Автореферат и диссертация по медицине (14.03.04) на тему:Токсиколого-гигиеническая характеристика триазавирина (натрия 7-метилтио-3-нитро-4-оксо-1,4-дигидро[1,2,4]триазоло[5,1-c] [1,2,4]триазин-1-ид дигидрата)

На правах рукописи

005008472

ЧЕРКАЩЕНКО Ольга Сергеевна

ТОКСИКОЛОГО-ГИГНЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТРИАЗАВИРИНА (НАТРИЯ 7-МЕТНЛТИО-3-ННТРО-4-ОКСО-1,4-ДИГИДРО|1,2,4|ТРИАЗОЛО[5,1-с1 |1,2,4|ТРИАП1Н-1-ИД ДИГИДРАТА)

14.03.04 - токсикология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 9 Я Н В 2012

Санкт-Петербург

2011

005008472

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «СевероЗападный научный центр гигиепы и общественного здоровья» Роспотребиадюра

Научный руководитель:

доктор медицинских наук.

профессор

Луковникова Любовь Владимировна

Официальные опноненты:

доктор медицинских наук.

профессор

Ливанов Георгий Александрович

доктор медицинских наук,

профессор

Глушков Сергей Иванович

Ведущая организация:

ФГУП «Научно-исследовательскнй институт гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России

Зашита диссертации состоится _ _ . . _ асов на заседании

диссертационного совета Д 208.030.01 при ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА России (192019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА России

0та^

«_»<у 2011 г.

Автореферат разослан «_»<

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Л.В.Луковникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Вторая половина XX и первая половина XXI века характеризуются интенсивным развитием фармакологии и фармацевтической промышленности. Об этом свидетельствует принятая Программа правительства Российской федерации, в соответствии с которой к 2020 году в России планируется синтезировать не менее 90 % препаратов, входящих в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарств. В этой связи большое значение приобретает оценка безопасности лекарственных препаратов, позволяющая обеспечить поступление на рынок лекарств, не наносящих ущерба здоровью человека и не обладающих опасными свойствами (Курляндский Б.А., 2010; Гуськова Т.А., 2010; Верстакова О.Л., 2010).

Промышленный синтез лекарственных препаратов может представлять реальную угрозу загрязнения окружающей среды и оказывать значительный вред здоровью людей, профессионально занятых в сфере фармацевтической индустрии. В резолюции 3-го съезда токсикологов России (2009) подчеркивается, что «...прямым следствием неудовлетворительных условий труда является высокий уровень профессиональных заболеваний химической этиологии». Основу профилактики острых и хронических профессиональных интоксикаций составляют научно обоснованные гигиенические регламенты химических веществ (ПДК, ОБУВ), которые являются необходимым количественным критерием для контроля содержания вредных химических веществ в воздухе рабочей зоны, расчёта риска здоровью населения, обоснования применения средств индивидуальной защиты и организации медицинских осмотров персонала.

Среди множества синтезируемых лекарственных препаратов средствам, проявляющим противовирусную активность, уделяется особенно пристальное внимание. По данным научно-исследовательского института Гриппа РАМН противовирусных средств лечения таких опасных инфекций, как желтая лихорадка и геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, особо опасные формы гриппа и атипичная коронавирусная пневмония до сих пор нет в мировой практике здравоохранения (Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита А.В, 2000; Деева Э.Г., 2008). Вследствие этого потребность в эффективных препаратах противовирусной терапии и химиопрофилактики чрезвычайно высока (Киселёв О.И., Маринич И.Г., Соминина A.A., 2003).

Анализ исторических и современных эпидемиологических данных показывает, что грипп остается непредсказуемой инфекцией, как с медицинской, так и социально-экономической точки зрения. Несмотря на успехи в создании противовирусных вакцин, ежегодно эпидемии гриппа охватывают многие страны и континенты. Прежде всего, это обусловлено антигенной новизной вирусов гриппа, их способностью к трансмиссии. Масштабы распространения эпидемий гриппа, высокая вирулентность вируса гриппа для человека стимулируют поиск новых эффективных средств противовирусной терапии и химиопрофилактики.

Триазавирин - оригинальный препарат, синтезированный Институтом органического синтеза им. И .Я. Постовского УрО РАН.

Триазавирин представляет собой противовирусный лекарственный препарат, относящийся к группе индукторов интерферона. Предназначен для лечения гриппа

(в том числе и птичьего), крымской геморрагической лихорадки, западного и восточного энцефаломиелита и других альфавирусных и буньявирусных инфекций.

Фармакологическая активность триазавирина достаточно хорошо изучена, однако данные о его токсичности и опасности при ингаляционном пути поступлении практически отсутствуют. В результате промышленного синтеза в воздух производственных помещений может поступать аэрозоль триазавирина и оказывать вредное действие на организм работающих. Внедрение современной технологии получения триазавирина требует исследования параметров токсичности и опасности названного противовирусного средства, особенно при ингаляционном пути поступлении, поэтому изучение токсических свойств и обоснование гигиенического регламента триазавирина для воздуха рабочей зоны является своевременным и актуальным.

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ФБУН «Северо-Западный научный центр гигиены и общественного здоровья» в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Гигиеническая безопасность России: проблемы и пути обеспечения на 2006-20 Юг.г.» по теме «Гигиеническая оценка факторов профессионального и экологического риска для населения и разработка мер по их снижению» (Номер государственной регистрации 01.2.00702346).

Цель настоящей работы - обосновать безопасный уровень воздействия триазавирина для здоровья работающих при его промышленном синтезе.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить параметры токсичности триазавирина на разных видах лабораторных животных при различных путях поступления;

2. Исследовать местное раздражающее, кожно-резорбтивное, аллергенное действие и способность триазавирина к кумуляции;

3. Оценить вероятность проявления мутагенного эффекта триазавирина;

4. Изучить влияние триазавирина на активность цитохром Р450-зависимых МОГ при ингаляционном и парентеральном пути поступлении в организм;

5. Исследовать действие препарата на репродуктивную функцию;

6. Изучить влияние триазавирина на уровень восстановленного глутатиона, активность глутатионпероксидазы и К+, №+-АТФ-азы при повторном введении;

7. Обосновать ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВр 3) триазавирина для воздуха рабочей зоны.

Научная новизна. Получены новые данные о характере вредного действия противовирусного препарата триазавирина при различных путях поступления в организм: в желудок, в брюшную полость, при ингаляции аэрозоля препарата.

Установлено, что по параметрам острой токсичности триазавирин относится к малоопасным соединениям (ГОСТ 12.1.007-76).

Показано, что триазавирин не раздражает кожные покровы, слизистые глаз и верхних дыхательных путей, не проникает через неповрежденную кожу, не вызывает сенсибилизации организма экспериментальных животных, характеризуется как соединение со слабовыраженной степенью кумуляции.

В опытах in vivo на клетках костного мозга установлено, что триазавирин не оказывает мутагенного эффекта после однократного введения в брюшную полость мышам обоего пола дозы 500 мг/кг (близкой к DLi6).

Триазавирин при введении в брюшную полость (1/3 DLS0), а также при ингаляционном поступлении в организм экспериментальных животных приводит к ингибированию активности реакций гидроксилирования цитохром Р450-зависимых МОГ.

Способность триазавирина модифицировать активность цитохром Р450-зависимых МОГ при парентеральном и ингаляционном поступлении в организм можно использовать как биомаркер эффекта при оценке вредного действия.

Экспериментально показано, что триазавирин, вводимый ежедневно в течение 30 дней в брюшную полость белых крыс (доза 0,0135 мг/кг, сопоставимая с ОБУВ) не оказывает влияния на репродуктивную функцию и общее состояние экспериментальных животных.

При ингаляционном поступлении концентраций значительно превышающих пороговый уровень (Limac) и повторном введении возрастающих доз по методу R.K. Lim et al (1961) установлено, что триазавирин приводит к снижению содержания гемоглобина в организме экспериментальных животных.

Полученные новые данные о токсичности и опасности триазавирина при различных путях поступления позволили обосновать величину гигиенического регламента (ОБУВ) для воздуха рабочей зоны.

Научно-практическая значимость. Результаты исследований позволили прогнозировать потенциальную опасность триазавирина для здоровья работающих в условиях производства данного препарата.

Выявленная способность триазавирина ингибировать активность цитохром Р45о-зависимых МОГ позволяет прогнозировать характер комбинированного действия препарата с другими химическими веществами при их одновременном поступлении в организм.

Величина гигиенического регламента (ОБУВ) триазавирина для воздуха рабочей зоны и сформулированные гигиенические рекомендации являются основным практическим результатом реализации диссертационного исследования.

Разработаны предложения по проведению периодических медицинских осмотров лиц, контактирующих с исследуемым препаратом на производстве. Положения, выносимые на защиту:

• по параметрам острой токсичности триазавирин относится к малоопасным соединениям (4 класс опасности, ГОСТ 12.1.007-76), характеризуется слабыми кумулятивными свойствами, не раздражает кожу и слизистые, не вызывает сенсибилизации организма экспериментальных животных, не проникает через неповрежденную кожу, не оказывает мутагенного эффекта;

• триазавирин, вводимый ежедневно в течение 30 дней в брюшную полость белых крыс на уровне ОБУВрз не оказывает влияния на репродуктивную функцию и общее состояние экспериментальных животных;

• способность триазавирина ингибировать активность цитохром Р45о-зависимых МОГ при различных путях поступления, можно использовать как биомаркер вредного действия при проведении экспериментальных исследований с целью обоснования гигиенического регламента;

• величина гигиенического регламента (ОБУВ) триазавирина для воздуха

рабочей зоны составляет 0,5 мг/м3.

Внедрение результатов исследования в практику. Материалы исследования использованы при создании нормативных и методических документов федерального уровня внедрения, необходимых для осуществления контроля содержания триазавирина в воздухе рабочей зоны предприятия. На основании выполненных экспериментальных исследований получены новые данные о токсичности и опасности триазавирина, которые позволили обосновать гигиенический регламент (ОБУВ) триазавирина для воздуха рабочей зоны на уровне 0,5 мг/м3 (Справка № 8/35-03-02/5-52 от 23.09.2010 Комиссии экспертов по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на ХХХХ1 научной конференции - Хлопинские чтения «Внутрибольничная инфекция. Эпидемиолого-гигиенические и клинические проблемы» (Санкт-Петербург, 2008), на втором Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008), на научной конференции с международным участием «Медицина труда. Здоровье работающего населения: достижения и перспективы (актуальные вопросы профпатологии)» (Санкт-Петербург, 2009), на мемориальной научной конференции «Академик АМН СССР З.Г. Френкель. 140 лет со дня рождения» (Санкт-Петербург, 2009), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы промышленной токсикологии» (Москва, 2010), на юбилейной научной конференции «Химическая безопасность России: медицинские и эколого-гигиенические аспекты» (Волгоград, 2011), на заседании экспертов Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Москва, 10.04, 2009).

Личный вклад автора. Автором проведен сбор и анализ научной литературы по теме диссертации, составлен план и разработана программа экспериментальных исследований по изучению токсичности и опасности триазавирина. Автором организованы и проведены исследования по всем разделам работы, самостоятельно проведена статистическая обработка, анализ и обобщение полученных результатов, а также оформление внедрения результатов исследования в практику. Доля участия автора в накоплении информации - 90%, в обработке результатов исследования -100%.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 13 научных работ, из них 3 в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, трёх глав, включающих: обзор научной литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований; заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Содержит 8 рисунков и 28 таблиц. Список литературы состоит из 245 источников, из них 182 отечественных и 63 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Триазавирин (C5H7N6Na05S) - натрия 7-метилтио-3-нитро-4-оксо-1,4-дигидро[1,2,4] триазоло[5,1-с] [1,2,4]триазин-1-ид дигидрат, М.м. 286,19, является синтетическим аналогом пуриновых нуклеозидов (гуанина) с выраженным противовирусным действием. По агрегатному состоянию представляет собой мелкокристаллический порошок или гранулы от светло-желтого до светло-коричневого цвета, горького вкуса, растворяется в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, ацетоне, плохо растворяется в воде, не растворяется в хлороформе. Основным механизмом действия триазавирина является ингибирование синтеза вирусных РНК и репликации геномных фрагментов (Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита A.B., 2000).

Экспериментальные исследования были выполнены на половозрелых беспородных белых мышах и крысах. Животные поступали из питомника «Рапполово» (РАМН) и содержались в виварии на стандартном рационе. Всего было использовано 450 крыс и 120 мышей. Общая схема исследований представлена на рисунке 1.

Обзор научной литературы по проблеме, поиск и анализ информации по токсичности н опасности противовирусных препаратов

Организация эксперимента, формирование экспериментальной базы

Определение параметров токсичности триазавирина

Оценка аллергенного

действия триазавирина

Экспериментальные исследования

Исследование раздражающего и кожно-резорбтивного действия триазавирина

ZZ1

Определение

пороговой концентрации однократного ингаляционного воздействия триазавирина

Оценка мутагенного эффекта триазавирина

Исследование - »- Изучение влияния

кумуляции триазавирина на

триазавирина репродуктивную

функцию

NT

Изучение влияния триазавирина на активность

ЦИТОХрОМ-р450

зависимых МОГ

Влияние триазавирина на уровень восстановленного глутатиона и активность глутатион-пероксидазы

Исследование влияния триазавирина на активность К1, Na'-АТФ-азы

Анализ полученных данных и обоснование безопасного уровня воздействия (ОБУВ) триазавирина для воздуха рабочей зоны

Рисунок 1. Общая схема экспериментальных исследований триазавирина

Определение параметров острой токсичности триазавирина проводилось на мышах с исходной массой 18-20 г и крысах массой 180 - 200 г. Исследуемое вещество вводили в желудок и брюшную полость в объёме 1 мл на 100 г массы тела крыс и 0,2 мл на 10 г массы тела мышей. Параметры острой токсичности рассчитывались методом пробит-анализа в модификации В.Б.Прозоровского (1962).

Определение пороговой концентрации однократного ингаляционного действия (Limac) аэрозоля триазавирина осуществляли при ингаляционной динамической подаче в специально сконструированных камерах для ингаляционных затравок мелких лабораторных животных (АС № 1183102 от 06.04.84) с применением специального дозатора, компрессора УК 40-2М, содержащего фильтр для очистки воздушного потока. Токсическое действие триазавирина при ингаляционном поступлении оценивали после 4-х часового воздействия концентраций 115, 62 и 5 мг/м3. У животных проводилось исследование основных функций и систем организма. Функциональное состояние центральной нервной системы изучали по способности к суммации подпороговых импульсов (СПП) по методу, предложенному В.В.Закусовым (1943, 1971, 1973), С.В.Сперанским (1965) и изменению поведенческих реакций по «норковому» рефлексу (Балынина Е.Г., Тимофеевская J1.A., 1978; Фролова А.Д. и соавт., 1980). Раздражающее действие на верхние отделы дыхательных путей оценивали по изменению частоты дыхания экспериментальных животных (Максимов Г.Г., 2006; Иванов Н.Г., 1973,1978).

Мембранотоксическое действие исследовали по устойчивости мембран эритроцитов к гемолизу (Гительзон И.И., Терсков И.А., 1969), содержание восстановленного глутатиона по методу G.L. Ellman (1959). Функцию печени изучали по активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови методом Райтмана-Френкеля (Елисеев Ю.Ю., 2010). Функцию почек оценивали по величине суточного диуреза, содержанию белка (Михневич В.И., 1966), хлоридов в моче (Травина О.В., 1955) и титруемой кислотности мочи (Берхин Е.Б. и соавт, 1972).

В крови животных определяли содержание эритроцитов (Воробьёв А.И., 1969), лейкоцитов и гемоглобина (Кушаковский М.С., 1968).

Оценку местного раздражающего и кожно-резорбтивного действия триазавирина проводили на белых мышах и крысах в соответствии с МУ № 280279 и МУ № 2196-80. Реакцию кожи на действие препарата оценивали визуально после воздействия и далее ежедневно в течение 10 дней по изменению внешнего вида кожных покровов у подопытных животных по сравнению с контрольными. Если раздражающее действие не выявлялось после однократной аппликации, то нанесение препарата повторялось в течение 10 дней.

Изучение раздражающего действия на слизистые глаз осуществляли при внесении в конъюнктивальный мешок глаза крыс 25% мази препарата на вазелиновой основе, с последующей регистрацией видимых и скрытых повреждений роговицы в течение 3 суток. Скрытые повреждения роговицы выявляли с помощью 1% раствора флюоресцеина в 2% растворе NaHC03.

Способность триазавирина проникать через неповрежденную кожу исследовали после однократных и повторных аппликаций, у животных регистрировали массу тела и поведение.

Исследование аллергенных свойств триазавирина проводили методом выявления гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на мышах (МУ 1.57896) при введении препарата в полном адьюванте Фрейнда (ПАФ).

Способность триазавирина к кумуляции оценивали по методу R.K. Lim et al (1961). Критерием оценки кумуляции служила гибель экспериментальных животных.

Изучение влияния триазавирина на репродуктивную функцию проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в пособии для врачей-токсикологов «Ускоренная оценка потенциальной опасности химических веществ для репродуктивной функции при их комплексном поступлении в организм животных» (2000).

Мутагенное действие триазавирина изучали методом микроядерного теста на мышах по К. Boller и W. Schmid (1970) и J. Heddle (1973). Микроядерный тест относится к скрининговым методам изучения мутагенного эффекта на клетках костного мозга in vivo и широко используется для выявления кластогенных химических соединений, способных вызывать структурные изменения хромосом.

Влияние триазавирина на активность цитохром Р450-зависимых МОГ оценивали косвенными методами: по времени окисления гексенала, характеризующему активность реакций гидроксилирования и по количеству выделенных метаболитов аминопирина с мочой. Нагрузка аминопирином позволяет последовательно оценить функциональную активность реакций гидроксилирования по выделению первого метаболита 4-аминоантипирина (4-ААП) и активность реакций ацетилирования по выделению второго метаболита ацетил-4-аминоантипирина (ацетил-4-ААП) (Арчаков А.И., 1975; Ляхович В.В., Цырлов И.Б., 1981; Леоненко О.Б., Попов Т.А., 1975).

Определение концентрации восстановленного глутатиона осуществляли с использованием 5,5'-дитио-бис(-2-нитробензойной кислоты) кислоты (ДТНБ) по методике G.L. Ellman (1959).

Активность глутатионпероксидазы определяли по методу А.Н. Гавриловой (1986) с использованием в качестве субстрата гидроперекиси трет-бутила (ГПТБ).

Определение активности К+, №+-АТФ-азы в мембранах эритроцитов выполняли по методикам Д.Д. Семенчука (1981) и В.К. Рыбальченко (1988).

Все исследования были выполнены с соблюдением правил гуманного отношения к животным в соответствии с требованиями «Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ВОЗ, Женева, 1985).

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel». Полученные экспериментальные данные подвергались статистической обработке с применением параметрических (критерий Стьюдента-Фишера) и непараметрических (метод Вилкоксона-Манна-Уитни) методов статистики (Саноцкий И.В., 1970; Гублер Е.В., 1973).

Результаты исследований

В соответствии с целью работы были проведены исследования по выявлению критериев вредного действия триазавирина при моделировании однократного и повторного поступления препарата в организм экспериментальных животных.

Клиника острого отравления триазавирином характеризовалась адинамией, частым поверхностным дыханием, регистрацией бокового положения. При введении смертельных доз триазавирина в желудок и брюшную полость гибель животных наступала в течение 3-10 минут. Параметры острой токсичности триазавирина представлены в таблице 1. Как видно из таблицы при поступлении в желудок триазавирин характеризуется как малоопасное соединение (ГОСТ 12.1.007-76), в брюшную полость - как практически не токсичное вещество (5 класс токсичности) по классификации К.К.Сидорова (1973).

Таблица 1 - Параметры острой токсичности триазавирина

Вид животных Способ введения Доза, мг/кг

вь16 оь50 оц4

Мыши в брюшную полость 876 1708 (1313,8-2220,4) 2540

в желудок 4860 7620 (6195-9373) 10380

Крысы в брюшную полость 498 1353 (1048-1745) 2211

в желудок > 10000

Исследования раздражающего действия показали, что триазавирин не оказывает раздражающего действия на кожу и не вызывает раздражения слизистых глаз, а также видимых и скрытых повреждений роговицы ни через 4 часа, ни через сутки после нанесения.

Оценка кожно-резорбтивного действия показала, что однократная и повторные аппликации триазавирина на кожу белых крыс не вызывали гибели животных, изменения массы тела и других симптомов интоксикации, что позволяет считать триазавирин препаратом, не представляющим опасности при контакте с неповрежденной кожей.

Выполненные исследования по выявлению аллергенного действия показали, что триазавирин не вызывает сенсибилизации организма экспериментальных животных и не является потенциальным аллергеном.

Для оценки мутагенного действия триазавирина использовали метод микроядерного теста. Триазавирин вводили однократно (500 мг/кг) в брюшную полость. Результаты исследования по выявлению микроядер в клетках костного мозга - полихроматофильных (ПХЭ) и нормохромных эритроцитах (НХЭ) показали, что доза триазавирина 500 мг/кг не оказывает мутагенного эффекта. Данные микроядерного теста обрабатывались методами параметрической и непараметрической статистики (таблица 2).

Таблица 2 - Результаты исследования мутагенного действия триазавирина после введения 500 мг/кг в брюшную полость мышей

Пол животных Группы животных п= 20 п ПХЭ/НХЭ Содержание ПХЭ с микроядрами (ед./500 ПХЭ)

Самцы контрольная 10 1,39+0,3 0,9

подопытная 10 1,29+0,15 р>0,05 1,0 р>0,05*

Самки контрольная 10 1,16±0,13 1,1

подопытная 10 1,19+0,17 р>0,05 1,0 р>0,05*

Обозначения:*- по методу Вилкоксона-Манна-Уитни

Исследования кумулятивных свойств триазавирина показали, что гибель животных не наступала даже при введении суммарной дозы равной 5 ОЬ50, не наблюдалось снижения массы животных и других признаков интоксикации. Величина Кч.м оказалась равной 5, что позволяет отнести триазавирин к веществам со слабовыраженными кумулятивными свойствами по классификации Л.И.Медведя (Каган Ю.С., 1970; Саноцкий И.В., Уланова И.П., 1975).

В условиях повторного эксперимента исследовали влияние триазавирина на репродуктивную функцию. Действие триазавирина на репродуктивную функцию изучали после введения в течение 30 дней в брюшную полость крыс дозы препарата, равной 0,0135 мг/кг, сопоставимой с ОБУВ р.з. (таблица 3).

Таблица 3 - Влияние триазавирина на развитие потомства после 30-дневного введения в брюшную полость крыс дозы 0,0135 мг/кг, сопоставимой с ОБУВр Показатели

Количество (п)

Эмбриональная смертность (%)

самок

плодов

доимплантационная

постимплантационная

общая внутриутробная

Кол-во плодов на одну самку

Контроль

13

136

13,4

1,3

14,5

10,5±0,6

Опыт

14

146_

10,0 р>0,05

1,61р>0,05

11,0 р>0,05

10,43+0,6 р>0,05

Средняя масса плодов (г)

2,5±0,16

2,3±0,06 р>0,05

Средняя длина плодов (см)

31,3±0,8

30,3+0,3 р>0,05

Коэффициент масса/длина плодов

0,08+0,003

0,076±0,001 р>0,05

Средняя масса плаценты (г)

0,52±0,03

Плодо-плацентарный индекс

21,4±1,6

0,51 ±0,03 р>0,05

23,0±1,4 р>0,05

Индекс выживаемости

85,5+4,9

88,9+4,2 р>0,05

Индуцированная гибель под действием фактора (%)_

-9,8

Как видно из представленных в таблице данным, не наблюдалось статистически достоверных изменений по таким показателям как: эмбриональная смертность, количество плодов в помёте, средняя масса и длина плодов, средняя масса плаценты, плодо-плацентарный индекс, индекс выживаемости у подопытных животных по сравнению с группой контрольных животных. Масса тела и динамика ее прироста у подопытных и контрольных животных не имели различий на всем протяжении беременности. Полученные результаты показали, что доза триазавирина (0,0135 мг/кг), сопоставимая с ОБУВрз, вводимая в брюшную полость самок крыс в течение 30 дней, не оказывает влияния на организм животных и развитие потомства в антенатальном периоде.

На следующем этапе исследования оценивалась динамика изменения концентрации восстановленного глутатиона, активности глугатионпероксидазы и К+-АТФ-азы в эритроцитах крыс при повторном поступлении препарата в организм экспериментальных животных.

Известно, что основным процессом, обеспечивающим эритроциты энергией, является гликолиз. В ходе гликолиза происходит образование таких макроэргов, как АТФ и НАДН. Поскольку для эритроцитов АТФ служит основным источником энергии и необходим для обеспечения работы Ка+, К+-АТФ-азы и поддержания самого гликолиза, эритроциты широко используются, как доступная модель для исследования многих важнейших функций. Кроме того, глюкоза в эритроцитах используется в пентозофосфатном цикле, который обеспечивает образование кофермента НАДФН, необходимого для восстановления глутатиона (Атауллаханов Ф.И., 1977; Кулинский В.И., 1990; Глушков С.И., 2003).

Рисунок 2. Изменение содержания восстановленного глутатиона в крови белых крыс при введении возрастающих доз триазавирина в брюшную полость. Обозначения: восстановленный глутатион; — теоретическая (расчетная) кривая

Рисунок 3. Изменение активности глугатионпероксидазы в крови белых крыс при введении возрастающих доз триазавирина в брюшную полость, изменения достоверны, р<0,05

Триазавирин вводили крысам в брюшную полость по методу R.K. Lim et al (1961) в течение 28 дней. Уровень восстановленного глутатиона и активность глутатионпероксидазы оценивали у интактных и подопытных животных на 5, 13, 21 и 29 дни эксперимента. Зависимость концентрации восстановленного глутатиона и активности глутатионпероксидазы от вводимой дозы триазавирина

показана на рисунках 2 и 3.

На рисунках 2 и 3 видно первоначальное снижение и дальнейшее повышение уровня восстановленного глутатиона, а также повышение активности глутатионпероксидазы к 20-му дню эксперимента. Выявленные повышения уровня восстановленного глутатиона и глутатионпероксидазы позволяют высказать предположение об антиоксидантной активности триазавирина, установленной для арбидола и других противовирусных препаратов (Гуськова Т.А., Глушков Р.Г., 1999; Деева Э.Г., 2008). На протяжении всего периода введения, не было зарегистрировано ухудшения общего состояния и достоверного снижения массы тела экспериментальных животных (рисунок 4).

зоо

f 250 §

I 200 • ¡0

£ 150

1

s 100

V «

2 50

—*-

у - -O.W1X5 +1,865* + 269,1 1? = 0,705

Сутки

4 12 И 20 24 , 2» ^

.......... ' ' I ' 1 ' ' I

5 10 15 20

Суммарная доза (г/*кт)

Рисунок 4. Изменение массы тела белых крыс при введении возрастающих доз триазавирина в брюшную полость

Обозначения: - - - масса тела;— теоретическая (расчетная) кривая(р >0,05)

Результаты эксперимента подтверждают полученные нами данные о низкой токсичности и хорошей переносимости высоких доз триазавирина. О резистентности организма к данному уровню и режиму воздействия триазавирина свидетельствует отсутствие не только изменений такого интегрального показателя токсического действия, как масса тела животных, но и сохранение активности № ,

К+-АТФ-азы. + +

На рисунке 5 показана зависимость активности № , К - АТФ-азы от

вводимой дозы триазавирина.

Контроль 541.2 2S43.4 7089.7 17210.2 Суммарная доза, мг/нг

Рисунок 5. Изменение активности Na+, К+-АТФ-азы мембран эритроцитов крови белых крыс при введении в брюшную полость возрастающих доз триазавирина

Как видно на рисунке 5 при введении нарастающих доз триазавирина не было установлено какой-либо зависимости активности Na+, К+-АТФ-азы от вводимой дозы. Только при введении дозы триазавирина 2543,4 мг/кг было зарегистрировано однократное повышение активности Na+, К+-АТФ-азы, но к окончанию эксперимента изменения значений активности фермента не были достоверны по отношению к контролю. Таким образом, результаты повторного поступления триазавирина в организм экспериментальных животных подтверждают полученные нами данные в эксперименте по оценке кумулятивных свойств триазавирина методом R.K. Lim et al (1961), как о соединении со слабой степенью кумуляции.

Однако, несмотря на то, что введение нарастающих доз триазавирина не приводит к существенным нарушениям активности Na+, К+-АТФ-азы, выявленное снижение содержания гемоглобина в крови экспериментальных животных свидетельствует о начале развивающихся нарушений в синтезе гема (рисунок 6), что может быть связано с ингибированием ферментов синтеза геминовых структур, например, 8-аминолевулинатсинтетазы (Тиунов Л.А., 1986).

контрола 541.2 2543.64 7080.7 17210.2 Суммарная доза, мг/кг

Рисунок 6. Изменение уровня гемоглобина в крови белых крыс при введении возрастающих доз триазавирина в брюшную полость

14

Для выяснения влияния триазавирина на функциональное состояние цитохром Р450-зависимых МОГ была проведена серия экспериментов с нагрузкой гексеналом и аминопирином. Гексенал и аминопирин относятся к субстратам первого типа НАДФН-зависимой ферментной системы, и изменение скорости их биотрансформации свидетельствует о влиянии исследуемого вещества на ферментативную активность цитохром Р450-зависимых МОГ.

Триазавирин вводили в брюшную полость в количестве 1/3 О1^50 в течение трех дней, после чего экспериментальным животным проводили нагрузку гексеналом (80 мг/кг в брюшную полость). Результаты представлены в таблице 4. Как видно из таблицы введение названной дозы триазавирина изменяло активность ферментов МОГ по типу ингибирования. Продолжительность гексеналового наркоза подопытных животных составила 46, 86 мин (р<0,05), против 23,4 мин у контрольных животных, что свидетельствует об угнетении реакций гидроксилирования цитохром Р450-зависимых МОГ.

Аминопириновую пробу проводили в ходе определения пороговой концентрации однократного ингаляционного воздействия (Ыгп^ ) триазавирина и оценки потенциальной опасности ингаляционного поступления триазавирина в организм. Для определения пороговой концентрации однократного ингаляционного воздействия триазавирина была проведена серия экспериментов по моделированию ингаляционного поступления в организм экспериментальных животных различных концентраций препарата: 115 мг/м , 62 мг/м , 5 мг/м . У животных оценивали функциональное состояние нервной системы, печени, почек, определяли кислотную резистентность эритроцитов, частоту дыхания, содержание эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, а также активность цитохром Р45о-зависимых МОГ по количеству выделенных метаболитов аминопирина. Результаты определения пороговой концентрации однократного ингаляционного воздействия представлены на рисунке 7.

Таблица 4 - Изменение длительности гексеналового сна белых крыс после трёхдневного введения 1/3 рь50 триазавирина в брюшную полость

№ п/п

Группы животных, длительность сна (минуты)

Контрольная

39

29

16

23

25

Подопытная

62

64

28

44

44

18

40

19

46

15

27

10

23

п

М±т

10

23,4±2,46

46,86±5,04 р<0,05

Как видно на рисунке 7, наибольшее количество достоверных изменений вызывали концентрации триазавирина 115 мг/м3 и 62 мг/м3. При ингаляции концентрации 115 мг/м3 были выявлены изменения состояния ЦНС по снижению способности к суммации подпороговых импульсов, в крови - уменьшение содержания гемоглобина; концентрация триазавирина 62 мг/м3 приводила к статистически достоверному изменению поведения животных, а именно -увеличению двигательной активности («норковый» рефлекс), нарушению функции почек в виде снижения диуреза и увеличения содержания белка в моче.

Концентрация триазавирина 5 мг/м3, при которой наблюдалось изменение всего лишь одного показателя, характеризующего ингибирование реакций гидроксилирования цитохром Р450-зависимых МОГ (по снижению выделения 4-ААП с мочой) была принята за пороговую концентрацию (Limac) однократного ингаляционного воздействия.

Как показали результаты данной серии экспериментов при ингаляционном пути поступлении триазавирина в организм экспериментальных животных был выявлен ингибирующий эффект на активность цитохром Р450-зависимых МОГ. На рисунке 7 представлены результаты ингаляционного воздействия триазавирина, которые показали, что при действии трех испытанных концентраций, судя по снижению выделения метаболита аминопирина (4-АПП) с мочой было установлено ингибирование реакций гидроксилирования. Причем уменьшение выделения метаболита аминопирина с мочой находилось в зависимости от величины концентрации триазавирина. Как видно на рисунке 7 при ингаляции концентраций триазавирина 115 мг/м3, 62 мг/м3, 5 мг/м3 регистрировали уменьшение выделения первого метаболита аминопирина (4-ААП) по сравнению с контрольной группой на 56%, 28,3% и 22,2 % соответственно. Одновременно регистрировалось уменьшение выделения второго метаболита аминопирина (ацетил-4-ААП), характеризующего активность реакций ацетилирования, однако обнаружение второго метаболита аминопирина было не достоверным по отношению к контролю.

Рисунок 7. Изменение наиболее чувствительных показателей при определении пороговой концентрации однократного ингаляционного воздействия (Утас) аэрозоля триазавирина

Анализ полученных результатов показал, что при ингаляционном воздействии триазавирина ингибирование активности цитохром Р450-зависимых МОГ (по изменению выделения метаболитов аминопирина с мочой) оказались наиболее чувствительными критериями оценки ингаляционного воздействия триазавирина и могут использоваться как биомаркеры вредного действия препарата.

Таким образом, при исследовании ингаляционного и парентерального поступления триазавирина в организм экспериментальных животных был выявлен ингибирующий эффект препарата преимущественно на реакции гидроксилирования цитохром Р450-зависимых МОГ.

Полученные нами данные согласуются с результатами опытов in vitro М.Ю. Еропкина и Е.Н. Еропкиной (2008) по исследованию метаболизма триазавирина микросомальной фракцией печени S9 после индукции ферментов МОГ полихлорированными бифенилами. В наших экспериментах in vivo установлен характер действия дозы (1/3 DL50) и различных концентраций триазавирина на активность цитохром Р45о-зависимых ферментов - ингибирование. Выявленные нами изменения активности цитохром Р450-зависимых МОГ, могут приводить к нарушениям биотрансформации, таких биологически активных субстратов, как стероидные гормоны, жирные кислоты, алкилпурины, жирорастворимые витамины, желчные кислоты, холестерин, тироксин и др., что в свою очередь может быть причиной нарушений различных функций организма.

Изменения активности цитохром Р450-зависимых МОГ при действии химических веществ и лекарственных препаратов необходимо учитывать для прогнозирования характера комбинированного действия химических веществ. Особое значение подобные исследования приобретают при проведении экспериментальных испытаний новых лекарственных средств для выявления индивидуальных особенностей метаболизма, что является важнейшим инструментом персонализированной медицины (Кукес В.Г., 2008).

Для прогнозирования потенциального риска здоровью персонала предприятия по получению триазавирина и обоснования ОБУВр 3 были проведены математические расчеты с использованием полученных параметров токсичности (DLjo, LimJ, а также минимальной (МСТД) и высшей (ВСТД) суточной терапевтической дозы (Буров Ю.В., 1995). Расчет ОБУВрл триазавирина проводили по следующим формулам:

1. lg ОБУВ = 0,21 • lgDL50 в/бр + 0,55- lg МСТД - 0,33 lg ОБУВ = 0,21- lg 1353 + 0,55- lg 0,5 - 0,33 = 0,162

ОБУВ = 1,5 мг/м3

2. lg ОБУВ = 0,49 • lgMCTfl + 0,42 • lg Limac + 0,11 • lg DL50 в/ж - 0,75 lg ОБУВ = 0,49 • lg 0,5 + 0,42 • lg 5+0,11- lg7620-0,75= - 0,177

ОБУВ = 0,67 мг/м3

3. lg ОБУВ = 0,77- lg МСТД + 0,34

lg ОБУВ = 0,77 • lg 0,5 + 0,34 = 0,108

ОБУВ = 1,3 мг/м3

4. lg ОБУВ = 0,45 ■ lg Limac + 0,5 • lg МСТД - 0,43

lg ОБУВ = 0,45 ■ lg 5 + 0,5 • Ig 0,5 - 0,43 = - 0,274 ОБУВ = 0,54 мг/мЗ ~ 0,5 мг/м3 5. lg ОБУВ = 0,81- lg ВСТД + 0,068 lg ОБУВ = 0,81 • lg 1,0 + 0,068 = 0,068 ОБУВ = 1,2 мг/м3

Полученная в результате расчетов величина ОБУВрз триазавирина, (исходя из среднего геометрического значений ОБУВ, полученных по пяти формулам) оказалась равной 1,0 мг/м3. Однако учитывая, что величина ОБУВр з, рассчитанная по формуле 4 с использованием Limac и МСТД, является наименьшей и составляет 0,5 мг/м3, то именно ее рекомендовали в качестве гигиенического регламента (ОБУВрз) триазавирина. Обоснованная величина гигиенического регламента триазавирина была рассмотрена и принята Комиссией экспертов по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (справка № 8/35-03-02/5-52 от 23.09.2010).

Выводы

1. По величинам параметров острой токсичности триазавирин относится к малоопасным соединениям (ГОСТ 12.1.007-76).

2. Триазавирин не раздражает кожные покровы, слизистые глаз, верхних дыхательных путей, не проникает через неповрежденную кожу.

3. Триазавирин не вызывает сенсибилизации организма и не является потенциальным аллергеном.

4. Триазавирин характеризуется как соединение со слабовыраженными кумулятивными свойствами.

5. Триазавирин не оказывает мутагенного эффекта после однократного введения в брюшную полость мышей дозы 500 мг/кг (близкой к DL16).

6. Триазавирин, вводимый ежедневно в брюшную полость белых крыс в течение 30 дней (доза 0,0135 мг/кг, сопоставимая с ОБУВ), не оказывает влияния на репродуктивную функцию и общее состояние экспериментальных животных.

7. Триазавирин ингибирует реакции гидроксилирования цитохром Р450-зависимых МОГ при введении в брюшную полость и при ингаляционном поступлении; способность триазавирина угнетать активность цитохром Р45о-зависимых МОГ при различных путях поступления, можно использовать как биомаркер вредного действия.

8. Триазавирин приводит к снижению содержания гемоглобина в организме экспериментальных животных при ингаляционном поступлении концентраций значительно превышающих пороговый уровень (Limac) и при повторном введении возрастающих доз по методу R.K. Lira et al.

9. Ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВрз) триазавирина составляет 0,5 мг/м3.

Практические рекомендации

Результаты выполненных исследований рекомендуется использовать:

- специалистам Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека при проведении социально-гигиенического мониторинга для принятия управленческих решений по сохранению здоровья работающих и обеспечению безопасных условий труда при получении триазавирина;

- специалистам Управлений Роспотребнадзора при осуществлении надзора за промышленными объектами, осуществляющими синтез триазавирина, на этапе проектирования, строительства и эксплуатации;

- врачам МСЧ при проведении периодических медицинских осмотров у персонала, занятого на производстве по получению триазавирина рекомендуется контролировать функциональное состояние печени, а также уровень гемоглобина;

- высшим учебным заведениям при подготовке специалистов по токсикологии, гигиене, профпатологии и медицине труда использовать полученные данные по токсичности, опасности и характере токсического действия триазавирина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список статей, опубликованных в изданиях рекомендованных ВАК РФ:

1. Черкащенко О.С. К обоснованию ОБУВ триазавирина для воздуха рабочей зоны / JI.B. Луковникова, Г.И. Сидорин, Л.И. Дьякова, Н.И. Сходкина, М.А. Битги, О.С. Черкащенко // Медицина труда и промышленная экология. - 2009. - №4. - С. 44-47.

2. Черкащенко О.С. Токсикологическая характеристика противоопухолевого препарата лизомустина / Г.И. Сидорин, М.А. Битти, Л.В. Луковникова, Л.И. Дьякова, Н.И. Сходкина, О.С. Черкащенко // Медицина труда и промышленная экология. - 2010. - №4. - С. 19-24.

3. Черкащенко О.С. Влияние триазавирина на активность ферментов детоксикации / О.С. Черкащенко // Medline.ru. Фармакология. - Май, 2011. -Том12.-СТ.38.- С. 458-463

Другие публикации по теме диссертационного исследования:

4. Черкащенко О.С. О методах оценки суммарной экологической нагрузки (материалы международного форума) / Л.В. Луковникова, Г.И. Сидорин, М.А. Битги, О.С. Черкащенко, И.И. Почкарев // Вестник российской военно-медицинской академии. Материалы второго Санкт-Петербургского международного экологического форума «Окружающая среда и здоровье человека. 1-4 июля, 2008». - СПб. - 2008. Приложение 2 (часть!), 3(23).-С. 113.

5. Черкащенко О.С. О методах оценки детоксицирующей функции печени при экспериментальных, клинических и эпидемиологических исследованиях / Л.В. Луковникова, М.А. Битти, М.А. Максимова, О.С. Черкащенко II Внутрибольничная инфекция. Эпидемиолого-гигиенические и клинические проблемы. Материалы ХХХХ1 научной конференции. Хлопинские чтения. - Санкт-Петербург, издательство СПбМАПО, 2008. - С. 54-57.

6. Черкащенко О.С. Экспериментальная оценка влияния лизомустина на репродуктивную функцию / М.А. Битти, О.С. Черкащенко // Медицина труда. Здоровье работающего населения: достижения и перспективы (Актуальные вопросы профпатологии). Материалы научной конференции с международным участием. Под ред. С.В.Гребенькова. -Санкт-Петербург.: СПбМАПО, 2009. - С. 204-205.

7. Черкащенко О.С. К материалам по обоснованию гигиенического регламента лизомустина / М.А. Битти, Л.И. Дьякова, Л.В. Луковникова, Г.И. Сидорин, Н.И. Сходкина, О.С. Черкащенко И Медицина труда. Здоровье работающего населения: достижения и перспективы (Актуальные вопросы профпатологии). Материалы научной конференции с международным участием. Под ред. С.В.Гребенькова. -Санкт-Петербург.:СПбМАПО, 2009. - С. 205-207.

8. Черкащенко О.С. Исследование мутагенных свойств триазавирина / О.С.Черкащенко, М.А. Битти // Медицина труда. Здоровье работающего населения: достижения и перспективы (Актуальные вопросы профпатологии). Материалы научной конференции с международным участием. Под ред. С.В.Гребенькова. - Санкт-Петербург.: СПбМАПО, 2009.-С. 257-258

9. Черкащенко О.С. Исследование мутагенных свойств новых химических веществ / О.С. Черкащенко, М.А. Битти, М.В. Фомин // Исследования по приоритетным направлениям в медицине и биологии. Материалы научно-практической конференции 24-30 апреля 2009. - СПб: СПб ГМА им. И.И. Мечникова, 2009. - С. 204-205.

10. Черкащенко О.С. Исследование эмбриотоксического действия лизомустина / М.А. Битти, О.С. Черкащенко // Исследования по приоритетным направлениям в медицине и биологии. Материалы научно-практической конференции 24-30 апреля 2009. - СПб: СПб ГМА им. И.И. Мечникова, 2009. - С. 205-207.

11. Черкащенко О.С. Экспериментальная оценка мутагенной активности новых химических веществ как способ профилактики нарушений репродуктивного здоровья у людей / Л.В. Луковникова, О.С. Черкащенко, М.А. Битти // Академик АМН СССР З.Г.Френкель. 140 лет со дня рождения. Хлопинские чтения. Материалы мемориальной научной конференции 18 декабря 2009 года под ред. А.П. Щербо. -Санкт-Петербург.: Издательство СПбМАПО, 2009. - С. 247-250.

12. Черкащенко О.С. Исследование мутагенной активности новых химических веществ и лекарственных препаратов для прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья у людей / Л.В. Луковникова, О.С.

Черкащенко // Актуальные вопросы промышленной токсикологии. -

Москва, 2010.-С. 73-75. 13. Черкащенко О.С. О токсичности и опасности триазавирина при различных путях поступления в организм / О.С. Черкащенко, Л.В. Луковникова // «Химическая безопасность России: медицинские и эколого-гигиенические аспекты» Тезисы юбилейной научной конференции, посвященной 40-летию ФГУП НИИГТП ФМБА России. 13-14 сентября 2011 года, Волгоград. Под ред. Б.Н. Филатова. -Волгоград: Панорама, 2011. - С. 136-139.

ЛР№ № 020365

Подписано в печать 27.12.2011 г. Заказ №.1891 Формат бумаги 60 х 84/16. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0.

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И. И. Мечникова Отпечатано в типографии ООО «Каро» 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47