Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Ультраструктурная реорганизация и стереологический анализ печеночной дольки крыс при действии циклофосфамида

ю - ь

1898

На правах рукописи

Сорокина Юлия Александровна

УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ И СТЕРЕОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЕЧЕНОЧНОЙ ДОЛЬКИ КРЫС ПРИ ДЕЙСТВИИ ЦИКЛОФОСФАМИДА

14.03.02 - патологическая анатомия 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2010

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Непомнящих Лев Моисеевич Молодых Ольга Павловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Горчаков Владимир Николаевич

Лапий Галина Анатольевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава.

в_час. на заседании диссертационного совета Д 001.037.01 в

Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2, тел. 334-84-38.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.037.01

доктор биологических наук Молодых Ольга Павловна

Защита диссертации состоится «

»

2010 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гепатотоксические эффекты различных лекарственных препаратов постоянно находятся в центре внимания исследователей и клиницистов и представляют одну из наиболее сложных и трудно разрешимых проблем современной медицины. Это обусловлено, в частности, тем обстоятельством, что тяжелые поражения печени и летальные исходы отмечены в основном при передозировке некоторых лекарственных препаратов (например, ацетаминофена) и для большинства препаратов являются очень редкими событиями (Lee W.M., 2003; Navarro V.J., Senior J.R., 2006). В то жв время, по данным проведенных в последние десятилетия исследований, спектр гепатотоксических эффектов многих часто применяемых препаратов весьма обширен и разнообразен, особенно у детей (Chitturi S., George J., 2002). К числу наиболее распространенных препаратов с возможными гепатотоксическими эффектами относят нестероидные противовоспалительные средства, антигипер-тензивные, противоопухолевые и антидиабетические агенты, анти-конвульсанты, некоторые психотропные лекарственные препараты, статины и др. (Ивашкин В.Т. и др., 1999; Никитин И.Г. и др., 2005; Непомнящих Г.И. и др., 2008; Молодых О.П. и др., 2008).

Патогенез лекарственно-индуцированной гепатопатии очень сложен и во многих случаях не ясен. Важная роль в нем принадлежит вводимым в организм цитотоксическим агентам (Jaeschke Н. et al., 2002; Hilmer S.N. et al., 2004) и метаболитам, которые образуются в гепатоцитах в результате биотрансформации лекарственных препаратов и могут обладать более выраженными цитотоксическими свойствами (Minotti G. et al., 2001; Park B.K. et al., 2005). Существенное значение играют также ишемические повреждения печени, которые возникают в результате развития хронической сердечной недостаточности или синусоидального обструктивного синдрома (токсического генеза) (Молодых О.П. и др., 2006; DeLeve L.D. et al., 2002).

Токсические повреждения печени чаще всего развиваются после проведения химиотерапии и могут отражать гепатотоксические эффекты применяемых в онкологии лекарственных препаратов (King P.D., Perry М.С., 2001). Гепатотоксичность цитостатических препаратов, применяемых в противоопухолевой терапии, изучена в меньшей степени, поскольку считается, что поражения кроветворной и репродуктивной систем, а также миокарда (развитие кардиомиопа-

тии) являются основными побочными эффектами антибластомной терапии. При оценке возможных гепатотоксических эффектов тех или иных препаратов в клинических условиях важно учитывать предсуществующее состояние органа, развитие каких-либо патологических процессов, наличие вирусных гепатитов, других инфекций, дефицита питательных веществ и т.п. В то же время при изучении морфологии печени после введения экспериментальным животным некоторых цитостатических препаратов показано, что даже их однократное введение вызывает значительную структурную реорганизацию органа и изменяет его регенераторный потенциал (Гольдберг Е.Д. и др., 1998; Молодых О.П. и др., 2006).

Циклофосфамид - препарат, оказывающий алкилирующее воздействие на ДНК, широко используемый в противоопухолевой терапии (Амосова E.H. и др., 2003; Malet-Martino М, 1999) и как индуктор толерантности при трансплантации (Okano S. et al., 2001). При введении циклофосфамида в организм он метаболизируется в печени с образованием 7 основных метаболитов, из которых цитостатическим эффектом обладают альдофосфамид, азотный иприт, фосфамид иприта. Образовавшиеся метаболиты ингибирукгг рост быстро пролиферирующих, прежде всего опухолевых, клеток. Отсутствие избирательности действия и выявляемые уро-, нефро- и кардиотоксические свойства метаболитов циклофосфамида создают в ряде случаев серьезную проблему для его клинического использования (Лушникова E.JI. и др., 2007).

О гепатотоксических свойствах циклофосфамида существуют противоположные мнения. Одни исследователи считают, что печень наименее подвержена токсическому действию метаболитов циклофосфамида (Abraham P., Sugumar Е., 2008), другие, наоборот, полагают, что этот орган обладает высокой чувствительностью к цитотоксическому действию циклофосфамида (Полунина Т.Е., 1999; Кашуро В. А. и др., 2006). Выводы о гепатотоксичности циклофосфамида базируются в основном на опытах с многократным введением малых доз (до 20 мг/кг) или однократном введении большой дозы (150 мг/кг) препарата (Саратиков A.C. и др., 2004; Malhi Н. et al., 2002; Abraham P., Sugumar E., 2008). Наименее изученными при этом остаются вопросы, касающиеся морфогенетических процессов, индуцируемых циклофосфамидом в печени, выраженности цитоток-сических эффектов в отношении гепатоцитов и других клеточных популяций, а также интенсивности регенераторных реакций.

Для выяснения механизмов циклофосфанового поражения гепа-тоцитов необходимо изучение ультраструюурных изменений гепа-тоцитов с оценкой выраженности внутриклеточных регенераторных реакций, а также выяснение закономерностей и особенностей ремо-делирования печени в этих условиях. Полученная информация имеет большое значение для разработки эффективных способов коррекции развивающихся побочных эффектов медикаментозной терапии.

Цель исследования - изучить характер ультраструктурной реорганизации печеночной дольки крыс при введении циклофос-фамида, выяснить особенности циклофосфамидных повреждений гепатоцитов и выраженность клеточных и внутриклеточных форм их регенерации.

Для достижения данной цели были поставлены и реализованы следующие задачи:

1. Изучить характер пространственной реорганизации печеночной дольки крыс и особенности репаративной регенерации печени при моделировании циклофосфамидных повреждений.

2. Установить с помощью электронно-микроскопического исследования основные типы циклофосфамидных повреждений гепатоцитов.

3. Изучить особенности внутриклеточной реорганизации гепатоцитов при циклофосфамидных повреждениях.

4. Изучить ультраструюуру тканевого микрорайона печени при циклофосфамидных повреждениях.

Научная новизна. Впервые при проведении комплексного морфологического исследования печени крыс при действии цик-лофосфамида выявлены особенности структурной реорганизации печеночной дольки и установлены особенности клеточной и внутриклеточной форм регенерации гепатоцитов. Впервые показано, что после однократного введения циклофосфамида развиваются выраженные морфофункциональные изменения печени (мелкоочаговые некрозы гепатоцитов преимущественно в перипортальной зоне, мононуклеарная клеточная инфильтрация), развивающиеся на фоне нарушений кровообращения. Важной особенностью цик-лофосфамидного поражения печени является массивная обтурация синусоидных капилляров мононуклеарами, наиболее выраженная в перипортальной зоне. Впервые установлено, что ключевым моментом пространственной реорганизации печени после введения циклофосфамида является снижение объемной плотности гепатоцитов

и увеличение объемной и поверхностной плотностей синусоидов.

Впервые показано, что регенераторные реакции гепатоци-тов развиваются в основном в ранние сроки после однократного введения циклофосфамида (3 сут) и заключаются в активации их митотического деления и увеличении доли двуядерных клеток, преимущественно в перипортальной зоне.

Впервые установлено, что внутриклеточная реорганизация ге-патоцитов после однократного введения циклофосфамида определяется выраженными изменениями тонкой структуры митохондрий, транзиторными изменениями гранулярной цитоплазматической сети, значительной редукцией гладкой цитоплазматической сети, гиперплазией и гипертрофией структурных элементов комплекса Гольджи, формированием массивных скоплений гликогена и его усиливающейся секвестрацией и аутофагоцитозом с формированием многочисленных субплазмалеммальных остаточных телец. Для пространственной реорганизации гепатоцитов в ранние сроки после воздействия циклофосфамида характерно значительное снижение структурной плотности гранулярной цитоплазматической сети, в более поздние сроки - восстановление количественных характеристик данной структуры, но снижение структурной плотности митохондрий.

Впервые показано, что после однократного воздействия циклофосфамида происходит активация эндотелиоцитов синусоидов, для внутриклеточной реорганизации которых характерно наличие хорошо развитой гранулярной цитоплазматической сети, многочисленных везикулярных структур, микротрубочек, остаточных телец (фагосом), формирование выростов на люминальной поверхности клеток.

Впервые показано, что для ультраструктурной реорганизации печеночной дольки после однократного введения циклофосфамида характерно появление в просветах синусоидов и пространствах Диссе активированных форм клеток Купфера, лимфоцитов, плазмоцитов. Ультраструктурная реорганизация пространств Диссе заключается также в его значительном сужении, появлении в нем единичных утолщенных пучков коллагеновых волокон и остаточных телец.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о характере тканевой и внутриклеточной реорганизации печени, в том числе об основных типах циклофосфамидных повреждений гепатоцитов и регенераторных стратегиях, что вносит

существенный вклад в развитие представлений о структурных реакциях печени и особенностях ее регенерации при токсических воздействиях. Представлена ультраструктурная характеристика основных клеточных популяций печени в динамике циклофос-фамидного повреждения. Полученные данные о качественных и количественных изменениях гепатоцитов могут быть использованы при разработке диагностических и прогностических критериев их состояния в условиях цитотоксического повреждения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морфофункциональные изменения печени после однократного введения циклофосфамида заключаются в мелкоочаговых некрозах гепатоцитов преимущественно в перипортальной зоне, мононуклеарной клеточной инфильтрации, нарушениях кровообращения, вызванных, в том числе, массивной обтурацией синусоидных капилляров мононуклеарами.

2. Внутриклеточная реорганизация гепатоцитов после однократного введения циклофосфамида определяется выраженными изменениями тонкой структуры митохондрий, транзиторным уменьшением структурной плотности гранулярной цитоплазматической сети, значительной редукцией гладкой цитоплазматической сети, усилением секвестрации гликогена и аутофагоцитоза с формированием многочисленных субплазмалеммальных остаточных телец.

3. Регенераторные стратегии гепатоцитов на клеточном уровне заключаются в усилении их митотической активности и увеличении доли двуядерных клеток в ранние сроки после однократного введения циклофосфамида. В более поздние сроки реализуются в основном внутриклеточные формы регенерации, что проявляется в нормализации тонкой структуры ядрышек и восстановлении структурной плотности гранулярной цитоплазматической сети.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2009» (Новосибирск, 2009), 4-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009), межлабораторной научной конференции в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 1 - в рецензируемом журнале по списку ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, иллюстрирована 8 таблицами, 56 микрофотографиями. Список использованной литературы включает отечественные и иностранные источники.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Комплексный морфологический анализ печени проведен у 3-месячных крыс-самцов Вистар (п = 80). Животным (п = 68) вводили однократно внутрибрюшинно циклофосфамид («Биохимик») в дозе 125 мг/кг. Контрольную группу (интактные животные) составили особи (п = 12), которым одновременно с опытными животными внутрибрюшинно однократно вводили физиологический раствор в соответствующем их массе тела объеме. Опытных животных содержали постоянно при комнатной температуре без ограничения доступа к воде и пище.

Методы светооптического и электронно-микроскопического исследования. Животных всех групп декапитировали в первой половине дня с использованием эфирного наркоза через 3 сут (34 опытных и 6 контрольных) и 14 сут (34 опытных и 6 контрольных) после введения циклофосфамида. После вскрытия грудной и брюшной полостей производили макроскопическое обследование внутренних органов. Печень осторожно отделяли от окружающих тканей, быстро взвешивали и проводили визуальное обследование, затем фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина при комнатной температуре.

Проводку осуществляли на гистологическом комплексе Микром («Zeiss», Германия), затем образцы заливали в смесь воска и парафина. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином с постановкой реакции Перлса, по методу ван Гизона с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили PAS-реакцию. Светооптическое исследование и морфометрический анализ проводили в универсальном микроскопе «Leica DM 4000В» (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры «Leica DFC 320» (Германия) и компьютерной программы «Leica QWin V3».

Для электронно-микроскопического исследования образцы печени размерами не более 1 мм3 первоначально фиксировали в 4% растворе параформальдегида, постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия, заливали в смесь эпона 812 и аралдита М. Полутонкие (1 мкм) и ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-III. Полутонкие срезы окрашивали капельным способом 1% раствором азура II, ставили PAS-реакцию с докраской раствором азура II. Ультратонкие срезы контрастировали в уранилацетате и цитрате свинца. Исследование проводили в электронном микроскопе JEM-1400 («Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Veleta и программного обеспечения ÍTEM («Olympus», Япония, Германия).

Методика стереологического анализа и количественной оценки популяции гепатоцитов. Стереологический анализ проводили с использованием методик, основанных на подсчете числа точек тестовой системы, попавших на профиль исследуемой структуры (Р;), и числа пересечений тестовой линии с границами этой структуры (C¡) (Автандилов Г.Г. и др., 1981; Непомнящих JIM. и др., 1984; Weibel E.R., 1969). Для подсчетов применяли многоцелевую тестовую систему - решетку, состоящую из коротких отрезков, в которой отрезок тестовой линии является стороной ромба (Weibel E.R. et al., 1966, 1969; Crus-Orive L.M., Weibel E.R., 1990).

В качестве основных количественных характеристик структур выбраны относительный объем (Vvj) и относительная площадь поверхности (Sv¡) тканевых и внутриклеточных компонентов, достаточно полно характеризующие перестройки на различных уровнях. Относительный объем, или объемную плотность, исследуемых структур вычисляли по формуле: Vv¡=P/P.,, где P¡ - число точек, попавших на структуры, а Рх - общее число точек тестовой системы. Относительную площадь поверхности, или поверхностную плотность, исследуемых структур вычисляли по формуле: Sv¡ = 2C/L,., где С, - число пересечений тестовой линии с границами структуры, a Lj - общая длина тестовой линии с учетом увеличения объекта.

При проведении тканевого стереологического анализа применяли тестовую систему с п = 36, Рт = 72, Lj - 282,0 мкм, анализировали неперекрывающиеся поля зрения при увеличении в 1000 раз. Относительный объем и относительную площадь поверхности

структур печени выражали относительно объема ткани. Число наложений тестовой системы составляло от 20 до 25. Для подсчетов использовали полутонкие срезы.

На полутонких срезах оценивали объемную плотность (относительный объем) гепатоцитов, ядер гепатоцитов, синусоидных капилляров, эндотелиальных клеток, клеток соединительной ткани без их дифференциации и суммарно основного вещества и волокон соединительной ткани. Поверхностную плотность определяли для следующих структур: гепатоцитов, ядер гепатоцитов, синусоидных капилляров, клеток соединительной ткани. Относительный объем стромы определяли путем сложения относительных объемов синусоидных капилляров, эндотелиальных клеток, волокон, основного вещества и клеток соединительной ткани; объемную плотность паренхимы определяли путем сложения объемной плотности цитоплазмы и ядер гепатоцитов.

На основании первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные, описывающие количественные взаимоотношения между различными компонентами стромы и паренхимы: поверхностно-объемное отношение структур (Sv/Vv¡), объемное отношение стромы к паренхиме (VvCTp/Vvnap), отношение объема синусоидных капилляров к объему гепатоцитов (Vvclw/Vvren) и поверхностно-объемное отношение синусоидных капилляров к гепатоцитам (SvCHH/Vvren).

Проводили также количественную оценку популяции гепатоцитов - оценивали процентное содержание одно- и двуядерных гепатоцитов в перипортальной и перицентральной зонах. Для этого использовали полутонкие срезы. Подсчеты проводили в универсальном микроскопе «Leica DM 4000В» (Германия) при увеличении 1 ООО раз. Для каждого животного соотношение одно- и двуядерных клеток вычисляли при анализе не менее 500 клеток.

Ультраструктурный стереологический анализ гепатоцитов проводили с помощью программы ÍTEM при конечном увеличении в 23500 раз (первоначальное увеличение 20000 раз). Оценивали объемную плотность митохондрий, гранулярной цитоплазматической сети, липосом, лизосом и цитоплазмы с включениями (гранулы гликогена и т.д.). Поверхностную плотность определяли для митохондрий, гранулярной цитоплазматической сети и липидных включений. На основании первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные - объемные и поверхностно-объемные

отношения основных ультраструктур.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием критерия Стьюдента. Различия считали статистически достоверными, если достигнутый уровень значимости (р) не превышал принятого критического уровня значимости, равного 0,05 (р< 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общетоксические свойства циклофосфамида оценивали по уровню летальности, которая составила 25% (смерть наступала в сроки 7-10 сут после введения препарата). Однократное введение циклофосфамида вызывало снижение абсолютной массы тела на 19% (р<0,05) и абсолютной массы печени на 17% (р<0,05) к 3-м суткам после введения препарата; соответственно, относительная масса печени животных существенно не изменялась (табл. 1). К 14-м суткам после введения препарата масса тела оставалась сниженной (на 12%, р<0,05), тогда как масса печени восстанавливалась до уровня контроля, соответственно, относительная масса печени была увеличена (на 19%, р<0,05).

Тканевая реорганизация печени крыс после введения циклофосфамида. Морфологические изменения печени после однократного введения циклофосфамида проявлялись, прежде всего, в дистрофических, некробиотических и некротических изменениях гепатоцитов и в нарушениях кровообращения в виде неравномерного синусоидального и венозного полнокровия. Однако для каждого срока наблюдения эти изменения были выражены в разной степени. Через 3 сут наблюдения в перипортальной зоне преобладали явления дистрофии и некробиоза гепатоцитов (равномерная вакуолизация цитоплазмы, значительные отложения гликогена с измененными тинкториальными свойствами, «опустошенность» цитоплазмы, сморщенное ядро), в перицентральной зоне - выраженная субплазмалеммальная «вакуолизация» цитоплазмы гепатоцитов. Наблюдались также небольшие скопления липидных капель на синусоидальных полюсах гепатоцитов. Регенераторные реакции гепатоцитов в этот срок эксперимента заключались в усилении мито-тической активности гепатоцитов, особенно в перипортальной зоне,

Таблица 1. Результаты морфометрического исследования крыс Вис-тар после введения циклофосфамида (М±ш)

Показатель Контроль Введение циклофосфамида

3 сут 14 сут

Масса тела, г 235,5±9,46 191,70±6,72* 206,40±16,33*

Масса печени, г 11,057±0,586 9,210±0,349* 11,458±0,968

Относительная масса печени, мг на 1 г массы тела 46,75±1,34 48,07±0,77 55,62±1,96*

Примечание. * - р < 0,05 при сравнении с контролем.

и в увеличении доли двуядерных гепагоцитов как в перипортальной, так и в перицентральной зонах дольки печени.

Характерной особенностью структурной реорганизации тканевого микрорайона печени после токсического действия циклофосфамида была значительная гипертрофия клеток Купфера и тромбирование ими просветов синусоидных капилляров. Следует отметить, что эти клетки часто содержали липидные включения.

Через 14 сут после однократного введения циклофосфамида печень приобретала выраженный «ячеистый» вид из-за расширения и полнокровия синусоидных капилляров. Во всех зонах дольки печени наблюдались обильные скопления гипертрофированных клеток Купфера, плазмоцитов, сегментоядерных лейкоцитов, об-турирующих просвет синусоидных капилляров. Отмечался выраженный полиморфизм эритроцитов (преобладание «звездчатых» форм), который рассматривается нами как одно из проявлений цитотоксического эффекта циклофосфамида. Митотической активности гепатоцитов в этот срок эксперимента не наблюдалось; доля двуядерных гепатоцитов в обеих зонах дольки была уменьшена как по сравнению с контролем, так и по сравнению с 3 сут после введения препарата.

При РАБ-реакции выявлено снижение количества гликогена во всех гепатоцитах дольки, но наиболее «опустошенными» выглядели гепатоциты в перипортальных зонах; гранулы полисахарида были сконцентрированы преимущественно перинуклеарно. Во многих гепатоцитах сохранялась значительная «вакуолизация» и метахро-мазия цитоплазмы. Увеличивалось количество некробиотически

измененных гепатоцитов, наблюдались некрозы гепатоцитов (преобладание литических повреждений). Перипортально регистрировались немногочисленные гепатоциты с выраженной маргинальной конденсацией гетерохроматина в ядрах и деструктурированной цитоплазмой, которые можно было отнести к апоптотически измененным. В очагах некроза гепатоцитов отмечалась интенсивная мононуклеарная инфильтрация. Усиливались склеротические процессы (преимущественно в портальных зонах) - развивался выраженный портальный склероз, строма портальных трактов была инфильтрирована мононуклеарными клетками так, что инфильтраты образовывали протяженные массивные муфтообразные скопления вдоль сосудов и желчных протоков.

Стереологический анализ печени крыс после введения циклофосфамида. Через 3 сут после введения циклофосфамида и в перипортальной, и в перицентральной зонах снижалась объемная плотность гепатоцитов (на 12%) и увеличивалась их поверхностная плотность (на 11 и 10%) (табл. 2,3). Поскольку изменения объемной и поверхностной плотности гепатоцитов носили противоположный характер, то это обусловливало увеличение их поверхностно-объемного отношения (на 23 и 26%, р<0,05) и свидетельствовало об уменьшении размеров гепатоцитов.

Объемная и поверхностная плотности ядер гепатоцитов в перипортальной зоне, так же как и их поверхностно-объемное отношение, существенно не изменялись. В перицентральной зоне объемная плотность ядер гепатоцитов также не изменялась, а поверхностная увеличивалась (на 14%), что приводило к росту их поверхностно-объемного отношения (на 13%, р<0,05). Эти данные свидетельствовали об увеличении в перицентральной зоне количества мелких двуядерных гепатоцитов. Количественная оценка популяции гепатоцитов и в перипортальной, и в перицентральной зонах в этот срок показала существенное увеличение через 3 сут после введения циклофосфамида доли двуядерных клеток (на 26 и 32%) (табл. 4). Ядерно-цитоплазмаггическое отношение возрастало и в перипортальной, и в перицентральной зонах (на 27 и 15%, р<0,05), что отражало возможную полиплоидию ядер гепатоцитов вследствие усиления биосинтетических процессов.

В перипортальной и перицентральной зонах увеличивались объемная (соответственно на 14 и 15%) и поверхностная (на 17 и 7%) плотности синусоидных капилляров, при этом их поверхност-

Таблица 2. Тканевый стереологический анализ перипортальной зоны печени крыс Вистар после однократного введения циклофос-фамида (М±т)

Показатель Контроль Время после введения циклофосфамида

3 сут 14 сут

Объемная плотность (мм3/ см3):

гепатоцитов 676,7±103,7 595,0±25,3 640,0±15,3

ядер гепатоцитов 51,7±3,1 55,0±5,0 50,0±0,001

синусоидных капилляров 173,3±21,4 197,5±16,5 193,3±6,7

соединительнотканных клеток 21,7±4,8 20,0±0,001 30,0±5,7*

волокон и основного вещества соединительной ткани 128,3±20,9 187,5±10,3* 136,7±12,0

Поверхностная плотность (м2/см3):

гепатоцитов 0,138±0,006 0,153±0,008 0,163±0,003*

ядер гепатоцитов 0,037±0,003 0,040±0,004 0,037±0,003

синусоидных капилляров 0,118±0,011 0,138±0,009 0,140±0,025*

соединительнотканных клеток 0,025±0,005 0,023±0,003 0,037±0,007*

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с контролем.

но-объемное отношение существенно не изменялось. В результате разнонаправленного изменения объемных плотностей гепатоцигов и синусоидных капилляров в перипортальной и перицентральной зонах наблюдалось увеличение поверхностно-объемного отношения синусоидных капилляров к гепатоцитам (соответственно на 26%, р<0,05 и 20%) и объемного отношения синусоидных капилляров к гепатоцитам (соответственно на 24%, р<0,05 и 29%).

Значительным изменениям подвергались количественные характеристики клеток и основного вещества соединительной ткани. В перицентральной зоне наблюдалось существенное увеличение

Таблица 3. Тканевый стереологический анализ перицентральной зоны печени крыс Вистар после однократного введения циклофос-фамида (М±ш)

Показатель Контроль Время после введения циклофосфамида

3 сут 14 сут

Объемная плотность (мм3/ см3):

гепатоцитов 701,7±83,3 620,0±33,4 686,7±28,5

ядер гепатоцитов 51,7±3,2 52,5±2,5 50,0±0,001

синусоидных капилляров 158,3±17,2 182,5±13,2 190,0±20,8

соединительнотканных клеток 13,2±3,4 22,5±4,8 30,0±5,8*

волокон и основного вещества соединительной ткани 126,8±15,2 175,0±20,6* 93,3±16,7*

Поверхностная плотность (м2/см3):

гепатоцитов 0,127±0,008 0,140±0,014 0,153±0,007*

ядер гепатоцитов 0,035±0,002 0,040±0,0001 0,033±0,003

синусоидных капилляров 0,110±0,012 0,118±0,015 0,130±0,006«

соединительнотканных клеток 0,017±0,004 0,018±0,003 0,030±0,006*

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с контролем.

объемной плотности клеток соединительной ткани (на 71%) и снижение их поверхностно-объемного отношения (на 40%). В обеих зонах возрастала объемная плотность волокон и основного вещества соединительной ткани (на 46 и 38%, р<0,05).

Разнонаправленные изменения показателей стромальных и паренхиматозных структур печени обусловили увеличение объемного отношения стромы к паренхиме как в перипортальной, так и перицентральной зонах (соответственно на 35 и 42%, р<0,05).

Через 14 сут после введения циклофосфамида в перипортальной и перицентральной зонах отмечалось восстановление объемной

Таблица 4. Количественная оценка (%) популяции гепатоцитов печени крыс Вистар после введения циклофосфамида (М±ш)

Показатель Контроль Введение циклофосфана

3 сут 14 сут

Перипортальная зона

1-ядерные гепатоциты 91,3±1,8 89,0±1,8 93,7±1,2

2-ядерные гепатоциты 8,7±1,8 11,0±1,8 6,3±1,2

Перицентральная зона

1-ядерные гепатоциты 89,2±1,4 85,8±2,5 94,6±0,7*

2-ядерные гепатоциты 10,8±1,4 14,2±2,5 5,4±0,7*

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с контролем.

плотности гепатоцитов до уровня контрольных значений и увеличение их поверхностной плотности (соответственно на 18 и 21%, р<0,05) (см. табл. 2,3). Это приводило к достоверному увеличению поверхностно-объемного отношения этих структур в обеих зонах (на 21 %, р<0,05) и свидетельствовало об увеличении доли мелких гепатоцитов. Объемная и поверхностная плотности ядер гепатоцитов, а также ядерно-цитоплазматическое отношение восстанавливались до уровня контроля.

Количественная оценка популяции гепатоцитов в этот срок эксперимента показала существенное снижение доли двуядерных клеток в обеих зонах и увеличение доли одноядерных клеток как по сравнению с контролем (соответственно на 28 и 50%, р<0,05), так и по сравнению с 3-ми сутками эксперимента (соответственно на 43 и 62%) (см. табл. 4). Уменьшение доли двуядерных гепатоцитов через 14 сут после введения циклофосфамида свидетельствовало об истощении клеточной формы регенерации гепатоцитов.

В обеих зонах сохранялись увеличенными объемные (соответственно на 12 и 20%) и поверхностные (на 19 и 18%) плотности синусоидных капилляров, в результате чего их поверхностно-объемное отношение не изменялось по сравнению с контролем. Это обусловливало достоверное увеличение поверхностно-объемного отношения синусоидных капилляров к гепатоцитам (на 17%), а также объемного отношения синусоидных капилляров к гепатоцитам

(соответственно на 11 и 19%) в обеих зонах.

Следует отметить в этот срок в перипортальной и перицен-тральной зонах еще большее, по сравнению с 3 сут, увеличение объемной (соответственно на 38 и 127%, р<0,05) и поверхностной (на 48 и 77%, р<0,05) плотностей клеток соединительной ткани. Объемная плотность волокон и основного вещества соединительной ткани в перипортальной зоне возвращалась к контрольным значениям, а в перицентральной зоне - снижалась (на 26%, р<0,05). Объемное отношение стромы к паренхиме в этот срок наблюдения в перицентральной зоне возвращалось к уровню контроля, хотя в перипортальной зоне оставалось повышенным (на 11%).

Внутриклеточная реорганизация печени при действии циклофосфамида. Ультраструктура гепатоцитов, расположенных в перипортальной и перицентральной зонах печеночной дольки у интактных крыс, имела ряд особенностей. В перипортальной зоне в большинстве гепатоцитов содержалось большое количество гранул гликогена, который образовывал своеобразные «поля», расположенные между морфофункциональными комплексами, состоящими из митохондрий и цистерн гранулярной цитоплазмагической сети. В гепатоцитах перицентральной зоны присутствовало меньшее количество гранул гликогена, хорошо была развита гранулярная цитоплазмагическая сеть, профили которой образовывали характерные морфофункциональные комплексы и были равномерно распределены по клетке. В гепатоцитах обеих зон хорошо была развита агранулярная цитоплазмагическая сеть.

Через 3 сут после однократного введения циклофосфамида особенности внутриклеточной организации гепатоцитов в перипортальной и перицентральной зон сохранялись и усиливались. В гепатоцитах перипортальной зоны большую часть цитоплазмы занимали обширные «поля» гликогена. Митохондрии характеризовались умеренным полиморфизмом, цистерны гранулярной цитоплазматической сети часто образовывали футляры вокруг митохондрий и формировали протяженные плотно упакованные стопки, особенно вблизи ядер. На синусоидальном полюсе часто располагались мелкие липидные капли, которые подвергались миелиноподобной трансформации и неравномерному истощению. В некоторых гепатоцитах отмечались субплазмалеммальные скопления гетерогенных вакуолей, иногда с мембранными структурами внутри. На синусоидальных полюсах и вдоль латеральных мембран

гепатоцитов располагались также многочисленные остаточные тельца, которые выводились в пространство Диссе. В отдельных гепатоцитах перипортальной зоны отмечалось неравномерное расширение и укорочение цистерн гранулярной цитоплазмати-ческой сети. Во всех гепатоцитах была значительно редуцирована агранулярная цитоплазматическая сеть, ее везикулы практически не выявлялись.

Гепатоциты перицентральной зоны содержали меньшее количество гликогена; большая часть цитоплазмы была занята митохондриями и многочисленными цистернами гранулярной цитоплазматической сети. В некоторых гепатоцитах субплазмалем-мально также располагались небольшие липидные включения или вакуолеобразные остаточные тельца с хлопьевидным содержимым. Митохондрии во всех гепатоцитах содержали электронно-плотный матрикс, в котором плохо различались немногочисленные, иногда расширенные, кристы. Ядра гепатоцитов в обеих зонах содержали преимущественно эухроматин и небольшое количество гетерох-роматина в виде глыбок. Ядрышки, как правило, были крупными, петлистыми, но состояли в основном из фибриллярного материала, что отражало нарушение процессов формирования рибосом.

Характерной особенностью внутриклеточной реорганизации гепатоцитов обеих зон через 3 сут после введения циклофосфамида были лизис и секвестрация гранул гликогена, которые регистрировались во всех клетках, но различались по интенсивности. В наибольшей степени лизис и секвестрация гликогена были выражены в гепатоцитах перипортальной зоны. Здесь отмечались образование светлого ободка вокруг гранул гликогена, формирование мелких миелиноподобных (остаточных) телец среди скоплений гликогена, выведение их в пространство Диссе.

На билиарных полюсах гепатоцитов в обеих зонах скапливались вторичные лизосомы, хорошо был развит пластинчатый комплекс Гольджи, ультраструктура которого отличалась от ортодоксальной. Пластинчатый комплекс Гольджи был представлен расширенными по периферии диктиосомами, которые, как правило, не образовывали стопки и содержали хлопьевидную субстанцию. Желчные капилляры были спавшимися, не содержали желчи, в ряде случаев в них отмечалась плотная упаковка микроворсинок.

Пространство Диссе было, как правило, заполнено хлопьевидной субстанцией, в которую были погружены микроворсинки гепато-

цитов. В некоторых участках печеночной дольки в пространстве Диссе располагались утолщенные пучки коллагеновых волокон, фиброциты, клетки Купфера, лимфоциты, плазматические клетки. Звездчатые клетки (липид-содержащие фибробласты) встречались редко. Клетки Купфера, лимфоциты и плазмоциты были представлены функционально активными формами. Функционально активные клетки Купфера характеризовались многочисленными микроворсинками, содержанием в цитоплазме большого количества лизосом и фагосом, митохондрий, хорошо развитой гранулярной цитоплазматической сетью; во многих клетках Купфера присутствовали липидные включения.

В активных формах лимфоцитов хорошо была развита ци-топлазматическая часть клеток, в которой содержались большое количество рибосом, везикулярные профили гранулярной цитоплазматической сети; мелкие митохондрии располагались в основном перинуклеарно. В активированных формах плазмоцитов хорошо была развита гранулярная цитоплазматическая сеть, цистерны которой образовывали характерные стопки; во многих клетках цистерны были неравномерно расширены и содержали плотную хлопьевидную субстанцию. Для активных форм лимфоцитов и плазмоцитов характерным было формирование цитоплазматических выростов и микроворсинок.

Значительным изменениям подвергалось микроциркуляторное русло печеночной дольки. Через 3 сут после введения циклофос-фамида регистрировалась гетерогенность эндотелиоцитов синусо-идных капилляров, которая была обусловлена преимущественно присутствием в эндотелиальной выстилке активированных форм клеток и некробиотически измененных клеток. Активированные эндотелиоциты были преимущественно электронно-плотными, гипертрофированными, в них хорошо была развита гранулярная цитоплазматическая сеть, присутствовали митохондрии, многочисленные окаймленные везикулы, микротрубочки, единичные мелкие липидные капли и остаточные тельца с хлопьевидным содержимым, сходные по структуре с таковыми в гепатоцитах. Ядра активированных эндотелиоцитов были крупными, полиморфными, содержали эухроматин и маргинально расположенный гетерохроматин. Ядерная оболочка в некоторых случаях образовывала инвагинации. Люминальная поверхность эндотелиоцитов часто образовывала утолщенные выросты. Вблизи активированных эндотелиоцитов

располагались пучки коллагеновых волокон, которые часто охватывали выросты эндотелиальных клеток. Некробиотически измененные эндотелиоциты были электронно-прозрачными, в них регистрировались те же органеллы, но плазматическая мембрана была неравномерно повреждена. В некоторых синусоидах некроз эндотелиоцитов обусловливал нарушение целостности эндотели-альной выстилки.

Через 14 сут после введения циклофосфамида ультраструклур-ные изменения гепатоцитов в обеих зонах усиливались. В первую очередь это касалось тонкого строения митохондрий и скоплений гранул гликогена. В перипортальной зоне скопления гликогена формировали еще более обширные «поля». Среди гранул гликогена в некоторых гепатоцитах располагались гетерогенные липидные включения. В некоторых липидных каплях находились скопления гликогена; в таких зонах по периферии всех липидных капель формировалась плотная кайма из гранул гликогена. Митохондрии и профили гранулярной цитоплазматической сети образовывали характерные комплексы. Тонкая структура митохондрий была значительно изменена, они содержали, как правило, электронно-плотный матрикс, но кристы в них практически не дифференцировались. В некоторых случаях отмечалась осмиофильная дегенерация митохондрий с образованием остаточных телец.

В гепатоцитах перицентральной зоны скопления гликогена были меньших размеров. Но здесь так же, как и в перипортальной зоне, постоянно регистрировались явления секвестрации гликогена - формирование светлых ободков вокруг гранул, появление среди гликогена вакуолей с мембранными структурами и истощающимися гранулами полисахарида. Ядра гепатоцитов отличались небольшим полиморфизмом: в одних гепатоцитах ядра содержали только эух-роматин, в других - гетерохроматин в виде глыбок и маргинально расположенных скоплений. Ядрышки, как правило, были крупными, петлистыми, содержали не только фибриллярный, но и гранулярный материал, что свидетельствовало о восстановлении сборки рибосом.

На билиарных полюсах гепатоцитов в обеих зонах наблюдались скопления вторичных лизосом и многочисленные структурные элементы гиперплазированного комплекса Гольджи. Диктиосомы комплекса Гольджи, как правило, были расширены по периферии и содержали всегда хлопьевидный материал. В составе везикулярной

части комплекса Гольджи хорошо различались многочисленные окаймленные везикулы. Вблизи билиарных полюсов часто наблюдались митохондрии с деструктурированными кристами или подвергающиеся миелиноподобной трансформации.

Пространства Диссе, как правило, были сужены, в них располагались микроворсинки гепатоцитов, редко встречались небольшие утолщенные пучки коллагеновых волокон. В пространство Диссе выводились остаточные тельца, которые располагались субплаз-малеммально. Эндотелиоциты синусоидов были представлены преимущественно активированными формами, формировали часто цитоплазматические выросты, активно фагоцитировали выводимые из гепатоцитов остаточные тельца. В некоторых случаях отмечалось тотальное разрушение эндотелиальной выстилки синусоидных капилляров, в таких участках отмечалась активация клеток Купфера и нейтрофилов.

Для ультраструктуры активированных клеток Купфера характерным было формирование многочисленных выростов плазматической мембраны - морфологического эквивалента усиления фагоцитоза. В цитоплазме клеток Купфера различались профили хорошо развитой гранулярной цитоплазматической сети, небольшие фагосомы и мелкие липидные включения, иногда - апоптотические тельца.

В разрывах эндотелиальной выстилки встречались звездчатые клетки с хорошо развитой гранулярной цитоплазматической сетью и единичными липидными включениями. Липидные включения содержались не только в звездчатых клетках, но также и в некоторых плазматических клетках, которые мигрировали в пространство Диссе. В этот срок эксперимента часто регистрировались явления периполеза и эмпериполеза. В некоторых случаях лимфоциты образовывали протяженные цитоплазматические выросты, что позволяло им внедряться между гепатоцитами. В просветах синусоидов встречались также нейтрофилы.

Важной особенностью циклофосфамидного поражения печени была массивная обтурация синусоидных капилляров, которая носила распространенный характер. Среди клеток, обтурирующих соину-соиды, чаще всего встречались клетки Купфера и лимфоциты. В некоторых синусоидах наблюдался некробиоз и разрушение клеток, обтурирующих просветы.

По данным электронно-микроскопического анализа, ультраструктурная реорганизация печеночной дольки после однократного

введения циклофосфамида была обусловлена изменениями тонкой структуры двух основных клеточных популяций - гепатоцитов и эндотелиоцитов синусоидов и реактивными изменениями мигрирующих в пространство Диссе клеток Купфера, лимфоцитов, плаз-моцитов. Ультраструкгурная реорганизация пространств Диссе заключалась в его значительном сужении, появлении в нем единичных утолщенных пучков коллагеновых волокон, остаточных телец.

Внутриклеточная реорганизация гепатоцитов после однократного введения циклофосфамида была обусловлена выраженными изменениями тонкой структуры митохондрий, транзиторными изменениями гранулярной цитоплазматической сети, значительной редукцией гладкой цитоплазматической сети, гиперплазией и гипертрофией структурных элементов комплекса Гольджи, формированием массивных скоплений гликогена и его усиливающейся секвестрацией и аутофагоцитозом с формированием многочисленных субплазмаллемальных остаточных телец.

Внутриклеточная реорганизация эндотелиоцитов определялась интенсификацией обменных процессов и фагоцитоза, что вызывало гипертрофию клеток. Для ультраструктурного фенотипа эндотелиоцитов характерным было присутствие в цитоплазме хорошо развитой гранулярной цитоплазматической сетью, многочисленных везикулярных структур, микротрубочек, остаточных телец (фагосом), формирование выростов на люминальной поверхности клеток.

По данным стереологического анализа, у крыс Вистар на 3-й сутки после введения циклофосфамида в гепатоцитах отмечено пропорциональное снижение объемной и поверхностной плотностей митохондрий (на 4%), что обусловило сохранение их поверхностно-объемного отношения на уровне контрольных значений и свидетельствовало о снижении количества структур (табл. 5). Объемная и поверхностная плотности гранулярной цитоплазматической сети увеличивались (соответственно на 16 и 9%), в результате чего наблюдалось уменьшение поверхностно-объемного отношения этой структуры (на 5%). В результате увеличения объемной плотности гранулярной цитоплазматической сети (на 16%) и снижения объемной плотности митохондрий (на 4%) возрастало объемное отношение гранулярной сети к митохондриям (на 24%).

Следует отметить снижение объемной и поверхностной плотности липидных капель (на 82 и 73%). Происходило увеличение объемной плотности вторичных лизосом (на 27%), что было связано

Таблица 5. Ультраструктурный стереологический анализ гепатоци-тов крыс Вистар после введения циклофосфамида (М±ш)

Показатель Контроль Введение циклофосфамида

3 сут 14 сут

Объемная плотность (мм3/см3):

митохондрий 305,8±27,4 293,1±16,6 232,2±15,5*

гранулярной эндоплаз-матической сети 68,9±4,8 80,2±18,1 70,0± 12,4

липидных капель 18,2±10,2 3,3±2,1 15,1±12,9

лизосом 1,5±0,4 1,9±0,5 6,4±2,4

цитоплазматического матрикса 612,8±38,7 621,5±13,8 676,3±13,4

Поверхностная плотность (м2/см3):

митохондрий 1,857±0,168 1,779±0,114 1,474±0,050*

гранулярной эндоплаз-матической сети 2,600±0,292 2,815±0,356 2,697±0,328

липидных капель 0,057±0,031 0,015±0,006 0,062±0,029

лизосом 0,020±0,006 0,020±0,006 0,070±0,026

Поверхностно-объемное отношение (м2/см3):

митохондрий 6,1±0,1 6,1±0,5 6,4±0,5

гранулярной эндоплаз-матической сети 39,0±6,8 37,1±2,9 39,5±2,8

липидных капель 2,3±0,8 4,5±2,3 4,0±1,3

лизосом 13,2±1,1 10,3±1,3 11,4±1,2

Объемное отношение гранулярной эндоп-лазматической сети к митохондриям (число): 0,227±0,010 0,282±0,074 0,301±0,051

Примечание. * - р < 0,05 при сравнении с контролем.

с усилением процессов аутофагоцитоза.

Через 14 сут после введения циклофосфамида в гепатоцитах крыс Вистар отмечено более существенное по сравнению с 3 сут пропорциональное снижение объемной и поверхностной плотностей митохондрий (соответственно на 24 и 21 %, р<0,05), что обусловило незначительное увеличение их поверхностно-объемного отношения (на 5%) (см. табл. 5) и свидетельствовало о снижении числа орга-нелл в клетке. Объемная и поверхностная плотности гранулярной цитоплазматической сети восстанавливались до уровня контрольных значений, соответственно, поверхностно-объемное отношение этой структуры не изменялось по сравнению с контролем. В результате восстановления объемной плотности гранулярной цитоплазматической сети до уровня контрольных значений и снижения объемной плотности митохондрий (на 24%) возрастало объемное отношение гранулярной сети к митохондриям (на 33%).

Следует отметить снижение объемной (на 17%) и увеличение поверхностной плотности липидных капель (на 11%), что обусловливало увеличение их поверхностно-объемного отношения (на 74%) и свидетельствовало об укрупнении данных включений. В результате усиления аутофагических процессов отмечено дальнейшее увеличение объемной и поверхностной плотности лизосом (на 327 и 250%). Объемная плотность цитоплазматического матрикса увеличивалась на 10%.

Данные стереологического анализа свидетельствуют о том, что у крыс Вистар через 3-й 14 сут после введения циклофосфамида происходят значительные изменения пространственной организации гепатоцитов. При этом через 3 сут пространственная реорганизация гепатоцитов определяется преимущественно увеличением структурной плотности гранулярной цитоплазматической сети и снижением структурной плотности липидных капель. Через 14 сут пространственная реорганизация гепатоцитов определялась значительным уменьшением структурной плотности митохондрий на фоне восстановления структурной плотности гранулярной цитоплазматической сети и увеличения данного параметра для лизосом.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что циклофосфамид вызывает значительные морфофункциональные изменения печени, сходные с таковыми при действии других противоопухолевых препаратов (Молодых О.П. и др., 2006), несмотря на данные о легких повреждениях печени при большой дозе данного

препарата (Abraham P., Sugumar E., 2008). Возможным механизмом длительного повреждающего воздействия однократного введения циклофосфамида может быть несостоятельность репарации основного звена сосудистого русла печени - синусоидов. Показано, что циклофосфамид активно разрушает эндотелий синусоидов печени (DeLeve L.D. et al., 2002; Malhi H. et al., 2002). При многократном введении малых доз циклофосфамида установлена также патогенетическая роль истощения функциональных возможностей системы антиоксидантной защиты гепатоцитов и активации свободноради-кальных процессов, что вызывает интенсификацию перекисного окисления липидов и повреждение мембранных структур (DeLeve L.D., 1996).

ВЫВОДЫ

1. Гепатотоксические эффекты циклофосфамида (в дозе 125 мг/ кг) проявляются в уменьшении массы печени в ранние сроки после введения препарата, структурной реорганизации печеночной дольки и внутриклеточной реорганизации гепатоцитов. Структурные изменения печени и ультраструктурные изменения гепатоцитов и синусоидов нарастают по мере увеличения срока после однократного введения циклофосфамида.

2. Однократное введение циклофосфамида вызывает выраженные морфофункциональные изменения печени (мелкоочаговые некрозы гепатоцитов преимущественно в перипортальной зоне, мононуклеарную клеточную инфильтрацию), развивающиеся на фоне нарушений кровообращения. Важной особенностью цикло-фосфамидного поражения печени является массивная обтурация синусоидных капилляров, наиболее выраженная в перипортальной зоне. Среди клеток, обтурирующих синусоиды, чаще всего встречаются клетки Купфера и лимфоциты.

3. Ключевым моментом пространственной реорганизации печени после введения циклофосфамида является снижение объемной плотности гепатоцитов, увеличение их поверхностной плотности и поверхностно-объемного отношения. К важным изменениям пространственной реорганизации печени при действии циклофосфамида относится также увеличение объемной и поверхностной плотностей синусоидов в результате возрастающего полнокровия

сосудов и стаза клеточных элементов крови с развитием в более поздние сроки тромбоза.

4. Регенераторные реакции гепатоцитов в ранние сроки после однократного введения циклофосфамида (3 сут) заключаются в активации их митотического деления и увеличении доли двуядерных клеток, преимущественно в перипортальной зоне. В более поздние сроки (14 сут) происходит уменьшение митотической активности гепатоцитов, в популяции гепатоцитов преобладают одноядерные клетки.

5. Внутриклеточная реорганизация гепатоцитов после однократного введения циклофосфамида определяется выраженными изменениями тонкой структуры митохондрий, транзиторными изменениями гранулярной цитоплазматической сети, значительной редукцией гладкой цитоплазматической сети, гиперплазией и гипертрофией структурных элементов комплекса Гольджи, формированием массивных скоплений гликогена и его усиливающейся секвестрацией и аутофагоцитозом с формированием многочисленных субплазмалеммальных остаточных телец. Для пространственной реорганизации гепатоцитов в ранние сроки после воздействия циклофосфамида характерно значительное снижение структурной плотности гранулярной цитоплазматической сети, в более поздние сроки - восстановление количественных характеристик данной структуры, но снижение структурной плотности митохондрий.

6. Внутриклеточная реорганизация эндотелиоцитов обусловлена интенсификацией обменных процессов и фагоцитоза, что вызывает их гипертрофию. Для ультраструкгурного фенотипа эндотелиоцитов характерно присутствие в цитоплазме хорошо развитой гранулярной цитоплазматической сети, многочисленных везикулярных структур, микротрубочек, остаточных телец (фагосом), формирование выростов на люминальной поверхности клеток.

7. Ультраструктурная реорганизация печеночной дольки после однократного введения циклофосфамида определяется изменениями тонкой структуры двух основных клеточных популяций печени - гепатоцитов и эндотелиоцитов синусоидов, а также реактивными изменениями мигрирующих в пространство Диссе клеток Купфера, лимфоцитов, плазмоцитов. Ультраструктурная реорганизация пространств Диссе заключается в его значительном сужении, появлении в нем единичных утолщенных пучков коллагеновых волокон и остаточных телец.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Молодых О.П., Лушникова Е.Л., Непомнящих JI.M., Бакулина А А., Сорокина Ю.А. Морфологические изменения печени при гепатотокси-ческом воздействии доксорубицина // Сиб. науч. вестн. - 2009. - Вып. 12. -С. 58-62.

2. Бакулина A.A., Сорокина Ю.А. Морфологические изменения печени крыс при гепатотоксическом воздействии доксорубицина // Ежегодный конкурс-конференция студентов и молодых ученых «Авиценна-2009». - Новосибирск, 2009. - С. 128 - 129.

'3. Сорокина Ю.А., Молодых О.П., Лушникова Е.Л. Морфологические изменения печени при действии циклофосфана // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: 4-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием. - Новосибирск, 2009. - С. 245 - 246.

4. Непомнящих Л.М., Молодых О.П., Лушникова Е.Л., Сорокина Ю.А. Морфогенез и гистостереологический анализ гепатопатии, индуцированной циклофосфамидом // Бюл. экспер. бнол. - 2010. - Т. 149, № 1. - С. 113-120.

5. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Сорокина Ю.А., Молодых О.П. Морфогенез и гистостереологический анализ гепатопатии, индуцированной циклофосфамидом // Сиб. науч. вестн. - 2010. - Вып. 13. - С. 70 - 73.

6. Молодых О.П., Сорокина Ю.А., Бакулина A.A. Циклофосфамид-ин-дуцированное поражение печени // XVII Национальный конгресс «Человек и лекарство». - Москва, 2010. - С. 682.

Соискатель

Ю.А.Сорокина

iO- 1S866

Подписано в печать 16.04.2010. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 45. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 333-37-39

2009197407

Актуальность темы. Гепатотоксические эффекты различных лекарственных препаратов постоянно находятся в центре внимания исследователей и клиницистов и представляют одну из наиболее сложных и трудно разрешимых проблем современной медицины. Это обусловлено, в частности, тем обстоятельством, что тяжелые поражения печени и летальные исходы отмечены в основном при передозировке некоторых лекарственных препаратов (например, ацетаминофена) и для большинства препаратов являются очень редкими событиями (Lee W.M., 2003; Navarro V.J., Senior J.R., 2006). В то же время, по данным проведенных в последние десятилетия исследований, спектр гепатотоксических эффектов многих часто применяемых препаратов весьма обширен и разнообразен, особенно у детей (Chitturi S., George J., 2002). К числу наиболее распространенных препаратов с возможными ге-патотоксическими эффектами относят нестероидные противовоспалительные средства, антигипертензивные, противоопухолевые и антидиабетические агенты, антиконвульсанты, некоторые психотропные лекарственные препараты, статины и др. (Ивашкин В.Т. и др., 1999; Никитин И.Г. и др., 2005; Непомнящих Г.И. и др., 2008; Молодых О.П. и др., 2008).

Патогенез лекарственно-индуцированной гепатопатии очень сложен и во многих случаях не ясен. Важная роль в нем принадлежит вводимым в организм цитотоксическим агентам (Jaeschke Н. et al., 2002; Hilmer S.N. et al., 2004) и метаболитам, которые образуются в гепатоцитах в результате биотрансформации лекарственных препаратов и могут обладать более выраженными цитотоксическими свойствами (Minotti G. et al., 2001; Park В.К. et al., 2005). Существенное значение играют также ишемические повреждения печени, которые возникают в результате развития хронической сердечной недостаточности или синусоидального обструктивного синдрома (токсического генеза) (Молодых О.П. и др., 2006; DeLeve L.D. et al., 2002).

Токсические повреждения печени чаще всего развиваются после проведения химиотерапии и могут отражать гепатотоксические эффекты применяемых в онкологии лекарственных препаратов (King P.D., Perry М.С., 2001). Гепатотоксичность цитостатических препаратов, применяемых в противоопухолевой терапии, изучена в меньшей степени, поскольку считается, что поражения кроветворной и репродуктивной систем, а также миокарда (развитие кардиомиопатии) являются основными побочными эффектами ан-тибластомной терапии. При оценке возможных гепатотоксических эффектов тех или иных препаратов в клинических условиях важно учитывать предсу-ществующее состояние органа, развитие каких-либо патологических процессов, наличие вирусных гепатитов, других инфекций, дефицита питательных веществ и т.п. В то же время при изучении морфологии печени после введения экспериментальным животным некоторых цитостатических препаратов показано, что даже их однократное введение вызывает значительную структурную реорганизацию органа и изменяет его регенераторный потенциал (Гольдберг Е.Д. и др., 1998; Молодых О.П. и др., 2006).

Циклофосфамид - препарат, оказывающий алкилирующее воздействие на ДНК, широко используемый в противоопухолевой терапии (Амосова Е.Н. и др., 2003; Malet-Martino М., 1999) и как индуктор толерантности при трансплантации (Okano S. et al., 2001). При введении циклофосфамида в организм он метаболизируется в печени с образованием 7 основных метаболитов, из которых цитостатическим эффектом обладают альдофосфамид, азотный иприт, фосфамид иприта. Образовавшиеся метаболиты ингибируют рост быстро пролиферирующих, прежде всего опухолевых, клеток. Отсутствие избирательности действия и выявляемые уро-, нефро- и кардиотоксиче-ские свойства метаболитов циклофосфамида создают в ряде случаев серьезную проблему для его клинического использования (Лушникова E.JI. и др., 2007).

О гепатотоксических свойствах циклофосфамида существуют противоположные мнения. Одни исследователи считают, что печень наименее подвержена токсическому действию метаболитов циклофосфамида (Abraham P., Sugumar Е., 2008), другие, наоборот, полагают, что этот орган обладает высокой чувствительностью к цитотоксическому действию циклофосфамида (Полунина Т.Е., 1999; Кашуро В.А. и др., 2006). Выводы о гепато-токсичности циклофосфамида базируются в основном на опытах с многократным введением малых доз (до 20 мг/кг) или однократном введении большой дозы (150 мг/кг) препарата (Саратиков А.С. и др., 2004; Malhi Н. et al., 2002; Abraham P., Sugumar E., 2008). Наименее изученными при этом остаются вопросы, касающиеся морфогенетических процессов, индуцируемых циклофосфамидом в печени, выраженности цитотоксических эффектов в отношении гепатоцитов и других клеточных популяций, а также интенсивности регенераторных реакций.

Для выяснения механизмов циклофосфанового поражения гепатоцитов необходимо изучение ультраструктурных изменений гепатоцитов с оценкой выраженности внутриклеточных регенераторных реакций, а также выяснение закономерностей и особенностей ремоделирования печени в этих условиях. Полученная информация имеет большое значение для разработки эффективных способов коррекции развивающихся побочных эффектов медикаментозной терапии.

Цель исследования - изучить характер ультраструктурной реорганизации печеночной дольки крыс при введении циклофосфана, выяснить особенности циклофосфановых повреждений гепатоцитов и выраженность клеточных и внутриклеточных форм их регенерации.

Для достижения данной цели были поставлены и реализованы следующие задачи:

1. Изучить характер пространственной реорганизации печеночной дольки крыс и особенности репаративной регенерации печени при моделировании циклофосфановых повреждений.

2. Установить с помощью электронно-микроскопического исследования основные типы циклофосфановых повреждений гепатоцитов.

3. Изучить особенности внутриклеточной реорганизации гепатоцитов при циклофосфановых повреждениях.

4. Изучить ультраструктуру тканевого микрорайона печени при циклофосфановых повреждениях.

Научная новизна. Впервые при проведении комплексного морфологического исследования печени крыс при действии циклофосфана выявлены особенности структурной реорганизации печеночной дольки и установлены особенности клеточной и внутриклеточной форм регенерации гепатоцитов. Впервые показано, что после однократного введения циклофосфамида развиваются выраженные морфофункциональные изменения печени (мелкоочаговые некрозы гепатоцитов преимущественно в перипортальной зоне, мононуклеарная клеточная инфильтрация), развивающиеся на фоне нарушений кровообращения. Важной особенностью циклофосфамидного поражения печени является массивная обтурация синусоидных капилляров мо-нонуклеарами, наиболее выраженная в перипортальной зоне. Впервые установлено, что ключевым моментом пространственной реорганизации печени после введения циклофосфамида является снижение объемной плотности гепатоцитов и увеличение объемной и поверхностной плотностей синусои-дов.

Впервые показано, что регенераторные реакции гепатоцитов развиваются в основном в ранние сроки после однократного введения циклофосфамида (3 сут) и заключаются в активации их митотического деления и увеличении доли двуядерных клеток, преимущественно в перипортальной зоне.

Впервые установлено, что внутриклеточная реорганизация гепатоцитов после однократного введения циклофосфамида определяется выраженными изменениями тонкой структуры митохондрий, транзиторными изменениями гранулярной цитоплазматической сети, значительной редукцией гладкой цитоплазматической сети, гиперплазией и гипертрофией структурных элементов комплекса Гольджи, формированием массивных скоплений гликогена и его усиливающейся секвестрацией и аутофагоцитозом с формированием многочисленных субплазмаллемальных остаточных телец. Для пространственной реорганизации гепатоцитов в ранние сроки после воздействия циклофосфамида характерно значительное снижение структурной плотности гранулярной цитоплазматической сети, в более поздние сроки -восстановление количественных характеристик данной структуры, но снижение структурной плотности митохондрий.

Впервые показано, что после однократного воздействия циклофосфамида происходит активация эндотелиоцитов синусоидов, для внутриклеточной реорганизации которых характерно наличие хорошо развитой гранулярной цитоплазматической сети, многочисленных везикулярных структур, микротрубочек, остаточных телец (фагосом), формирование выростов на люминальной поверхности клеток.

Впервые показано, что для ультраструктурной реорганизации печеночной дольки после однократного введения циклофосфамида характерно появление в просветах синусоидов и пространствах Диссе активированных форм клеток Купфера, лимфоцитов, плазмоцитов. Ультраструктурная реорганизация пространств Диссе заключается также в его значительном сужении, появлении в нем единичных утолщенных пучков коллагеновых волокон и остаточных телец.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о характере тканевой и внутриклеточной реорганизации печени, в том числе об основных типах циклофосфановых повреждений гепатоцитов и регенераторных стратегиях, что вносит существенный вклад в развитие представлений о структурных реакциях печени и особенностях ее регенерации при токсических воздействиях. Представлена ультраструктурная характеристика основных клеточных популяций печени в динамике циклофосфамид-ного повреждения. Полученные данные о качественных и количественных изменениях гепатоцитов могут быть использованы при разработке диагностических и прогностических критериев их состояния в условиях цитоток-сического повреждения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морфофункциональные изменения печени после однократного введения циклофосфамида заключаются в мелкоочаговых некрозах гепатоцитов преимущественно в перипортальной зоне, мононуклеарной клеточной инфильтрации, нарушениях кровообращения, вызванных, в том числе, массивной обтурацией синусоидных капилляров мононуклеарами.

2. Внутриклеточная реорганизация гепатоцитов после однократного введения циклофосфамида определяется выраженными изменениями тонкой структуры митохондрий, транзиторным уменьшением структурной плотности гранулярной цитоплазматической сети, значительной редукцией гладкой цитоплазматической сети, усилением секвестрации гликогена и аутофагоци-тоза с формированием многочисленных субплазмаллемальных остаточных телец.

3. Регенераторные стратегии гепатоцитов на клеточном уровне заключаются в усилении их митотической активности и увеличение доли дву-ядерных клеток в ранние сроки после однократного введения циклофосфамида. В более поздние сроки реализуются, в основном внутриклеточные формы регенерации, что проявляется в нормализации тонкой структуры ядрышек и восстановлении структурной плотности гранулярной цитоплазматической сети.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2009» (Новосибирск, 2009), 4-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009), межлабораторной научной конференции в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 1 - в рецензируемом журнале по списку ВАК:

1. Молодых О.П., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Бакулина А.А., Сорокина Ю.А. Морфологические изменения печени при гепатотоксиче-ском воздействии доксорубицина // Сиб. науч. вестн. - 2009. - Вып. 12. - С. 58-62.

2. Бакулина А.А., Сорокина Ю.А. Морфологические изменения печени крыс при гепатотоксическом воздействии доксорубицина // Ежегодный конкурс-конференция студентов и молодых ученых «Авиценна-2009». - Новосибирск, 2009. - С. 128 - 129.

3. Сорокина Ю.А., Молодых О.П., Лушникова Е.Л. Морфологические изменения печени при действии циклофосфана // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: 4-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием. - Новосибирск, 2009. - С. 245 - 246.

4. Непомнящих Л.М., Молодых О.П., Лушникова Е.Л., Сорокина Ю.А. Морфогенез и гистостереологический анализ гепатопатии, индуцированной циклофосфамидом // Бюл. экспер. биол. - 2010. - № 1. - С. 113 - 120.

5. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Сорокина Ю.А., Молодых О.П. Морфогенез и гистостереологический анализ гепатопатии, индуцированной циклофосфамидом // Сиб. науч. вестн. - 2010. - Вып. 13. - С. 70 - 73.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

123 ВЫВОДЫ

1. Гепатотоксические эффекты циклофосфамида (в дозе 125 мг/кг) проявляются в уменьшении массы печени в ранние сроки после введения препарата, структурной реорганизации печеночной дольки и внутриклеточной реорганизации гепатоцитов. Структурные изменения печени и ультраструктурные изменения гепатоцитов и синусоидов нарастают по мере увеличения срока после однократного введения циклофосфамида.

2. Однократное введение циклофосфамида вызывает выраженные морфофункциональные изменения печени (мелкоочаговые некрозы гепатоцитов преимущественно в перипортальной зоне, мононуклеарную клеточную инфильтрацию), развивающиеся на фоне нарушений кровообращения. Важной особенностью циклофосфамидного поражения печени является массивная обтурация синусоидных капилляров, наиболее выраженная в перипортальной зоне. Среди клеток, обтурирующих синусоиды, чаще всего встречаются клетки Купфера и лимфоциты.

3. Ключевым моментом пространственной реорганизации печени после введения циклофосфамида является снижение объемной плотности гепатоцитов, увеличение их поверхностной плотности и поверхностно-объемного отношения. К важным изменениям пространственной реорганизации печени при действии циклофосфамида относится также увеличение объемной и поверхностной плотностей синусоидов в результате возрастающего полнокровия сосудов и стаза клеточных элементов крови с развитием в более поздние сроки тромбоза.

4. Регенераторные реакции гепатоцитов в ранние сроки после однократного введения циклофосфамида (3 сут) заключаются в активации их ми-тотического деления и увеличении доли двуядерных клеток, преимущественно в перипортальной зоне. В более поздние сроки (14 сут) происходит уменьшение митотической активности гепатоцитов, в популяции гепатоцитов преобладают одноядерные клетки.

5. Внутриклеточная реорганизация гепатоцитов после однократного введения циклофосфамида определяется выраженными изменениями тонкой структуры митохондрий, транзиторными изменениями гранулярной цитоплазматической сети, значительной редукцией гладкой цитоплазматической сети, гиперплазией и гипертрофией структурных элементов комплекса Гольджи, формированием массивных скоплений гликогена и его усиливающейся секвестрацией и аутофагоцитозом с формированием многочисленных субплазмаллемальных остаточных телец. Для пространственной реорганизации гепатоцитов в ранние сроки после воздействия циклофосфамида характерно значительное снижение структурной плотности гранулярной цито-плазматической сети, в более поздние сроки - восстановление количественных характеристик данной структуры, но снижение структурной плотности митохондрий.

6. Внутриклеточная реорганизация эндотелиоцитов обусловлена интенсификацией обменных процессов и фагоцитоза, что вызывает их гипертрофию. Для ультраструктурного фенотипа эндотелиоцитов характерно присутствие в цитоплазме хорошо развитой гранулярной цитоплазматиче-ской сети, многочисленных везикулярных структур, микротрубочек, остаточных телец (фагосом), формирование выростов на люминальной поверхности клеток.

7. Ультраструктурная реорганизация печеночной дольки после однократного введения циклофосфамида определяется изменениями тонкой структуры двух основных клеточных популяций печени - гепатоцитов и эндотелиоцитов синусоидов, а также реактивными изменениями мигрирующих в пространство Диссе клеток Купфера, лимфоцитов, плазмоцитов. Ультраструктурная реорганизация пространств Диссе заключается в его значительном сужении, появлении в нем единичных утолщенных пучков коллагеновых волокон и остаточных телец.