Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Урогенитальные инфекции у женщин с осложненным акушерско-гинекологическим анамнезом и риск инфицирования плода и новорожденного

НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ И ПЕРИНАТОЛОГИИ РАМН

Бурменская Ольга Владимировна

Урогенитальные инфекции у женщин с осложненным акушерско-гинекологическим анамнезом и риск инфицирования плода и новорожденного.

14.00.30 - эпидемиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научные руководители: член-корреспондент РАМН, профессор Г.Т. Сухих, кандидат биологических наук Л.З.Файзуллин.

Москва, 1999.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список сокращений и обозначений...........................................................................4

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................5

Глава 1. Клинико-эпидемиологические аспекты урогенитальных инфекций и методы их диагностики (обзор литературы)......................................................................10

1.1. Клинико-эпидемиологическая и биологическая характеристика возбудителей урогенитальных инфекций: ВПГ-2, ЦМВ, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, M.hominis............................................................................................................10

1.2. Влияние урогенитальных инфекций на течение беременности, развитие плода и новорожденного...........................................................................................................19

1.3. Методы диагностики урогенитальных инфекций............................................30

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы и реактивы....................................................................................40

2.2. Характеристика клинического материала...................................................40

2.3. Методы выделения ДНК................................................................................41

2.4. Методы лабораторной диагностики инфекций............................................43

2.4.1. Метод полимеразной цепной реакции..........................................................43

2.4.2. Диагностика хламидий методом НИФ..........................................................44

2.4.3. Выявление иммуноглобулинов класса G к C.trachomatis методом тИФА............................................................................................................................45

2.4.4. Выявление хламидийной протеазы.......................... ......................................45

2.4.5. Выявление иммуноглобулинов классов М и G к ВПГ и ЦМВ методом тИФА............................................................................................................................45

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Оптимизация условий проведения ДНК-амплификационного метода диагностики возбудителей УГИ....................................................................................................49

1.1. Подбор праймеров....................................... ........................................................49

1.2. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР.............................................52

1.3. Подбор оптимальных условий выделения ДНК..............................................52

1.4. Учет чувствительности, специфичности и воспроизводимости метода.............................................................................................................................................54

1.5. Сравнение эффективности разных методов лабораторной диагностики возбудителей УГИ...............................................................................................58

2. Широта распространения хламидийной, микоплазменных и герпесвирусных инфекций среди женщин с осложненным акушерским анамнезом и гинекологическими заболеваниями........................................................................................................................75

3. Диагностика возбудителей УГИ у новорожденных детей с нарушениями развития инфекционного генеза. Риск передачи УГИ от матери новорожденному.............................................................................................................................................87

4. Исследование возможности внутриутробного инфицирования плода возбудителями УГИ во втором триместре беременности...............................................................90

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ.....................................................................

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................

..94

.104 105

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

Hela, Vero, McCoy, L-929, BHK-21, ФЭЧ, ПЭЧ - клеточные культуры АГ - антиген AT - антитело

ВПГ -вирус простого герпеса

ЗППП - заболевания, передаваемые половым путем

ИФ - иммуно флуоресценция

ИФА - иммуноферментный анализ

КОЕ -колониеобразующая единица

ЛИФА - лантанидный иммуноферментный анализ

ЛПС - липополисахарид

ЛЦР - лигазная цепная реакция

МКА - моноклональные антитела

НИФ - непрямая иммунофлуоресценция

ПИФ - прямая иммунофлуоресценция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РН - реакция нейтрализации

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РСК - реакция связывания комплемента

РТ - ретикулярное тельце хламидий

тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ

УГИ - урогенитальные инфекции

УГТ - урогенитальный тракт

УГХ - урогенитальный хламидиоз

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоционат

ЦМВ - цитомегаловирус

ЦНС - центральная нервная система

ЦПД - цитопатическое действие

ЭТ - элементарное тельце хламидий

ВВЕДЕНИЕ.

Несмотря на значительные успехи медицины в области диагностики, лечения и профилактики заболеваний, передаваемых половым путем (ЗППП), распространенность возбудителей урогенитальных инфекций (УГИ) остается высокой и представляет собой серьезную социальную и демографическую проблему. Социальная значимость данной проблемы определяется прежде всего влиянием ЗППП на воспроизводство здорового поколения. Нередко УГИ могут стать причиной бесплодия, самопроизвольных выкидышей, рождения больного ребенка. В настоящее время 10-15 % супружеских пар страдают бесплодием, основной причиной которого являются воспалительные заболевания органов репродуктивной системы (58, 217).

В нашей стране проблема ЗППП является особенно актуальной. Экономические и политические преобразования, начавшиеся в стране в конце 90 годов, создали ряд предпосылок для значительного увеличения числа случаев сексуально передаваемых инфекций. По данным 1995 года на фоне общего снижения уровня венерических заболеваний в странах Западной Европы, на территории стран СНГ уровень заболеваемости сифилисом вырос в 40 раз по сравнению с 1989 годом (И). Параллельно с этим отмечено увеличение числа случаев гонореи, а также хламидиоза, уреаплазмоза, которые часто выступают в «эпидемическом синергизме» с венерическими болезнями (42). Статистика свидетельствует, что среди заболевших женщин зарегистрировано в два с лишним раза больше, чем мужчин (42).

Наиболее распространенными возбудителями ЗППП являются Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, вирус простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), цитомегаловирус (ЦМВ). При наличии данных микроорганизмов у женщин во время беременности возникает риск их передачи от матери плоду и новорожденному (18). Не всегда в ответ на инфицирование иммунная система новорожденного отвечает синтезом специфических антител класса М, поэтому необходима непосредственная детекция патогенных микроорганизмов. Последствия перенесенных пренатальных и перинатальных инфекций могут быть отдаленными. Например, у 90% ЦМВ-инфицированных новорожденных заболевание протекает в бессимптомной форме, однако с течением времени у 5-15% этих детей субклинические органические поражения мозга, вызванные ЦМВ, могут привести к прогрессирующей потере слуха, нарушению высших психических функций и создать серьезные проблемы адаптации в обществе (96, 126, 198).

Помимо контактного механизма передачи возбудителей УГИ от матери ребенку во время родов при прохождении через инфицированный родовой канал, а также контактно-бытового пути передачи возбудителей в постнатальный период, немаловажное значение может иметь и "вертикальный" механизм передачи возбудителей (внутриутробно). Большинство работ, посвященных "вертикальной передаче", связаны с периодами до 12 недель и после 28 недель внутриутробного развития. Период с 12 по 28 неделю гестации остается малоизученым.

УГИ часто протекают в субклинической форме. Отсутствие специфической клинической картины создает трудности для своевременного выявления носителей возбудителя. Заболевание может быть установлено только на основании лабораторной диагностики микроорганизмов. Метод "золотого стандарта" высева на культуру клеток или культивирования в питательной среде является наиболее оптимальным, но не всегда доступным в силу трудоемкости и значительных материальных затрат. Практически все применяемые до настоящего времени диагностические системы основаны на использовании антигенных свойств инфекционных частиц - иммунодиффузия, реакция связывания комплемента, реакция преципитации, прямая и непрямая агглютинация, радио-, иммуноферментные и иммунофлюоресцентные методы. Однако, иммунологические методы обладают тем недостатком, что они выявляют фенотипические свойства микроорганизмов, т.е. те свойства, которые проявляются в результате экспрессии генов, детерминирующих антигенные структуры. При латентных, скрытых, атипичных формах заболевания уровень синтеза антигенных белков может находиться на низком уровне, антигенные свойства микроорганизмов могут меняться под давлением защитных сил иммунитета, что затрудняет диагностику с помощью иммунологических методов.

В последние годы были разработаны молекулярно-биологические методы диагностики, основанные на уникальности нуклеотидной последовательности генома возбудителей: ДНК-гибридизация, лигазная цепная реакция и полимеразная цепная реакция (ПЦР). К преимуществам ДНК-методов следует отнести (75, 235):

- высокую и регулируемую специфичность, задаваемую лишь специфичностью выбранной последовательности праймеров и нуклеотидных зондов;

- высокую чувствительность, позволяющую выявить не только острые, но и хронические инфекции, что особенно важно для определения скрытых и атипичных форм заболеваний;

- химическое сходство всех нуклеиновых кислот, несмотря на их различие по нуклеотидному составу, позволяет разработать универсальную процедуру постановки реакции, варьируя лишь в отношении используемых ДНК-зондов, праймеров и режима амплификации;

- нуклеиновые кислоты более стабильны, чем белки и поэтому можно использовать более жесткие методы экстрации из биологических образцов и хранения материала.

Наиболее широкое распространение в диагностической практике получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Многие авторы отмечают, что ПЦР - единственный метод, который может превосходить традиционный "золотой стандарт" не только по скорости, простоте и дешевизне, но и по чувствительности, не уступая ему в специфичности (119). Однако при использовании метода ПЦР сохраняются проблемы, связанные с подбором праймеров; наличием в образце ингибиторов полимеразной цепной реакции и необходимостью наиболее полной очистки ДНК; возможностью контаминации образцов "из пробирки в пробирку" или фрагментами продуктов амплификации (33). Поэтому необходима дальнейшая адаптация этого метода к условиям учреждений здравоохранения и оценка клинической значимости и информативности результатов ПЦР.

Цель исследования:

Изучить основные эпидемиологические закономерности УГИ (С. trachomatis, U. urealyticum, М. hominis, ВПГ-2, ЦМВ) среди женщин с акушерскими осложнениями и гинекологическими заболеваниями, а также определить риск передачи этих возбудителей от матери плоду и новорожденному.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. Оптимизировать условия проведения полимеразной цепной реакции и адаптировать ее для диагностики возбудителей урогенитальных инфекций (С. trachomatis, U. urealyticum, М. hominis, ВПГ-2, ЦМВ) в клинических образцах эпителия слизистых цервикального канала женщин, клетках осадка мочи новорожденных и околоплодных водах. Оценить клиническую значимость и информативность ПЦР.

2. Выявить особенности эпидемиологии урогенитальных инфекций среди женщин с осложненным акушерским и гинекологическим анамнезом.

3. Определить частоту передачи возбудителей УГИ от матери новорожденному

в зависимости от способа родоразрешения.

4. Исследовать возможность внутриутробной передачи возбудителей УГИ от матери плоду во 2 триместре беременности.

Научная новизна работы.

С помощью метода полимеразной цепной реакции, адаптированного для выявления возбудителей УГИ, получены данные о частоте распространения отдельных микроорганизмов и их ассоциаций среди женщин с различными гинекологическими заболеваниями и акушерскими осложнениями. Показано, что в группах пациенток с осложненным акушерско-гинекологическим анамнезом частота выявления инфекционных агентов и их ассоциаций друг с другом была достоверно выше, чем в группе условно здоровых женщин. В контрольной группе отмечена высокая частота выявления U.urealyticum и ЦМВ, однако они преимущественно присутствовали вне ассоциаций с остальными исследуемыми микроорганизмами.

Оценен риск передачи хламидий, микоплазм, уреаплазм, вируса генитального герпеса и цитомегаловируса от матери новорожденному. Показано, что передача возбудителей УГИ чаще происходит при самопроизвольных родах (по сравнению с оперативным родоразрешением) и при наличии у матери маркеров острой формы инфекции (ДНК, IgM).

Впервые получены данные о возможности внутриутробного инфицирования плодов во 2 триместре при физиологически нормально протекающей беременности на уникальном материале искусственно абортированных плодов. Показаны низкие частоты (4% и менее) риска внутриутробной передачи возбудителей УГИ во 2 триместре гес-тации при носительстве данных микроорганизмов у матери. При этом ДНК инфекционных агентов может быть определена в околоплодных водах, но не всегда присутствует в фетальных тканях.

Практическая значимость работы.

Проведена адаптация метода полимеразной цепной реакции для выявления ДНК возбудителей УГИ (ВПГ-2, ЦМВ, С. trachomatis, U. urealyticum, М. hominis) в клинических образцах цервикального эпителия женщин, клетках осадка мочи новорожденных детей, клетках околоплодных вод и тканях плодов 18-22 недель внутриутробного развития. Применение этого высокочувствительного и специфичного метода в акушерско-

гинекологической практике обеспечивает достоверность диагностики и сокращает время проведения анализа.

Полученные в работе данные о корреляции наличия конкретных инфекционных агентов и их ассоциаций с различными гинекологическими заболеваниями дают возможность проводить целенаправленное обследование пациента и своевременно начать этиотропную терапию.

Выявление возбудителей УГИ у беременных женщин методом ПЦР позволяет оценить риск внутриутробного и перинатального инфицирования плода и новорожденного и выбрать адекватный способ родоразрешения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Метод диагностики возбудителей УГИ на основе полимеразной цепной реакции обладает высокой чувствительностью и специфичностью и пригоден для установления инфицированности женщин, плодов и новорожденных детей.

2. В группах женщин с гинекологическимим заболеваниями и осложненным акушерским анамнезом (бесплодие, невынашивание беременности, нарушения развития инфекционного генеза со стороны новорожденного, воспалительные заболевания органов репродуктивной системы) возрастает вероятность определения в эпителии цервикального канала возбудителей УГИ (ВПГ-2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis). При этом преобладают сочетанные формы бактериальных и вирусно-бактериальных возбудителей.

3. Передача от матери новорожденному возбудителей УГИ в значительной степени определяется способом родоразрешения. Она возрастает при прохождении ребенка через инфицированный генитальный тракт в самопроизвольных родах.

4. Риск инфицирования новорожденного цитомегаловирусом возрастает при наличии у матери специфических IgM-AT против вируса в сыворотке крови и наличии ДНК возбудителя в цервикальном канале.

5. Риск инфицирования плодов Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, ВПГ-2, ЦМВ во втором триместре беременности является незначительным при носительстве этих возбудителей у матери.

ГЛАВА 1. КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ И МЕТОДЫ ИХ ДИАГНОСТИКИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Клинико-эпидемиологическая и биологическая характеристика возбудителей УГИ.

По данным многочисленных исследований, проведенных в лабораториях и клиниках различных стран, более 70% акушерской и гинекологической патологии обусловлено хроническими урогенитальными инфекциями как вирусной, так и бактериальной природы (209). Роль герпесвирусов, хламидий и микоплазм в этиологии воспалительных заболеваний хорошо известна. Эти заболевания мочеполовой системы распространены более значительно, чем поражения гонореей, сифилисом и другими возбудителями ЗППП. Они поражают людей в период наибольшей половой активности и нередко сопровождаются осложнениями, которые приводят к бесплодию или внутриутробной инфекции, обусловливая заболевания плода и новорожденного. Каждый из рассматриваемых возбудителей обладает рядом особенностей. В то же время их объединяет наклонность к длительному хроническому течению воспалительного процесса в мочеполовой системе и пути распространения этого процесса (восходящая инфекция), а так же многосимптомность, схожесть и тяжесть осложнений, что затрудняет этиологическую диагности�