Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Влияние морадреналина на мембрану эпителиальных клеток слизистой оболочки тонкой кишки и его возрастные особенности

шчио - исследовательский институт геро^толоп;;-

ШИСТЕРСТВЙ- ЗДРАВООХР.ШсНИЯ УКРАИНЫ

на правах рукописи

ПРОШЧЕНКО АЛЕКСАНДР ЕВГЕНЬЕВИЧ )

ВЛИЯНИЕ НОРЙДРЕНШНЙ НА.. МЕМБРАНУ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОНКОЙ ' кши ' и его возрастные; особенкости

14,00.1? - нормальная физиология

• / 1

А В 'Т О Р ЕУ0 £ Р Й Т диссертации на соискание * дченой степени кандидата биологических наук

N

Л

Киев 1992

Работа внполнена в Запоровскои медицинском институте

Научнне руководители: доктор недвд^яских наук, Йкадеиик (Ш ,9краины. профессор В.В.Фролькис доктор медицинских наук, профессор 3,И. Сливко ' - -ч Официальные оппонент: доктор иедицинских наук ■ - Закостьян В. П.

доктор медицинских наук " Наливайко Д.Г.

Вйднцав организация: Донецкий медицинский институт'

Завита состоится * ("^199 г, в часов_на заседании специализированного совета Д 001.28.01, при Украинском Институт! геронтологии ИЗ Украини по адресу: 254114, Киев - 114, ул. Вша-городская, 67, ' . >

С диссертацией можно ознаксииться в библиотеке Украинской Института геронтологии -КЗ Нкраины. ,, ,

автореферат разослан 199 г„ Учений секрета!

специализированного совета - ' •

кандидат Биологических наук . - Р.И. Потапенко

ОБЩПД ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Вегетативная нервная система играет основной роль в регуляции процессов секреции и всасывания в кишечнике. Физиологические исследования, проведенные на различных объектах, показали, что парасимпатические нейроны вегетативной нервной системы стимулируют секреции кишечного сока, а симпатические - процессы всасывания, йксоны симпатических адренергичес-ких нейронов ооразупт многочисленные синапсы в непосредственной близости от клеток слизистой оболочки тонкой кишки (. Cooke Н.З.. liJbÜ; Keast, 3.R.. Furness 3. 8.. Costa M., 1984 ). Установлено, что норадреналин тормозит кишечную секреции и в то яе время усиливает всасывание воды и растворенных в ней веществ из полости кишки (. Diet: J.. Field M.. 1973; Field M., 1971; Гончаревская Û.fl.. Moнии Ю.Г.. 1987; Загороднева A. Г.. 1983: Фролькис fi.В., 19H1 ). Однако, до сих пор остается открытым вопрос о клеточных механизмах, опосредующих влияние норадреналина на транспорт веществ в слизистой оболочке тонкой киики. Системы трансмембранного переноса веществ в эпителиоцитах тонкой кивки сложны и многообразны. Эксперименты, проведенные до настоящего времени, не содераат однозначных указаний на то, с какими из этих систем связано действие норадреналина нэ процессы всасывания в слизистой оболочке тонкой кишки ( НэвПп М.,1989 ). Меяду те«, исследование этой проблемы представляется весьма ваяным для понимания сущности управления яизненно вазными транспортными процессами в тонкой кишке, качение такого исследования обусловлено также тем обстоятельством, что в последнее время адренокиметики успешно применяются в клинической практике для лечения нарушений процессов всасывания в кишечнике iGoff 3.S., 1984: Fedorak R.N., Field M., Chang E.B., 1985 ).

На примере деятельности различных органов и систем.организма поквгано. что регулирующее влиянио адренергических нейронов претерпевае-r определенные изменения в процессе старения I Турае-ва H.«.. 197S; Фролькис И.В.. 1979; Фролькис В.В., 1975. 1981, ■ 1988, 1989: Фролькис В.В.. Мурадян Х.К., 1988 ). Эти изменения отражают как понияение активности симпатической нервной системы при старении, так и адаптивные процесса в организме. Изучение возрастных особенностей адренергических влияний на клетки кишечного эпителия мозет представлять интерес как в плане творетичес- ^ кой геронтологии, так и с точки зрения оооснования особенностей применения адреномиметиков для лечения патологий кишечника у лиц пояилого возраста.

При исследовании клеточных механизмов действия норадренали-

на на эпителиоциты слизистой оболочки тонкой кишки ваяное значение ксвет икеть ыикрозлектродная техника. Применение внутриклеточных микроэлектродов дает возможность измерять мембранный потенциал эпителиальных клеток,который является важным интег-радьнин показателен состояния плазматической мембраны. Анализ изменений иембранного потенциала под влиянием норадреналина позволяет судить о процессах активного и пассивного трансмембранного переноса ионов, которые ииевт важное значение для выполнения транспортной функции эпителиальными клетками слизистой оболочки тонкой кишки.

Цель к задачи исследования. Цельв настоящей работы явилось изучение влияния норадреналина на мембрану зпителиоцитов слизистой оболочки тонкой кивки. Конкретные задачи работы заклвчались в следуЕцем.

1. Выяснение характера изменений мембранного потенциала зпителиоцитов в условиях воздействия норадреналина.

2. Установление типа адренорвцепторов, посредством которых реализуется влияние норадреналина на неубранный потенциал зпителиоцитов .

3. Исследование изменения процессов пассивного и активного трансыекоракного ионного транспорта, лекащих в основе действия норадреналина на кенсраннкй потенциал зпителиоцитов

4. Изучение зависимости действия норадреналина на мембрану зпкгелгшцитов от процессов биосинтеза белка в клетке.

5. Выяснение особенностей влияния норадреналина на мембранная потенциал зпителиоцитов тонкой кивки при старении.

Цадчяаа нзвкзна. Е работе впервие показано, что норадрека-лин оказывает влияние на кеибранный потенциал зпителиоцитов слизистой оболочки тонкой кипки теплокровного гизотного. Чбнаруаены ососзнности влияния норадреналина на потенциал Сазолатеральной и апикальной кеибрани эпителиальных клеток.

С покоцьо специфических адрено&лскаторов определен подтип адрекорецаптороз, посредством ч:оторкх реализуется действие норадреналина на кеыораннкй потенциал зпителиоцитов.

Выявлены изкзкекм проницаемости апикальной нембранк зпителиоцитов для коков натрия и хлора, возникавшие в результате воздействия корадрвяаяика. Показано, что действие норадреналина на кемораника пстскц-иал связано с влканиек на Ка/Н обменный неха-ккза, локализованной о апнкальиой аеайраке.

Впервые г.о.газано действие норадреналина на злектрогеякий

активный транспорт ионов натрия и калия в оазолатеральной мембране эпителиоцитов. Данные об этом полу.эны путем применения двух различных методик: исследования активности мембранной йа.К - йТФазы биохимическим методом и при помощи использования специфического ингипитора натрий-калиевого насоса оуабаина.

Обнаружено, что влияние норадреналина на моморанный потон-циал эпителиоцитов слизистой оболочки тонкой кивки реализуется плагодаря усилении биосинтеза белка в цитоплазме клеток.

Впервые изучены особенности действия норадреналина на вемб-ранный потенциал эпителиальных клеток слизистой оболочки тонкой кишки при старении. Показано возраст-зависимов увеличение активности натрий-калиевой ДТФаз., эпителиоцитов, вызываемое норадре-налинок. Проведено сопоставление влияния норадреналина на зпиге-лиоциты слизистой оболочки взрослых и старых животных. Обнаружено, что старение клеток эпителия тонкой кияки сопровождается увеличением их чувствительности к норадреналину, увеличением гиперполяризуюцего аффекта норадреналина и сужением диапазона действующих его концентраций. Высказано предположение об адаптационном характере возрастных осооенностей влияния норадреналина на слизистую ооолочку тонкой киики.

Теоретическое и практическое зиачепма работа. Полученные экспериментальные данные спосооствувт раскрытии клеточных паха-низков регуляторного влияния норадреналина на транспортные процессы в эпителии слизистой оболочки тонкой кивки. На основании проведенных исследований можно сделать заключение о том, что в основе физиологического влияния норадреналина на всасывание веществ в тонком кишечнике лежит его действие на мембрану эпителиоцитов слизистой оболочки тонной кивки, приводящее к изменения ионной проницаемости и активного транспорта ионов и зависяжее от процессов клеточного метаболизма. ибнаруяенные возрастные изменения при действии норадреналина на эпнтелиоциты носят, по видимому, адаптационный характер и указывает на необходимость учитывать возрастной фактор при анализе процессов всасывания и секреции в кишечнике, что вйжно при использовании адренергичэс-ких средств для лечения нарушений всасывания и секреции в тонкой киике.

Основные положения, которые овносятся на защита.Норадрена-лин в физиологических концентрациях вызывает изменение мембранного потенциала эпителиоцитов слизистой оболочки тонкой юшки крысы. В условиях действия норадреналина наблвдаатся гиперпола-

ризация базолатеральной мембраны эпителиальных клеток. Потенциал апикальной мембраны не обнаруаивает существенных изменений. Ги-перполяризувций эффект норадреналина зависит от его дозы.

Влияние норадреналина на потенциал базолатеральной мембраны зпителиоцитов происходит в результате преимущественной активации альфа 2 - адренорвцвпторов, о чем свидетельствуют результаты опытов с применением ряда адреноолокаторов.

Изменение мембранного потенциала зпителиоцитов в условиях воздействия норадреналина связано с влиянием последнего на электронейтральный транспорт ионов натрия и хлора из полости кишки в цитоплазму эпителиальных клеток. Основным мембранным механизмы, при помощи которого происходит усиление поступления ионов натрия внутрь клеток в этих условиях, является Иа/Н обмен.

В условиях действия норадреналина наблюдается усиление активного электрогенного транспорта ионов натрия и калия через ба-золатеральнув мембрану зпителиоцитов. Предполагается, что влияние норадреналина на мембранный потенциал зпителиоцитов реализуется при участии внутриклеточных регуляторов - инверторов, способных активировать Ыа,К - йТФазу, обеспечивая ге-ном-мексранное сопряЕекке в клетка. Повышение активности злект-рогенного натрий-калиевого насоса в базолатеральной мембране проявляется в ее гиперполяризации, которая возникает под влиянием норадреналина.

Действие норадреналина на мембранный потенциал зпителиоцитов опосредуется путем-усиления биосинтеза белка. Оно становится невозиоЕнык в условиях применения блокаторов белкового синтеза.

9 старых животных повивается чувствительность плазматической мембраны зпителиоцитов к норадреналину, интенсивность ее реакции на норадреналин. Влияние норадреналина приводит т?кае к более значительному, по сравнении со взрослыми еивотными, увеличении активности Иа.К - АТОазы. Наряду с этим происходит сузение диапазона действуицих концентраций норадреналина. Обнаруженные возрастные изменения действия норадреналина носят, по видимому, адаптационный характер.

йпробацад работа. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Основные полокения и отдельные фрагменты диссертационной работк Выли вынесены на оосугдение Всеггазной конференции по секреции пищеварительных хелез в норме и патологии ( Андижан, 198В), 13-го сьезда Украинского физиологического общества ( Харьков, 1990 ), 4-го съезда фармакологов Украинской ССР ( Харьков, 1930 )

и заседания Запорожского отделения физиологического общества.

Обьси и структура диссертации. Диссертация изложена на ИЗ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения полученных экспериментальных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включавшего ¿81 источник. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 8 таблицами.

МЙТЕРИПЯН И ИЕТОДИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проведены на взрослых I 5-8 мес. ) и старых ( 26-28 мес.) белых крысах линия Вистар.содеряавпихся на стандартном пищевом рационе. Исследование мембранного потенциала зпителиоцитов производили на изолированных отрезках тонкой кинки in vitro. За сутки до опыта животных лишали пищи, не ограничивая доступ к воде. Под этаминал-натриевым наркозом ( 40 мг на кг массы ) вскрывали оршнув полость, иссекали отрезок начальной части тощей кишки длиной 5 см и выворачивали его слизистой оболочкой наруву. Приготовленный таким способом вывернутый мешочек закрепляли на стеклянной трубочке, диаметр которой соответствовал просвету кишки t Barry ft.J.С., Eggenton J., 1972 ). Измерение мембранного потенциала зпителиоцитов тощей кишки производили посредством внутриклеточных стеклянных микроэлектродов. Использовались микроэлектроды с сопротивлением не менее 10 ИОм и собственным потенциалом не более 5 мВ. Погружение микроэлвктрода в слизистую ооолочку кишки осуществляли вертикально, посредством микроманипулятора ИПМ - 2 с паговой подачей ( величина вага 5 мкм.).

О проколе кончиком микроэлектрода мембраны эпителиальной клетки судили по общепринятым критериям: скачкообразному появлению отрицательного потенциала при введении микроэлвктрода в слизистую ооолочку: увеличению электрического сопротивления измерительной цепи за счет входного сопротивления плазматической мембраны клетки; скачкообразному возвращении потенциала к исходному уровню в момент выведения микроэлектрода и отсутствии изменения сопротивления его кончика после выведения I Ukada V., et. al.. 1975: Henin S.. Saith H.H.. 1976; Dinno H.A.. Huane К. C.. 1377 ). Общая продолжительность отдельного опыта не превышала одного часа. В ходе работы изучали изменение мембранного потенциала зпителиоцитов в условиях действия норадреналина и ряда других веществ, которые добавляли к раствора, омывающему серозную и мукознуга оболочку кишки.

О помощью биохимической методики измеряли активность На/К

- а -

й'ГОази в слизистой оболочке тонкой кишки (Потапенко Р.И..1У77). Два отрезка тощей кишки инкубировали в течение ¿0 минут при температуре 37'С - первый в физиологическом растворе, второй в физиологическом растворе с добавлением исследуемых веществ. После инкубации соскабливали верхний слой слизистой ооолочки. который гомогенизировали в буфере следукщего состава I ммоль/л г. трис HCl - 10, дитиотрейтон - 7, фенилмвтилсульфонилфлуорид - Ü, 1, pH 7,5. Концентрацию белка определяли по методу Лоури. Об Н'ГФаз-ной активности судили по накоплению неорганического фосфата Pi. Активность На,К -АТФази определяли как разность между общей ак-тивностьп и активносты Mg -ДТФазы и выражали нмоль Pi/мг.белка мин.

Эксперимента проведены на 326 животных. Полученные данные обработаны с помощьп методов математической статистики. Вычисляли средние значения X, стандартные ошибки S, асимметрию А, эксцесс Е. Для оценки достоверности результатов использовали непараметрические критерии Ьан-дер-Вердена . и Колмогорова-Смирнова. Сравнение полученных результатов для взрослых и старых животных проводили при помощи дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние норадреналина на мембранный потенциал эпителиоцитов слизистой оболочки тонкой ки«ки.Изучении влияния норадреналина на мембрану эпителиоцитов предшествовали контрольные серии опытов, в задачу которых входило определение исходной величины потенциала апикальной и базолатеральной мембраны. Отрезки тонкой кивки помечали в физиологический раствор и производили измерение мембранного потенциала, вводя микрозлектрод последовательно в различные участки слизистой оболочки.

Потенциал апикальной мембраны эпителиоцитов тонкой кишки равен в средне* 10,8 ± 0,3 мВ ( п = 228 ), базолатеральной мембраны 11,6 ± 0,3 мЬ ( п = 264 ). Полученная исходная величина мембранного потенциала близка к соответствующим значениям более ранних исследований, проведенных в условиях аналогичной методики l Barry RJ.C., Eggenton 3.. 1973 ).

Исследование распределений эпителиоцитов по величине их мембранного потенциала показало, что они существенно отличается от закона нормального распределения и характеризуются правосторонней асимметрией и отрицательным эксцессом.

При изучении изменений мембранного потенциала в условиях воздействия норадреналина, последний добавляли к физиологическо-

му раствору, омывающему как серозную, так и мукознуп оболочку кивки. В различных опытах применяли концентрации норадреналина от 10-7 моль/л до 10-4 моль/л.

Результаты проведенных опытов характеризуют мембранный потенциал эпителиоцитов слизистой оболочки тонкой киики в исходном состоянии и в условиях воздействия норадреналина ( таблица 1

Таблица 1.

Величина потенциала апикальной и базолатераяьной мембран эпителиоцитов слизистой оболочки тонкой кшки в условиях действия норадреналина.

Обьект исследования Мембранный потенциал эпителиоцитов в исходном состоянии и при действии норадреналина в разных концентрациях

Исходное состояние 1 10-7 моль/л!5 10-7 моль/л 1 1 1 1 1 10-6 коль/л!10-5 моль/л110-4 иоль/л

Базолате- ральная мембрана 11.6+0.3мВ п = ¿64 11.9+0.3 мВ!12.6+0.3 мВ п = 226! п = 136 [ 2.5 г Ш 8.6 7. 1 13.6+0,4 нВ; 13.8+0.3 мЭМ4.3+0.4 ыВ п = 1Эб : п = 144 : п = 128 [ 17 я : Е 20 г ] [ 23 г ) > »

Йпшальная мембрана 10.8+0,ЗмВ п = 223 —. ' 1 1 11,0+0.4 *В.'10.9+0.3 нВ!И. 1+0.5 мВ п = 152 : п- 265 : п = 111

□-выраженное в процентах относительное увеличение мембранного потенциала.Р <0,05 Достаточно низкий порог действия норадреналина и зависимость эго эффекта от дозы свидельствувт о физиологическом значении данного явления. Существенное значение имеет тот факт, что норадреналин вызывает гиперполяризаиии оазолатеральной мембраны эпителиоцитов, не оказывая влияния на потенциал апикальной мембраны, Эту особенность действия норадреналина следует оценивать в свете функционального различия этих мембран, их неодинаковой роли в трансмемсракном переносе веществ.

В настоящей работе показано не только действие норадреналина на потенциал оазолатеральной мембраны эпителиоцитсв, но и его влияние на характер распределения эпителиальных клеток по величине их меморанного потенциала. При действии норадреналина был отмочен сдвиг максимума функции вероятности распределения в сторону более высокого значения мембранного потенциала при отсутствии существенных изменений размаха вариации. Йссиметрия умень-

пилась с 1.2 при концентрации норадреналина 10-7 моль/л до 0,08 при концентрации 10-4 моль/л. Это обстоятельство говорит о то«, что норадреналин действует неодинаково на зпителиоциты с различной величиной мембранного потенциала. Оценку силы влияния норадреналина на потенциал базолатеральной мембраны производили посредством однофакторного дисперсионного анализа I метод Снедекора). Показатель силы влияния оказался равным 0.53. Это означает, что 50.3 у. общего варьирования величины мембранного потенциала обусловлено регулирующим влиянием норадреналина. Объектом его воздействия являются, главным образом, клетки, мембранный потенциал которых имеет значение, близкое к среднему для данной популяции. В меньшей мере проявляется действие норадреналина как на деполяризованные зпителиоциты, так и на те клетки, мембранный потенциал которых более высок по сравнении с другими.

Фармакологический анализ действия норадреналина на мембрану зпителиоцитов слизистой оболочки тонкой кивки.

Влияние норадреналина на эффекторные клетки происходит в результате его взаимодействия со специальными мембранными белками - адренорецепторами. Для эпителия слизистой оболочки тонкой кишки характерна смешанная популяция адренорецепторов. ^ля выяснения типа адренорецепторов, посредством которых реализуется действие норадреналина на мембранный потенциал зпителиоцитов слизистой оболочки тонкой кишки были использованы следуищие адренобло-каторы: анаприлин юбзидан) - неселективный бета-адреноолокатор; бутироксан - неселективный алыра - адреноСлокатор; прззозин -один из наиболее специфических постсинаптических блокаторов альфа 1 - адренорецепторов; иохимсин - вксоксселективный блокатор альфа 2 - адренорецепторов. Указанные вещества добавляли в омывавший препарат физиологический раствор и определяли пороговую концентрацию адреноблокатороЕ, которая устраняла гиперполяризуш-щее действие норадреналина на базолатеральную мембрану зпителиоцитов слизистой оболочки тонкой кипки. Показателем эффекта норадреналина слуаила величина потенциала базолатеральной мембраны зпителиоцитов.

Результаты проведенных опытов указывают на неодинаковую чувствительность гиперполяризушщего действия норадреналина ка мемОрану зпителиоцитов к различным адреноблокаторам: анаприлину, бутироксану и празозину ( рис.1 ). Более сложный характер носило действие йохимбина, который в концентрации 10-6 - 10-8 ыоль/л не только блокировал эффект норадреналина, но и сам вызывал гиперполяризации оазолатеральной мембраны эпителиоцитоЕ. Блокирующее действие йохимбина исчезг-с при снижении его концентрации до 105 моль/л.

Ю-7 Ю'6,моль/л

Рисунок 1. Влияние адреноблокаторов на гиперполяризувщий эффект норадреналина (. пунктиром - - - - указано значение ИП в контроле. -- — ■ - значение ЯП при действии норадреналина в концентрации 10-6 моль/л ).

1 - анаприлин:

2 - бутироксан;

3 - празоэин.

Уровень значимости Р = 0.05

Тот факт, что иохимбин вызывает увеличение потенциала оа-золатералъной мембраны эпителиальных клеток, можно объяснить наличием альфа 2 - адренорецепторов на пресинаптических терминалах нейронов интракуральных нервных сплетений кишечника. На различных ооьактах показано, что стимуляция пресинаптических альфа 2 -адренорецепторов уменьвает, а их блокада увеличивает высвобождение различных нейротрансмиттеров I Ennis С. et. al., 1979: (¡other П., Hath Н., 1980; Ricciardi S. et. al., 1984)

Полученные данные говорят о том,что действие норадреналина на мембранный потенциал эпителиоцитов тонкой кижки реализуется, главным образом, посредством альфа 2 - адренорецепторов. Влияние йохикбииа на мембранный потенциал зпителиоцитов указывает на то, что норадреналин способен влиять на всасывание в тонкой кивке косвенным путем, регулируя возбудимость других типов нервных волокон.

Известно, что с активацией алыра 2 - адренорецепторов свя-зывавт и влияние норадреналина на всасывание воды и электролитов слизистой оболочкой тонкой кивки i Chang Е.В. et. al., 1982; KcArthtrr К.Е. et. al., 1982; Durbin Т. et. al., 1S82; Fondacaro J.Li. et. al., 1988). Зто даст основания полагать, что гиперполя-рнзациа сазоматеральнсй иомбраны зпителиоцитов является одним из компонентов биофизического механизма действия норадреналина на процесс всасывания в кивечнике.

Влияние норадреналина на транспортов процессы в плазматической век&ранв зпателквцгпгов.

Как было установлено выве, норадреналин оказывает гиперпо-ляризуЕцее влияние ливь на базолатеральнув мембрану эпителиоцитов и не изменяет потенциал их апикальной мембраны. Этот результат uoter свидетельствовать оо активации норадреналином натрий-калиэвой ЙТОазы базолатеральной мембраны. Как известно, локализованный в ней натрий - калиевый насос является злектро-геннык, поскольку транспортирует ионы натрия и калия в соотноие-нии 4:3, и его активация способна вызвать увеличение мембранного потенциала I Okada У. et al., 197В ).

Для проверки этого предполояения были проведены опыты с применением ингибитора lia,K - ЯТФазы оуабаина, который является специфическим блокаторои натрий-калиевого насоса, Оуабаин добавляли к раствору, оыываЕщему серознуа ооолочку кивки, в концентра-

ции 10-3 моль/л. В первой серии экспериментов измеряли потенциал оазолатеральной мембраны эпителиоцитов при воздействии самого оуаоаина. Он оказался равным 11,3 ± 0.6 мВ ( п = 79 ). В следующей серии опытов изучали эффект совместного действия норадреналина и оуабаина. Полученные результаты показали, что оуабаин полностью устраняет гиперполяризувщее действие норадреналина на 9 мембранный потенциал эпителиоцитов. Его величина, измеренная в данных условиях, была равна 11,1 ± 0.4 мВ („п = 169 ), что не отличается существенно от данных полученных в предыдущей серии опытов ( Р > 0.05 ).

Таким образом, результаты экспериментов свидетельствует о том, что гиперполяризация базодатеральной мембраны эпителиоцитов тонкой кишки, возникавшая под влиянием норадреналина, является результатом псвыиения активности локализованного в ней злектро-генного натрий-калиевого насоса. Этот вывод навел подтверждение в серии опытов, в которых определялась активность На. К - ОТФаэы в мембранах эпителиоцитов слизистой оболочки тонкой киаки. Действие норадреналина на слизистув оболочку тонкой кивки привело к значительному повышении активности йа, К - АТОазы, которая возросла до величини 12,2 ± 2,0 по сравнении с контролем 6,2 а 0,8 нмоль Р1/мг.белка.нин.

С цельи исследования влияния норадреналина на ионнув прони- • цаемость плазматической мембраны эпителиоцитов использовали оло-каторы ионных каналов, а также производили замещение ионов в фи- • зиологическом растворе, омнвавщем препарат. Результаты опытов свидетельствуй о том, что не только блокада натрий-калиевого насоса,оуаоаином, но и замена ионов натрия и хлора плохопроника-пщиии нонами трис и ХОцустраняет, либо резко изменяет влияние норадреналина ка мембранный потенциал эпителиоцитов. В результате такой замены происходит значительное нарушение трансмеморан-ных электрохимических градиентов этих ионов, что приводит к резкому ослаблении их взаимосвязанных диффузионных потоков через неморану. В физиологическом растворе с замещенными ионами натрия значение потенциала оазолатеральной мембраны составило 13.1 ± 0.3 иВ, апикальной - 14.8 £ 0.4 мВ, а при замене ионов хлора на сульфатные ионы 14.4 ± 0.3 мВ и 14.3 ± 0.3 кВ соответственно. Действие норадреналина в условиях замени натрия ионами трис привело к снкшенип величины потенциала базолагвральпой мембраны до значения 12.0 ± 0.3 мВ, апикальной - 11,7 ± 0.5 кВ. В физиологическом растворе с заменой ионов хлора при действии норадреналина

величина потенциала базолатеральной мембраны составила 13.5 4 0.3 *В. апикальной - 14.4 + 0.3 мВ, что не отличается существенно от соответствунщих показателей, 'зарегистрированных при использовании сульфатного физиологического раствора оез применения норадреналина. В этих условиях при воздействии норадреналина не наблюдается оцабаин-зависимой гиперполяризации базолатеральной мембраны эпителиоцитоЕ.

Ястраненив действия норадреналина на мембранный потенциал зпителиоцитов под влиянием специфического блокатора Иа / Н обмена амилорида указывает на то, что эффект норадреналина связан с усилением Иа / Н - обмена б апикальной мембране ( таблица 2. ). Последний, как известно связан с П/НСОзобменом, посредством которого внутрь зпителиоцитов поступапт ионы хлора I Сагзапо £. е^ а1., 1984; $илс!агаа и. в1. а]., 19Э1 ).

Таблица 2

Действие амилорида (АЮ на гипврполяризущий эффект норадреналина

Условия эксперимента Величина мембранного потенциала зпителиоцитоз

Апикальная мембрана Базолатеральная меморана

Действие ЙМ б концентрации 5'10-3 II 12.6 + 0.4 мВ п = 147. Р > 0.05 14.4 + 0.4 мВ п = 236. Р < 0.05

Действие ЙМ С0.5'10-3 М) и Hfl (10-6 Ю 11.8 + 0.5 мВ п = 115. Р > 0.05 14.7 + 0.4 мВ п = 216. Р < 0.05

Действие ЙН (0.5-10-3 И) и Hfl (10-5 Н) 12.0 ± 0.4 мВ п = 140. Р > 0.05 13.3 .+ 0.5мВ п => 130. Р < 0.05

В наших опытах было исследовано влияние блокатора кальциевых каналов верапамила. Действие верапамила в концентрации 10-4 моль /л не оказало существенного влияния на потенциал базолатеральной мембраны, который был равен 11.5 ± 0.5 мВ. При комбинации верапамила с норадреналином (10-6 моль/л) величина потенциала составила 12.4 ± 0.3 мВ, что меньше значения мембранного потенциала при действии норадреналина в данной концентрации I Р < 0.05 ). Результаты опытов с верапамилом указывавт на то. что Олокаторы

кальциевых каналов способны уменьшать действие норадреналина на мембранный потенциал зпителиоцитов,приводящее к изменении процессов всасывания в тонкой кишке. Применение блокатора калиевых каналов 2 - аминопиридина в концентрации 10-3 моль/л не привело к изменении эффекта норадреналина.

Весьма слоеным является вопрос о внутриклеточных сигналах, опосредующих связь между алыра-адренорецепторами зпителиоцитов тонкой кишки и процессами ионного транспорта в их плазматической меморане. Показано, что гиперополяризацил клеточной мембраны предупрегдашт ингибиторы биосинтеза белка. В то яе время активизация оиосинтеза белка в клотках различного типа способна вызывать гиперполяризацив их плазматической мембраны ( Фролькис В.В., 1980, 1981 ).

Полученные нами данные говорят о том, что гиперполяризация оазолатеральной мембраны зпителиоцитов тонкой кишки под влиянием норадреналина сопряжена с процессами оиосинтеза белка в клетке. Применение ингибиторов белкового синтеза циклогвксимида и ак-тиномицина - й в концентрации 10-6 и 10-7 моль/л приводило к устранению гиперполяризувщего эффекта норадреналина. Более эффективным оказался актиномицин - Д. Возможно, усиление белкового синтеза обусловлено действием норадреналина на проницаемость апикальной мембраны зпителиоцитов для ионов натрия. Иногие • данные свидетельствуют о том, что соотновение одновалентных катионов в цитоплазме влияет на процессы биосинтеза в клетке (Данко И. Н. и др., 1984; Кафиани И. Я., Маленков А. Г., 1976 ; Каленков Й. Г., 1976; Фролькис В.В.. Мурадян Х.К., 1988 ).

Известно, что при действии целого ряда гормонов и физиологически активных веществ в клетках способны возникать гиперполя-ризуещие факторы пептидной природы. В дальнейшем оказалось, что речь идет о целой группе так называемых инверторов - внутриклеточных регуляторах, обеспечиваощих геном - мембранное сопряжение. Это подтверждается существованием зависимости гиперполяризации плазматической мембраны клеток от процессов оелкового синтеза ( Фролькис В.В., 1988; 1992 ). При изучении действия норадреналина на мембрану эпителиальных клеток тонкого кишечника речь может идти о влиянии норадреналина на возникновении гиперполяризувщего фактора, вызывающего увеличение потенциала Ьазолатеральной мембраны и активации натрий - калиевого насоса. Применение ингибиторов белкового синтеза, препятствувщих активации генома, предупреждает развитие гипврполяризации

базолагеральной мембраны.

Таким образок, влияние норадреналина на мембрану элителио-цитов слизистой оболочки тонкой кишки, приводящее к усилению процессов всасывания в тонкой кишке, осуществляется олагодаря нескольким взаимосвязанным механизмам: активации Ыа, К - ЙТИазы посредством возникновения внутриклеточного гиперполяризувщего фактора и изменения проницаемости апикальной мембраны для ионов натрия и хлора. При этом предполагается, что развитие гиперполяризации Оазолатеральной мембраны связано с активацией биосинтеза белка, влияидего на ионную проводимость апикальной измбраны эпителиальных клеток по принципу обратной связи.

Особенности влияния норадреналина на мембрану эпителиоцитов слизистой оболочки тонкого кивечника при старении.

Проведенные исследования показали, что величина мембранного потенциала для старых еивотннх в исходном состоянии не отличается существенно от соответствующего показателя для взрослых крыс и равна 12.3 ± 0.2 мВ ( п = 372 Влияние же норадреналина на мембрану эпителиоцитов существенным образом зависит от возраста вивотных. 9 старых крыс чувствительность эпителиоцитов тонкой кивки к норадреналина оказалась более высокой, чем у взрослых. Норадреналин вызывал у старых вивотных более выраженную гиперпо-ляризациш эпителиоцитов ( рис. 2 ). Величина потенциала базола-теральной иембранн при концентрации норадреналина 10-6 ыоль/л возросла в среднем на 33 X для старых крыс и на 23 7. для взрослых. Й соответствии с этим у старых «ивотных наблпдалось и боль-вее, по сравнения со взрослыми крысами, повышение активности На, К - ЙТФазы - соответственно в 3.4 и 1.9 раза ( рис. 3 ). Однако, диапазон концентраций норадреналина, вызывающих сдвиги мембранного потенциала эпителиоцитов, стал у старых крыс более узким, чем у взрослых. Нвелкчение концентрации норадреналина сверх определенного уровня приводило к снижении его эффекта.

Обнаруженные нами возрастные особенности действия норадреналина на мемерану эпителиоцитов' тонкой кишки отражают общие закономерности изменения адренергической регуляции при старении, которые были показаны ранее при изучении различных вегетативных реакций организма С Тураева Н.М., 1979; Фролькис И.В., 1979; Оролькис В.В., 1981, 1988, 1983; Фролькис В.В., Иурадян Х.К., 1388 ). Повыгение чувствительности эпителиоцитов к норадреналину носит, вероятно, адаптационный характер. Клетки при этом сохраняет способность реагировать на -адренергическув стимуляции в ус-

мВ 16

15

14

13

12

16-7 10=6 10^5 10-4, моль/л

"исунок I. График зависимости гиперполяризущего действия норадреналина о: его дозы для старых I 1") и взрослых ( 2 ) крыс.

15

10

нмоль Р /мг.беляа кш

Рисунок 3. Влияние норадреналина на активность Иа.К -йТФазы зпи-телиоцитов слизистой оболочки тонкой кишки взрослых (А) и старых (Б) крыс: 1 - активность Иа.К-АТФази в контроле;

I - активность Иа.К-АТФаза при действии норадреналина. Уровень значимости Р = 0,05

О

ловиах понижения ее функциональной активности. Система оказывается адаптированной к более низкому входному сигналу. Можно полагать, что таким путем поддергивается уровень регуляции процессов всасывания в кишечнике, несмотря на возможное ослабление активности симпатической нервной системы при старении.

Таким образом, результаты исследований характеризуют клеточные механизмы действия норадреналина на мембранный потенциал зпителиоцитов слизистой оболочки тонкой кишки и трансэпителиальный транспорт электролитов. Они раскрывают также возрастные изменения- адреиергической регуляции процессов всасывания в кивеч-нике. Полученные данные могут иметь значение для обоснования применения альфа - адреномиметиков в целях лечения нарушеннй всасывания в кишечнике, а также особенностей их дозировки для лиц пожилого возраста.

выводи

1. Норадреналин оказывает влияние на мембранный потенциал зпителиоцитов слизистой оболочки тонкой кишки крысы, ин вызывает гиперполяризациш базолатеральной мембраны зпителиоцитов. не приводя к существенным изменениям потенциала апикальной мембраны. Гиперполяризующее действие норадреналина на базолатеральной меморане зависит от его дозы.

2. Действие норадреналина на мембранный потенциал эпителиальных клеток слизистой оболочки тонкой кишки реализуется посредством преимущественной активации альфа2 - адренорецептороз мемораны, с которыми связывают физиологическое влияние норадреналина на усиление всасывания воды и электролитов в тонкой кишке.

3. Инализ действия норадреналина на мембранный потенциал зпителиоцитов позволяет охарактеризовать клеточные механизмы его влияния на транспорт ионов в слизистой оболочке тонкой киаки. Нктивация альфа 2 - адренорецепторов норадреналином приводит к усилению электронейтрального переноса ионов натрия и хлора через апикальнуи мембрану из полости кишки в цитоплазму эпителиальных клеток. При этом повышается активность Иа/Н обмена в апикальной меморане.

4. Усиление поступления ионов натрия в цитоплазму зпителиоцитов в условиях действия норадреналина сопряжено с активацией электрогенного Иа.К - насоса, локализованного в базолатеральной мембране, что является причиной ее гиперполяризации.

5. Внутриклеточные механизмы, опосредующие влияние норадре-

налина на мембранный потенциал зпителиоцитов зависят от биосинтеза белка в их цитоплазме. Гиперполяризующее действие норадре-нг.'ина при этом устраняется в условиях применения ингибиторов болкового синтеза.

В. Обнаружены возрастные особенности влияния норадреналина на мембранный потенциал зпителиоцитов слизистой оболочки тонкой кишки. У старых крыс ( 26-28 нес. ) наблюдается более высокая чувствительность зпителиоцитов и более значительная гиперполяризация, при действии норадреналина, чем у взрослых животных. В то же время диапазон концентраций норадреналина, вызывающих сдвиг мембранного потенциала, у старых крыс является более узким, чем у взрослых.

?. Указанные возрастные особенности действия норадреналина могут иметь адаптивное значение, обеспечивая возможность регуляции процессов всасывания в кишечнике при старении в условиях снижения активности симпатической нервной системы.

1. Прокопченко Й.Е. Действие норадреналина на мембрану эпителиальных клеток тонкого кишечника крысы // Всесоюзная конференция " Секреция пищеварительных желез в норме и патологии", 3 - 5 октября 1988 г., йндижан:Тез.докл. - Андижан, 1988. - С.197.

2. Прокопченко А.Е., Сливко Э.й. Действие норадреналина на кеморану зпителиоцитов тонкого килечника крысы и его возрастные особенности // Докл. АН УССР. Сер.Б.- 1990.- Н 11. - С. 80 - 83.

3. Прокопченко O.E., Чернипова С.В., Коваленко С.О. Вплив норадренал1ну, ацетилхол1ну та пентагастр1ну на меибраний по-тенц:ал еп!тел1альних кл1тин тонкох кивки //13 31зд Укра1нского 5>i3iолог1чного ювариства ¡м 1.П. Павлова, 17 - 21 вересня 1990 р., Харк1в: Тез.доп. - Киев, Наукова думка. - С. 183.

4. Прокопченко А.Е. Фармакологическое исследование действия норадреналина на мембрану зпителиоцитов тонкого кивечника крысы // 4 -й сьезд фармакологов Украинской ССР,25 - 27 сентября 1990 г.. Харьков: Тез. докл. - Харьков, 1990. - С.253.

5. Прокопченко Й.Е., Икапенко А.Л.Возрастные особенности влияния норадреналина на величину мембранного потенциала и активность Na,К - АТФазы зпителиоцитов тонкого кишечника // Докл. АН УССР. - 1991. Н 7. - С. 166 - 159.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ