Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Влияние некоторых неспецифических факторов трансплантации на жизнеспособность пересаженной ткани аденогипофиза (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

Титаров Дмитрий Леонидович

ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ТРАНСПЛАНТАЦИИ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ПЕРЕСАЖЕННОЙ ТКАНИ АДЕНОГИПОФИЗА

(экспериментальное исследование)

14.00.41 —трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре оперативной хирургии и клинической анатомии с курсами андрологии и трансплантологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация

Научно-исследовательский институт органов МЗ РФ

Смирнова Элионора Дмитриевна

Лысенко Анатолий Иванович

Готье Сергей Владимирович

Бабиченко Игорь Иванович

и искусственных

Защита состоится «_»_2004 года в_часов

на заседании диссертационного совета Д.212.203.09 в Российском Университете дружбы народов (117198, ГСП, ул. Миклухо-Маклая, д.6) С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского Университета дружбы народов (117198, ГСП, ул. Миклухо-Маклая, д.6)

Автореферат разослан «_»_

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

.2004 года

Э.Д.Смирнова

Актуальность проблемы

В связи с многогранным регулирующим влиянием, оказываемым гипофизом в организме, нарушение, в частности ослабление деятельности этой железы, отражается на течении многих физиологических реакций, что приводит к развитию различных патологических процессов. При гипофизарной недостаточности заместительная гормональная терапия не всегда в состоянии полностью возместить недостаточность функции желез внутренней секреции. Поэтому и в настоящее время велико внимание исследователей и клиницистов к пересадке гипофиза, которая может применяться наряду с медикаментозным лечением эн-докринопатий для восполнения утраченной гормональной функции (Т. Е. Гни-лорыбов, В. М. Казаченок, 1970; Хенкин В. Л., 1973; И.Д.Кирпатовский, 1998).

Известно несколько вариантов этой операции: пересадка целого органа с восстановлением питающих его сосудов (Н. А. Богораз, 1948; Г. Е. Гнилоры-бов, 1966, 1970; Хенкин В. М., 1973; И.Д.Кирпатовский, 1990); свободная пересадка тканевых фрагментов (Е.П.Володина, 1972; M.Matsuda с соавт., 1995; F.Obal с соавт., 1997) и пересадка культуры клеток (В.Н.Блюмкин с соавт., 1990; В.И.Шумаков с соавт., 1994; И.Д.Кирпатовский с соавт., 1998, 2003; З.С.Каитова, 1996,2003).

Важную роль в приживлении и длительном функционировании тканевых и клеточных трансплантатов играет место пересадки. Свободную пересадку ткани гипофиза целесообразно осуществлять в иммунологически привилегированные области: желудочки мозга (Falconi G. и Rossi G.L., 1964, Knigge К.М.,1980), под капсулу почки, в переднюю камеру глаза (Мартинович П. И., с соавт., 1974; Siperstein E.R., Greer MA, 1956; Goldberg R.C. и Knobil E., 1957; Funguist В., 1968), под белочную оболочку семенника (Кирпатовский И.Д., Нурманбетов Д.Н., Дендеберов Е.С., 1993, Лысенко А.И., Смирнова Э.Д., 1996; Aron M., с соавт., 1962, 1964,), где наблюдается их длительное переживание.

Существенное влияние на приживление и длительное функционирование как органного, так и свободного тканевого или клеточного трансплантата оказывает временная ишемия. В клинической практике для аллотрансплантации, как правило, используются органы и ткани от трупов, подвергшиеся повреждающему воздействию ишемии, которое продолжается и во время консервации. Поэтому для практических трансплантологов всегда остается острым вопрос о безопасных сроках забора трансплантата после прекращения кровообращения в донорском органе. Хорошо изучены безопасные сроки забора таких крупных жизненно важных органов, как сердце, почки, легкие, печень (В.И.Шумаков, Н.А.Онищенко, 1994). Однако проблема своевременного изъятия эндокринных органов, в частности, гипофиза и способность их тканей противостоять повреждающему воздействию временной ишемии освещена недостаточно. Единственное исследование, посвященное изучению влияния временной ишемии на ткань задней доли гипофиза, проведено на кафедре оперативной хирургии и клиниче-

0ОС- НАЦИОНАЛЬНА« »МСДИОГСКД

ской анатомии РУДН И.С.Зиминой (1988). В нем с помощью биохимического анализа и электронной микроскопии установлено, что максимальный срок ишемии, при котором клетки нейрогипофиза сохраняют свою структуру, составляет 6 часов.

В доступной нам литературе отсутствуют сведения о безопасных сроках забора и методах консервации аденогипофиза при его трансплантации.

Цель работы: изучить влияние места пересадки, различных сроков ишемии и методов консервации на жизнеспособность ткани аллогенного аденогипофиза при его трансплантации.

Задачи исследования

1. Изучить влияние места пересадки на жизнеспособность ткани аллогенного аденогипофиза при пересадке его под капсулу почки, в паренхиму семенника, под белочную оболочку семенника в различные сроки после трансплантации.

2. Изучить клеточный состав аллогенного аденогипофиза в различные сроки после его тканевой трансплантации под белочную оболочку семенника.

3. Изучить влияние различных сроков тепловой ишемии на жизнеспособность ткани аллогенного аденогипофиза при пересадке его под белочную оболочку семенника.

4. Изучить влияние консервации на жизнеспособность ткани аллогенного аденогипофиза при пересадке его под белочную оболочку семенника.

Научная новизна

• Показано длительное (до 13 месяцев) выживание тканевого трансплантата аденогипофиза при его пересадке в паравазальную клетчаточную щель под белочную оболочку семенника. Доказано преимущество этой модели трансплантации, дающей максимальную сохранность семенника.

• Впервые изучен клеточный состав аденогипофиза, пересаженного в парава-зальную клетчаточную щель под белочную оболочку семенника, и выявлено выживание различных типов клеток до 6 месяцев после трансплантации.

• Установлены максимально допустимые сроки ишемии для забора донорского аденогипофиза в качестве трансплантата: до 6 часов при немедленной пересадке и до 4 часов при гипотермической консервации и последующей его пересадке.

Практическая значимость Максимально допустимые сроки ишемии (4 и 6 часов) для забора аденоги-пофиза в качестве трансплантата, установленные в работе, могут быть использованы в клинической трансплантологии.

Минимальная травматизация мужской половой железы при тканевой субкап-сулярной пересадке гипофиза в паравазальную клетчаточную щель с использо-

ванием микрохирургической техники позволяет рекомендовать эту модель трансплантации гипофиза в клиническую практику.

Апробация работы

Основные разделы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)» (Москва, 2002), на конференции молодых ученых (Эндокринологический научный центр РАМН, Москва, 2002), на научно-практических конференциях кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии РУДН (Москва, 2001-2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 статьи в центральной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 146 страницах и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение собственных результатов исследования в 4 главах, общее заключение, выводы, практические рекомендации, указатель литературы. Содержит 57 рисунков и 10 таблиц. Библиография включает 88 отечественных и 125 зарубежных источников.

Содержание работы Материал и методы исследования

Эксперименты по пересадке аллогенного аденогипофиза выполнены на 384 нелинейных белых крысах-самцах в 4 сериях опытов. Общий объём исследова-

ний [Яеяр.'*делением :ериям представлен в таблице 1 .

_Таблица 1

№ Серия Кол-во животных

1 Пересадка аллогенного аденогипофиза крысы под капсулу почки, в паренхиму семенника и под белочную оболочку семенника. 72/72*

2 Пересадка аллогенного аденогипофиза крысы под белочную оболочку семенника для оценки клеточного состава в различные сроки после операции 20/20

3 Пересадка аллогенного аденогипофиза крысы под белочную оболочку семенника после тепловой ишемии 40/40

4 Пересадка аллогенного аденогипофиза крысы под белочную оболочку семенника после тепловой ишемии, гипотермической консервации и крио-консервации. 60/60

Итого 192/192

Всего. 384

*-донор/реципиент

Методы исследования 1. Хирургический эксперимент

Все операции проводили с использованием микрохирургической техники. Забор трансплантата аллогенного аденогипофиза

После вскрытия полости черепа удалялись большие полушария мозга с пересечением зрительных нервов. Рассекалась твердая мозговая оболочка на основании черепа по периметру гипофиза, последний удалялся и помещался в физиологический раствор в чашке Петри. Отсекалась заднюю долю гипофиза - нейро-гипофиз. Аденогипофиз разделялся на фрагменты размерами до 1 мм3 лезвием бритвы.

Пересадка аллогенного аденогипофиза под капсулу почки

Разрез кожи проводился параллельно позвоночнику слева от него между рёберной дугой и гребнем подвздошной кости длиной 1 см. Рассекалась кожа, подкожная клетчатка, мышцы спины. В рану выводилась левая почка. Рассекалась капсула почки на участке 0,2 см микрохирургическим скальпелем и глазным шпателем отслаивалась от паренхимы. Под капсулу помещался трансплантат аденогипофиза с помощью специально изготовленной тупой иглы и мандрена. На капсулу накладывался один шов нитью 7/0. Почка помещалась на место. Рана послойно ушивалась наглухо.

Пересадка аллогенного аденогипофиза в паренхиму семенника

Нижнесрединная лапаротомия. Семенник выводился в рану. Производился разрез белочной оболочки длиной 1 мм в бессосудистой зоне микрохирургическим скальпелем. В паренхиму семенника с помощью тупой иглы и мандрена вводились фрагменты аденогипофиза. На разрез белочной оболочки яичка накладывался один узловой шов атравматической иглой с нитью 7-0. Семенник погружался в брюшную полость. Разрез передней брюшной стенки ушивался послойно наглухо.

Пересадка аллогенного аденогипофиза под белочную оболочку семенника

Нижнесрединная лапаротомия. Семенник выводился в рану. Производился разрез белочной оболочки семенника в бессосудистой зоне микрохирургическим скальпелем длиной 1 мм. Создавался туннель под белочной оболочкой в парава-зальной клетчаточной щели над паренхимой семенника глазным микрохирургическим шпателем. В образованный туннель с помощью тупой иглы и мандрена вводились фрагменты аденогипофиза. На разрез белочной оболочки яичка накладывался один узловой шов с помощью атравматической иглы с нитью 7-0. Семенник погружался в брюшную полость. Разрез передней брюшной стенки ушивался послойно наглухо.

Тепловая ишемия аденогипофиза

Экспериментальное животное умерщвлялось с помощью передозировки эфирного наркоза и оставлялось в помещении с температурой воздуха не ниже

+20°С на срок, необходимый по условиям эксперимента (1,2,3,4,5,6,8 часов). Затем осуществлялся забор трансплантата. Гипотермическая консервация аденогипофиза

После забора, который проводился с соблюдением правил асептики и антисептики, трансплантат аллогенного аденогипофиза помещался в стерильные пени-циллиновые флакончики со стерильным раствором Евроколлинз, как часто употребляемым в трансплантологии для консервации органов, и закрывался стерильной пробкой. В этих флаконах материал сохранялся при температуре не выше +4°С в течение 24 ч до трансплантации. Криоконсервация аденогипофиза

Метод криоконсервации использовался для сохранения тканевых фрагментов аденогипофиза до операции и включал 3 этапа:

1. подготовка трансплантата к низкотемпературному хранению, с использованием криозащитного раствора, приготовленного на основе раствора Евро-коллинз с добавлением криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО), 0,5 М сахарозы и 2% альбумина;

2. непосредственно низкотемпературное хранение при -50°С в течение 10 суток;

3. отмывка трансплантата от криозащитного раствора перед пересадкой. 2. Морфологические методы

Во всех сериях экспериментов оценка жизнеспособности трансплантата ал-логенного аденогипофиза проводилась с помощью приготовления препаратов семенника с пересаженным гипофизом по стандартной методике и их гистологической окраски гематоксилин-эозином.

Во второй серии опытов клеточный состав трансплантата оценивался гистохимическим методом - окраской срезов семенника с пересаженным под белочную оболочку аллогенным аденогипофизом специфическими красителями:

• оранжевым G - для выявления ацидофильных аденоцитов, продуцирующих соматотропный гормон (СТТ);

• ШИК-реакция с тианином и альдегидфуксином - для выявления базофиль-ных клеток аденогипофиза, продуцирующих тиреотропный гормон (ТТГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), адренокортикотропный гормон (АКТГ);

• Эритрозином - для выявления лактотропоцитов - клеток, продуцирующих пролактин.

Результаты исследования

Влияние места пересадки на жизнеспособность аллогенного аденогипофиза после его тканевой трансплантации Для изучения влияния места пересадки на жизнеспособность аллогенного аденогипофиза крысы проводили его тканевую трансплантацию под капсулу почки, в паренхиму семенника и в паравазальную клетчаточную щель под белочной оболочкой семенника в различные сроки (3,7,10.14 суток, 1,3,5 месяцев) после операции (табл. 2). В группе экспериментов по пересадке аллогенного аденогипофиза под белочную оболочку семенника максимальный срок наблюдения составил 13 месяцев.

Таблица 2

Условия эксперимента Кол-во пересадок

под капсулу почки 21

в семенник в паренхиму 21

под белочную оболочку 30

Итого: 72

После пересадки аллогенного аденогипофиза под капсулу почки трансплантат в 16 из 21 случая оказался жизнеспособным. В 5 случаях трансплантат аллогенно-го аденогипофиза был замещен соединительной тканью: через 3 месяца в 2 из 3 опытов и через 5 месяцев во всех 3 опытах. Во всех 16 случаях, когда пересаженный аденогипофиз оказался жизнеспособным, при гистологическом исследовании трансплантат располагался сразу под капсулой почки и представлял скопление эпителиальных клеток: базофильных и ацидофильных, в виде трабе-кулярных структур, разделённых скудной стромой с большим количеством си-нусоидных органоспецифических капилляров. Такая картина наблюдалась преимущественно в периферических участках трансплантата. В его центральной части отмечалось замещение некротизированных участков соединительной тканью. Из этих данных следует, что при пересадке ткани аллогенного аденогипофиза под капсулу почки наблюдается различная морфологическая картина трансплантата в одни и те же сроки экспериментов - как его приживление, так и отторжение. При приживлении трансплантата во все сроки до 3 месяцев наблюдения строение его периферических участков сравнимо с интактным аденоги-пофизом. Однако в некоторых случаях к этому сроку и во всех экспериментах к 5 месяцам трансплантат обильно инфильтрируется лимфоцитами, ткань гибнет с формированием очагов склероза, сохраняются лишь отдельные трабекулы и рассеянные клетки.

При пересадке аденогипофиза как в паренхиму, так и под белочную оболочку семенника фрагменты тканевого трансплантата аллогенного аденогипофиза обнаружены во все сроки наблюдения во всех 51 случаях. При гистологическом исследовании на 3 сутки центральная часть трансплантата подвергается некрозу, а жизнеспособные клетки занимают его периферическую область. Репара-

тивные процессы протекают быстро: к 7 суткам некротические участки рассасываются и замещаются рыхлой соединительной тканью, а к 10 суткам — рубцовой. К 14 суткам на периферии трансплантата аденоциты формируют тяжи, которые оплетаются синусоидными кровеносными капиллярами, и трансплантат приобретает органоидную структуру, т.е. в нем к этому сроку завершаются все репаративные процессы. Через 1,3,5 и даже 13 месяцев (для пересадки под белочную оболочку семенника) гистологическая картина тканевых трансплантатов аденогипофиза оставалась аналогичной 14 суткам: жизнеспособные клетки в виде колонок аденоцитов, тесно соседствующих с синусоидными капиллярами, располагаются на периферии трансплантата, в то время как его центральная часть замещена соединительной тканью. Учитывая вышеизложенное, срок 14 суток выбран нами для выведения животных из эксперимента в других сериях опытов как прогностический показатель приживления ткани аденогипофиза.

Различная гистологическая картина наблюдалась только в ткани семенника. Так, при пересадке в паравазальную клетчаточную щель под белочной, оболочкой семенника в примыкающих к трансплантату извитых канальцах структура часто сохранена, в них активно протекает сперматогенез с образованием сперматозоидов, или изредка лишь в одном слое канальцев, непосредственно окружающих аденогипофиз, наблюдается картина повреждения сперматогенного эпителия, проявляющаяся запустеванием просвета канальцев или их склерозом. Однако это не оказывает влияния на хорошую сохранность структуры извитых канальцев в других отделах семенника. Совсем иная картина обнаруживается при пересадке в паренхиму семенника, когда наблюдается множественные повреждения извитых канальцев, как вокруг трансплантата, так и по ходу туннеля, созданного при его проведении в глубину семенника. Таким образом, при пересадке ткани аллогенного аденогипофиза, как в паренхиму, так и под белочную оболочку семенника наблюдается выживание трансплантатов во всех случаях во все сроки наблюдения (максимальный срок при пересадке под белочную оболочку семенника — 13 месяцев). Различным является степень воздействия на паренхиму семенника: минимальная ее травматизация при трансплантации в паравазальную клетчаточную щель под белочной оболочкой семенника, и более выраженное повреждение паренхимы семенника при пересадке в его глубину.

Оценка клеточного состава аллогенного аденогипофиза крысы, пересаженного под белочную оболочку семенника Вопрос о клеточном составе аллогенного аденогипофиза, пересаженного в различные области, исследовался многими авторами (В.В.Никитина, 1972; Е.П.Володина, 1968, 1970, 1972; П. Н. Мартинович с соавт., 1974; RM.May, 1935-1955; B.R.Settebrini, M.G.Gallardo, J.H.Tramezzani, 1991; T.K.Bera с соавт., 1994). Однако мнение о типах клеток аденогипофиза, выживших после пересадки в различные иммунологически привилегированные области, неоднозначно.

Как показали наши исследования, через 14 дней после пересадки наблюдается выживание соматотропоцитов (СТ) и хромофобных клеток во всех 5 случаях, лактотропоцитов (ЛТ) - в 2 случаях, а клеток с сине-красным окрашиванием, характерным для гонад отропоцитов (ГТ) - только в 1 случае из 5 (табл. 3). На 30-ые сутки после пересадки при гистохимическом исследовании были обнаружены соматотропоциты и хромофобы во всех трансплантатах, лактотропоци-ты — в 3, а в 1 случае из 5 - клетки с сине-фиолетовым окрашиванием, характерным для тиреотропоцитов (ТТ). Через 3 месяца наблюдается выживание соматотропоцитов и хромофобов во всех 5 случаях, а лактотропоцитов — только в 1 из 5. Через 6 месяцев в трансплантатах аденогипофиза были обнаружены соматотропоциты и хромофобы во всех 5 препаратах, тиреотропоциты, лактотропо-циты и клетки с красно-розовым окрашиванием, характерным для кортикотро-поцитов в — 3-х препаратах из 5.

Таблица 3

Срок забора материала после трансплантации Кол-во трансплантатов Выявленные клетки аденогипофиза

СТ ТТ кт хромофобы ЛТ ГТ

14 дней 5 5 - 5 2 1

30 дней 5 5 1 5 3 -

3 месяца 5 5 - 5 1 -

6 месяцев 5 5 3 3 5 3 -

Итого"" 20 20 4 3 20 9 1

Таким образом, выживание соматотропоцитов в аденогипофизе, пересаженном в семенник, наблюдается во всех случаях во все сроки наблюдения. Аналогичная картина отмечается в отношении хромофобных клеток, - они обнаружены во всех 20 трансплантатах, и, как известно, могут формировать камбиальный резерв. Остальные типы клеток аденогипофиза были выявлены не во всех препаратах и не во все сроки. Так, тиреотропоциты были обнаружены только через 1 и 6 месяцев, причем в одном и 3-х случаях соответственно. Кортикотропоци-ты удалось выявить только через 6 месяцев в 3-х из 5 препаратов трансплантата аденогипофиза. Гонадотропоциты были обнаружены в пересаженных аденоги-пофизах только в 1 случае через 14 дней после операции. Лактотропоциты выявлены во все сроки наблюдения в 9 трансплантатах аденогипофиза из 20. Появление кортикотропоцитов и выявление большего количества тиреотропоцитов и лактотропоцитов на более поздних сроках исследования (6 месяцев), по нашему мнению, связано с регенерацией их из клеток камбиального резерва, сформированного хромофобами.

Влияние тепловой ишемии на жизнеспособность аллогенного аденогипофиза после его тканевой трансплантации в семенник Через 14 суток после пересадки под белочную оболочку семенника аденогипофиза, ишемизированного в течение 1-8 часов, пересаженный аденогипофиз в 32 случаях из 40 опытов оказался жизнеспособным и был замещен соединительной тканью в 8 случаях: при 2-часовой ишемии - в 2 из 6 опытов, при 3-часовой - в 1 из 8 опытов, при 4-часовой - в 1 из 6, при 6-часовой - в 2 из 8 и

при 8-часовой - в 2 из 4 опытов (табл. 4). Во всех 32 случаях, когда пересаженный аденогипофиз оказался жизнеспособным, при гистологическом исследовании трансплантат был обнаружен сразу под белочной оболочкой и представлял скопление базофильных и ацидофильных эпителиальных клеток в виде трабе-кулярных структур или неупорядоченных комплексов, разделённых скудной стромой с большим количеством синусоидных органоспецифических капилляров. Такая картина наблюдалась преимущественно в периферических участках трансплантата, а в его центре отмечалось разрастание соединительной ткани. Несколько прилежащих к трансплантату извитых семенных канальцев были повреждены. Остальные извитые семенные канальцы были хорошо сохранены, содержали свыше 5 слоев эпителиальных клеток. Сперматогенез завершался в них образованием сперматозоидов.

Таблица4

Трансплантат аденогипофиза

Условия эксперимента Всего Обнаружен обнаружен

тепловая ишемия аденогипофиза 1 ч 4 4

тепловая ишемия аденогипофиза 2 ч 6 4 2

тепловая ишемия аденогипофиза 3 ч 8 7

тепловая ишемия аденогипофиза 4 ч 6 5 1

тепловая ишемия аденогипофиза 5 ч 4 4 -

тепловая ишемия аденогипофиза 6 ч 8 6 2

тепловая ишемия аденогипофиза 8 ч 4 2 2

Итого: 40 32 8

Из этих данных следует, что жизнеспособность пересаженного аллогенного аденогипофиза сохраняется даже после 8-часовой ишемии, хотя половика трансплантатов в этот срок погибает. С практической точки зрения, важным является тот факт, что подавляющее число трансплантатов выдерживает 6-часовую тепловую ишемию. Поэтому можно считать данный срок ишемии максимально допустимым периодом для забора донорского аденогипофиза в качестве трансплантата.

Влияниегипотермическойконсервации икриоконсервации на жизнеспособность аллогенного аденогипофиза после его тканевой трансплантации в семенник Через 14 суток после пересадки аденогипофиза, ишемизированного в течение 1 -8 часов и сохранявшегося до трансплантации в консервирующем растворе Ев-роколлинз в течение 24 часов при +4°С, из 40 опытов пересаженный аденогипофиз в 23 случаях оказался жизнеспособным. В 17 случаях трансплантат аллогенного аденогипофиза был замещен соединительной тканью: при 2-часовой ишемии - в 1 из 4 опытов, при 3-часовой - в 2 из 7, при 4-часовой - в 1 из 5, при 5-часовой - в 2 из 4, при 6-часовой - в 5 из 7 опытов и при 8-часовой - во всех 6

опытах (табл. 5). Во всех 23 случаях, когда пересаженный аденогипофиз оказался жизнеспособным, при гистологическом исследовании трансплантат располагался сразу под белочной оболочкой в виде колонок аденоцитов, соседствующих с синусоидными капиллярами на периферии трансплантата, и участков соединительной ткани его центре. В нескольких непосредственно прилежащих к трансплантату извитых семенных канальцах наблюдалось запустевание или повреждение с заполнением просвета некротическими массами. Остальная паренхима семенника была не изменена, а в семенных канальцах обнаруживались сперматозоиды.

Таблица 5

Трансплантат аденогипофиза

Условия эксперимента Всего Обнаружен Не обнаружен

тепловая ишемия 1 ч + гипотермическая консервация 24 ч 4 4 -

тепловая ишемия 2 ч + гипотермическая консервация 24 ч 4 3 1

тепловая ишемия 3 ч + гипотермическая консервация 24 ч 7 5 2

тепловая ишемия 4 ч + гипотермическая консервация 24 ч 4 3 1

тепловая ишемия 5 ч + гипотермическая консервация 24 ч 4 2 2

тепловая ишемия 6 ч + гипотермическая консервация 24 ч 7 2 5

тепловая ишемия 8 ч + гипотермическая консервация 24 ч 6 - 6

Итого' 36 19 17

Из этих данных следует, что ишемия до 4 часов и последующая 24-часовая консервация в растворе Евроколлинз при +4°С не оказывает выраженного повреждающего воздействия на ткань аденогипофиза, что проявляется сохранением структуры пересаженного аденогипофиза к 14 суткам после операции почти во всех опытах. Однако после 6 часов тепловой ишемии и гипотермической консервации подавляющее число трансплантатов оказались погибшими, а после 8 часов ишемии и консервации ни один трансплантат аденогипофиза не выжил. Поэтому можно считать 4 часа ишемии сроком, максимально допустимым для забора донорского аденогипофиза, в качестве трансплантата при планируемой в дальнейшем гипотермической консервации.

Через 14 суток после пересадки аллогенного аденогипофиза, ишемизированного в течение 3 или 6 часов и подвергнутого криоконсервации, ни в одном препарате не была обнаружена пересаженная ткань аденогипофиза (табл. 6). Во всех 20

случаях на месте трансплантата под белочной оболочкой семенника обнаружен соединительнотканный рубец.

Таблица 6

Условия эксперимента Трансплантат аденогипофиза

Всего Обнаружен Не обнаружен

интактный аденогипофиз + криоконсервация 5 - 5

аденогипофиз тепловая ишемия 3 ч + криоконсервация 5 - 5

аденогипофиз тепловая ишемия 6 ч + криоконсервация 5 - 5

аденогипофиз тепловая ишемия 3 ч + гипотермическая консервация 24 ч + криоконсервация 5 - 5

Итого- 20 - 20

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что предложенная схема криоконсервации не обеспечивает сохранность ткани аденогипо-физа при его трансплантации под белочную оболочку семенника. Дальнейшее изучение влияния криоконсервации на ткань аденогипофиза и разработка другой схемы криопротекции и низкотемпературного хранения, возможно, могут обеспечить сохранность и жизнеспособность ткани аденогипофиза.

ВЫВОДЫ

1. Пересадка аденогипофиза под белочную оболочку семенника, в паренхиму семенника, под капсулу почки подтвердила преимущество первой модели и привилегированность семенника как места пересадки.

2. Ткань аллогенного аденогипофиза сохраняет жизнеспособность при пересадке под белочную оболочку семенника до 13 месяцев (срок наблюдения).

3. В трансплантате аллогенного аденогипофиза, пересаженного под белочную оболочку семенника, через 6 месяцев после пересадки выживают соматотропо-циты, лактотропоциты и хромофобы. Появление на более поздних сроках кор-тикотропоцитов и тиреотропоцитов обусловлено, по-видимому, их дифферен-цировкой из клеток камбиального резерва, сформированного хромофобами.

4. Жизнеспособность ткани аденогипофиза при его трансплантации под белочную оболочку семенника зависит от срока тепловой ишемии. Максимально допустимым сроком тепловой ишемии можно считать 6 часов.

5. Длительные сроки ишемии и последующая консервация отчетливо влияют на выживаемость ткани аденогипофиза при его трансплантации под белочную оболочку семенника. Максимально допустимым сроком ишемии при гипотер-мической консервации после тепловой ишемии аденогипофиза можно считать 4 часа.

6. Применённая схема криоконсервации ткани аденогипофиза не обеспечивает

его выживаемость при трансплантации под белочную оболочку семенника.

Практические рекомендации.

1. Забор аденогипофиза в качестве трансплантата можно осуществлять в сроки ишемии до 6 часов для немедленной пересадки и до 4 часов для последующей гипотермической консервации в растворе Евроколлинз.

2. Минимальная травматизация паренхимы гонады при тканевой пересадке гипофиза в паравазальную клетчаточную щель под белочной оболочкой семенника с использованием микрохирургической техники позволяет рекомендовать эту модель трансплантации гипофиза в клиническую практику.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Влияние неспецифических факторов трансплантации на аллогенный адено-гипофиз при свободной пересадке в семенник крыс. Смирнова Э.Д., Лысенко А.И., Титаров Д.Л. //Матер. II Международной научно-практич. конф. «Здоровье и образование в XXI веке». М., 2001, С.118

2. Изучение клеточного состава аллогенного аденогипофиза при его тканевой пересадке в семенник крысы. Титаров Д.Л., Юшков П.В. //Сб. матер, клинич. конф. молодых ученых ФППО ММА им. И.М. Сеченова «Актуальные вопросы клинической медицины». М., 2002, С. 169-170

3. Оценка клеточного состава аллогенного аденогипофиза при тканевой пересадке в семенник крысы. Титаров Д.Л., Юшков П.В. //Матер. III Международной научно-практ. конф. «Здоровье и образование в XXI веке». М., 2002, С. 393

4. Клеточный состав аллогенного аденогипофиза, пересаженного в семенник крысы. Титаров Д.Л., Юшков П.В. //Сб. матер, научн. конф. «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)» М., 2002, С. 272

5. Морфологическая оценка жизнеспособности ишемизированной и консервированной ткани, аллогенного аденогипофиза, пересаженной в семенник. Лысенко А.И., Смирнова Э.Д., Титаров Д Л., Соловьева НА//Вестник трансплантологии и искусственных органов.-2002.- № 4,С. 33-35

6. Тканевая трансплантация аденогипофиза при воздействии на него ишемии, гипотермической консервации и криоконсервации. Смирнова Э.Д., Титаров Д.Л., Кирпатовский В.И. //Сб. матер, научн. конф. «Актуальные проблемы прикладной анатомии, оперативной и клинической хирургии». С-Пб., 2004.С. 139-141

7. Влияние ишемии, гипотермической консервации и криоконсервации на тканевой трансплантат аденогипофиза. Титаров Д.Л., Смирнова ЭД//Вестник РГМУ, М.-.ГОУ ВПО РГМУ.-2004.-№8(39),С231-233

Тита ров Дмитрий Леонидович (Россия) Влияние некоторых неспецифических факторов трансплантации на жизнеспособность пересаженной ткани аденогипофиза (экспериментальное исследование)

Диссертация посвящена изучению влияния места пересадки, временной тепловой ишемии и различных видов консервации на жизнеспособность тканевого трансплантата аденогипофиза крыс, а также изучению его клеточного состава при пересадке под белочную оболочку семенника. Эксперименты выполнены на 384 нелинейных животных.

На основании результатов собственных исследований показано преимущество модели пересадки тканевых фрагментов аденогипофиза в паравазальную клетчаточную щель под белочной оболочкой семенника, где наблюдается длительное (до 13 месяцев) выживание трансплантата.

В трансплантате аллогенного аденогипофиза, пересаженного под белочную оболочку семенника, на всех сроках до 6 месяцев после пересадки обнаруживаются соматотропоциты, хромофобы и лактотропоциты. Установлено, что жизнеспособность ткани аденогипофиза при его трансплантации под белочную оболочку семенника зависит от срока тепловой ишемии. Максимально допустимым сроком тепловой ишемии можно считать 6 часов. Длительные сроки ишемии и последующая консервация отчетливо влияют на выживаемость ткани адено-гипофиза при его трансплантации под белочную оболочку семенника. Максимально допустимым сроком ишемии при гипотермической консервации после тепловой ишемии аденоги-пофиза можно считать 4 часа. Применённая схема криоконсервации ткани аденогипофиза не обеспечивает его выживаемость при трансплантации под белочную оболочку семенника.

Titarov Dmitry L. (Russia) Evaluation of several nonspecific factors influenced the survival of adenohypophysis tissue in transplantation.

The dissertation studies the influence of the factors like: site of grafting, temporary ischemia and different conservation techniques on the survivability of tissue transplant from rat's adenohypophysis inserted under tunica albuginea of testicle and assesses the composition of ceils in the transplant. Experiments were driven on 384 nonlineal rats.

The data confirm the preference of technique provided the grafting of adenohypophysis tissue in paravasal cellular fissure under tunica albuginea of testicle. The technique ensures long-term survival ofthe tissue (up to 13 months).

The transplant of allogenic adenohypophysis grafted under tunica albuginea of testicle contains somatotropocytes, chromophobes and lactotropocytes within 6 months. It was shown that the heat ischemia noticeably affects the survivability of adenohypophysis tissue in transplantation. Maximum period of heat ischemia withstood may not exceed 4 hours. No scheme of cryoconservation ensures the survival of the transplant when grafted under tunica albuginea of testicle.

29 08

Подписано в печать^ ОФормат60х84/16. Тираж '{00 экз. Усл. печ. л. . Заказ /О9у

Типография Издательства РУДН 117923, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д. 3

Актуальность проблемы

В связи с многогранным регулирующим влиянием, оказываемым гипофизом в организме, нарушение, в частности, ослабление деятельности этой железы, отражается на течении многих физиологических реакций, что приводит к развитию различных патологических процессов. При гипофизарной недостаточности заместительная гормональная терапия не всегда в состоянии полностью возместить недостаточность функции этой железы внутренней секреции. В качестве метода, который применяется наряду с медикаментозным лечением эндокринопатий, для восполнения утраченной гормональной функции может быть использована аллотрансплантация гипофиза. Поэтому внимание к пересадке гипофиза исследователей теоретических и клинических медицинских дисциплин очень велико (Гнилорыбов Т. Е. и Казаченок В. М., 1970; Хенкин В. Л., 1973; Казаченок В. М., 1974, Кирпатовский И.Д., 1998). Известно несколько вариантов этой операции: пересадка целого органа с восстановлением питающих его сосудов; свободная пересадка тканевых фрагментов и пересадка культуры клеток (Богораз Н. А., 1938, 1948; Гнилорыбов Г. Е., 1956-1966, 1970; Хенкин В. М., 1973; Казаченок В. И., 1973, 1974; З.С.Каитова, 1996, 2003; Кирпатовский И.Д., 1996, 1998). Существенную роль в приживлении и длительном функционировании тканевых и клеточных трансплантатов играет место пересадки. Свободную пересадку ткани гипофиза целесообразно осуществлять в иммунологически привилегированные области: желудочки мозга (Falconi G. и Rossi G.L., 1964, Knigge К.М.,1980, Tulipán N.B. с соавт., 1985), под капсулу почки, в переднюю камеру глаза (Siperstein E.R., Greer М.А., 1956; Goldberg R.C. и Knobil E., 1957; Funguist В.,1968; Мартинович П. И., с соавт., 1974), под белочную оболочку семенника (Кирпатовский И.Д.,

Нурманбетов Д.Н., Дендеберов Е.С., 1993; Лысенко А.И., Смирнова Э.Д., 1996; Aron М. с соавт., 1962, 1964), где наблюдается их длительное переживание.

Мнения авторов о функции таких трансплантатов существенно расходятся. Одними было показано, что такой аденогипофиз секретирует все гормоны (Мартинович П. Н. и др., 1974) или некоторые из них: тиреотропный (Martini L. с соавт., 1959), адренокортикотропный, соматотропный (Cheng С.Р. с соавт., 1949; Goldberg R.C. и Knobil Е., 1957), хотя и на более низком уровне, чем интактный гипофиз. По мнению Goldberg R.C. и Knobil Е. (1957), Мартинович П. Н.5 Павич Д., Живкович Н. (1974), аллотрансплантат аденогипофиза в передней камере глаза может секретировать также ФСГ и ЛГ, но большинство исследователей не придерживается этого взгляда.

В связи с практикой пересадки органов и тканей от трупа, в том числе и эндокринных желез, всегда требуется четкий ответ о жизнеспособности трансплантата. После забора органа у донора его обычно сохраняют в консервирующем растворе. В связи с этим важное значение имеет вопрос о максимально допустимых безопасных сроках забора гипофиза от трупа и способах его сохранения до пересадки. Имеются лишь единичные работы, посвященные этому вопросу. Так на кафедре оперативной хирургии и клинической анатомии РУДН изучалось состояние нейрогипофиза при тепловой ишемии в различные сроки с использованием метода электронной микроскопии (Зимина И.С., 1988). Других работ по этой проблеме в доступной литературе нами не обнаружено.

Неоднозначность и противоречивость данных о клеточном составе тканевых трансплантатов аденогипофиза, а так же отсутствие в литературе сведения о безопасных сроках забора гипофиза от трупа и его консервации различными методами с целью дальнейшей трансплантации, подтвержденных в прямых опытах его пересадки, определило цель и задачи данного исследования.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение влияния места пересадки, различных сроков ишемии и методов консервации на жизнеспособность ткани аллогенного аденогипофиза при его трансплантации.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние места пересадки на жизнеспособность ткани аллогенного аденогипофиза при пересадке его под капсулу почки, в паренхиму семенника, под белочную оболочку семенника в различные сроки после трансплантации.

2. Изучить клеточный состав аллогенного аденогипофиза в различные сроки после его тканевой трансплантации под белочную оболочку семенника.

3. Изучить влияние различных сроков тепловой ишемии на жизнеспособность ткани аллогенного аденогипофиза при пересадке его под белочную оболочку семенника.

4. Изучить влияние консервации на жизнеспособность ткани аллогенного аденогипофиза при пересадке его под белочную оболочку семенника.

Научная новизна

• Показано длительное (до 13 месяцев) выживание тканевого трансплантата аденогипофиза при его пересадке в паравазальную клетчаточную щель под белочную оболочку семенника. Доказано преимущество этой модели трансплантации, дающей максимальную сохранность семенника.

• Впервые изучен клеточный состав аденогипофиза, пересаженного в паравазальную клетчаточную щель под белочную оболочку семенника, и выявлено выживание различных типов клеток до 6 месяцев после трансплантации.

• Установлены максимально допустимые сроки ишемии для забора донорского аденогипофиза в качестве трансплантата: до 6 часов при немедленной пересадке и до 4 часов при гипотермической консервации и последующей его пересадке. Практическая значимость.

Максимально допустимые сроки ишемии (4 и 6 часов) для забора аденогипофиза в качестве трансплантата, установленные в работе, могут быть использованы в клинической трансплантологии.

Минимальная травматизация семенника при тканевой субкапсулярной пересадке гипофиза в паравазальную клетчаточную щель с использованием микрохирургической техники позволяет рекомендовать эту модель трансплантации гипофиза в клиническую практику.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены:

1. На II Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2001 г.

2. На клинической конференции молодых ученых ФППО ММА им. И.М. Сеченова «Актуальные вопросы клинической медицины», Москва, 2002 г.

3. На научно-практической конференции «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)», Москва, 2002 г.

4. На конференции молодых ученых, Эндокринологический научный центр РАМН, 2002 г.

5. На научно-практических конференциях кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии РУДН в 2001-2004 гг.

выводы

1. Пересадка аденогипофиза под белочную оболочку семенника, в паренхиму семенника, под капсулу почки подтвердила преимущество первой модели и привилегированность семенника как места пересадки.

2. Ткань аллогенного аденогипофиза сохраняет жизнеспособность при пересадке под белочную оболочку семенника до 13 месяцев (срок наблюдения).

3. В трансплантате аллогенного аденогипофиза, пересаженного под белочную оболочку семенника, через 6 месяцев после пересадки выживают соматотропоциты, лактотропоциты и хромофобы. Появление на более поздних сроках кортикотропоцитов и тиреотропоцитов, по-видимому, обусловлено их дифференцировкой из клеток камбиального резерва, сформированного хромофобами.

4. Жизнеспособность ткани аденогипофиза при его трансплантации под белочную оболочку семенника зависит от срока тепловой ишемии. Максимально допустимым сроком тепловой ишемии можно считать 6 часов.

5. Длительные сроки ишемии и последующая консервация отчетливо влияют на выживаемость ткани аденогипофиза при его трансплантации под белочную оболочку семенника. При гипотермической консервации после тепловой ишемии аденогипофиза максимально допустимым сроком ишемии можно считать 4 часа.

6. Применённая схема криоконсервации ткани аденогипофиза не обеспечивает его выживаемость при трансплантации под белочную оболочку семенника.

Практические рекомендации.

1. Забор аденогипофиза в качестве трансплантата можно осуществлять в сроки ишемии до 6 часов для немедленной пересадки и до 4 часов для последующей гипотермической консервации в растворе Евроколлинз.

2. Минимальная травматизация паренхимы гонады при тканевой пересадке гипофиза в паравазальную клетчаточную щель под белочной оболочкой семенника с использованием микрохирургической техники позволяет рекомендовать эту модель трансплантации гипофиза в клиническую практику.