Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Структурно-метаболическая характеристика почек при системной эндотоксинемии

РГБ ОД

1 7 НЮН 2002

На правах рукописи

ТИНЬКОВА Ирина Олеговна

СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧЕК ПРИ СИСТЕМНОЙ ЭНДОТОКСИНЕМИИ

14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете и Институте хирургии им. А.В.Вишневского РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор О.Д.Мишнёв доктор медицинских наук, профессор А.И.Щеголев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН Г.Г.Автандилов доктор медицинских наук, профессор И.И.Бабиченко

Ведущая организация - НИИ морфологии человека РАМН

Защита состоится «_»_2002 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.04 при Российском государственном медицинском университете (117869, Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «_»

2002 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

А.И.Щеголев

Актуальность проблемы. Эндогенные интоксикации являются частым и грозным осложнением различных заболеваний и состояний организма (перитонит, панкреонекроз, сепсис). Возникающие при этом системные прогрессирующие нарушения нередко носят характер септического или инфекционно-токсического шока [Савельев B.C. и др., 1987; Гринев М.В. и др., 2001; Glauser et al., 1991; Balk, 2000] и сопровождаются развитием синдрома полиорганной недостаточности [Мишнёв О.Д. и др., 2001; Вайе, 1997].

Ведущим звеном патогенеза синдрома системного воспалительного ответа и эндотоксинового шока является поступление в системный кровоток критического количества липополисахарида грамотрицательных бактерий (ЛПС) при несостоятельности антиэндотоксиновых систем организма [Пермяков Н.К. и др., 1989; Лысова Н.Л., 2000; Woltman et al., 1994; Naka-yama et al., 2000].

Характер полиорганной недостаточности и тяжесть состояния больных с распространенными формами перитонита и сепсисом во многом зависит от развивающихся повреждений ткани почек и острой почечной недостаточности (ОПН). Однако, несмотря на большое количество исследований, посвященных этой проблеме, остается еще много нерешенных вопросов об основных механизмах формирования нефропатии и острой почечной недостаточности при зндотоксикозах вообще и системной эндотоксине-мии в частности. Имеющиеся сведения о морфологических изменениях ткани почек посвящены в основном либо их ранним изменениям (данные экспериментов), либо терминальным состояниям (материал аутопсий) [Канылина Н.Ф., 1979; Харланова Н.Г. и др., 1993; Lurcas,1982], При этом гистологические изменения нефронов, наблюдаемые при исследовании аутопсийного материала, во многом обусловлены явлениями аутолиза и посмертным перераспределением крови. Кроме того, в литературе отсутствуют данные о сравнительных морфологических исследованиях почек при эндотоксинемии различной степени выраженности, о нарушениях структурно-метаболической организации отдельных сегментов нефронов при системной эндотоксинемии и перитоните.

Проведение морфологического изучения почек при системной эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке представляет собой актуальную задачу, решение которой позволит прояснить отдельные стороны их патогенеза и получить морфофункциональное обоснование возникновения в данных условиях острой почечной недостаточности.

Цель и задачи

Цель исследования: изучить в динамике особенности структурно-метаболических изменений почек при системной эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке и выяснить их значение в патогенезе острой почечной недостаточности.

Задачи исследования:

1. При помощи гистологических и электронномикроскопическо-го методов выявить особенности морфологических изменений почек крыс в зависимости от дозы вводимого липополисахарида E.coli и длительности развития экспериментальной системной эндотоксинемии.

2. Изучить морфологическую характеристику расстройств кровообращения в почках при эндотоксинемии различной степени выраженности и зндотоксиновом шоке.

3. При помощи морфометрического и информационного анализов получить количественные критерии повреждения проксимальных и дистальных канальцев почек крыс при экспериментальной системной эндотоксинемии.

4. На материале ранних вскрытий при помощи гистологических и гистоэнзиматических методов изучить особенности повреждения почек у больных, погибших от перитонита.

5. На основании результатов комплексного морфологического исследования ткани почек и сопоставления их с результатами биохимических и иммунологических методов исследования получить новые данные о пато- и морфогенезе почечной дисфункции и острой почечной недостаточности при эндотоксинемии и зндотоксиновом шоке.

Научная новизна. В проведенной работе впервые представлена сравнительная структурно-метаболическая характеристика почек крыс при экспериментальной системной эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке.

Впервые, благодаря проведенному морфометрическому анализу, получены новые количественные данные о нарушении структурно-метаболической организации нефронов при эндотоксинемии в зависимости от дозы вводимого липополисахарида.

В результате проведенных морфологических и электронномикро-скопических исследований получены новые данные об особенностях компенсаторных процессов в почках крыс при развивающейся эндотоксинемии в зависимости от дозы ЛПС и сроков эксперимента.

Впервые на экспериментальном материале проведено определение титров антиэндотоксиновых антител к эндотоксину Е. coli 055 :В при развивающейся эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке у крыс.

Проведено комплексное сравнительное морфологическое (гистологическое, гистохимическое, электронномикроскопическое) изучение почек у больных, погибших от распространенного перитонита различного гене-за.

Практическая значимость работы определяется комплексным изучением изменений структуры и функции почек при нарастающей эндо-токсинемии и зндотокскновом шоке. Полученные данные позволяют:

- использовать в патологоанатомической практике полученные данные о морфологических изменениях нефронов для оценки состояния почек на биопсийном и аутопсийном материале;

- уточнить пато- и морфогенез почечной недостаточности, развивающейся при системной эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке;

- использовать в клинических условиях возможности прогнозирования развития острой почечной недостаточности по результатам структурно-метаболических и биохимических исследований;

- использовать выявленные закономерности нарушения структуры и функции почек при перитоните для своевременной медикаментозной коррекции.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертации доложены и обсуждены на совместных научных конференциях кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ и патологоанатоми-ческих отделений ГКБ №1 и №57 г. Москвы (1998 - 2001), XX Итоговой межвузовской научной конференции молодых ученых (Москва, 1998), ежегодных научно-практических конференциях РМАПО по морфометрии (Москва, 1999- 2001), 9 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1999), II Международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 1999), 2 съезде Международного союза ассоциаций патологоанатомов (Москва, 1999), V Международном конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ульяновск, 2000), V Межрегиональной научно-практической конференции патологоанатомов Урала и Западной Сибири (Челябинск, 2001), Всероссийской конференции «Морфология - физической культуре, спорту и авиакосмической медицине» (Москва, 2001), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы хирургической гепато-логии» (Киров, 2002).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения; обзора литературы; главы, посвященной описанию материала и методов исследования; глав, в которых представлены собственные результаты и их обсуждение; выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Содержание работы иллюстрировано рисунками (микрофотографии, электроннограммы, графики), количественные данные представлены в таблицах. Библиографический указатель содержит отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Настоящее исследование является составной частью комплексного изучения патологической анатомии и патогенеза полиорганной недостаточности, проводимого на кафедре патологической анатомии лечебного факультета совместно с кафедрой факультетской хирургии лечебного факультета РГМУ (зав. кафедрой - академик РАН и РАМН, профессор В. С. Савельев). Иммунологическое исследование (иммуноферментный анализ) сыворотки крови крыс с целью определения титра антиэндотоксиновых антител проведено совместно с к.м.н. И.М. Салаховым в Институте общей и клинической патологии (директор - доктор мед. наук М.Ю .Яковлев).

В основу работы положена экспериментальная модель системной эндотоксинемии и эндотоксинового шока, а также материалы ранних вскрытий больных, умерших от распространенного перитонита.

Моделирование системной эндотоксинемии и эндотоксинового шока [Харланова Н.Г., 2001; Kikeri D.J. et al., 1986; Onda et al., 1986] проведено на белых беспородных крысах-самцах массой 180 - 200 г путем внутри-брюшинного введения липополисахарида (ЛПС) Е. Coli 055:В ("Difco Laboratories", США).

Экспериментальные животные в количестве 215 крыс были разделены на две основные группы: контрольную (25 животных) и экспериментальную (190 животных). Экспериментальная группа животных была разделена на 5 подгрупп в зависимости от дозы ЛПС: 0.5,2.5, 10, 25 и 50 мг/кг. Эвтаназию крыс проводили путем декапитации, взятие внутренних органов и крови проводили через 30 мин, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 часа, 1,2 недели. Введение эндотоксина в дозе 25 и 50 мг/кг приводило к развитию эндотоксинового шока и гибели животных в течение первых шести часов. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Для выяснения роли эндотоксина в патогенезе почечной недостаточности, развивающейся при перитоните, нами изучены почки больных, погибших от распространенного перитонита, на материале ранних вскрытий, проведенных коллективом кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ в патологоанатомическом отделении Городской клинической больницы № 1 г. Москвы. Отбор и систематизацию клинического материала проводили на основе совместного с клиницистами изучения данных историй болезни, протоколов вскрытий с выяснением основного заболевания, его осложнений и непосредственной причины смерти, характера оперативных вмешательств, особенностей терминального периода и характеристики структурно-метаболических изменений, выявленных при патологоанатомическом исследовании сразу после наступления летального исхода. При этом установление основного заболевания и непосредственной причины смерти проводилось на основании результатов ранних

вскрытий, клинических данных и срочного гистологического и гистоэнзи-матического исследования тканей и органов по общепринятым критериям патологоанатомической диагностики [Абрикосов А.И., 1938 - 1947; Давыдовский И.В., 1956, 1958; Пермяков Н.К. и др., 1982; Калитеевский П.Ф., 1987]. Клиническими критериями почечной недостаточности явились оли-гоанурия, азотемия (повышение уровня креатинина и мочевины), гипопро-теинемия, диспротеинемия, которые были выражены в различной степени. Согласно данным литературы [Колесов А.П. и др., 1988; Шуркалин Б.К. и др., 1993; Родоман Г.В. и др., 2000], некоторые стороны патогенеза, клинической картины и лечения распространенного перитонита определяются микробиологическими особенностями, которые зависят от источника его развития. В основу работы положен материал 25 ранних аутопсий больных (10 мужчин и 15 женщин в возрасте 33 - 87 лет), погибших от распространенного перитонита. Все наблюдения ранних вскрытий больных были разделены на три группы. Первую группу составили 14 наблюдений перитонита, осложнившего заболевания тонкой кишки: гангрены тонкой кишки в результате острого тромбоза мезентериальных артерий (8 наблюдений), спаечной кишечной непроходимости (3 наблюдения) и ущемленных грыж (3 наблюдения). Во вторую группу вошли наблюдения перитонита, возникшего в результате перфорации сигмовидной кишки (3 наблюдения) или как осложнение острого аппендицита (2 наблюдения). В третьей группе наблюдали панкреонекроз, осложненный перитонитом (6 наблюдений). Во всех наблюдениях отмечался распространенный фибринозно-гнойный перитонит. В качестве контрольной группы мы использовали материал 6 судебно - медицинских вскрытий (4 мужчин и 2 женщин в возрасте от 42 до 71 года), взятие которого осуществлялось в пределах 1-1,5 часа с момента наступления смерти. У четырех из них установлена внезапная сердечная смерть, у двух - несовместимая с жизнью травма. Вскрытия проводились врачами-экспертами судебно-медицинского бюро № 2 г. Москвы. Согласно данным историй болезни и результатам патологоанатомических вскрытий, у всех исследованных больных отсутствовали указания на перенесенные ранее болезни почек и экзогенные интоксикации.

Эвисцерацию органов умерших больных производили в течение 1-1,5 часов после констатации смерти. Кусочек почки, предназначенный для гисто-энзимологического исследования, замораживали в петролейном эфире, охлажденном сухим льдом и хранили в сосуде Дьюра с жидким азотом. Второй кусочек (для биохимического анализа) замораживали и хранили в жидком азоте. Третий кусочек (для гистологического исследования) фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Фиксацию и хранение экспериментального материала проводили аналогично клиническому аутопсийному материалу. Для гистологического исследования весь материал обрабатывался при помощи «Автоматизированного закрытого процессора тканей» (БЬапскт, Англия). Во время проведения ранних

s

вскрытий и эксперимента осуществляли также взятие крови для последующего биохимического исследования. Стандартизация взятия материала, хранения, резки и обработки с подбором оптимальных условий проведения гистохимических реакций отвечали требованиям, предъявляемым к проведению гистохимических реакций и их количественному анализу. Структурно - метаболическое исследование ткани почек включало комплексное гистологическое, морфометрическое, гистохимическое, гистоэнзиматиче-ское и электронномикроскопическое изучение материала. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах, толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином, резорцин-фуксином Вейгерта на эластику, на фибрин - по Маллори. Применяли гистохимические методики: окраски на нейтральные жиры Суданом Ш и IV, на фосфолипиды Суданом черным В, выявление гликогена ШИК - реакцией по Мак-Манусу с контролем амилазой. Для электронномикроскопического исследования кусочки почек фиксировали в глутаральдегиде и четырёхокиси осмия по общепринятой методике, обезвоживали в спиртах и заключали в аралдит. Электронномикроскопическое исследование проведено в лаборатории ультраструктурных морфологических методов исследования (зав. проф. В.Б. Втюрин) Института хирургии им. А.В .Вишневского РАМН.

Гистоэнзиматические исследования проводили на криостатных срезах толщиной Юмкм. Количественную оценку активности ферментов проводили с помощью анализатора изображения «МЕКОС-Ц». На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, при помощи "МЕКОС-Ц" в проксимальных и дистальных канальцах и собирательных трубках определяли их площадь, площадь цитоплазмы и ядер эпителиоцитов, площадь, периметр и фактор формы просвета, на основании которых рассчитывали ядерно-цитоплазматическое отношение нефроцитов. На основании морфометриче-ских данных вычисляли значения информационной энтропии (Н), относительной энтропии (h), избыточности (R) и организации (О) системы, используя общепринятые формулы [Автандилов Г.Г., 1996]. Рассчитывали также показатель эквивокации (D), который служит количественным критерием структурной дезорганизации системы.

При помощи биохимического анализатора «Импакт - 400» фирмы «GILFORD» США в сыворотке крови определяли концентрацию общего белка и альбумина, азота мочевины и креатинина, глюкозы, билирубина, холестерина, а также активность АЛТ, ACT, ЩФ и амилазы. Биохимические исследования проведены в лаборатории биохимии (зав. - проф. Н. А. Сергеева) кафедры факультетской хирургии лечебного факультета РГМУ.

Цифровой материал обработан методами вариационной статистики, с целью определения индекса морфофункционального состояния нефроцитов проведен многофакторный анализ [ИберлаК., 1980].

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Развитие системной эндотоксинемии при введении ЛПС Е. coli в изученных дозах и при эндотоксиновом шоке сопровождается существенными морфофункциональными изменениями почек, а также иммунологическими и биохимическими показателями сыворотки крови.

При иммунологическом исследовании сыворотки крови нами установлена дозозависимая динамика изменения уровня антиэндотоксиновых IgG антител к вводимому ЛПС (рис. 1). Доза ЛПС, равная 0.5 мг/кг является, по-видимому, верхней границей допустимого прироста концентрации эндотоксина в системном кровотоке. ЛПС в дозах 2.5 и 10 мг/кг вызывает развитие выраженной эндотоксинемии («эндотоксиновой агрессии», по М.Ю. Яковлеву, 2000) и, соответственно, повреждения ткани почек, что согласуется с результатами морфологического исследования. Введение ЛПС в шокогенных дозах характеризуется резким снижением уровня антиэндотоксиновых антител, что, вероятно, является одним из факторов та-натогенеза крыс в первые 6 часов эксперимента. Наблюдаемое нами увеличение титра антиэндотоксиновых антител у выживших животных через 48 часов после введения ЛПС является показателем достаточного иммунного ответа для купирования патогенного действия эндотоксина.

При гистологическом и электронномикроскопическом изучении препаратов установлена зависимость повреждения ткани почек от дозы вводимого липополисахарида и времени развития интоксикации. Морфологические изменения ткани почек после введения эндотоксина в дозе 0.5 мг/кг выражены слабо и носят неспецифический характер. Изучение данной группы животных представляет определенный интерес в связи с тем, что липополисахарид в физиологических условиях постоянно проникает из кишечника в кровоток. Во все сроки эксперимента отмечается умеренное полнокровие вен и малокровие артерий и капилляров клубочков. В эпите-лиоцитах наблюдается зернистость или небольшая вакуолизация цитоплазмы. Нами установлено, что первые часы эндотоксинемии характеризуются тенденцией к повышению активности СДГ, ЛДГ, а также изученных диафораз. Наряду с этим отмечается гетерогенность различных сегментов канальцев, типичная для контрольных животных. При электронной микроскопии нефроцитов проксимальных канальцев отмечено увеличение количества митохондрий, особенно в центральном и апикальном отделах клетки, пиноцитозных везикул и вакуолей - в апикальных отделах, рибосом и полисом, а также набухание микроворсинок щеточной каймы. В просвете отдельных канальцев, преимущественно проксимальных извитых (ПИК), определяется небольшое количество аморфных масс. Кроме того, через 72 ч и 1 неделю после введения ЛПС наблюдаются небольшие участки лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации.

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Рис. 1. Уровень антиэндотоксиновых антител в сыворотке крови крыс после введения ЛПС.

Морфологические изменения в почках крыс после введения ЛПС в дозе 2.5 мг/кг характеризуются малокровием артерий и артериол в первые 3 суток эксперимента и полнокровием их в последующие сроки. Вены на протяжении всего эксперимента полнокровные, с агрегацией эритроцитов и единичными фибриновыми тромбами. В просвете капсулы клубочков отмечается небольшое количество светлорозовых нитчатых масс. Просвет большинства проксимальных канальцев выглядит щелевидным из-за набухания эпителиоцитов и их щеточной каймы. Кроме того, через 24 ч наблюдаются некроз и слущивание последней в просвет канальцев. Повреждения дистальных канальцев представлены вакуолизацией цитоплазмы и некрозами преимущественно апикальных частей нефроцитов. На второй неделе эксперимента нами установлены признаки внутриклеточной регенерации, а также появление митозов эпителиоцитов проксимальных и дистальных канальцев.

Динамика компенсаторных изменений дегидрогеназ и диафораз в данной группе имеет в целом определенное сходство с гистоэнзиматическими изменениями, наблюдающимися после введения ЛПС в дозе 0.5 мг/кг. Однако обращает на себя внимание большая степень выраженности этих изменений. В конце эксперимента активность СДГ на 4,2-6,7%, ЛДГ - на 6,4-9,3%, НАД - 2,7-5,8% и НАДФ - на 3,8-7,4% превышают контрольные показатели (р>0,05) в эпителиоцитах различных отделов нефрона.

Отличительным признаком повреждений почек крыс при дозе ЛПС 10 мг/кг является скопления лейкоцитов в клубочковых и перитубулярных капиллярах с одновременным образованием фибриновых тромбов в просвете вен. Такие лейкостазы мы наблюдали уже через 1 ч, при этом выраженность их возрастала с 3 до 12 ч. Наличие белковых масс в подоцитах и просвете канальцев свидетельствует о повышении проницаемости гломе-рулярных капилляров, в результате чего некротизируются эпителиальные

ч г

■ : — —

-МИЙДЙЙН»-

К 0,5 1 3 6 12 24 48 72 1 н 2 н

¡□0.5 Я 2,5 В10 Я25 В50 мг/кг"]

клетки висцерального листка капсулы. В первые 6 ч эксперимента отмечается набухание эпителиоцитов проксимального и дистального отделов нефрона, в дальнейшем (через 12-48 ч) наблюдается некроз и слущивание щеточной каймы проксимальных отделов, некроз апикальных частей неф-роцитов дистальных отделов, а также некрозы эпителиоцитов и отдельных канальцев (24-72 ч). Наряду с этим, через 48-72 ч после введения ЛПС наблюдаются признаки репаративной регенерации эпителиоцитов: в извитых канальцах преобладает внутриклеточный тип регенерации, в собирательных трубках - пролиферация клеток, - что согласуется с данными Н.К.Пермякова с соавт. (1982) и Д.С.Саркисова (1987).

При количественном гистоэнзимологическом исследовании нефроцитов проксимальных и дистальных канальцев почек крыс после введения ЛПС в дозе 10 мг/кг установлено повышение активности дегидрогеназ и диа-фораз через 1 ч и понижение через 3 ч после введения ЛПС. Так, СДГ имеет максимальные значения в ПИК (на 7,2% превышающие контрольный уровень, р<0,05), а ЛДГ - в ППК (на 9,4%, р<0,05). При этом значения активности ферментов остаются ниже контрольных показателей в течение первой недели эксперимента, что согласуется с результатами гистологического и электронномикроскопического исследований.

Введение ЛПС в дозах 25 и 50 мг/кг приводило к развитию эндотокси-нового шока и гибели животных в первые 6 ч эксперимента. При гистологическом изучении препаратов почек крыс через 30 мин после введения ЛПС сосуды коркового вещества выглядят малокровными. В последующие сроки установлено полнокровие сосудов с седиментацией плазмы, выраженными лейкостазами и микротромбами, а также обширные участки кровоизлияний. При электронной микроскопии в эпителиоцитах всех отделов наблюдаются вакуолизация и клазматоз цитоплазмы, деструкция микроворсин щеточной каймы, вакуолизация и деструкция крист митохондрий. При световой микроскопии повреждения и некрозы нефроцитов в большей степени выражены в проксимальных извитых и прямых канальцах. При количественном гистоэнзиматическом исследовании нами выявлено прогрессирующее снижение активности ферментов цикла Креб-са, гликолиза, а также НАД- и НАДФ-диафоразы в эпителиоцитах с нарушением внутриканальцевой гетерогенности.

Таким образом, выявленные нами морфологические изменения почек крыс, развивающиеся при системной эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке, лежат в основе нарушений их функций и развития ОПН. Полученные данные согласуются с результатами гистоэнзимологического исследования и данными АХашЬа^еп с соавт. [1993]: развитию острой почечной недостаточности при эндотоксиновом шоке у крыс предшествуют нарушения энергетического метаболизма нефроцитов. Нами также показано [Лысова Н.Л. и др., 1998; Мишнёв О.Д. и др., 1998, 1999; Щеголев А.И. и др., 2002], что удлинение периода эндотоксинемии сопровождается по-

вреждениями энтероцитов и клеток печени, что влечет за собой нарушения кишечного барьера и детоксикационной функции печени и, соответственно, утяжеление течения эндотоксикоза.

При морфометрическом исследовании гистологических препаратов нами установлены особенности изменений проксимальных и дистальных канальцев почек крыс при эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке. Необходимо отметить, что при системной эндотоксинемии (0.5, 2.5 и 10 мг/кг) изменения изученных параметров носят, как правило, колебательный характер, амплитуда которых коррелирует с дозой ЛПС. В первые 3 ч интоксикации выявлено увеличение площади эпителиоцитов, что, видимо, связано с набуханием цитоплазмы, а в проксимальных канальцах также с набуханием щеточной каймы. Зарегистрированное в дальнейшем уменьшение площади нефроцитов согласуется с наблюдаемыми повреждениями и некрозом клеток (особенно при дозе ЛПС 10 мг/кг). К исходу второй недели исследованные показатели приближаются к контрольным (особенно при 0.5 и 2.5 мг/кг). Изменения площади и периметра просвета канальцев (рис. 2) отражают нарушения процессов реабсорбции, наибольшие изменения при этом выявлены в ПИК. При эндотоксиновом шоке более выраженные повреждения нами установлены также для ПИК, что согласуется с данными литературы [Lieberthal et al., 1998].

Рассчитанные нами информационные характеристики позволили сравнить наблюдаемые изменения в проксимальных и дистальных канальцах при помощи обобщенных критериев и тем самым установить «критические периоды» структурных нарушений почек при эндотоксинемии различной степени выраженности.

С целью уточнения патогенеза нарушений функций почек при системной эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке было проведено биохимическое изучение сыворотки крови. При этом совокупность выявленных данных указывает на развивающиеся нарушения структуры и функции почек и отражает особенности формирования почечной недостаточности при выраженной эндотоксинемии. Так, повышение уровня креатинина и мочевины в сыворотке крови прямо коррелирует с дозой введенного ЛПС. Максимальные значения содержания креатинина отмечены нами через 3 ч после введения эндотоксина в дозе 50 мг/кг, а мочевины - через 1 ч при дозе 25 мг/кг. При анализе содержания общего белка в сыворотке крови нами установлено повышение его уровня в первые часы эндотоксинемии и прогрессирующее снижение с увеличением времени эксперимента.

Таким образом, суммируя результаты собственных исследований и данные литературы [Харланова Н.Г., 2001; Crimi et al., 1987; Morel et al., 1991], можно заключить, что введение ЛПС животным сопровождается развитием системной эндотоксинемии или эндотоксинового шока с нарушением морфофункционального состояния почек. Повреждения клеток и

нарушения функций почек связаны как с прямым действием эндотоксина, так и опосредованным.

Рис. 2. Площадь и периметр просвета проксимальных и дистальных извитых канальцев почек крыс при эндотоксинемии.

А - площадь просвета ПИК, Б - площадь просвета ДИК, В - периметр просвета ПИК, Г - периметр просвета ДИК. Ось абсцисс - время, ось ординат - у .е.

Как известно, главной причиной олигурии в начальной фазе ОПН при различных видах шока является снижение клубочковой фильтрации вследствие афферентной вазоконстрикции, в генезе которой принимают участие ряд факторов. Среди них стоит эндотоксин, который сам по себе является одним из наиболее сильных вазоконстрикторов [\Vardle, 1982]. Помимо этого эндотоксин активирует процессы перекисного окисления липидов и, по мнению Н.К.Пермякова с соавт. [1989], является тем этиологическим фактором, который ответственен за инициацию и прогрессирование синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови при шоке любой этиологии, так как он способен активировать фактор Хагемана, индуцировать высвобождение прокоагулянтных факторов

лейкоцитами и макрофагами, ингибировать синтез эндотелием фибрино-литических агентов [Mayer et al., 1984; Wilson, 1985].

Выявленные нами нарушения регионарного кровообращения в гломеру-лярных капиллярах также снижают клубочковую фильтрацию. Кроме того, уже на ранних стадиях системной эндотоксинемии и особенно эндо-токсинового шока нами установлены нарушения метаболизма и повреждения кардиомиоцитов, являющиеся морфологическим субстратом сердечной недостаточности [Мишнёв О.Д. и др., 1998]. Наличие последней усугубляет явления системной и регионарной сосудистой недостаточности и циркуляторной гипоксии.

Действие эндотоксинов на почки в значительной степени опосредовано образованием медиаторов [Fougeray et al., 1993; Froon et al., 1994]. В результате воздействия эндотоксина клетки крови, в первую очередь, лейкоциты и макрофаги, выделяют десятки биологически активных соединений, существенно влияющих на течение физиологических процессов, а в ряде случаев запускающих каскад патологических реакций, приводящих к повреждениям органов и тканей с развитием полиорганной недостаточности [Абидов М.Т. и др., 2000; Olson et al., 1995]. Установлено, что такими медиаторами являются фактор некроза опухолей (ФНО-а), интерлейкин-1 и интерлейкин-6, фосфолипидный фактор активации тромбоцитов, тромбок-саны и лейкотриены, катехоламины, фрагменты комплемента СЗа и С5а, ре-лаксирующий фактор эндотелия и оксид азота (N0), эндотелии-1, вазопрес-син и ангиотензин-2 [Пальцев М.А. с соавт. 1995; Lugon et al., 1989; O'Hair, 1989]. Многие эффекты ЛПС осуществляются через метаболизм арахидо-новой кислоты, продукты которого выполняют роль trigger-сигналов для многих физиологических и патологических реакций. Преимущественно опосредованный механизм действия ЛПС на различные органы и ткани подтверждается тем фактом, что токсичность его in vivo многократно превышает токсичность in vitro.

Ключевую роль в повреждении почек и развитии полиорганной недостаточности при системной эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке многие авторы отводят ФНО-а [Li S-P.et al., 1990]. Пик концентрации ФНО в плазме крови после бактериальной инвазии наблюдается через 1.5 часа. В экспериментах показана пусковая роль ФНО в образовании простагланди-на Е2, интерлейкина-1, гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора [Белобородов В.Б. и др., 1991;

Kaushansky et al., 1988]. ФНО ответственен за продукцию Н2О2 лейкоцитами, хемотаксис лейкоцитов, адгезию гранулоцитов. В связи с этим характерным морфологическим признаком повреждения почек при эндотоксиновом шоке является секвестрация лейкоцитов в капиллярах клубочков [Kikiri et al., 1986], что согласуется с полученными нами результатами микроскопического исследования препаратов. При этом нами установлено, что количество лейкоцитов в перитубулярных и

перитубулярных и клубочковых капиллярах коррелирует с дозой введенного ЛПС и длительностью эндотоксинемии.

Введение ЛПС приводит к усилению выработки оксидов азота (N0, N02,

N03), образующихся путем окисления гуанидиновой кислоты, аргинина. В свою очередь, оксиды азота активируют тканевую цГМФ-синтетазу, взаимодействуют с ионами железа и другими металлами с переменной валентностью, что влечет нарушения функции цитохромов и энергетические повреждения в клетках. В пользу последнего свидетельствуют полученные нами при количественном гистоэнзиматическом исследовании данные о значительном снижении активности изученных дегидрогеназ и диафораз в нефроцитах с нарушением физиологического внутриканальцевого градиента активности ферментов.

После введения эндотоксина эндотелиальные клетки также продуцируют оксид азота, который вызывает снижение тонуса сосудов. В результате этого усугубляются нарушения микроциркуляции, повышение сосудистой проницаемости, развитие стаза и синдрома диссеминированного внутри-сосудистого свертывания крови (Банин В.В., 2000), что согласуется с наблюдаемыми нами изменениями при гистологическом и электронномик-роскопическом изучении препаратов. Более того, нами установлена зависимость нарушений микроциркуляции в почках крыс от дозы вводимого ЛПС.

По данным литературы [Floege, 1993; Grandoliano et al., 1996], эпителио-циты проксимальных канальцев сами способны продуцировать ФНО, ин-терлейкин-6, тромбоцитарный ростковый фактор, а также МСР-1 (monocyte chemoattractant protein) и специфическую белковую субстанцию RANTES. Последние выступают как хемоприлипающие агенты для моноцитов, макрофагов и Т-клеток, усиливающие повреждения нефроцитов и развитие интерстициальных макрофагальных инфильтратов. Подобные инфильтраты мы наблюдали в почках крыс через 1-2 недели после введения ЛПС в дозе 2.5 и 10 мг/кг.

Системная эндотоксинемия является одним из основных факторов патогенеза почечной недостаточности у больных перитонитом. В работе Б.Р. Гельфанда с соавторами [1992] показано, что у всех больных перитонитом наблюдается системная эндотоксинемия, основным источником которой являлся кишечник. Кроме того, введение эндотоксина экспериментальным животным вызывало развитие острой почечной недостаточности со значительным повышением уровня мочевины и креатинина в сыворотке крови, в том числе в условиях нормальной системной гемодинамики [Morel et al., 1991].

Нами на материале ранних вскрытий проведено комплексное структурно-метаболическое изучение почек у больных, погибших от распространенного перитонита. Во всех наблюдениях выявлены нарушения микро-

циркуляции и повреждения клубочков и канальцев почек. Расстройства кровообращения представлены неравномерно выраженным полнокровием клубочков и сосудов мозгового слоя. В большинстве препаратов почек больных с перитонитом кишечного происхождения (1-я и 2-я группы) наблюдается расширение просвета капсулы клубочка с небольшим количеством аморфных масс, в 3-й группе просвет щелевидный. Кроме того, во всех препаратах отмечаются признаки склероза и гиалиноза артерий и склерозированные клубочки, причем большее количество последних наблюдается у больных с гипертонической болезнью. В просвете артерий наблюдаются лейкоциты, большая часть которых прилежит к эндотелию, что, как мы уже указывали, является морфологическим признаком выраженной эндотоксинемии. В венах определяются единичные фибриновые тромбы. Перитубулярные капилляры резко расширены. В них отмечаются явления стаза, представленные скоплениями эритроцитов и лейкоцитов, особенно в наблюдениях перитонита, обусловленного патологией тонкой кишки. В отдельных препаратах обнаружены мелкие кровоизлияния в корковом веществе почки. В строме почек, преимущественно у больных 1-й группы, наблюдаются очаговые мононуклеарные инфильтраты, локализующиеся преимущественно вокруг сосудов, в перитубулярных пространствах и вблизи клубочков. В части наблюдений отмечается отек стромы (преимущественно мозгового слоя).

Практически у всех больных, погибших от перитонита, в проксимальных и дистальных канальцах выявлена зернистость цитоплазмы эпителиоцитов и расширение просвета. При электронной микроскопии в этих клетках отмечается набухание и вакуолизация митохондрий, фокальная деструкция их крист, сглаженность базального лабиринта и очаговая десквамация микроворсинок щеточной каймы в проксимальных канальцах. Кроме того, отмечалась и вакуолизация цитоплазмы, преимущественно в ПИК у больных 3-й группы и ППК во 2-й группе, что подтверждается резельтатами электронномикроскопического исследования. Щеточная кайма большинства нефроцитов отечна, на отдельных участках слущена в просвет канальцев. В просвете части проксимальных и дистальных канальцев наблюдается слабо эозинофильное или нитчатое содержимое, кроме того, в дистальных канальцах (особенно у больных 1-й группы) - гиалиновые цилиндры. Во всех изученных препаратах отмечается различной степени выраженности некроз эпителиоцитов. Более выраженные повреждения нефроцитов вплоть до некроза отдельных канальцев выявлены при панкрео-некрозе.

Проведенное нами морфометрическое исследование позволило получить количественную характеристику наблюдающихся изменений в ткани почек у больных с перитонитом. При морфометрическом анализе канальцев почек 1-й группы установлено увеличение (на 5,4-53,7% по сравнению с контролем) площади канальцев во всех отделах нефрона, что обусловлено

увеличением площади нефроцитов и площади просвета канальцев. Во 2-й и 3-й группах отмечается уменьшение размеров канальцев, что также связано с изменением площади эпителиоцитов и просвета. Площадь нефроцитов, в свою очередь, зависит от изменения размеров ядра и цитоплазмы. Нами установлено, что у больных перитонитом в извитых канальцах отмечается уменьшение размеров ядер нефроцитов, а в прямых канальцах -увеличение или их значения не отличаются от контроля. В связи с этим меняется и ядерно-цитоплазматическое отношение. Необходимо отметить, что набухание эпителия, сопровождающееся увеличением их размеров, считается ведущим морфологическим признаком ОПН в ранней, шоковой стадии, а расширение просвета канальцев характерно для больных, умерших в олигоанурическую стадию заболевания (Пермяков Н.К. и др., 1982).

Рассчитанные нами информационные характеристики позволили сравнить наблюдающиеся изменения при помощи обобщенных (интегральных) критериев. У больных перитонитом установлено повышение значений текущей и относительной энтропии, эквивокации и уменьшение показателей организации и избыточности. Наибольшие отклонения от контрольных значений отмечаются в проксимальных канальцах во 2-й группе и в дис-тальных канальцах в 3-й группе, что свидетельствует о некоторых особенностях морфогенеза повреждений нефрона у больных перитонитом.

Таким образом, проведенное нами информационно-морфометрическое изучение ткани почек позволило дать объективную количественную характеристику изменений проксимальных и дисталышх канальцев, а также выявить особенности повреждения нефронов при перитоните различного генеза.

Для получения более доказательных выводов о повреждении почек у больных перитонитом нами было проведено количественное гистоэнзима-тическое исследование, позволившее с функционально-морфологических позиций оценить характер и степень повреждения клеток. В контрольной группе максимальные значения активности СДГ, ЛДГ и НАД отмечены в ДИК, а НАДФ - в ППК. Минимальная активность всех изученных ферментов наблюдалась в собирательной трубке. При гистоэнзиматическом исследовании почек больных, умерших от перитонита, установлено снижение активности дегидрогеназ во всех отделах нефрона. Минимальные значения активности ферментов отмечены в 3 группе. Так, активность ЛДГ меньше контрольных показателей на 66% в ДИК, на 62,2% в ППК и на 61,3% в ПИК (р<0,05). Столь выраженное угнетение процессов гликолиза свидетельствует о выраженном эндотоксикозе. Об угнетении процессов энергогенеза в нефроцитах свидетельствует также низкая активность НАД- и НАДФ-диафоразы. Активность СДГ, центрального фермента цикла Кребса, в наибольшей степени снижена в ДИК (на 57,1%, р<0,05) и ПИК (на 53%, р<0,05). Наименьшие, но достаточно существенные, отклонения активности дегидрогеназ от контрольного уровня выявлены в поч-

ках больных с перитонитом, обусловленным патологией тонкой кишки. При этом активность НАДФ-диафоразы в большей степени снижена в ППК и ПИК (на 41,5 и 33,3% соответственно, р<0,05), ЛДГ - в ППК и ДИК (на 40,5 и 34, 3%, р<0,05), НАД и СДГ - в ПИК (на 31,1 и 30,6% соответственно, р<0,05). Необходимо отметить, что у всех изученных нами больных наблюдались нарушения пространственной организации нефронов, что подтверждается существенными изменениями значений внутриканальце-вого градиента активности дегидрогеназ.

С целью уточнения степени повреждения почек в различных группах нами при помощи факторного анализа рассчитан индекс морфофункцио-нального состояния нефроцитов. Более высокие значения индекса в проксимальных канальцах в контрольной группе подтверждают структурно-метаболическую гетерогенность нефроцитов и объясняются более высокими уровнями активности дегидрогеназ и диафораз в эпителиоцитах. При перитоните кишечного происхождения отмечается снижение индекса функционально-морфологического состояния нефроцитов. У больных с панкреонекрозом значения индекса минимальны, что свидетельствует о необходимости проведения дополнительных методов коррекции у больных с эндотоксикозами. Кроме того, более низкие значения индекса, и, соответственно, наиболее выраженные повреждения, наблюдаются в ПИК.

Рис. 3. Активность СДГ (а), ЛДГ (б), НАД (в) и НАДФ (г) в почках больных перитонитом. Проксимальные канальцы: 1 - извитой, 2 - прямой; дистальные канальцы: 3 -прямой, 4- извитой; 5 - собирательная трубка. Светлые столбики - контроль, косая штриховка - 1-я группа, темные - 2-я группа, вертикальная штриховка - 3-я группа.

Таким образом, выявленные нами структурно-метаболические изменения ткани почек лежат в основе нарушения их функций, клинические признаки которого (в виде олиго- и анурии, протеинурии, цилиндрурии и азотемии различной степени выраженности) отмечались у обследованных нами больных. Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что повреждения почек в большей степени выражены при панкреонекрозе и перитоните, вызванном перфорацией толстой кишки, что связано с прогрессирующей гипоксией и интоксикацией. Более того, патогенез поражения почек и формирование острой почечной недостаточности во многом обусловлен развитием системной эндотоксинемии кишечного происхождения. Необходимо отметить, что системная эндотоксинемия не ограничивается повреждением только почек, а сопровождается изменением всех физиологических систем организма с формированием синдрома полиорганной недостаточности. Поэтому любые попытки лечения только, например, почечной недостаточности будут не эффективны.

ВЫВОДЫ

1. При системной эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке в почках крыс выявлен комплекс морфологических изменений, включающих в себя выраженные в различной степени расстройства кровообращения, повреждения клубочков и канальцев.

Титр антиэндотоксиновых ^ в антител в сыворотке крови уменьшается в первые 6 часов эксперимента. Через 48 часов после введения ЛПС увеличивается титр антиэндотоксиновых антител у выживших животных, что является показателем достаточного иммунного ответа на купирование патогенного действия эндотоксина.

2. Расстройства кровообращения в почках крыс нарастают с увеличением дозы ЛПС и характеризуются неравномерным полнокровием сосудов микроциркуляции, агрегацией эритроцитов, лейкостазами в клу-бочковых и перитубулярных капиллярах, микротромбами в просветах венул, очаговыми кровоизлияниями. Через 2 недели после введения ЛПС в дозах 0.5, 2.5 и 10 мг/кг происходит относительная нормализация микроциркуляции почек.

3. Получена комплексная структурно-метаболическая характеристика обратимых и необратимых повреждений нефроцитов в зависимости от дозы и продолжительности эндотоксинемии. Обратимые повреждения представлены маргинацией хроматина, вакуолизацией цитоплазмы, мелкими хлопьевидными отложениями в митохондриях, сглаженностью складок базального лабиринта, набуханием микроворсинок щеточной каймы. Необратимые повреждения - кариолизисом, набуханием митохондрий с отложением в них крупных включений, деструкцией и слущиванием щеточной каймы, клазматозом цитоплазмы, значитель-

ным снижением активности дегидрогеназ с нарушением внутриканаль-цевой гетерогенности.

4. Установлены количественные (морфоденситометрические и информационные) критерии повреждения проксимальных и дистальных канальцев, свидетельствующие о возрастании энтропии, уменьшении организации и коррелирующие с дозой вводимого ЛПС и длительностью интоксикации. В большей степени повреждаются проксимальные извитые и прямые канальцы по сравнению с дистальными.

5. На клинико-анатомическом материале ранних вскрытий при распространенном перитоните в почках выявлены расстройства кровообращения, повреждения нефроцитов и нарушения тканевого метаболизма. Повреждения выражены в большей степени при панкреонекрозе и перитоните, обусловленном перфорацией сигмовидной кишки, что подтверждено результатами количественного гистоэнзимологического исследования, свидетельствующими о преимущественном снижении активности дегидрогеназ и диафораз в проксимальных извитых канальцах (на 33-61% по сравнению с контролем).

6. В экспериментах с эндотоксинемией выявлены закономерности нарушений гистоэнзиматических характеристик нефроцитов, отражающие процессы компенсаторной перестройки тканевого метаболизма и преходящие нарушения пространственной организации канальцевого аппарата. Полученные данные подтверждены результатами биохимических исследований сыворотки крови (азотемия, гипопротеинемия), отражающими обратимые нарушения морфофункционального состояния почек. При эндотоксиновом шоке, а также у больных, умерших от распространенного перитонита, наблюдается срыв компенсации, приводящий к развитию почечной дисфункции и острой почечной недостаточности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Полученные в работе морфологические критерии оценки состояния почек могут быть использованы при исследовании биопсийного и аутоп-сийного материала для проведения объективной диагностики почечной недостаточности.

Развитие структурно-метаболических изменений организации неф-ронов при системной эндотоксинемии необходимо учитывать при изучении патогенеза почечной недостаточности у больных с эндотоксикозами различной этиологии.

Результаты, полученные в работе, о закономерностях возникновения и прогрессирования нарушений функций почек могут быть использо-

ваны в клинике при оценке состояния больных и разработке целенаправленной медикаментозной коррекции почечной недостаточности.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ В результате проведенного исследования экспериментального и клинического материала получены данные о структурно-метаболических изменениях почек при системной эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке как одном из компонентов эндотоксикоза, которые используются:

в учебном процессе и научной работе кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ;

в практике патологоанатомических отделений Городских клинических больниц №1 и №57 г. Москвы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Морфофункциональные изменения печени и почек при системной эндотоксинемии. - Тезисы XX Итоговой межвузовской научной конференции молодых ученых. М., 1998, с.52 (соавт. Н.Л.Лысова).

2. Морфологическая характеристика тонкой кишки при системной эндотоксинемии. - Российский гастроэнтерологический журнал, 1998, № 4, с. 159. (соавт. Мишнев О.Д., Салахов И.М., Щеголев А.И., Лы-сова Н.Л.)

3. Морфо- и патогенез острой почечной недостаточности при эндотоксиновом шоке (обзор литературы). - М.: РГМУ, 1999. 30 с. (рук. деп. в ГЦНМБ № 26171 от 3.03.99) (соавт. Щеголев А.И.)

4. Патологическая анатомия миокарда и вопросы патогенеза сердечной недостаточности при системной эндотоксинемии. - Актуальные вопросы сердечно-сосудистой патологии. М., 1998, с.34-35 (соавт. Мишнёв О.Д., Лысова Н.Л., Салахов И.М., Щеголев А.И.)

5. К вопросу о структурно-метаболических изменениях почек при перитоните (на материале ранних вскрытий). - Актуальные вопросы общей и военной патологии. С-Пб., 1999, с.125-126 (соавт. Сердо-бинцева Т. С., Богданова A.A.)

6. Морфо- и патогенез печеночно-почечной недостаточности при эндотоксиновом шоке. - Актуальные вопросы общей и военной патологии. С-Пб., 1999, с.146-147 (соавт. Щеголев А.И., Лысова Н.Л., Салахов И.М., Мишнев О. Д.)

7. Патологическая анатомия печени и почек и вопросы патогенеза пе-ченочно-почечной недостаточности при эндотоксинемии и эндотоксиновом шоке. - Тезисы 2-го съезда Международного союза ассоциаций патологоанатомов. М., 1999, с. 203-204. (соавт. Мишнёв О.Д., Щеголев А.И., Лысова Н.Л.)

8. Ультраструктурные изменения клубочков почек крыс при эндоток-синемии и эндотоксиновом шоке. - Мат-лы П Международ. Конф. «Микроциркуляция и гемореология». Ярославль, 1999, с.114-115 (соавт. Мишнёв О.Д., Щеголев А.И.)

9. Морфометрическая характеристика нефроцитов при системной эн-дотоксинемии. - Успехи теоретической и клинической медицины. М.: РМАПО, 1999, вып. 3, с.87 (соавт. Щеголев А.И., Лысова Н.Л., Мишнёв О. Д.)

10. Количественная гистоэнзимологическая характеристика различных отделов нефрона у больных перитонитом. - Морфология, 2000, № 3, с.110 (Сердобинцева Т.С., Щеголев А.И., Мишнёв О.Д.)

11. Морфологические изменения почек при системной эндотоксинемии. -Актуальные вопросы патологической анатомии. Челябинск, 2001, с.200-201.

12. Морфофункциональная характеристика почек у больных перитонитом. -Вестник РГМУ, 2001, № 2 (17), с.159-160 (соавт. Лысова Н.Л.)

13. Морфометрическая характеристика почек крыс. — Морфология - физической культуре, спорту и авиакосмической медицине. М.: Советский спорт, 2001. с.2б 1-263 (соавт. Щеголев А.И.)

14. Применение денситометрии для диагностики преходящей олигоану-рии и острой почечной недостаточности. - Морфология - физической культуре, спорту и авиакосмической медицине. М.: Советский спорт, 2001. с.261-263 (соавт. Сердобинцева Т.С., Щеголев А.И.)

15. Структурно-метаболическая характеристика нефроцитов при перитоните различного генеза. - Бюлл. эксперим. биол. и мед., 2001, № 10, с.464-468 (соавт. Мишнёв О.Д., Сердобинцева Т.С., Щеголев А.И.)

16. Патология печени и почек у больных перитонитом - Актуальные вопросы хирургической гепатологии. Киров, 2002, с.63 (соавт. Мишнёв О.Д., Щеголев А.И.)