных РНК генов, участвующих в реализации иммунного ответа, в норме и патологии, во-первых, позволит ближе подойти к пониманию закономерностей течения иммунозависимых заболеваний, а, во-вторых, может стать основой для разработки новых подходов к их диагностике. В качестве исследуемых заболеваний были выбраны рак молочной железы и ревматоидный артрит - заболевания с различными формами иммунопатологий.

Цель работы:

Оценить возможности анализа качественного и количественного состава внеклеточных РНК плазмы крови в роли инструмента для диагностики иммунозависимых патологий.

Задачи работы:

1. Разработать методику количественной оценки внеклеточных РНК плазмы крови.

3. С помощью разработанной методики охарактеризовать профиль представленности транскриптов анализируемых генов в плазме крови клинически здоровых добровольцев, составляющих контрольную группу.

4. Выбрать модельные заболевания, в патогенезе которых иммунная система принимает непосредственное участие, и способные стать наиболее ярким примером клинико-иммунологических возможностей предложенного подхода.

Научная новизна работы:

Охарактеризован качественный и количественный профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови здорового контроля, больных раком молочной железы (РМЖ) и больных ревматоидным артритом (РА).

Показаны диагностические возможности оценки уровня внеклеточных РНК. Получены данные о повышении уровня представленности РНК IL8, IL18 (относительно референсных генов) в плазме крови больных РМЖ по сравнению с клеточной фракцией крови больных РМЖ и по сравнению с уровнем представленности РНК данных генов в плазме крови здорового контроля. Показано, что количество транскрипта IL8 в плазме крови больных РМЖ коррелирует со способностью опухоли к метастазированию.

Установлено, что при развитии РА изменение относительного профиля представленности РНК цитокинов в плазме повторяет изменение относительного профиля представленности РНК цитокинов в клеточной фракции цельной крови. Совпадение профиля представленности РНК цитокинов в плазме крови с цитокиновым профилем клеточной фракции делает количественную оценку внеклеточных РНК альтернативой определению уровня экспрессии генов клетками периферической крови.

Практическая значимость работы:

Разработана простая и эффективная методика количественной оценки внеклеточных РНК плазмы крови, адаптированная к использованию с отечественным оборудованием. Количественное определение уровня представленности транскриптов генов иммунного ответа в плазме может обеспечить новый подход к диагностике и прогнозированию распространенных нарушений в работе иммунной системы. Разработанная система является хорошей моделью для создания диагностических инструментов, основанных на анализе внеклеточных РНК.

Показано, что качественный и количественный профиль представленности внеклеточных РНК цитокинов является диагностически значимым инструментом при оценке и характеристике таких иммунозависимых патологий, как ревматоидный артрит и рак молочной железы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Относительные количества РНК генов цитокинов в плазме крови приблизительно в 1000 раз ниже количеств РНК тех же генов в клетках крови. Типичный профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови существует и отличается от цитокинового профиля клеточной фракции. Относительные уровни РНК ILip и IL8 в плазме крови существенно ниже уровня РНК этих генов в клетках крови.

2. При развитии РМЖ в плазме крови больных возрастают уровни представленности IL12, IL6, IL8 и IL18. В клеточной фракции больных РМЖ возрастает относительное количество только IL12 и IL6. Уровень РНК IL8 повышен в плазме крови больных с метастазирующим заболеванием по сравнению с больными с минимальными проявлениями заболевания.

3. При развитии РА уровни представленности РНК основных провоспалительных цитокинов возрастают как в плазме крови, так и в клетках крови больных.

4. Полученные данные подтверждают гипотезу о связи профиля представленности РНК цитокинов в плазме крови с уровнем продукции цитокинов клетками в очаге развития патологического процесса и служат предпосылкой для изучения возможности применения разработанной методики для анализа особенностей течения и разработки методов диагностики других иммунозависимых заболеваний.

Личный вклад автора:

Автору принадлежит решающая роль в разработке дизайна экспериментов, отработке методик и обобщении полученных результатов.

Личный вклад автора в данном исследовании составляет около 80%.

Публикации:

Материалы диссертации изложены в 8 публикациях: 1 .Турчанинова М.А., Ребриков Д.В. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2009. - №2. - С. 22.

2.Турчанинова М.А., Ребриков Д.В, Алексеев Л.П. // Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. 2010. №10. Том 13. С. 3-8.

3.Турчанинова М.А. // Российский аллергологический журнал. 2007. №3. С. 12.

4.Turchaninova M., Rebrikov D. // V International Conference on Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. 2007. Books of abstracts. P. 28.

5.Turchaninova M., Rebrikov D. // 6th Cytokines and Inflammation Conference. 2008. Books of abstracts. P. 324.

6.Turchaninova M., Rebrikov D. // XX International Congress of Genetics. 2008. Books of Abstracts. P. 430.

7.Турчанинова M.A. // Материалы 13й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». 2008. С. 154.

8.Турчанинова М.А., Ребриков Д.В. // Материалы II Российского симпозиума «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека». 2009. С. 31.

Заключение диссертационного исследования на тему "Возможности клинико-иммунологического использования оценки уровня внеклеточных РНК"

выводы

3. При развитии рака молочной железы в плазме крови больных возрастают уровни представленности IL12, IL6, IL8 и IL18. В клеточной фракции крови больных раком молочной железы возрастает относительное количество только IL12 и IL6. Уровень РБК IL8 повышен в плазме крови больных с метастазирующим заболеванием по сравнению с больными с минимальными проявлениями заболевания.

4. При развитии ревматоидного артрита уровни представленности РНК основных провоспалительных цитокинов возрастают как в плазме крови, так и в клетках крови больных.

5. Количественная оценка внеклеточных РНК цитокинов при развитии рака молочной железы может быть использована в качестве дополнительного инструмента при диагностике и оценке степени прогрессии заболевания.

7. Полученные данные подтверждают гипотезу о связи профиля представленности внеклеточных РНК плазмы крови с ходом патологического процесса и служат предпосылкой для исследования возможности применения предложенной методики для анализа особенностей течения и разработки новых инструментов диагностики других иммунозависимых заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современное здравоохранение сталкивается с проблемой неуклонного роста заболеваемости патологиями, связанными с нарушениями функций иммунной системы. В связи с этим разработка методов своевременнной и адекватной молекулярно-генетической диагностики этих болезней представляется актуальной задачей, требующей грамотного решения. Анализ современной литературы показывает, что одним из перспективных направлений в данной области является исследование внеклеточных нуклеиновых кислот, как универсальных маркеров патологических процессов, происходящих в организме человека. В своей работе мы попытались оценить возможности клинико-иммунологического использования оценки уровня внеклеточных РНК в роли инструмента для диагностики иммунозависимых патологий.

В качестве патологий, способных послужить удобными моделями для отработки метода, были выбраны два заболевания, в патогенезе которых иммунная система принимает непосредственное участие: ревматоидный артрит (РА) и рак молочной железы (РМЖ). В качестве модельных генов, уровень представленности РНК которых мог бы адекватно отражать функциональное состояние иммунной системы, были выбраны гены основных цитокинов, как одних из главных регуляторов иммунологического гомеостаза в организме.

В ходе исследования на основе комбинации методов обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции «в реальном времени» была разработана простая и эффективная методика количественной оценки внеклеточных РНК цитокинов плазмы крови. С помощью разработанной методики был охарактеризован качественный и количественный профиль представленности внеклеточных РНК цитокинов в плазме крови больных РМЖ, РА и в плазме крови здорового контроля. Для оценки целесообразности применения анализа внеклеточных РНК цитокинов параллельно проводилось исследование уровней представленности РНК цитокинов в клеточной фракции периферической крови в тех же группах.

Было установлено, что для нормального физиологического состояния организма человека характерен типичный профиль представленности внеклеточных РНК цитокинов в плазме крови, отличающийся от профиля представленности РНК тех же генов в клетках крови.

Анализ качественного и количественного профиля представленности внеклеточных РНК цитокинов в плазме крови больных РМЖ показал достоверное увеличение концентрации РНК IL8 и IL18 по сравнению со здоровым контролем. При этом для клеточной фракции крови таких различий между исследуемой и контрольной группой обнаружено не было. Кроме того, было установлено, что концентрация IL8 в плазме крови онкологических больных коррелирует с размером опухоли и ее способностью к метастазированию. В литературе имеются данные о роли IL8 и IL18 в патогенезе РМЖ и о возрастании уровня их продукции клетками в зоне роста опухоли. Обнаруженное нами повышение концентрации внеклеточных транскриптов IL8 и IL18 подтвержает гипотезу о связи уровня представленности РНК цитокинов в плазме крови с уровнем их продукции в очаге опухолеобразования, и позволяет использовать эти цитокины в дальнейшем в качестве маркеров, ассоциированных с развитием РМЖ. Говорить о количественной оценке представленности маркерных РНК цитокинов в плазме крови, как о самостоятельном инструменте диагностики РМЖ нельзя. Однако полученные нами результаты позволяют использовать количественную оценку внеклеточных РНК плазмы в качестве дополнительного инструмента при ранней диагностике заболевания, мониторинге его течения, оценке степени прогрессии.

Исследование качественного и количественного состава РНК цитокинов в плазме и клетках крови больных РА показало, что при развитии РА относительный профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови повторяет профиль экспрессии генов цитокинов клетками периферической крови. Повышенные уровни РНК основных провоспалительных цитокинов в плазме крови больных РА соответствуют повышенным уровням РНК этих же генов и в клетках крови. По всей видимости, полученные результаты объясняются тем, что характер и особенности патогенеза РА препятствуют свободному попаданию внеклеточных РНК из очага воспаления в циркуляцию. Тем не менее, использование данного подхода позволяет выявлять изменения цитокинового профиля, характерные для развития РА. Совпадение относительных профилей представленности РНК цитокинов в плазме крови и в клеточной фракции крови делает количественную оценку внеклеточных РНК при данной патологии альтернативой определению уровня экспрессии цитокинов клетками периферической крови.

Проведенный в работе сравнительный анализ уровня представленности в плазме крови внеклеточных РНК цитокинов, как одних из основных регуляторов иммунологического гомеостаза в организме, в норме и патологии, во-первых, позволяет ближе подойти к пониманию закономерностей течения иммунозависимых заболеваний, а, во-вторых, может стать основой для разработки новых подходов к их диагностике. Предложенная система является хорошей моделью для создания диагностических инструментов, основанных на анализе внеклеточных РНК. Результаты, полученные в ходе исследования, свидетельствуют о целесообразности исследования возможности применения разработанной методики для анализа особенностей течения и создания новых инструментов диагностики других иммунозависимых патологий.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Турчанинова, Мария Андреевна

1. Бабышкина Н.Н., Стахеева М.Н., Слонимская Е.М. Иммунологические параметры и уровень продукции цитокинов с больных с пролиферативными заболеваниями и раком молочной железы. // Цитокины и воспаление. 2006. №1. С. 37-43.

2. Бережная Н.М. Цитокиновая регуляция при патологии: стремительное развитие и неизбежные вопросы. // Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6. №2.С.26-34.

3. Быков В. JI. Цитология и общая гистология: функциональная морфология клеток и тканей человека. // С-Пб.: СОТИС. 2008. 520 с.

4. Егорова В. А., Блинов М.Н. ДНК-связывающие белки сыворотки крови при гемобластозах. //Вопр. мед. Химии. 1993. Т. 39. С. 36-38.

5. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. // Цитокины. Санкт-Петербург. Фолиант. 2008. 550 с.

6. Ребриков Д.В., Саматов Д.Ю., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР «в реальном времени». М: Бином. 2009. 215 с.

7. Сигидин Я. А., Лунина Г. В. Ревматоидный артрит. // М: Медицина. 2001.328 с.

8. Симбирцев А.С. Цитокины: классификация и биологические функции. // Цитокины и воспаление. 2004. Т.З. №2. С. 16-23.

9. Тамкович С.Н., Власов В.В., Лактионов П.П. Циркулирующие дезоксирибонуклеиновые кислоты крови и их использование в медицинской диагностике // Молекуляр.биология. 2008. Т. 42(1). С. 1223.

10. Черепанова А.В., Тамкович С.Н., Власов В.В., Лактионов П.П. Активность дезоксирибонуклеаз крови в норме и при патологии. // Биомед. Химия. 2007. Т.93 (5). С. 488-496.

11. Abruzzo L. V., Lee K. Y. Validation of oligonucleotide microarray data using microfluidic low-density arrays: a new statistical method to normalize realtime RT-PCR data. // BioTechniques. 2005. Vol. 38. №5. P. 785-792.

12. Akira S., Uematsu S., Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. // Cell. 2006. 124: 781-801.

13. Alarcon G. S. Epidemiology of rheumatoid arthritis. // Rheum Dis Clin North Am. 1995.21:589-604.

14. Ambros V. The function of animal microRNAs. // Nature. 2004. 431: 350355.

15. Anderson J.J. Factors predicting response to treatment in rheumatoid arthritis: the importance of disease duration // Arthritis Rheum. 2000. 43:22-29.

16. Anker P., Mulkahy H., Stroun M. Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer: time for large-scale clinical studies? // Int. J. Cancer. 2003. 103: 149-152.

17. Anker P, Stroun M. Immunological aspects of circulating DNA. // Ann N Y Acad Sci. 2006. 1075: 34-9.

18. Anker P., Stroun M., Maurice P.A. Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes as shown in an in vitro system. // Cancer Res. 1975. 35: 2375-2382.

19. Balkwill F. Tumor necrosis factor or tumor promoting factor? // Cytokine Growth Factor Rev. 2002. 13: 135-141.

20. Bergsmedh A., Ehnforce J., Kawane K., Motoyama N., Nagata S., et al. DNAse II and the Chk2 DNA damage pathway form a genetic barrierblocking replication of gorizontally transferred DNA. // Mol. Cancer Res. 2006. 4: 187-195.

21. Bergsmedh A., Szeles A., Henriksson M., Bratt A., FolkmanMJ., et al. Horisontal transfer of oncogenes by the uptake of apoptotic bodies. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. 98: 6407-6411.

22. Beutler B. Innate Immunity: an overview. // Mol. Immunol. 2004. 40: 845859.

23. Bianchi D.W. Circulating fetal DNA: its origin and diagnostic potential a review. // Placenta. 2004. 25: 93-101.

24. Bianchi D.W., Williams J.M., Sullivan L.M., et al. PCR quantification of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploid pregnancies. // Am. J. Hum. Genet. 1997.61:822-9.

25. Birch L., English C.A., O'Donoghue K., et al. Accurate and robust quantification circulating fetal and total DNA in maternal plasma from 5 to 41 weeks of gestation. // Clin. Chem. 2005. 51: 312-320.

26. Bremnes R.M., Sirera R., Camps C. Circulating tumor-derived DNA and RNA markers in blood: a tool for early detection, diagnostics, and follow up? // Lung Cancer. 2005. 49:1-12.

27. Butler P.J., Tennent G.A., Pepys M.B. Pentraxin-chromatin interactions: serum amyloid P component specifically displaces HI-type histones and solubilizes native long chromatin. // J. Exp. Med. 1990. 172: 13-18.

28. Capone R.B., Pai S.I., Koch W.M., et al. Detection and quantification of human papillomavirus (HPV) DNA in the sera of the patients with HPV-associated head and neck squamous cell carcinoma. // Clin. Cancer Res. 2000. 11:4171-4175.

29. Chan КС, Lo YM. Circulating EBV DNA as a tumor marker for nasopharyngeal carcinoma. // Semin. Cancer Biol. 2002. 12(6):489-96.

30. Chang C.P.Y., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. // Clin. Chem. Acta. 2003. 327: 95-101.

31. Chang H.V., Lee S.M., Goodman S.N., et al. Assessment of plasma DNA levels, allelic imbalance and CA 125 as diagnostic test for cancer. // J. Natl. Cancer Inst. 2002. 94: 1697-1703.

32. Chen X.Q., Bonnefoi H., Pelte M.F., et al. Telomerase RNA as a detection marker in the serum of breast cancer patients. // Clin. Cancer. Res. 2000. 6:3823-3826.

33. Chen Z., Fadiel A., Naftolin F., EichenbaumK.D., Xia Y. Circulation DNA: Biological implication for cancer metastasis and immunology. // Medical Hypotheses. 2005. 65: 956-961.

34. Chim S.S.C., Tong Y.K., Chiu R.W.K., et al. Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. 102: 14753-14758.

35. Chiu R.W.K., Lui W.B., Cheung M.C., et al. Time profile of appearance and disappearance of circulating placenta-derived mRNA in maternal plasma. // Clin. Chem. 2006. 52: 313-316.

36. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal. Biochem. 1987. Vol. 162. № l.P. 156-159.

37. Colombo M., Trinchieri G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. // Cytokine Growth Factor Rev. 2002. 13: 155-168.

38. Coussens L., Werb Z. Inflammatory cells and cancer: think different! // J. Exp. Med. 2001. 193:23-26.

39. Deligezer U., Yaman F., Erten N., Dalay N. Frequent copresence of methylated DNA and fragmented of nucleosomal DNA in plasma of lymphoma patients. // Clin Chim Acta. 2003. 335(l-2):89-94.

40. Deligezer U., Yaman F., Erten N., Dalay N. 2003. Frequent copresence of methylated DNA and fragmented nucleosomal DNA in plasma of lymphoma patients. // Clin. Chim. Acta. 335: 89-94.

41. Dranoff G. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy. // Nat. Rev. Cancer. 2004. 4: 11-21.

42. Dunn G., Koebel K., Schreiber R. Interferons, immunity and cancer immunoediting. // Nat. Rev. Immunol. 2006. 6: 836-848.

43. Dutton G. Oligos enable new classes of therapeutics. Gen Updates in Biotechnology: Olygonucleotides. // Suppl. Genet. Engineering News. 2006. 26:4-6.

44. El-Hefnawy Т., Raja S., Kelly L., Bigbee W.L., Kirkwood J.M., et al. Characterization of amplifiable, circulating RNA in plasma and its potential as a tool for cancer diagnostics. // Clin. Chem. 2004. 50: 564-573.

45. Fiegl H., Millinger S., Mueller-Holzner E., Marth C., Ensinger C., et al. Circulating tumor-specific DNA: a marker for monitoring efficacy of adjuvant therapy in cancer patients. // Cancer Res. 2005. 65:1141-1145.

46. Filipovicz W., Jaskiewikz L., Kolb F.A., Pillai R.S. Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2005. 15: 331341.

47. Finning K., Martin P., Daniels G. A clinical service in the UK to predict fetal Rh (Rhesus) D blood group using free fetal DNA in maternal plasma. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2004. 1022: 119-123.

48. Firestein GS. // Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 2003. 423(6937):356-61.

49. Firestein GS. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 2005.11(3 Suppl):S39-44.

50. Fox D.A. The role of T cells in the immunopathogenesis of rheumatoid arthritis New perspectives // Arthritis Rheum. 1997. 40: 598-609.

51. Gadi V.K., Nelson J.L., Boespflug N.D., et al. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. // Clin. Chem. 2006. 52: 379-82.

52. Gallagher A., et al. Detection of EBV genomes in the serum of patients with EBV-associated Hodgkin's disease. // Int. J. Cancer. 1999. 84: 442-448.

53. Galeazzi M., Morozzi G., Piccini M., Chen J., et al. Dosage and characterization of circulating DNA: present usage and possible application in systemic autoimmune disorders. // Autoimmun. Rev. 2003. 2:50-55.

54. Garcia-Olmo D.C., Guttierez-Gonzalas L., Ruiz-Picueras R., et al. Detection of circulating tumor cells and of tumor DNA in plasma during tumor progression in rats. // Cancer Lett. 2005. 217: 115-123.

55. Gentle A., Anastasopoulus F., McBrien N.A. high-resolution semiquantitative real-time PCR without the use of a standart curve. // Biotechniques. 2001. 31:502, 504-506, 508.

56. GerasimovaY.V., Alekseyeva I.V., Bogdanova T.G., et al. Affinity separation of polyribonucleotide-binding human blood proteins. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006. 16, 5526-5529.

57. Gomperts В., Strieter R. Chemokine-directed metastasis. // Contrib. Microbiol. 2006. 13: 170-190.

58. Gorelik L., Flavell R. Transforming growth factor-beta in T-cell biology. // Nat. Rev. Immunol. 2002. 2:1-8.

59. Grammatopoulos D, Elliott Y, Smith SC, et al. Measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood as an adjunctive test for monitoring thyroid cancer. //Mol Pathol. 2003. 56(3): 162-166.

60. Gravallese E.M., Goldring S.R. Cellular mechanisms and the role of cytokines in bone erosions in rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. 2000. P. 43.

61. Gupta P., Su Z., Lebedeva I., et al. Mda-7/ IL-24: Multifunctional cancer-specific apoptosis-inducing cytokine. //Pharmacol. Ther. 2006. Ill: 596-628.

62. Hudson J., Shoaibi M., Maestro R., et al. A proinflammatory cytokine inhibits p53 tumor supressor activity. //J. Exp. Med. 1999. 90: 1375-1382.

63. Hahn S., Huppertz В., Holzgreve W. Fetal cells and fetal cell-free nucleic acids in maternal blood: new tools to study abnormal placentation? // Placenta. 2005. 26: 515-526.

64. Hamaoui K., et al. Concentration of circulating rodopsin mRNA in diabetic retinopathy. //Clin. Chem. 2004. 50: 2152-2155.

65. Hao J., Shan B. Immune enhancement and anti-timor activity of IL-23. // Cancer Immunollmmunother. 2006. 55: 1426-1431.

66. Harandi A.M. CpG oligodeoxynucleotides and mobilization of innate mucosal immunity: tasks and tactics. Vaccine. 2006. 24. Suppl. 2: 48-49.

67. Hasselman D.O., et al. Detection of tumor-associated circulating mRNA in serum, plasma and blood cells from patients with disseminated malignant melanoma. // Oncol. Rep. 2001. 8: 115-118.

68. Hasselman D.O., et al. Extracellular tyrosinase mRNA within apoptotic bodies is protected from degradation in human serum. // Clin. Chem. 2001. 47: 1488-1489.

69. Henderson B. Mechanisms and models in rheumatoid arthritis. // San Diego: Academic Press INC. 1995. P. 548.

70. Holdenrieder S., Stieber P. Therapy control in oncology by circulating nucleosomes. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. 1022, 211-216.

71. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3'-exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. 88:7276-7280.

72. Holmgren L., Szeles A., Rajnavolgyi E., Folkman J., Klein G., et al. Horisontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 1999. 93: 3956-3963.

73. Honda H., Miharu N., Ohashi Y., et al. Fetal gender determination in early pregnancy through qualitative and quantitative analysis of feta DNA in maternal serum. //Hum. Genet. 2002. 110: 75-79.

74. Houssiau F.A., Devogelaer J.P., Van Damme J., de Deuxchaisnes C.N., Van Snick J. Interleukin-6 in synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis and other inflammatory arthritides. // Arthritis Rheum. 1988. 31:784788.

75. Jahr S, Hentze H, Englisch S, Hardt D, Fackelmayer FO, et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. // Cancer Res. 2001. 61: 1659-1665.

76. Jeronimo C., Nomoto S., Caballero O.L.,Usadel H., Henrique R., et al. Mitochondrial mutations in early stage prostate cancer and bodily fluids. // Oncogene. 2001. 20: 5195-5198.

77. Judge A.D., Sood V., Shaw J.R., Fang D., McClintock K., et al. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA. //Nat. biotechnol. 2005. 23: 457-462.

78. Kamm R.C., Smith A.G., Nucleic acids concentrations in normal human plasma. // Clin. Chem. 1972. 18: 519-522.

79. Kannemeier С., Shibamiya A., Nakazawa F., Trusheim N., et al. Extracellular RNA constitutes a natural procoagulant cofactor in blood coagulation. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2007. 104(15):6388-6393.

80. Kawane K., Ohtani M., Miwa K., Kizawa M., Tkanbara Y., et al. Chronic polyarthritis caused by mammalian DNA that escapes from degradation in macrophages. //Nature. 2006. 443: 998-1002.

81. Kinzler K.W., Vogelstein B. Lessons from hereditary colorectal cancer. // Cell. 1996. 87: 159-170.

82. Klinman D.M. Adjuvant activity of CpG oligodeoxynucletides. // Int. Rev. Immunol. 2006. 25: 135-154.

83. Komeda Т., et al. Sensitive detection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venus blood. // Cancer. 1995. 75: 2214-2219.

84. Kopreski M.S., et al. Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma. // Clin. Cancer Res. 1999. 5:1961-1965.

85. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. // Annu. Rev. Immunol. 2002. 20: 709-760.

86. Kruman N.P., et al. Apoptosis of murine BW 5147 thymoma cells induced by dexamethasone and y-iiradiation. //J. Cell. Physiol. 1991. 148: 267-273.

87. Laktionov PP, Tamkovich SN, Rykova EY, et al. Extracellular circulating nucleic acids in human plasma in health and disease. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. 23(6-7): 879-83.

88. Lam N.Y.L., et al. Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients. // Clin. Chem. 2003. 49: 1286-1291.

89. Lam N.Y.L, et al. Plasma DNA as a prognostic marker for stroke patients with negative neuroimaging within the first 24 hours of symptom onset. Resuscitation. 2006. 68(1): 71-78.

90. Lam N.Y.L, et al. Plasma cell-free DNA concentrations and stroke mortality and morbidity. // Abstracts for CNAPS IV: Fourth International Conference on Circulating Nucleic Acids in Plasma/Serum. 2005. P. 32.

91. Lekanne Deprez R.H., Fijnvandraat A.C., Ruijter J.M., Moorman A.F. Sensitivity and accuracy of quantitative real-time polymerase chain reaction using SYBR green I depends on cDNA synthesis conditions. // Annal. Biochem. 2002. 307: 63-69.

92. Lichtenstein A.V., Melkovyan H.S., Tomei L.D., Umansky S.R. Novel applications of polymerase chain reaction to urinary nucleic acid analysis. // Methods Mol Biol. 2006. 336:145-54.

93. Lichtenstein AV, Melkonyan HS, Tomei LD, Umansky SR. Circulating nucleic acids and apoptosis. // Ann N Y Acad Sci. 2001. 945:239-249.

94. Lichtenstein A.V., Potapova G.I. Genetics defects and markers of tumors growth. // Mol. Biol. 2003. 37: 181-193.

95. Lin E., Nguyen A., Russel R., Pollard J. Colony-stimulated factor 1 promotes progression of mammary tumors to malignancy. // J. Exp. Med. 2001. 193: 727-740.

96. Liu Y.Y., Chik K.W., Chiu R.W.K., et al. Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation. // Clin. Chem. 2002. 48: 421-7.

97. Liu X., Li P., Widlak P, Zou H., et al. The 40-kDa subunit of DNA fragmentation and chromatin condensation during apoptosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. 95: 8461-8466.

98. Lledo S.M., et al. Real time quantification in plasma of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) mRNA in patients with colorectal cancer. // Colorectal Dis. 2004. 6: 236-242.

99. Lo Y.M.D., et al. Molecular prognostication of nasopharyngeal carcinoma by quantitative analysis of circulating EBV DNA. // Cancer Res. 2000. 60: 68786881.

100. Lo Y.M.D., et al. Circulating EBV DNA in the serum of patients with gastric carcinoma. // Clin. Cancer Res. 2001. 7: 1856-1859.

101. Lo Y.M.D., et al. Plasma DNA as a prognostic marker in trauma patients. // Clin. Chem. 2000. 46: 319-323.

102. Lo Y.M.D, Corbetta N., Chamberlain P.F., et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. // Lancet. 1997. 350: 485-7.

103. Lo Y.M.D., Tsui N.B.Y., Chiu R.W.K., et al. Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal detection of fetal chromosomal aneuploidy. //Nat. Med. 2007. 13(2):218-223.

104. Mandel P., Metais P. Les Acides Nuleic Du Plasma Sanguin Chez L'Homme. // C. R. Acad Sci Paris. 1948. 142:241-243

105. Martins P.N., Mashreghi M.F., Reutzel-Selke A., et al. Quantification of donor-derived DNA in serum: a new approach for acute rejection diagnosis in a rat kidney transplantation model. // Transplant. Proc. 2005. 37: 87-8.

106. Miossec P. An update on the cytokine network in rheumatoid arthritis // Curr. Opin. Rheumatol. 2004. 16: 218-222.

107. Molina M.A., Gamboa E.M., Tello P.C., et al. Spontaneous inflammatory cytokine gene expression in normal human peripheral blood mononuclear cells. // Lymphat Res Biol. 2006. 4(l):34-40.

108. Muller A. J., Scherle P.A. Targeting the mechanism of tumoral immune tolerance with small-molecule inhibitors. // Nature Reviews. Cancer. 2006. 6: 613-625.

109. Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. //Exp. Cell Res. 2000 256: 12-28.

110. Nakazawa F., Kannemeier C., Shibamiya A., Song Y., Tsima В., et al. Extracellular RNA is a natural cofactor for the (auto-) activation of Factor VH-activating protease (FSAP). // Biochem J. 2005. 385: 831-838.

111. Napirei M., Gultekin A., Kloeckl Т., Moroy Т., Frosegard J., et al. Systemic lupus-erythematosus: deoxyribonuclease-1 in necrotic chromatin disposal. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2006. 38: 297-306.

112. Ng E.K., et al. Presence of filterable and nonfilterable mRNA in the plasma of cancer patients and healthy individuals. // Clin. Chem. 2002. 48: 1212-1217.

113. Ng E.K.O., Leung T.N., Tsui N.B.Y., et al. The concentration of circulating cortico-tropin releasing hormone mRNA in maternal plasma is increased in preeclampsia. // Clin. Chem. 2003. 49: 721-731.

114. Ng E.K.O., Tsui N.B.Y., Lau Т.К., et al. mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. 100: 4748-4753.

115. Nicola N. Guidebook of cytokines and their receptors. // Sambrook and Tooze. Oxford: Oxford Univ. Press. 1994. Pp 261.

116. Nicolini A, Carpi A, Rossi G. Cytokines in breast cancer. // Cytokine Growth Factor Rev. 2006. 17(5):325-37.

117. Ohm J., Carbone D., VEGF as a mediator of tumor-associated immunodeficiency. // Immunol. Res. 2001. 23:263-272.

118. O'Connel J., Bennet M., O'Sullivan G., et al. The Fas counterattak: cancer as a site of immune privillege. // Immunol. Today. 1999. 20: 46-52.

119. Palmer S., Wiegand A.P., Maldarelli F., et al. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. // J. Clin. Microbiol. 2003. 41:4531-4536.

120. Poon L.L.M., Leung T.N., Lau Т.К. Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma. // Clin. Chem. 2002. 48: 35-41.

121. Pornthanakasen W., et al. Human papillomavirus DNA in plasma of patients with cervical cancer. // BMC Cancer. 2001. 1:2.

122. Radonic A., Thulke S., Mackay IM, Landt O. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. Vol. 313. №4. P. 856-862.

123. Rainer Т., et al. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001. 945: 211-220.

124. Rainer Т., et al. Prognostic use of circulating plasma nucleic acid concentrations in patients with acute stroke. // Clin. Chem. 2003. 49: 562-569.

125. Rainer Т., et al. Comparison of circulating plasma (3-globin DNA and S-100 protein concentrations in patients with acute stroke. // Abstract Syllabus of the 3rd Mediterranean Conference of Emergency Medicine. 2005. P. 132.

126. Rainer Т.Н., Lam N.Y.L. Circulating nucleic acids and critical illness. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. 1075: 271-277.

127. Rieber M., et al. An "external" RNA removable from mammalian cells by mild proteolysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1974. 71: 4960-4964.

128. Rogers J.C., Boldt D., Kornfeld S., Skinner A., Valeri C.R. Excretion of deoxyribonucleic acid by limphocytes stimulated by phytohemagglutinin or antigen. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1972. 69: 1685-1689.

129. Scrivo R, Di Franco M, Spadaro A, Valesini G. // The immunology of rheumatoid arthritis. Ann N Y Acad Sci. 2007. 1108:312-22.

130. Seruga В., Zhang H., Bernstein L.J., Tannock I. F. Cytokines and their relationship to the symptoms and outcome of cancer. // Nat. Rev. Cancer. 2008. 8(ll):887-899.

131. Shaw J.-P., Kent K., Bird J., Fishback J., Froehler B. Modified deoxyoligonucleotides stable to exsonuclease degradation in serum. // Nucleic Acids Res. 1991. 19: 747-750.

132. Sheu В., Lin R., Lien H., et al. Predominant Th2/Tc2 polarity of tumor-infiltrated lymphocytes in human cervical cancer. // J. Immunol. 2001. 167: 2972-2978.

133. Shulte-Hermann R., et al. Role of active cell death (apoptosis) in multi-stage carcinogenesis. Toxicol. Lett. 1995. 82/83: 143-148.

134. Silva J.M., et al. Detection of epithelial messenger RNA in the plasma of breast cancer patients is associated with poor prognosis tumor characteristics. // Clin. Cancer Res. 2001 7: 2821-2825.

135. Silva J.M., et al. Detection of epithelial tumor RNA in the plasma of colon cancer patients is associated with advanced stages and circulating tumor cells. // Gut. 2002. 50: 530-534.

136. Sisco CI. Is RNA in serum bound to nucleprotein complexes? // Clin. Chem. 2001.47: 1744-5.

137. Schmittgen T.D., Zakrajsek B.A. Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2000. 46: 69-81.

138. Sorenson G.D., Pribish D.M., Valone F.H., Memoli V.A., Bzik D.J., et al. Soluble normal and mutated DNA sequences from single copy genes in human blood. Cancer Epidemiol. Biomarkers. Prev. 1994. 3: 67-71.

139. Sozzi G., Gonte D., Mariani L., Lo Vullo S., Roz L., et al. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients. // Cancer Res. 2001. 61: 4675-4678.

140. Street S., Trapani J., MacGregor D., Smyth M. Supression of lymphoma and epithelial malignancies effected by interferon gamma. // J. Exp. Med. 2002. 196: 129-134.

141. Stroun M, et al. The origin and mechanism of circulating DNA. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000. 906: 161-168.

142. Stroun M, Anker P, Maurice P, Lyautey J. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients. // Oncology. 1989. 46(5):318-22.

143. Stroun M., Lyautey J., Lederrey C., Olson-Sand A., Anker P. About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release. // Clin. Chem. Acta. 2001. 313: 139-142.

144. Tan E.M., Schur P.H., Carr R.I., Unkel H.G. DNA and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erithematosus. // J. Clin. Invest. 1966. 45: 1732-1740.

145. Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Rykova E. Yu., et al. Circulating nucleic acids in blood of healthy male and female donors. // Clin Chem. 2005 Jul;51(7): 1317-9.

146. Tamkovich SN., Cherepanova A.V., Kolesnikova E.V., et al. Circulating DNA and DNAse activity in human blood. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. 1075: 191-196.

147. Toi M., Taniguchi Т., Yamamoto Y., et al. Clinical significance of the determination of angiogenic factors. // Eur. J. Cancer. 1996. 32A: 2513-2519.

148. Tomasevic G., et al. The tumor suppressor p53 and its response gene p21WAFl/Cipl are not markers of neuronal death following transient global cerebral ischemia. //Neuroscience. 1999. 90: 781-792.

149. Tong Y.K., Lo Y.M. Diagnostic developments involving cell-free (circulating) nucleic acids. // Clin. Chem. Acta. 2006. 363: 187-196.

150. Tsui N.B., Chim S.S., Chiu R.W., Lau Т.К., Ng E.K., et al. Systematic micro-array based identification of placental mRNA in maternal plasma: towards noninvasive prenatal gene expression profiling. // J. Med. Genet. 2004.41:461-467.

151. Umansky S.R. Apoptotic process in the radiation-induced death of lymphocytes. In Apoptosis: The Molecular Basis of Cell Death. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1991. P. 193-208.

152. Vandesompele J., Preter K.De, Pattyn F, Poppe B. // Genome Biol. 2002. Vol. 3. №7.

153. Vasioukhin V., Anker P., Maurice P., Lyautey J., Lederrey C., et al. Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukemia. // Br. J. Heamatol. 1994. 86: 774-779.

154. Wieczorek A.J., et al. Diagnostic and prognostic value of RNA-proteolipid in sera of patients with malignant disorders following therapy: first clinical evaluation of novel tumor marker. // Cancer Res. 1987. 47:6407-6412.

155. Willey A.H., Kerr J.F.R., Currie A.R. The significance of apoptosis. // Int. Rev. Cytol. 1980. 68: 251-306.

156. Wong S.C., et al. Quantification of plasma beta-katenin mRNA in colorectal cancer and adenoma patients. // Clin. Cancer Res. 2004. 10: 1613-1617.

157. Wong T.S., Kwong D.L., Sham J.S., et al. Quantitative plasma hypermethylated DNA markers of undifferentiated nasopharyngeal carcinoma. // Clin. Cancer Res. 2004. 10, 2401-2406.

158. Wu T.L., Zhang D., Chia J.H., Tsao K.H., Sun C.F., et al. Cell-free DNA: measurement in various carcinomas and establishment of normal reference range. // Clin Chem. Acta. 2002. 321:77-87.

159. Yeh T.M., Chang H.C., Liang C.C., Wu J.J., Liu M.F. Deoxyribonuclease-inhibitory antibodies in systemic lupus erythematosus. // J. Biomed. Sci. 2003. 10: 544-551.

160. Yakubov L., Khaled Z., Zhang L.M., Truneh A., Vlassov V., et al. Oligodeoxynucleotides interact with recombinant CD4 at multiple sites. // J. Biol. Chem. 1993. 268: 18818-18823.

161. Yamamoto S., Yamamoto Т., Tokunaga T. The discovery of immunostimulatory DNA sequence. // Springer Semin. Immunopathol. 2000. 22: 11-19.

162. Yoshimura A. Chemokines and cancer. // Int. J. Cancer. 2006. 119: 20262029.

163. Xiang S., Fruehauf J., Li C.J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. // Nat. biotechnol. 2006. 24: 697-702.

164. Zheng M., Bocangel D., et al. Human interleukin-24 (MDA-7/IL-24) protein kills breast cancer cells via the IL-20 receptor and is antagonized by IL-10. // Cancer Immunol. Immunother. 2007. 56: 205-215.