Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Структурно-функциональные изменения клеточных мембран при разных вариантах эндокринных нарушений

До

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОМ ^ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

5 РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 616.379-008.64-085.31:547.953

МАКСИНА Александра Генриховна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ПРИ РАЗНЫХ ВАРИАНТАХ ЭНДОКРИННЫХ НАРУШЕНИЙ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете

Научный консультант: Доктор медицинских наук,

профессор Ю.А.КНЯЗБВ

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук,

профессор Н.К.ХИТРОВ

Доктор биологических наук, профессор В.М.СМИРНОВ

Доктор биологических наук, профессор Д.М.СПИТКОВСКИЙ

Ведущее учреждение: НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита состоится " "_ 1996 года в " " часов на заседании

специализированного Совета Д 084.14.06 при Российском государственном медицинском универсистете (г. Москва, ул. Островитянова, д.1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ

Автореферат разослан " "_1996 года

Ученый секретарь специализированного ученого совета кандидат мед. наук, доцент Т.Е.Кузнецова

Актуальность проблемы.

В настоящее время эндокринные болезни по частоте встречаемости занимают третье место после онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний (М.И.Балаболкин. 1994; А.С.Ефимов. 1989; Ю.А.Князев. 1989; C.R.Edwards & G.P.McNicol. 1992). Всестороннее изучение факторов, способствующих росту заболеваемости эндокринопатиями, разработка новых принципов терапевтических методов, позволяющих проводить адекватную метаболическую коррекцию этих заболеваний, являются актуальными не только в практической медицине, но и в параклинических дисциплинах, в частности, патофизиологии и биофизике.

Основой регулирующего действия гормонов на метаболические процессы в организме человека и животных является взаимодействие их с рецепторами, представляющими собой белхово-липидные мембраносвязанные комплексы. Это общебиологическое явление позволяет смотреть на эндокринные заболевания как патологию клеточной проницаемости, или болезни рецепторов. Такими заболеваниями являются, в частности, сахарный диабет, дистиреозы и некоторые формы ожирения.

Барьерная функция мембран выполняется при определенной структурной композиции составляющих их элементов. Как правило, при различных патологических процессах одним из важнейших неспецифических эффектов является интенсификация процессов лерекисного окисления липидов (ПОЛ), в результате чего изменяется микровязкость фосфолипидного бислоя мембран (Ю.А.Владимиров.1987; Г.И.Клебанов. 1991). Известно, что эндокринопатии также сопровождаются увеличением концентрации продуктов ПОЛ, однако вопрос о структурном состоянии белкового и липидного компонентов мембран клеток при этом остается неизученным.

В связи с этим выявление структурных изменений (модификаций) в клеточных мембранах при развитии эндокринолатий, а также в ответ на взаимодействие со специфическим гормоном представляет собой актуальную и практически значимую задачу. Исследование взаимосвязи между структурными параметрами мембран клеток и их функциональным статусом является основой для создания методов направленного воздействия на мембраны, а также позволяет определить критерии обратимости экстремальных воздействий на них.

Все вышеизложенное и определило главную цель и основные задачи работы. Цель работы:

Исследовать структурно-функциональные изменения в клеточных мембранах при некоторых эндокринных заболеваниях (сахарный диабет, ожирение, тиреоидная патология). Основные задачи работы:

1. Установить специфические структурные модификации в клеточных мембранах при разных типах эндокринолатий.

2. Выявить структурные параметры, изменение которых характеризует тот или другой вид эндокринного заболевания.

3. Исследовать основные этапы развития в мембранах клеток структурных изменений, связанных с осложнениями сахарного диабета (кетоацидоз, катаракта).

4. Исследовать вклад ПОЛ в модификацию структурно-функционального состояния мембран клеток при эндокринных заболеваниях.

5. Оценить инсулинсвязывающую активность клеток крови в связи с функциональным состоянием рецепторов На поверхности цитоплазматических мембран.

6. Установить характерные для данного заболевания структурные параметры клеточных мембран, • на основании измерения которых было бы возможно осуществлять коррекцию гормональной терапии. На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Развитие инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД), для которого характерен абсолютный или относительный дефицит инсулина, сопровождается выраженными структурными перестройками в мембранах клеток крови. При декомпенсации заболевания увеличивается микровязкость мембран эритроцитов практически по всему профилю, меняется конформация поверхностных и интегральных белков. При этом уменьшается количество активных толовых групп, экспонированых на поверхность мембраны, а поверхностный потенциал увеличивается на 16 мВ (Р<0.05) по абсолютной величине.

Структурные изменения в мембранах приводят к уменьшению связывания шеулииа с рецепторами, уго происходит не только из-за уменьшения количества :вязывающих мест, но и за счет снижения аффинности рецепторов к гормоИу. Эдновременно с этим наблюдается существенное уменьшение утилизации клетками -люкозы. Обнаруженные структурно-функциональные изменения сопровождаются жтивапией процессов свободнораднкального ПОЛ и снижением штиокислителыгой активности (АОА) сыворотки крови.

!. Структурно-функциональный статус клеток крови беременных женщин с ДЗСД демонстрирует увеличение микровязкости и гидрофильности, а также югружение белков в фосфолипидный бислой; увеличиваются вязкость и идрофобность липидов плазмы крови. Применение "эссенциальных" [юсфолипидов и инсулина для достижения компенсации диабета приводит к юрмализации структурно-функциональных показателей.

Наиболее чувствительной структурной характеристикой при передозировк инсулина является параметр солюбилизации спин-меченого бензокарболин гидрофобными участками поверхностных и интегральных мембранных белкот при снижении численного значения этого показателя до 0,20 отн.ед. (Р<0.001 диагностируется передозировка инсулина.

3. Дегидратация организма, как крайняя степень экспериментальног кетоацидоза, сопровождается элиминацией воды в следующей последовательности При трехсуточном обезвоживании происходит эвакуация из организм внеклетчной воды, при шестисуточной дегидратации начинается удалени внутриклеточной воды, что сопровождается увеличением микровязкост фосфолипидного бислоя; на сублетальных сроках дегидратации (12 суток) мембранах происходят необратимые в последующем изменена сопровождающиеся существенным возрастанием микровязкости липидов увеличением гидрофоблости бислоя.

4. При диабетической катаракте у крыс с аллоксановым сахарным диабетом мембранах волокон хрусталика обнаруживаются увеличение гидрофобности изменение топографии поверхности, сопровождающиеся уменьшением количест! активно реагирующих с малеимидом тиоловых групп. Уже на начальной стаду. помутнения хрусталика структурные параметры достигают численных значенш характерных для более поздних стадий развития катаракты. Инициируклци фактором помутнения хрусталика является сдвиг осмомолярности в клетках результате накопления в них нерастворимых форм сахаров.

5. При тиреоидной патологии изменяется структурная композиция мембр; клеток крови, митохондрий, фрагментированного саркоплазматическо: ретикулума. Во всех случаях кооперативные изменения генерализуются по вс( мембране, что проявляется в снижении температуры фазовых переходо

характеризующих подвижность мембранных липидов и лабильность белок-липидных взаимодействий. Тироксин в физиологических концентрациях обладает выраженным мембранотропным эффектом.

Одновременно со структурными изменениями меняется и функциональное состояние мембран клеток: снижается активность мембраносвязанной Са2+ -зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума. При гипертиреозе в большей степени модифицируется эффективность работы фермента как насоса . Обнаружено интибирующее действие тиреоидных гормонов на процессы ПОЛ в мембранах эритроцитов, в то время как в митохондриях, напротив, тироксин и трийодтиронин способствуют интенсификации ПОЛ.

6. При ожирении у детей и подростков изменяется жирнокислотный состав мембран эритроцитов и снижается процент атерогенных фракций липидов. Микровязкость мембран эритроцитов крови возрастает не столь значительно, как при ювенильном сахарном диабете. Изменения в белковых областях мембран клеток не превышают 15%. По-видимому, ожирение приводит прежде всего к изменению количественного и качественного состава липидов в клеточных мембранах, что может нормализоваться соответствующей диетой.

Научная новизна.

Впервые установлено, что при ИЗСД увеличивается микровязкость мембран эритроцитов на расстоянии 0,6 нм от поверхности, уменьшается гидрофобность фосфолипидного бислоя. Обнаружено изменение топографии поверхности мембран, характеризующееся уменьшением количества поверхностных быстрореагирующих тиоловых групп. При декомпенсации ИЗСД вместо двух типов БН-групп, реагирующих с тиоловым реагентом, остается только один. Обнаружено возрастание по абсолютной величине поверхностного мембранного потенциала. Модификация структуры мембран приводит к снижению связывания

инсулина как вследствие уменьшения числа мест связывания (количеств; рецепторов), так и из-за снижения сродства рецепторов к гормону, чтс сопровождается уменьшением уровня утилизации глюкозы клетками.

Показано, что в III триместре у беременных женщин с ИЗСД в фаз< субкомпенсации повышается плотность и микровязкость липидов плазмы крови; i эритроцитах обнаружено увеличение микровязкости по всему профилю мембраны Применение эссенциальных фосфолипидов и инсулина влияет не только н; параметры бислоя, но и на состояние мембранной поверхности, нормализу; соответствующие структурные характеристики.

Установлено, что дегидратация организма, как крайняя степсн! диабетического кетоацидоза, в зависимости от срока обезвоживания, приводит ] последовательной эвакуации внеклеточной, внутриклеточной и мембраносвязанно! воды, резкому изменению электролитного состава среды, в которой иаходятс: клетки. Обнаруженные изменения не обратимы, если при дегидратации началас: потеря мембраносвязанной воды с параллельным увеличением микровязкост] фосфолипидного бислоя.

Впервые выявлено, что начальные стадии развития старческой ; диабетической катаракты различны. Диабетическая катаракта, в отличие о старческой, инициируется, по-видимому, накоплением нерастворимых фор! сорбитола и фруктозы в клетках, в результате чего резко возрастает поступление них воды. Коррекция гликемии может предотвратить развитие катаракты.

При экспериментальных тиреоидных состояниях обнаружено изменени организации мембранных липидов во фрагментах саркоплазматическог ретикулума скелетных мышц, причем эти изменения однонаправлены п отношению к норме как при тиреотоксикозе, так и при гипотироз< Зарегистрировано также ослабление белок-липидных взаимодействий в Ca2"

АТФазном комплексе. Структурные изменения сопровождаются снижением скорости поглощения кальция и АТФазной активности, причем при тиреотоксикозе в большей степени меняется скорость поглощения кальция, а при гипотиреозе - активность фермента. Обнаружена высокая чувствительность митохондрий к тироксину: при введении больным животным тироксина за 48 часов до эксперимента практически восстанавливается структурная организация мембран в бислое. Впервые зарегистрированы прямые мембранотропные эффекты тиреоидных гормонов на мембранах эритроцитов in vitro.

Установлено, что ИЗСД и тиреоидные патологии сопровождается неоднотипными структурными перестройками в цитоплазматичсских мембранах: при дефиците инсулина (абсолютном или относительном) модификации подвергаются прежде всего поверхностные мембранные белки и выступающие области интегральных белков. Тиреоидная патология приводит в первую очередь к изменению структурной композиции мембранных липидов с изменением микровязкости бислоя. Практическая значимость.

Результаты исследования и полученные выводы расширяют представления о взаимосвязи между функциональными изменениями, регистрируемыми в клетке, и структурным состоянием клеточных мембран. Обнаруженные модификации клеточных мембран в результате прямого взаимодействия с гормонами , а также при возникновения и развитии эндокршюпатий позволяют углубить представления о механизме патогенеза эндокринных заболеваний. Основные положения диссертации формируют систему доказательств взаимообусловленности структурных и функциональных параметров на мембранном уровне . Предложено использовать чувствительный структурный параметр, характеризующий степень экспонирования на поверхность мембранных белков, по которому с большой

вероятностью возможно определить передозировку инсулина. Обнаруженные существенные структурные изменения в мембранах хрусталика на начальной стадии диабетической катаракты позволяют сместить акцент в лечении с ангиоксидантов на коррекцию обмена углеводов. Использование практических подходов и теоретических положений, представленных в работе, позволяет проследить за динамикой патологического процесса, а также дает возможность оценивать эффективность проводимого лечения. Апробация работы.

Результаты диссертации докладывались и обсуждались на международных и всесоюзных симпозиумах и конференциях: "Липиды биологических мембран "(Ташкент, 1980), "Магнитный резонанс в биологии и медицине"(Черноголовка,1981), 1-ом Всесоюзном биофизическом конгрессе (Москва, 1982), 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1983), "СтруК1урная динамика биологических мембран и её роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов'ЧМинск, 1988), 4-ом Всесоюзно*: съезде патофизиологов (Кишинев,1988), 3 и 4-й Всесоюзных конференция} "Виоантиоксидант", (Москва, 1989 и 1992 гг), "Новые физические методы I медицине" (Ворошиловград, 1990), "2-ом Всероссийском съезде эндокринологов' (Челябинск, 1991), "5-ой Конференции республик Средней Азии и Казахстана' (Алма-Ата, 1991), "Всесоюзном съезде эндокринологив" (Свердловск, 1992) Всес.конференции"Детская эндокринология"( Алма-Ата, 1992), "Сахарный диабе-и генетика'Ч Алма-Ата, 1992), "Медицинская техника-93" (Москва,1993) "Актуальные вопросы теории и практики физической медицины" (Иваново 1993), "Эссенциальные фосфолипиды в лечении сахарного диабета ] дислипидемий'ЧМосква, 1993), "Человек и лекарство'ЧМосква, 1995), . Всесоюзном съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995),

съезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины (Суздаль, 1995).

Публикации.

Результаты исследования опубликованы в 41 работе в нейтральной отечественной и зарубежной научной печати, а также в материалах съездов, симпозиумов и конференций. Опубликованы методические рекомендации и методическое руководство. Структура диссертации.

Диссертация включает введение , обзор литературы, 6 глав по результатам собственных исследований, заключение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 458 работ, из них 196- отечественных и 262 иностранных авторов.

Материалы и методы. Настоящее исследование является клинико-эксиериментальным. Наряду с клиническим материалом (кровь, получаемая от больных пациентов и доноров) нами исследовались модели эндокринопатий на животных.

Клинический материал. 1. Результаты, представленные в гл. 3 и 4, получены с использованием крови 268 женщин детородного возраста, поступивших в Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии, а также в отделение патологии беременности при 1-й Градской больнице. Исследования проводились совместно с Петрухиным В.А. и Себко Т.В. Пациентки были разделены на следующие основные группы:

1-я - контрольная, включавшая 69 беременных женшин в III триместре беременности без эндокринной патологии;

2-я - больные ИЗСД (136 женщин) в III триместре беременности. Суточная доза инсулина у них колебалась от 62 до 90 Ед. Длительность заболевания составляла 5-14 лет. Больные получали различные сочетания инсулина короткого и пролонгированного действия. У 47 больных этой группы обследования проводили в стадии компенсации, у 53- в стадии субкомпенсации у 36- декомпенсации сахарного диабета. Степень тяжести и компенсации заболевания оценивалась по сумме клинико-метаболических синдромов, таких как гипергликемия, кетоацидоз, содержание лактата в крови и др. (Ю.А.Князев, 1985);

3-я- больные ИЗСД, получавшие эссенциальные фосфолипиды (63 пациентки); препарат "эссенциале" применялся по схеме: 6 капсул в сутки per os и 5-10 мл в

- сутки внутривенно.

Дети и подростки с ИЗСД составили 4-ю группу (23 человека). Возраст пациентов от 8 до 16 лет, продолжительность заболевания от 2 до 6 лет. Исследования проведены в стадии субкомпенсации, которая определялась по сумме клинико-метаболических синдромов, свойственных ювенильному сахарному диабету.

Исследования хрусталиковых волокон (гл. 5) проводили совместно с Бабижаевым М.А. на препаратах, полученных от 38 пациентов, обратившихся в Институт глазных болезней им. Гельмгольца по поводу удаления помутневшего хрусталика. Возраст больных был от 39 до 73 лет, длительность течения сахарного диабета у 18 из них составляла от 5 доЮ лет. Контрольная группа хрусталиков была получена с кафедры судебной медицины.

Материалом исследований для гл.8 была кровь 43 детей и подростков, больных ожирением и склонных к данному заболеванию, которые наблюдались на кафедре гигиены питания РАПО. Возраст пациентов составлял от 6 до 15 лет.

Модели эндокринопатий.

1. Модель аллоксанового диабета получена на беспородных крысах-самцах массой от 100 до 150 г. Диабет вызывали однократным введением внутрибрюшинно 17 мг аллоксана из расчета на 100 г массы животного после 3048 часового голодания. Крысы поступали в опыт через 14-18 суток после введения аллоксана с содержанием сахара в крови не ниже 280 мг%.

2. Для моделирования тиреоидных состояний использовали крыс-самцов линии Вистар массой 180-250 г и кроликов породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг. Гипотиреоз вызывался гиреоидэктомией, которая выполнялась на молодых особях (кролики массой 1,5-1,8 кг , крысы 80-100 г). Операции проводили под общим нембуталовым (кролики) или легким эфирным (крысы) наркозом. Тиреоидэктомированные животные использовались в эксперименте спустя 1-1,5 месяца после операции.

Гипертиреоз вызывали внутрибрюшинным введением животным тироксина (фирмы "Серва", Германия и "Сигма", США), растворенного в 0,01 N КОН. Контрольным животным вводили растворитель. В зависимости от задачи эксперимента, дозу вводимого гормона варьировали. Тиреотоксикоз вызывали ежедневным введением тироксина ( 4мг/100 г массы) в течение 6 дней. О токсичности таких доз гормона свидетельствовал падеж животных, который достигал 30-50%.

Гипертиреоз кроликов вызывали введением тироксина (120-200 мкг/кг массы животного) в течение 12-25 суток, в некоторых экспериментах -путем однократного введения гормона в количестве 300 мкг/кг массы за 24-48 часов до опыта. Контроль состояния осуществляли с помощью ряда тестов: радиоиммунного определения содержания тироксина в сыворотке ' крови

животного, контролем динамики массы тела, массы сердца, количественного содержания гликогена в тканях.

Методы исследования структуры биологических мембран.

В настоящем исследовании мы использовали два метода определения структурной организации клеточных мембран: методику электронной микроскопии, позволяющую оценивать изменения в определенном статическом состоянии, и метод спинового зонда. Последний является способом исследования, отражающим динамические характеристики структуры макромолекул и мембранных систем. Его применение в наших исследованиях обусловлено возможностью изучения биологических объектов в условиях, близких к физиологическим, а также гам, где оптические методы неприменимы из-за непрозрачности сред (например, в суспензии эритроцитов).

Некоторые варианты использования метода спинового зонда.

Нами были использованы некоторые типы спиновых зондов, позволяющие оценивать по их спектрам ЭПР микровязкость, гидрофобность различные областей мембран, фиксировать изменение поверхностного потенциала, а такж< рельефа , обусловлешюго конфигурацией и количеством тиоловых групп. Кром( того, гидрофобные спиновые зонды использовали для оценки вязкости плазмь крови, обусловленной определенным белковым составом. Рассмотрим отдельны! методы оценки структурных параметров исследуемых объектов по спектрам ЭП] спиновых зондов.

а) Спин-меченые стеариновая и пальмитиновая жирные кислоты.

Эти спиновые' зонды практически нерастворимы в воде, но хорош растворяются в 96%-ом этаноле. Использовали маточный раствор зон до концентрацией 10~2М. К суспензии мембран добавляли 1 мкл маточного раствор зонда и в течение 20 минут при комнатной температуре оставляли для инкубации

За этот промежуток времени зонды встраивались в фосфолипидный бислой исследуемой мембранной структуры, давая характерный спектр, соответствующий анизотропному вращению нитроксильного фрагмента (рис. 1а).

Рис.1. Спектры ЭПР спин-меченой жирной кислоты (а) и бензокарболина (б).

На рисунках указаны параметры спектров для расчета 5 и а/Ь.

Основная расчетная формула параметра упорядоченности Э учитывает численные значения компонент тензора сверхтонкого взаимодействия А, определенные моделированием спектров ЭПР зондов на основе жирных кислот (Gaffпey В. & МсСоппеИ Н, 1974):

Б = 1,66А„ - (Ах+ С)]/[АП + 2(Аа+ С)] , где С = 4,06 - 0,05 (А„ - Ах )

По спектрам ЭПР жирнокислотных спиновых зондов оценивали также полярность микроокружения нитроксильного фрагмента. При снятии температурной зависимости параметра упорядоченности пользовались температурной приставкой, позволяющей регулировать температуру с точностью ±0,5°С.

б) Спин-меченый бензокарболин (1,2,3,4-тетрагидро-карболин-3-оксил).

В мембранный препарат вводили спиртовой раствор радикала, конечна концентрация спирта при этом не превышала 3%. В контрольных эксперимента: во избежание побочного действия спирта применяли метод ультразвукового диспергирования зонда. Для этого навеска радикала в небольшом объем используемого в соответствующем эксперименте буфера озвучивалась н дезинтеграторе "МВЕ-2" в течение 15 минут. Затем в озвученную дисперси! радикала вводили мембранный препарат и перемешивали 40 минут пр температуре 23-25°С. Невключившийся зонд отмывали буфером и мембран] осаждали центрифугированием. Осевшие мембраны суспендировали в небольшо объеме буфера и использовали для снятия спектров ЭПР распределенного мембранах зонда.

Типичный спектр зонда представлен на рис. 16). В ряде работ показано, чт радикал сорбируется гидрофобными группами белков. Для количественной оценк растворимости зонда использовали эмпирический "параметр солюбилизации численно равный отношению интенсивностей компонент спектра от зондо: солюбилизированных мембраной, и зондов, находящихся в водной фазе. Парамет солюбилизации а/Ь однозначно связан с распределением зонда меж; мембранными структурами и водной фазой и является мерой способное! мембраны связывать зонд. Изменение способности мембран солюбилизирова' зонд в результате какого-либо воздействия отражает изменение конфигуращ мембранной поверхности при этом воздействии.

При обработке результатов исследования использовались стандарта! статистические методы обработки данных. Как правило, расчитывались средне стандартная ошибка, доверительный интервал при заданной доверительн! вероятности (уровне значимости). При проверке гипотез при апнроксимаш

экспериментальных точек функциональных зависимостей определялся коэффициент корреляции, показывающий достоверность гипотез.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1, Структурно-функциональные изменения в мембранах эритроцитов

крови при ИЗСД.

ИЗСД- метаболическое состояние, характеризующееся абсолютным или относительным дефицитом инсулина, который способствует утилизации глюкозы тканями. Этот гормон вырабатывается ß-клетками поджелудочой железы, его структура хорошо известна. Хорошо изучены и метаболические пути инсулина в организме. Данные о действии инсулина на клеточные мембраны противоречивы. Рецепторы к инсулину обнаружены в эритроцитах, лимфоцитах, на поверхности мембран хрусталика глаза, адштоцигов, гепагоцигов и т.д. Можно сказать, что. инсулин влияет на все виды обмена веществ. Дефицит инсулина приводит к существенным изменениям в организме на уровне клеточных мембран, поскольку мишени действия гормона находятся на их поверхности. Так, многими авторами отмечается уменьшение деформируемости мембран эритроцитов при СД, что связывают обычно с уменьшением индекса ненасыщенности фосфолипидов вследствие интенсификации процессов ПОЛ (Давиденкова Е.Ф. [1990], Ефимов A.C. [1987], Сальникова Л.А. [1990], Shio Hideo [1991]). В то же время существенное изменение структурного состояния мембранных липидов возможно и при гормон-рецепторных взаимодействиях.

Представляло интерес выяснить, как меняется микровязкость бислоя в мембранах эритроцитов крови при ИЗСД. Для этого мы использовали спин-меченые производные стеариновой кислоты, у которых нитрокенльный фрагмент находится в различных положениях относительно карбоксильной группы, что

позволяет зондировать структурное состояние мембраны на разной глубине (рис.2).

Спектр ЭПР зонда 1 (12,3) характерен для меток, совершающих быстрое анизотропное вращение. В качестве параметра, характеризующего подвижность парамагнитного фрагмента метки, условно используют параметр упорядоченности (Б).

Рис.2. Спектры ЭПР спиновых меток на основе жирных кислот и их структурные ормулы со схемой возможного расположения в мембране.

В случае быстрого анизотропного вращения молекулы зонда Б характеризует ориентацию оси вращения молекулы относительно нормали к поверхности мембраны. Увеличение подвижности зонда и уменьшение степени анизотропии вращения парамагнитного фрагмента сопровождается уменьшенем Б (микровязкости окружения фрагмента). Значение 5 можно расчитать, пользуясь параметрами спектра: расстоянием между "внутренними" и "внешними" экстремумами спектра. Для зонда 2 (5,10) расчитывали время корреляции вращения, также характеризующее микровязкость окружения в месте локализации нитроксильного фрагмента. Чем больше это время, тем больше микровязкость. По

представленным спектрам можно также расчитать параметр гидрофобное™ окружения зонда, что и делали для обоих зондов.

Рис. 3. Структурные параметры мембран

эритроцитов крови,

определенные по

спектрам ЭТ1Р

жирнокислотных спиновых зондов с парамагнитным фрагментом на

расстоянии 0,6 нм ( Б, Ь|) и 2 нм ( (:, Ьг) от поверхности мембраны.

Как видно из рисунка 3, декомпенсация заболевания сопровождается увеличением микровязкости по всей толщине мембраны, в то же время гидрофобность уменьшается лишь на расстоянии около 0,6 нм от поверхности мембраны, где локализован нитроксильньга фрагмент первого зонда. Это может быть следствием структурных изменений на поверхности мембраны в результате конформационных изменений поверхностных и интегральных мембранных белков.

Для тестирования мембранной поверхности мы использовали спин-меченый бензокарболлн, спектр ЭПР которого в суспензии мембран эритроцитов представлен на рис. 16). По спектру расчитывали параметр а/Ь , пропорциональный количеству молекул зонда, связанных с гидрофобными группами белков. При этом использовали образцы крови трех групп пациентов: здоровые доноры, декомпенсированная и компенсированная фазы ИЗСД. Полученные результаты представлены на рис.4, из которого видно, что декомпенсация заболевания приводит к резкому уменьшению параметра а/Ь.

Можно предполагать, что происходит "углубление" белков в бислой уменьшением поверхности, доступной для связывания зонда. Это долж! приводить к изменению конформации полипептидной цепи, в частности, за сч образования Э-Э сшивок между активными тиоловыми группам

Рис.4. Изменение параметра а/Ь спин- меченой бензокаболина в трех группах пациентов

Для проверки предположения < изменении состояния поверхности! тиоловых групп мы использовали спи меченый М-этилмалсимкд- реагент на Э" группы, при определенных услови избирательно реагирующий с ним Спектр этой метки в растворе представляет собой триплет с компонентами равн интенсивности. При связывании метки с ЭЛ-группами уменьшается интенсивное высокополыгой компоненты, и чем больше выражено это уменьшение, тем больш количество метки ковалентно связалось с тиоловыми группами белков поверхности мембран клеток.

На рис.5 представлены кинетические зависимости изменения амплиту, высокопольной компоненты, нормированной на начальную амплитуду, для тр трупп: контроль, компенсация и декомпенсация ИЗСД.

стабилизирующими молекулу белка.

Рис.5. Спектр ЭПР малеимидной спиновой метки в суспензии мембран эритроцитов (вверху) и кинетические зависимости изменения амплитуды высокопольной компоненты спектра при инкубации метки с клетками: К-контроль, КД- компенсированный диабет, ДД- декомпенсированный.

На основании анализа данных , полученных при кинетических

исследованиях изменения

амплитуды высокопольной компоненты спектра ЭПР спин-меченого малеимида в суспензии мембран эритроцитов, можно заключить, что при декомпенсации СД уменьшается количество доступных для метки БН-групп; по-видимому, происходит частичное маскирование их, а частично- образование Б-Б сшивок.

Важно также отметить, что меняется не только количественный состав БН-групп (об этом судят по тангенсу угла наклона кинетической зависимости относительно оси времени), ио и их качественный состав: при декомпенсации заболевания па графиках отсутствуют изломы, свидетельствующие о наличии, по крайней мере, двух типов тиоловых групп.

Столь существенные изменения топографии мембранной поверхности не могут

не повлиять на изменение поверхностного мембранного потенциала. Для проверки этого предположения мы использовали заряженный спиновый зонд, спектр ЭПР которого изображен на рис.6.

Рис.6. Спектр ЭПР заряженного амфифильного

_ спинового зонда в мембранах эритроцитов. Указаны

параметры для расчета поверхностного мембранного потенциала.

Распределение спиновых зондов между мембранами эритроцитов и водным окружением определяли по отношению hi/h2 где h| - половина амплитуды низкопольной компоненты сигнала ЭПР зондов, связанных с эритроцитами, а h2 -амплитуда высокопольной компоненты сигнала зондов, растворенных в водной фазе. Оценку изменения поверхностного потенциала мембран эритроцитов при сахарном диабете проводили с использованием следующей расчетной формулы:

Д ф = (RT/zF) ЫО^/Ы.зсд/ (h,/h2)K] (1) Индексы "изсд" и "к" соответствуют группам больных и контрольной; R -универсальная газовая постоянная, Т- абсолютная температура, г- заряд зонда, F-константа Фарадея.

Нами было расчитано изменение мембранного потенциала мембран эритроцитов крови пациентов, больных ИЗСД. Это изменение количественно оценено согласно формуле (1) у пациентов с декомпенсированным заболеванием по сравнению с величиной потенциала контрольной группы. Как свидетельствуют полученные данные, ИЗСД сопровождается увеличением по абсолютной величине отрицательного потенциала мембранной поверхности на 16,3±2,0 мВ (Р<0.05). Можно полагать, что изменение поверхностного потенциала мембран эритроцитов окажет заметное влияние на характер взаимодействия мембранных рецепторов со специфическими лигандами, в том числе рецепторов инсулина.

Для проверки функциональной активности инсулиповых рецепторов, существование которых на поверхности мембран эритроцитов показано многими авторами (Kahn C.R.,1980; Zetterstrom М.,1982; Zick Y.,1986; Ефимов A.C., 1987), изучали связывание меченого радиоактивным йодом инсулина и утилизацию глюкозы эритроцитами (рис.7).

g^KofM-po f/> g компенсация QjieKosuieiiuvuM

Рис. 7. Процент сняааииого ^ 1-й псу ли на (а) и утилизация глюкозы »

мкмоль/(Ю-Ыл час Мб) эритроцитами кропи разных групп пациентов.

мкмо.чь (10У к/1)

о

Специфическое связывание гормона

а)

б)

рецепторам» па поверхности мембран

эритроцитов у больных СД существенно

меньше (Р<0.05), чем в контроле, причем, это снижение обусловлено в большей степени уменьшением концентрации рецепторов на поверхности и о меньшей степени снижением сродства рецепторов к инсулину. При этом утилизация глюкозы клетками падает почти па 20% по сравнению с контролем (Р <0.001).

Уменьшение числа мест специфического связывания инсулина (числа функционирующих рецепторов) может быть связано с затрудненным образованием олигомерпого рецепторпого комплекса в плоскости мембраны из-за увеличения микровязкости бнелоя, зарегистрированного нами практически но всему профилю мембран. Причиной такого увеличения может быть изменение метаболизма линидон с накоплением насыщенных форм, а также интенсификация процессов

Ипсулииотерапия приводит к нормализации уровня глюкозы о крови, вследствие того, что инсулин способствует проникновению глюкозы через клеточные мембраны. В связи с этим представляло интерес выяснить, как инсулин in vitro влияет па функциональную активность клеток и структурные параметры цитоплазматических мембран. Для экспериментов in vitro использовали следующие концентрации гормона: 20, 80 и 1000 иг/мл инкубационной смеси. Выбор таких концентраций гормона определялся следующими соображениями: 20

ПОЛ.

пг соответствуют нормальному физиологическому уровню инсулина в крови, 8( пг- при нагрузке глюкозой и 1000 пг- при передозировке гормона и в случае явнс выраженной инсулинорезистентности. В качестве критериев функциональное активности клеток использовали процент связавшегося специфически меченогс радиоактивным йодом инсулина и количество утилизированной клеткамг глюкозы. Полученные данные представлены на рис.8.

Анализ данных свидетельствует о наличии инсулинрезистентности клеток, т.е потере чувствительности к гормону при ИЗСД. Только очень высоки« концентрации инсулина приближают к норме процент связанного гормона i

По-видимому, инсулин может са>

Рис.8. Связывание меченого инсулина (а и утилизация глюкозы (6) эритроцитам1 крови пациентов с ИЗСД в стада декомпенсации при инкубации in vitro i инсулином.

Для выяснения возможногс мембранотропного действия гормонг были определены микровязкость, параметр гидрофобности и параметры, характеризующие изменение

мембранного потенциала пру Как видно из таблицы, мембрань эритроцитов крови больных менее реактивны по отношению к инсулину, и> структурные параметры меньше меняются в ответ на добавление гормона i инкубационную смесь по сравнению с контролем, что отражает

утилизацию глюкозы эритроцитами, модифицировать структуру мембран.

30

19 25

X

X а 20

S

о

t. О 15

Z

« s 10

о

i? 5

0

□ контроль

■ декомпенсация 320 пг/мл

□ 80 пг/мл

11000 пг/мл

а)

б)

из й

А Е

Чг-

мкмоль/Ю* клеток в час

связывании инсулина in vitro (табл.1).

Таблица 1.

Влияние инсулина in vitro на структурные параметры мембран эритроцитов крови больных ИЗСД в стадии декомпенсации и у здоровых доноров.

Группа Инсулин ,пг/мл S.oTH.efl. а/Ь,отн.ед. Ь1/Ь2,отн.ед.

Контроль 0 0.630 ±0.005 0.42±0.01 0.6±0.015

ч 20 0.640 ±0.006 0.38±0.01 0.54+0.018

80 0.695±0.005 0.45±0.03 0.38±0.02

1000 0.708+0.007 0.50±0.02 0.30±0.018

Больные 0 0.670±0.004 0.1±0.02 1.33±0.02*

и 20 0.680+0.005* 0.18±0.022 1.26±0.0J5

80 0.688+0.006* 0.260+0.03* 0.98+0.02

и 1000 0.708±0.010 0.32±0.03 0.90±0.025*

Примечание: * -р<0.001 но сравнению с контрольной трупной, в других случаях р<0.05.

отмечающуюся при тяжелой форме заболевания инсулинрезистентность тканей. Для достижения терапевтического эффекта приходится в этих случаях увеличивать дозу инсулина. Однако передозировка гормона приводит к нарушению метаболизма не только глюкозы, но также белков и липидов. В связи с этим представляло интерес выявить такие структурные параметры мембран, которые были бы чувствительны к передозировке гормона. Это особенно важно для детей и беременных женщин, больных ИЗСД. Ранее в клинике было показано (Вахрушева Л.Л.), что хроническая передозировка инсулина сопровождается увеличением в плазме крови уровня лактата (молочной кислоты). Нами проанализированы данные по группе из 23 больных ювенильным СД и 39 беременных женщин и обнаружено, что с значимой корреляцией (г=-0,75) увеличение уровня лактата сопровождается уменьшением параметра а/Ь, характеризующего солюбилизацию спин-меченого бензокарболина гидрофобными группами мембранных белков.

Дополнительные клинические исследования показали, что структурный параметр а/Ь позволяет выявить передозировку инсулина в тех случаях, когда по уровню лактата больной еще не состоял в группе риска. Это дало основание подать заявку на изобретение по новому способу диагностики хронической передозировки инсулина в терапии ИЗСД.

Таким образом, на большой группе больных ИЗСД нами показано изменение структурного состояния мембран эритроцитов крови, что сопровождается нарушением функционирования специфических мембраносвязанных рецепторов. Наряду . с неспецифическими изменениями - увеличением микровязкости фосфолипидного бислоя, обнаружены существенные нарушения нормальной

топографии поверхности мембран с уменьшением числа активных SH-групп и возрастанием по абсолютной величине поверхностного мембранного потенциала.

Известно, что при беременности, несмотря на постоянное возрастание концентрации инсулина в циркуляторном русле, утилизация глюкозы тканями нарушается, т.е. проявляется инсулинорезистентность. У больных СД доза инсулина меняется в зависимости от срока беременности. Использование больших концентраций гормона приводит к развитию гнперлипидемии. При этом в терапии наряду с инсулином используют "эссенциальные" фосфолипиды (ЭФЛ) . Этот термин означает высокоочищенный экстракт семян Linne Merril, в котором содержится стандартное количество различных фосфолипидов, причем, около 52% составляет 1,2-дилинолеилфосфатидилхолин. Основная роль ЭФЛ состоит в том, что, подобно липопротеидам высокой плотности, они способны удалять холестерин из клеточных мембран, уменьшая холестерин/фосфолипидный индекс. В связи с этим нами были исследованы структурные и функциональные параметры мембран эритроцитов крови беременных женщин с ИЗСД в III триместре. Полученные данные приведены в таблице 2. При беременности происходит ухудшение всех показателей структурного состояния мембран: увеличивается микровязкость, уменьшаются значения гидрофобности и параметра солюбилизации, что сопровождается ухудшением функциональных показателей. Традиционно используемая инсулинотерапия приводит к некоторому улучшению структурно-функционального состояния цитоплазматических мембран, однако сочетанное применение гормона с ЭФЛ существенно влияет как на структурные параметры мембран, так и на функциональную активность инсулиновых рецепторов. Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что применение ЭФЛ на фоне инсулмногерапии не только нормализует липидный обмен, но и способствует целенаправленной инсулинсвязывающей активности

Таблица 2.

Структурные и функциональные параметры мембран эритроцитов крови беременных женщин с ИЗСД,, в III триместре беремешюсти , находящихся на инсулинотерапии в сочетании с применением ЭФЛ.

Группы пациентов Б, отн.ед. Ь, отн.ед. а/Ь, отн.ед. АО А, % МДА, нмоль/мл % I Глюкоза, мкмоль/(20 108 кл ч)

контроль 0.638+0.005 0.74+0.01 0.43+0.01 58.3±3.9 37±12 29+4 8.3±1.4

больные ИЗСД 0.708±0.007 0.51+0.02 0.12+0.03* 26.0+4.2* 68±8 23±2 5.9+1.1*

инсулинотералия 0.687+0.012* 0.61+0.02 0.27+0.02 47.6+5.2 61+10 26+2* 6.8+0.8

сочетание с ЭФЛ 0.650+0.010 0.71+0.03 0.40+0.03 54.9±4.7* 38±10* 28±3 8.1+1.3

Примечание: *- р<0.001 по сравнению с контрольной группой. В других случаях р<0.05.

рецепторов, снижает интенсивность ПОЛ, модифицирует генерализованные по всей плазматической мембране структурные перестройки.

На основании полученных результатов можно представить схему, объясняющую причины гипергликемического синдрома и выделяющую способы воздействия на него с целью компенсации ИЗСД, показанную на рис.9.

Рис. 9. Схема путей нормализации гипергликемии.

2. Структурный изменение мембран оолокон хрусталика глаза при развитии диабетической катаракты.

Хроническая гиперглнкемия в условиях дефицита инсулииа привод существенным нарушениям функционирования ряда систем и органов. Саха диабет занимает одно из первых мест но частоте сопровождающих его изменен! стороны глаз, диабетическая катаракта может составлять до 40% общей наго.; зрения при СД.

Относительно механизма образования катаракты (помутнения хрусталик

настоящее время нет единого мнения. В ряде работ показано, чго при

заболевании интенсифицируются процессы ПОЛ, по этот факт характеризует С1

неспедифические изменения. Нами было продемонстрировало, что при ката

возрастает обводненность ткани хрусталика, на электронных микрофотогра

отчетливо проявляются извитость, выпячивание мембран хрусталиковых волоком.

тестирования структурного состояния этих мембран мы использовали спиновый ;кн

сшш-мсченый бензокарбол также расчить

коэффициент извитости электронным икрофотограс] При сравнении структу параметров для хрусталик! старческой и диабетич! катарактой полу

результаты, представленнь рис. 10.

Рис. 10. Структурные цари мембран ¡ю.юкоп хрусталика глаал при ярил он форме старческой и днайешческоа катаракт параметр гидрофобное! и, СО-параметр солюбидилацнп, и) копффикнеш и.иш гости (псе нар; определены и отн.ед.).

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

ЕЗ контроль

! ^диабетическая

катаракта □ старческая катаракта

При диабетической катаракте параметр солюбилизации существенно возрастает по ¡равнению с контролем, что может свидетельствовать о "всплывании" белков над юверхностью мембраны, а гидрофобиость уменьшается. Следует отметить, что ираметр гидрофобности мембран волокон хрусталика при старческой и диабетической >азвитой катаракте достоверно не различается. Коэффициент извитости, «считываемый по электронным микрофотографиям исследованных объектов, меняется юлее существенно.

На электронных микрофотографиях зрелые формы старческой и диабетической ;атаракт выглядят однотипно, однако начальные фазы развития заболевания могут >азличаться. В связи с этим дальнейшие исследования мы проводили на хрусталиках ;рыс с аллоксановым СД. При этом появляется возможность выделить для геследования начальную стадию катаракты. Полученные результаты представлены на •ис .11. а) б)

жазатели функционального состояния (б ) в гмбранах волокон хрусталика крыс с

глоксановым сахарным диабетом.

Видно, что уже на начальной стадии развития катаракт структурные измен выражены более явно , причем, это проявляется не в увеличении микровязкости уменьшении гидрофобности в глубине бислоя и увеличении солюбилиз бензокарболина. Одновременно с этим снижается утилизация глюкозы интенсификация ПОЛ, оцениваемая по поглощению ультрафиолета (А2зо ), ещ проявляется. На основании полученных экспериментальных данных

представляется вероятной схема развития диабетической катаракты, представленна рисунке 12.

3. Экспериментальное обезвоживание как модель гиперосмии при кетоацидозе Во всех случаях при СД наблюдается изменение степени гидрофобности по в< профилю цитоплазматических мембран. Это означает, что внутренние обл фосфолипидного бислоя становятся более доступными для воды. Одним из са; опасных последствий СД является кетоацидоз. Вследствие снижения утилиза глюкозы клетками и повышения ее концентрации во внеклеточной жидкости I выходит из клеток, что сопровождается одновременной потерей внутриклеточ: ионов. Дефицит воды при кетоацидозе имеется всегда, превышая иногда 10% от об: массы тела.

В связи с этим представляло интерес оценить структурное состояние клеточ] мембран при дегидратации организма и обратимость происходящих изменений последующей регидратации. Исследования проводили на эритроцитах крыс, кото) подвергали последовательно трех, .шести- и двенадцагисугочной дегидратации. Анал структурного состояния мембран проводили с использованием зондов 1 и 2, оцени микровязкость на разных уровнях от поверхности, а также с помощью спин-мечен бензокарболина. Полученные результаты представлены в таблице 3.. Трое су

Рис.12. Схема развития диабетической катаракты.

Таблица 3.

Структурные характеристики мембран эритроцитов крови крыс при де- и регидратации в течеиие разноых сроков.

Группы Срок Параметр Время Параметр Параметр

животных обезвоживания и упорядоченности вращательной солюбилизации гидрофобности

регидратации, (сут) Б, отн. ед. корреляции не а/Ь, отн. ед. Ь, отн. ед.

Контроль - 0.635±0.008* 5.3±0.2 0.25±0.08 0.78+0.03

Дегидратация 3 0.642+0.012 6.1±0.6 0.38±0.023 0.71+0.2

6 0.697+0.010 8.3±0.65* 0.65+0.034* 0.62+0.16*

н 12 0.743±0.016 15.8+0.56* 1.08+0.043* 0.51+0.13

Регидратация 3 0.638+0.014* 5.6+0.4 0.29+0.012 0.74+0.04

6 0.643+0.012 6.4+0.3 0.46+0.018 0.66+0.14*

12 0.720+0.037* 12.4+0.5 0.86±0.042* 0.56±0.08

Примечание: * -

Р< 0.001, в других экспериментах Р< 0.05.

|дратации мало сказываются на величинах S и t, характеризующих состояние юя, в то же время параметр солюбилизации меняется уже довольно значительно.

двенадцатисуточной дегидратации указанные изменения достигают максимального зня.

Можно думать, что дегидратация организма приводит к эвакуации воды из дистого русла (внеклеточной воды). Начиная с б суток обезвоживания, удаляется гриклеточная вода, причем в критическом сроке (12 суток на безводном пищевом тоне) значительно увеличивается микровязкость бислоя. При регидратации тановление первоначального структурного статуса возможно лишь только после :суточной дегидратации, длительное обезвоживание необратимо меняет не только ояние поверхности мембран, но и модифицирует микровязкость липидов. Потому, промежуточная стадия дегидратации (6 суток) является пограничной между кциональным и патологическим состоянием на уровне цитоплазматических бран. Если при дегидратации меняется микровязкость фосфолипидного бислоя, это штся признаком сублетальной стадии обезвоживания.

■/. Структурные изменения в цитоплазматических мембранах при экспериментальных дистиреозах.

Существуют эндокринные заболевания, обусловленные недостаточностью или .ITKOM гормонов, взаимодействиующих с ядерными мембранами. К таким гормонам «д лежат тироксин и трийодгиропин, вырабатываемые щитовидной железой. Они ывают влияние на метаболизм многих систем организма. Рядом авторов кружена зависимость функциональных параметров скелетной и сердечной сулатуры от уровня гиреоидных гормонов ( Абер В.Я.,1981; Марзоев .,1984¡Баранов В.Г.,1985; Werner С.,1990) . Поскольку гормональная регуляция

мышечного аппарата может опосредоваться через воздействие на систему калыда насоса, представляло интерес оценить влияние тиреоидных гормонов на струкп состояние мембран саркоплазматического ретикулума (СР) и их функционал: активность.

Для оценки генерализованных по всей мембране структурных превращена воспользовались подходом, при котором регистрируются зависимые от темпера фазовые переходы в мембранах. В качестве температурнозависимого параметр; использовали Б для доксилпальмигата, вводимого в фосфолипидный бислой.

Полученные данные представлены на рис. 13. При тиреотоксикозе (изб тироксина) происходит ослабление белок-липидных взаимодействий, о свидетельствует сдвиг на 4° С аррениусовского графика в сторону более ни температур. При этом меняется наклон температурной зависимости, что свидетельс-о кардинальных перестройках в мембранах с изменением энергии актив переходных процессов.

0.00-1 аоо .

603 .

3,3 3,4 - ю°/т -

з,я э.е

Рис.13. Температурная заеиси параметра упорядоченности спинового зс 5 мембранах СР кролика: 1- контрол тиреотоксикоз, 3- липосомы из ли тиреотоксических кроликов.

Низкотемпературный и обусловлен состоянием мембра! липидов (переход гель-жи, кристалл), высокотемператур частичной денатурацией белков, с свидетельствует отсутствие ;

излома в препаратах линосом. Процесс денатурации белков при тирсотоко происходит при более низких температурах, чем в норме. Следовательно, ануля] липиды уже не могут стабилизировать нативную структуру белка.

ри гипотиреозе аррениусовы графики имеют следующий вид (рис.14).

Рис.14. Температурная зависимость параметра упорядоченности 5-

доксилстеарата в мембранах ФСР кролика: 1- контроль, 2- гипотиреоз, 3-гипотиреоз + 300 мкг Т4/ кг веса жвотного за 48 часов до опыта.

Состояние липидов также существенно изменяется по сравнению с контролем (сдвиг температуры фазового перехода). Интересно отметать, что введение животным больших доз тироксина за 48 часов до опыта возвращает мпературу фазового перехода к нормальному значению.

Об изменении топографии поверхности мембран СР при дистиреозах идетельствуют и результаты по языванию спин-меченого малеимида тс.15).

2,0,

Рис. 15. Кинетика связывания малеимидной ¡^ яновой метки с тиоловыми группами белков ' здоровых (1), гипотиреоидных (2) и тертиреоидных (3) кроликов. , а

Как видно из рисунка, в личие от контроля количество ^

ступных для метки активных 5Н-

• -1-т-ч-|-ч—

упп уменьшается, причем в 4 ® [6 20 или

з,г з.а ю?/т

большей степени это характерно для гипергиреоза.

Генерализованные структурные перестройки в мембранах СР неизбежно долг отразиться на функциональном состоянии Са2+-транспортирующей системы мы Оценку такого рода изменений мы проводили, регистрируя скорость поглоще

кальция и АТФазную активно Результаты представлены на рис.16.

Рис. 16. Скорость поглощения кальция О активность Са2+-АТФазы (Б) СР здоровых (1 тиреотоксических (2) кроликов. Скорость поглощ кальция -в мкмоль на мг белка в минуту, активн фермента- мкмоль гидролизованной АТФ в минут мг белка.

Как видно, оба параметра тиреотоксикозе уменьшаются, но в боль степени это выражено для скорс поглощения кальция. Следовател) избыток тироксина в крови приводит угнетению работы насоса в большей степ< чем АТФазы, что может быть результа изменений в большей степ фосфолигшдного бислоя, чем конфигура

/I

! 2

к

и-'

20 25 30 35 40 °С

протеолипидного АТФазного комплекса. Таким образом, дистиреозы приводя-комплексу взаимозависимых изменений в структуре и функциональном стат мембран СР.

Дистиреозы могут рассматриваться как прямая модификация мембран организации клеток (эритроцитов), на поверхности которых обнаруже

цепторы к тиреоидным гормонам. Возможно непосредственное гормон-центорное взаимодействие, на которое облигатное влияние оказывает руктурное состояние как мембранных липидов, так и белкового каркаса. При потиреозе в организации мембран происходят такие изменения, при которых легчаются индуцируемые изменением температуры структурные перестройки в эсфолипидах и области белок-липидного контакта. Такой вывод следует из ализа температурной зависимости параметра упорядоченности для ксилпальмитата в эритроцитах, полученных из крови контрольной группы и пертиреоидных животных. Эти данные представлены на рисунке 17.

с. 17. Температурная зависимость параметра упорядоченности 5-доксиллальмятата в эритроцитах эви здоровых (1) и гилертиреоидных (2) кроликов.

-1С»

■0,3-

0,4-

3,1 з^ эи Хб ——- Юа/ Г -—

По сравнению с нормой, оба излома наблюдаются на графиках Аррениуса при более низких температурах. Поскольку

температурные фазовые переходы зависят от состояния не только мембранных липидов, но и белков,

¡сои характер температурной зависимости можно интерпретировать, по-видимому, к ослабление белок-лшшдных взаимодействий.

Для оценки прямого мембранотропного действия тиреоидных гормонов на мембраны эритроцитов была проведена следующая серия экспериментов с зондом 1 (5-доксилстеаратом). На рис.18 представлены полученные результаты.

0,1

о, г

А / ~ * 1 В У Рис.18. Влияние

252,9 ^¿.260,8 / тиреоидных ГОрМОНОБ

/ 1п у^го на параметр

99, ЗУ упорядоченности зонда 1 е

37,4°/ / эритроцитах крови

/ крыс: А- котроль,

Б- добавлен Тз, В-

/г за' как Б, но добавлен тироксин.

ад а,э з,5 з,з з.з э,1 з.з

Ю

ц

Трийодтиронин вызывает снижение упорядоченности липидов в бислое (оС этом свидетельствует увеличение тангенса угла наклона графика Аррениуса). Это] же вывод можно сделать вследствие сдвига точки излома на графике в сторон) низких температур. Если одновременно с трийодтиронином к эритроцита* добавляли тироксин в концентрации 10"7М, структурные перестройки в мембран« предотвращались. Таким образом, можно говорить о возможности прямоте влияния тиреоидных гормонов на мембрану эритроцита и возможносп регулирующего влияния на структурное состояние мембран путем варьированш концентраций тиреоидных гормонов в физиологических пределах.

Рассмотренные нами структурно-функциональные изменения в гоплазматических мембранах свидетельствуют о том, что эндокринные юлевания, независимо от причины, их вызывающей, сопровождаются во многих ^тях необратимыми генерализованными структурными перестройками как в сфолипидном бислое, так и в мембраносвязанных белках. Эти изменения иводят к нарушению стерического соответствия между рецепторами и эмонами, затрудняют образование активных олигомерных комплексов, зсобствуют иигибированию мембранных ферментов, локализованных в бислое.

5. Ожирение как фактор риска развития эндокринных болезней.

Факторами риска развития эндокринопатий, в частности, СД II тина, тяются не только генетически обусловленные причины, но и такое ;пространенное заболевание, как ожирение. Ожирение сопровождается сличением количества жировой ткани как путем пролиферации (возрастания тичества адипоцигов), так и вследствие увеличения их размеров. У детей с ирением преобладают процессы увеличения размеров адипоцитов, которые шнают потреблять больше глюкозы и синтезируют больше жирных кислот, чем эмальные адипоциты. Одновременно с этим развивается инсулинорезистентность шферических тканей, повышающая риск развития СД II типа жнсулинзависимого). Кроме того, избыток инсулина в крови тормозит зилизацию жира из жировой ткани. Гормоны щитовидной железы также

оказывают влияние на жировой обмен. При гипотиреозе отмечается усилена отложения жира в тканях. У 95% тучных больных имеет место в той или ино степени выраженный гипотиреоз.

Нами проведен сравнительный анализ липидного спектра и структурны характеристик мембран эритроцитов детей с ожирением и больных сахарны диабетом. В таблице 4 представлены данные по жирнокислотному состав мембран эритроцитов в разных группах пациентов, а также приведены численны значения структурных параметров, характеризующих состояние липидного бисло и мембранного гликокаликса.. При ожирении общее количество фосфолилддс возрастает по сравнению с нормой, существенно увеличивается содержание эфиро холестерина, в то время как уровень триглицеридов снижается.

Обнаруженные изменения липидного состава мембран отражаются и на и структурных параметрах (см. табл.4). Из анализа представленных результате можно сделать вывод о том, что в белковых областях мембран эритроците существенных изменений при ожирении по сравнению с контролем не отмечаете* хотя их микровязкость возрастает. Изменение структурного состояния бисло легче поддается коррекции, чем изменения мембранного гликокаликса и белко! Это позволяет рассматривать ожирение как пограничное между нормальным патологическим состояние. Коррекция такого состояния возможна пр использовании определенного пищевого рациона, что подтверждаете литературными данными (Князев Ю.А., Картелишев A.B., 1982; Беюл Е.А.,198( Клиорин А.И., 1989; Cusin J. et al„ 1995).

Таблица 4.

Сравнение лииидного спектра и структурных параметров мембран эритроцитов крови при ожирении и сахарном диабете.

Группа пациентов Фосфолипи-ды, мг% Эфиры холест. ,мг% Триглицериды, мг% Индекс ХС/ФЛ, отн. ед. 8, отн.ед. а/Ь, отн.ед. Ь,отн. ед.

Контроль 73.0+0.6 141.2+2.3 138.4+1.5 1.9 0.65010.007* 0.45+0.02 0.68+0.03

Ожирение 94.7+8.02 179.5+18.7* 95.96Ц0.8* 1.89* 0.704+0.016 0.38+0.01 0.66+0.03

Сахарный диабет 102.0+0.2 230.0+1.1 178.0+3.9 2.25 0.78610.018 0.12010.007* 0.5710.02

Примечание: *- Р< 0.001, во всех остальных экспериментах Р< 0.05.

Таким образом, в отличие от гормонозависимых эндокринных заболи сопровождающихся значительными генерализованными перестройками цитоплазматических мембранах и одновременным снижением функциона активности клеток, ожирение, как обменное заболевание, характеризуется пракп стабильным состоянием гликокаликса с некоторой модификацией стру фосфолипидного бислоя.

ВЫВОДЫ.

1. Методом спиновых зондов исследованы структурные изме цитоплазматических мембран при инсулинзависимом сахарном диабете, дисгирес ожирении. Проведено сопоставление обнаруженных модификаций структуры мем< уровнем перекисного окисления липидов в них и параметрами, характеризуй: функциональный статус клеток: инсулинсвязывающая активность, число связывания гормона, утилизация глюкозы клетками при диабете, АТФазная актш и скорость поглощения кальция фрагментами саркоплазматического ретикулум дистиреозах.

2. .Сахарный диабет в фазе декомпенсации и субкомпенсации сопровожу увеличением микровязкости фосфолипидного бислоя мембран эритроцитов на у 0,6 им от поверхности с "погружением" в бислой части белков, сниж гидрофобности бислоя в этой же области мембран, уменьшением количества акп БН-групп и увеличением по абсолютной величине поверхностного мембра потенциала. Увеличение микровязкости фосфолипидов обусловлено не т интенсификацией процессов ПОЛ, но и прямым мембранотропным дейс инсулина. Параллельно с этим снижаются инсулинсвязывающая активность кле утилизация глюкозы клетками.

Наиболее чувствительным структурным параметром при передозировке инсулина в оцессе инсулинотерапии является измеряемый с помощью спин-меченого чзокарболина спектральный параметр а/b. При снижении этого показателя ниже ределенного уровня (0,20+0.03) можно диагностировать передозировку инсулина. 1нный параметр оказался более чувствительным по сравнению с известными иническими критериями, что дает возможность определить передозировку инсулина более ранних этапах.

В крови беременных женщин с ИЗСД сниженная инсулипсвязывающая активность еток нормализуется in vitro в прямой зависимости от концентрации инсулина (20, 80, 00 пг/мл), повышается чувствительность клеток к инсулину. Большие концентрации рмона (1000 пг/мл) вызывают изменения структурно-функциональных свойств мбран клеток, что выражается в значительном увеличении микровязкости и дрофобности мембран эритроцитов и существенной активации перекисного окисления пидов.

При диабетической катаракте, в отличие от старческой, на начальной стадии мутнения хрусталика практически не регистрируется увеличение продуктов ободнорадикалыюго перекисиого окисления липидов; микровязкость липидного слоя мембран хрусталиковых волокон практически не меняется, однако уменьшается дрофобность и модифицируется топография мембранной поверхности.

При аллоксановом диабете у крыс уже на этапе начальной катаракты изменяются руктурные показатели мембран волокон хрусталика: на 35% увеличивается параметр Ъ и на 25% уменьшается гидрофобность фосфолипидного бислоя. Применение ъекций инсулина животным с начальной стадией катаракты предотвращает подобные менения.

6. Дегидратация клеток сопровождается изменениями структурных компоне цитоплазматических мембран, особенно в области мембранного гликокаликс; ранних сроках дегидратации. Последствия промежуточной стадии обезвожив ликвидируются при регидратации. При обезвоживании животных в течение и, суток начинается эвакуация внутриклеточной воды, что сопровождается увелича микровязкости фосфолипидов мембран эритроцитов.

Регидратация приводит к восстановлению нативной структуры мембран ;. после трехдного срока. Более длительное обезвоживание ведет к значитель модификациям структуры мембран, которые не возвращаются к норме даже больших сроках регидратации.

7. С помощью спиновых зондов установлены зависимые от тиреоидных горм модификации физических свойств мембран саркоплазматического рети^ скелетных мышц, эритроцитов и липосом, сформированных из митохондриаль липидов: изменения микровязкости липидного бислоя, нарушения белок-лини^ взаимодействий и ориентации молекул Са 2+ -АТФазы относительно поверхн мембраны.

Модификациям структуры мембран саркоплазматического ретикулума у гипс гипертиреоидных животных сопутствуют снижение скорости аккумуляции кальция системой и уменьшение активности Са2+-АТФазы. При гипертиреозе наблюда снижение эффективности кальциевого насоса, одной из причин которого может ( увеличение объема пассивной "утечки" кальция из везикул сист саркоплазматического ретикулума наружу за счет повышения окисляемости лит ретикулума.

8. В концентрациях 10"7-10"9М, соизмеримых с физиологическим уровнем тиреоид гормонов в тканях, тироксин и трийодтирошш влияют на микровязкость липид]

[слоя мембран эритроцитов, ингибируют в лих развитие процессов ПОЛ, тогда как в похондриях, наоборот, стимулируют перекисное окисление липидов.

Ожирение у детей и подростков как фактор риска развития эндокринопатий, провождается изменением жирнокислотного спектра мембран эритроцитов: возрастает гавень общих липидов, эфиров холестерина. Микровязкость мембран увеличивается, > не столь значительно, как при сахарном диабете; более чем на 15% уменьшается в ;мбранах эритроцитов при ожирении лабильный фактор а/Ь, что свидетельствует об вменении структурной организации мембранных белков. Обнаруженные структурные ¡менения в мембранах обязаны, прежде всего, структурирующей роли мембранных шидов и не связаны с необратимой деструкцией белкового каркаса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Результаты исследования и полученные выводы расширяют представления о аимосвязи между функциональными изменениями, регистрируемыми в клетке, и руктурным состоянием клеточных мембран. Обнаруженные модификации клеточных ■мбран прямым взаимодействием с гормонами , а также в результате возникновения развития эндокринопатий позволяют углубить представления о механизме тогенеза эндокринных заболеваний. Основные положения диссертации формируют стему доказательств взаимообусловленности структурных и функциональных раметров на мембранном уровне .

Предложено использовать чувствительный структурный параметр,

растеризующий степень экспонирования на поверхность мембранных белков. Наряду определением уровня лактата в плазме крови, расчет параметра а/Ь позволяет с роятностыо 86% определить передозировку инсулина.

3. Комплексная терапия беременных женишн с применением "эссенциалъ фосфолипидов приводит к компенсаций ИЗСД. При этом нормализ] микровязкость бислоя по всему профилю мембран эритроцитов. Одноврем возвращаются к норме структурные показатели, отражающие состояние .мембран гликокаликса, снижается уровень ПОЛ в плазме крови и мембранах эритрощ возрастает практически до контрольного уровня утилизация глюкозы клетк Увеличение вязкости крови при ИЗСД происходит не только за счет измен структурного состояния мембран эритроцитов, йо и вследствие увеличения плоти липидов и вязкости плазмы. -

4. Обнаруженные существенные структурные изменения в мембранах хрусталик начальной стадии диабетической катаракты позволяют сместить акцент в лечен антиоксидантов на коррекцию обмена углеводов. Использование практиче подходов и теоретических положений, представленных в работе, позволяет просле за динамикой патологического процесса, а также дает возможность оцени эффективность проводимого лечения. >

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Артемова Л.Г., Махснна А.Г., Жегунов I Марзоев А.И. Изучение методом спиновых меток и зондов структурных наруш мембран саркоплазматического реТикулума при патологических воздействиях Тр. 2-го Моск. мед. ин-та.- 1979,- Т.129,- N.3.- С.23-24.

2. Кузнецов В.А., Максина А.Г., Азизова O.A., Лившиц В.А. О влиянии водород показателя среды на липидную и белковую области Са2+-АТ<1 саркоплазматического регикулума.// Тез. Всес.симп "Липиды биол. мембр Ташкент, 1980. С.27-28. '

3. Марзоев А.И., Максина А.Г., Азизова O.A., : Владимиров Ю.А. Тирок структурные перестройки в мембранах саркоплазматического ретикулума скелсл мышц кролика.// Бюл. эксперям. биол. и мед.- 1980,- Т.89.- N.4.- С. 41-412.

4. Максина А.Г., Азизова O.A., Артемова Л.Г., Владимиров Ю.А., Ритов Изучение стрктурных превращений при функционировании Ca-ATd саркоплазматического ркулума.// Тез. Всес. симп.'Магн. резонанс в био. мед.", Черноголовка,- 1981.- С.155-156.

5. Авакян Э.А., Ритов В.Б., Максина А.Г., Азизова O.A., Суханов В.А., Владимиров Ю.А., Швец В.И, Взаимодействие свободных жирных кислот с Са-зависимой АТФазой саркоплазматического ретикулума.// Биохимия,- 1981.- Т.46.- N. 5.-С. 809-823.

6. Максина А.Г., Азизова O.A., Ритов В.Б., Мурзахметова М.И. Изучение структурных перестроек, индуцированных кальцием и АТФ в Са-АТФазе саркоплазматического ретикулума с помощью двух типов спиновых меток.// Тез. 1-го Вссс. биофиз. конгресса.- 1982.- Т.1.- С.172.

7. Ритов В.Б., Артемова Л.Г., Максина А.Г., Азизова O.A., Комаров П.Г. Взаимодействие спин-меченого фосфатидилхолина с Са-зависимой АТФазой саркоплазматического ретикулума.// Биохимия.- 1982.-T.47:-N.12.- С.2042-47.

8. Азизова O.A., Максина А.Г., Каган В.Е., Клаан Н.К., Владимиров Ю.А. Модификация ферментной системы транспорта кальция при перекисном окислении липидов. Изменение молекулярной организации липопротеидного комплекса АТФазы.// Биохимия. 1983.- Т.48.- N. 5,- С.861-69.

9.- Тимофеев A.A., Стойда Л.В., Максина А.Г., Азизова O.A., Чернышева Г.Н. Изучение с помощью спиновых меток структуры Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума скеленых мышц кролика при гиперхолсстеринемии.// Бюл. экспер. био. и мед.- 1983.- Т.96.- 11.- С.59-62.

10. Ритов ВБ., Мурзахметова М.К., Максина А.Г., Азизова O.A. Конформационная подвижность и ферментативная активность Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума.// Биохимия,- 1983,-Т.48.- N.11.-С.1890-96.

11. Марзоев А.., Максина А.Г., Борщевская Т.А., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Влияние гипотиреоза на структурные и функциональные характеристики саркоплатического ретикулума скелетных мышц кролика.// Вопр. мед. химии.-198,- Т.30,- N.6.- С.21-24.

12. Рубцов Б.В., Клебанов Г.И., Максина А.Г., Владимиров Ю.А. Влияние перекненого окисления липидов на структуру мембран саркоплазматического ретикулума.// Изв. АН СССР. Сер. биол.- 1986,- N.3.- С.465-70.

13. Тихомиров А.Н., Максина А.Г., Дайняк Б.А., Гусев С.А., Суслов В.Б. Мембранные характеристики эритроцитов белых крыс на этапах экспериментальной дегидратации.// Тез. Все. конф."Фунд. и прикл. вопр. мед. и биол.", Полтава.-1990,- С.97-98.

14. Максина А.Г., Дайняк Б.А., Бабижаев М.А., Эскина Э.Н. Исследование с помощью метода ЭПР модификации мембранных структур при катаракте.// Тез. Републ. конф."Новые физич. методы в мед.", Ворошиловград,- 1990,- С.32.

15. Клебанов Г.И., Максина А.Г., Крейшша М.В., Дайняк Б.А., Владимиров Ю.А. Изменение физического состояния мембран в процессе стимуляции полиморфноядерных лейкоцитов крови.// Биол.мембр.- 1990,- Т.7.- N.3.- С.281-88.

16. Микаелян Н.П., Гей А.К., Максина А.Г., Ширяева Т.Ю.- Значение структурно-функиональных изменений клеточных мембран и инсулинорецепция при сахарном диабете.// Тез. 2-го Всерос. съезда эндокрин., Челябинск.- 1991.- С.131-2.

17. Тихомиров АН., Максина А.Г., Дайняк Б.А. Системный микроциркуляторный индекс- обобщающий показатель оценки изменений микроциркуляции при обезвоживании.// В кн.:"Пробл. морфологии, 5-ая конф. Респ. Средней Азии и Казахстана", ч.2,- 1991,- С.215-16.

18. Максина А.Г., Князев Ю.А., Микаелян Н.П. Использование ЭПР в оценке состоян цитомембран при сахарном диабете.// Сб.труд. 2-го МОЛГМИ "Иммунопатология эндокринной системы у детей и подростков", Москва,- 1991.- С.73-5.

19. Максина А.Г., Дайняк Б.А. О некоторых апектах использования метода спи меток и зондов в медицинских исследованиях.// Мед.техника.- 1991.- N. 6. 18.

20. Микаелян Н.П., Максина А.Г., Князев Ю.А. Оценка состояния ме эритроцитов методом электронной парамагнитной спектроскопии при сах диабете.// Лаб. дело,- 1991.- N. 9.- С.41-44.

21. Максина А.Г., Микаелян Н.П., Князев Ю.А., Дайняк Б.А., Петрухин Изучение методом ЭПР цитоплазматических мембран при сахарном диабе: Тез. Регион, конф. по эндокринологии детского и подрост, возраста, Алмг 1992 - С.8-9.

22. Максина А.Г., Дайняк Б.А., Князев Ю.А., Миаелян Н.П. О защитном дei инсулина на структуру цитоплазматических мембран при ПОЛ.// Тез. 4-ой конф."Биоантиоксидант", Москва.- 1992.- С.26-7.

23. Максина А.Г., Князев Ю.А., Микаелян Н.П., Дайняк Б.А. Изучение ме спинового зонда цитоплазматических мембран в группе генетического риск сахарном диабете.// Тез. Всес. конф. "Сах.. диабет и генетика", Алма-Ата,-С.76-7.

24. Князев Ю.А., Максина А.Г., Микаелян Н.П. Изучение структуры цитоме при сахарном диабете у детей.// Тез. Регион, конф. "Детская эндокрин.", Ата.: 1992.- С.67-68.

25. Микаелян Н.П., Максина А.Г., Князев Ю.А. Структурные изменения в мем£ эритроцитов при сахарном диабете.// Тез. Всес. съезда эндокрин., Свердл 1992,- С. 103-04.

26. Maxina A.G., Dayniyk В.A., Babitshaev М.А. ESR spin label and ultrastri monitoring of protein-lipid interactions in the lens fiber-cell plasma membra relation to human ageing and cataractogenegis.// Mtechanisms of Ageing and I

1992.-V.64,- P. 133-147.

27. Максина А.Г., Микаелян Н.П., Князев Ю.А., Дайняк Б.А. Исследова помощью спин-меченых жирных кислот структурных изменений в мемС эритроцитов при сахарном диабете.// Биофизика. 1992.-Т.З.- N.2.- С.306-9.

28. Князев Ю.А., Максина А.Г., Микаелян Н.П., Дайняк Б.А., Петрухин Изучение методом спинового зонда цитоплазматических мембран при сах диабете.// Пробл. эндокрин,- 1992.-N.4.- С.33-5.

29. Максина А.Г., Микаелян Н.П., Дайняк Б.А., Князев Ю.А. Оценка эффекта! ' применения эссенциальных фосфолипидов при сахарном диабете методом ЭЛ

Тз. Симп."Эссенц. фосфолип. в лечении сах. диаб. и дислипидемий", Мс

1993.- С.14-15.

30. Максина А.Г., Дайняк Б.А., Себко Т.А., Князев Ю.А. Влияние температу взаимодействие инсулина с мембранами эритроцитов крови в норме и при сах диабете.// Тез. науч.-практ.конфер. "Актуальные вопр. теории и физич.мед.", Иваново.- 1993.- С.18-19.

31. Максина А.Г., Резников И.И., Ремизов А.Н., Дайняк Б.А. Использование спектроскопии для решения актуальных медицинских задач.// Тез.док.i конф."Мед.физика-93", Москва,- 1993.- C.Í 18-19.

32. Резников И.И,, Максина А.Г., Ремизов А.Н., Дайняк Б.А. Использование спектроскопии для решения актуальных задач биологии и медицин Мед.техника.- 1993.- N.6.- С.43-44.

33. Максина А.Г., Микаелян Н.П., Дайняк Б.А., Князев Ю.А. Регистрация м( спинового зонда изменений поверхностного потенциала мембран эритроцитов

больных инсулинзависимым сахарным диабетом.// Биофизика.- 1994.- T.39.-N. 3,-С.4-78.

Микаелян Н.П., Максина А.Г., Князев Ю.А. Инсулин-рецепторные взаимодействия и метаболические эффекты эссенциальных фосфолипидов при сахарном диабете.// Бюлл. эксп. биол. и мед.- 1994. -N.10.- С.388-92.

Микаелян Н.П., Князев Ю.А., Максина А.Г., Петрухин В.А. Механизмы нарушения функций мембранорецепторного аппарата при инсулинзависимом сахарном диабете у беременных женщин.// Пробл. эндокр.- 1994,- Т.40. -N.4.- С. 4-7.

Максина А.Г., Архангельская Ю.С., Дайняк Б.А. ЭПР-спектроскопия в практической медицине, медико-биологических исследованиях и учебном процессе мед.вуза.// Мед.техника,- 1995.- N. 5.- С.32-35.

Maxina A.G., Kniazev Yu.A., Mikaeljan N.P., Petrouchin V.A. The investigation of erythrocyte plasmatic membranes structural organisation disorders in IDDM.// 2nd Internat. Sympos. on Diabetes and Pregn., Israel.- 1995.- P.191-92.

Петрухин B.A., Князев Ю.А., Федорова M.B., Максина А.Г., Микаелян Н.П. Опыт применения эссенциальных фосфолипидов у беременных женщин с сахарным диабетом.// Тез. 2-го Рос.нац. конгр. "Человек и лекарство", Москва.- 1995.-С.151-52.

Максина А.Г., Дайняк Б.А., Себко Т.В. , Князев Ю.А. Исследование методом ЭПР дозозависимого влияния инсулина на микровязкость мембран эритроцитов в норме и при ИЗСД.// Тез. 5-го Всес. съезда специалистов по лаб. диагн., Москва.- 1995.-С 86-87.

Петрухин В.А., Федорова М.В., Микаелян Н.П., Максина А.Г., Князев Ю.А. Антенатальная охрана плода при инсулинзависимом сахарном диабете.// Тез. 1-го съезда Росс, ассоц. спец. перинат. мед., Суздаль,- 1995.- С.30-31.

Максина А.Г., Дайняк Б.А., Дергачева А.В., Буданцева С.В., Сахаров В.В. Липидный спектр и структурные параметры мембран эритроцитов крови у детей с ожирением.// Успехи теоретической и клинической медицины. Материалы 1-й научной сессии РМАПО,- М. -1995.- С.92.