Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Сравнительная оценка методов выявления антиэритроцитарных антител

На правах р> копили

Моисеенкова Людмила Геннадиевна

Сравнительная оценка методов выявления атиэритроцитарных антител

14.00.29 - Гематология и переливание крови 14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученей степени кандидата медицинских наук

003169749

На правах рукописи

Моисеенкова Людмила Геннадиевна

Сравнительная оценка методов выявления антиэритроцитарных антител

14.00.29 - Гематология и переливание крови 14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук и Областном государственно^ учреждении здравоохранения - Смоленский центр

крови

Научные руководители.

доктор медицинских наук, профессор Донсков Сергей Иванович кандидат медицинских наук Васильев Николай Иванович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Сахаров Роман Сергеевич доктор биологических наук Порешина Лидия Петровна

Ведущая организация - ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий»

Защита диссертации состоится «18» июня 2008 г в 14 час на заседании диссертационного совета Д001042 01 в Гематологическом научном центре РАМН (125167, г Москва, Новый Зыковский проезд, 4а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН

Автореферат разослан «16» мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Е Е Зыбунова

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

До настоящего времени сравнительная оценка (валидация) методов выявления антиэритроцитарных антител, применяемых в Российской Федерации, в полном объеме не проводилась Рядом авторов осуществлялись работы по сравнению отдельных методов, предназначенных в основном для определения резус-фактора Так, А Г Башлай в 1960 году провела сравнение усовершенствованного ею желатинового метода Фиска-Мак Ги с методом агглютинации в солевой среде Винера Метод А Г Башлай, получивший название «реакции конглютинации в пробирках с 10% желатином при температуре 46 - 48°С», до сих пор с успехом используется в учреждениях службы крови Российской Федерации

А Я Ашкенази в 1962 году сравнивала два метода разработанный ею экспресс-метод определения резус-фактора на предметных стеклах с использованием гепаринизированных сывороток и широко применяемый в то время метод определения резус-фактора в сывороточной среде на чашках Петри, предложенный Н И Блиновым и Н С Дробышевой Результаты исследования обоими методами практически совпали за исключением редких случаев трудноопределимого антигена Б"

А А Михайлова (1972) провела сравнительную оценку предложенной ею реакции конглютинации в пробирках с 33% полиглюкином при комнатной температуре и чашечного метода Н И Блинова и Н С Дробышевой (1947) Результаты обоих методов были в достаточной степени воспроизводимы

Имеются данные сравнительной оценки поликатионного метода выявления антиэритроцитарных антител (Г В Скосырев, 1998), альбуминового метода (С И Донсков, 1968), двухэтапной модернизированной пробы с использованием антиглобулина (Н И Васильев, 2002), гелевой технологии (М Элламаа с соавт, 1998), ферментных (С И Донсков, 1969, Р С Сахаров, 1968) и других методов выявления антител

Упомянутые авторы проводили сравнение воспроизводимости и чувствительности разработанных или модифицированных ими методов лишь с некоторыми, отдельно взятыми методами, применяемыми в РФ В целом же сопоставление одновременно всех используемых в РФ методов, как уже указывалось выше, не проводилось

Вторым побудительным мотивом, продиктовавшим необходимость проведения настоящей работы, послужили накопленные в литературе последних лет многочисленные данные о неодинаковом химическом строении и своеобразии пространственной структуры антиэритроцитарных антител Указанные особенности антител, по-видимому, обусловливают неодинаковое их клиническое значение, а также неодинаковую возможность детекции тем или иным методом

Антиэритроцитарные антитела дифференцируются на три основных класса 1§М, ^А, и несколько субклассов Однако не все классы и суб-

классы иммуноглобулинов способны вызвать in vivo разрушение эритроцитов (Giblett, 1977, Walker et al, 1989) Shaw et al (1988), Lynen et al (1994) отметили, что в трансфузиологической и акушерской практике имеют значение антитела, относящиеся к классам М и G и субклассам IgGl и IgG3

Nieuwenhuys et al в 1989 и другие авторы (Lynen et al, 1994) показали, что антитела всех субклассов IgG проходят через плаценту, однако, не все вызывают гемолитическую болезнь новорожденных Авторы объясняют это тем, что, по-видимому, только IgGl и IgG3 реагируют с Fc-фрагментами Ig-рецепторов лимфоцитов и в большей степени, чем IgG2 и IgG4, активируют комплемент В то же время большинство антител независимо от их класса и субкласса, включая антитела, не имеющие клинического значения, детектируются применяемыми в настоящее время методами

Имеется и иная точка зрения По мнению классиков современной транс-фузиологии Mollison et al (1997), Voak (1999), Gustafsson et al (2004) не существует универсального метода выявления всех клинически значимых антител Очевидно, что методы, детектирующие неполный спектр трансфузи-онно опасных антител, неприемлемы, поскольку не исключают риска по-сттрансфузионных осложнений Так же, по-видимому, неприемлемы и чрезмерно чувствительные методы, выявляющие параллельно с клинически значимыми клинически незначимые антитела

В связи с выше перечисленным возникает ряд актуальных для клинической иммуносерологии вопросов Какую степень чувствительности имму-носерологических методов следует считать достаточной для детекции антител в клинической практике9 Насколько клинически значимы антиэритро-цитарные антитела, не детектируемые некоторыми методами7 Имеется ли взаимосвязь между частотой распределения антител в популяции и их принадлежностью к тому или иному субклассу иммуноглобулинов7 Какова частота субклассов иммуноглобулинов среди антител разной специфичности7

В отечественной литературе отсутствуют данные о частоте антиэрит-роцитарных антител IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 у аллосенсибилизированных лиц Нет сведений о гемолизирующей активности антиэритроцитарных антител, несмотря на то, что именно это их свойство, как считается, обусловливает гемолиз эритроцитов in vivo и, соответственно, тяжесть посттрансфу-зионных осложнений

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка (ва-лидация) методов выявления антиэритроцитарных антител, применяемых в лечебно-профилактических учреждениях Российской Федерации

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Исследовать серологические параметры сывороток (активность, специфичность, титр и др) семью методами, применяемыми в лечебно-профилактических учреждениях Российской Федерации

2 Установить частоту антиэритроцитарных антител, относящихся к ^01, 1§С2, ^03 и 1§С4, у представителей русской популяции, а также распределение субклассов иммуноглобулина в в зависимости от специфичности антител

3 Установить возможную связь между субклассами, к которым относятся антиэритроцитарные антитела, и их способностью детектироваться разными серологическими методами

4 Исследовать гемолизируюшую активность антител в зависимости от их активности, специфичности и принадлежности к тому или иному субклассу ^С

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Показано, что антиэритроцитарные антитела в силу структурного полиморфизма проявляют неодинаковую способность реагирования при их детекции разными методами Установлена частота распределения антиэритроцитарных антител 1, ^02, ^вЗ и среди сенсибилизированных лиц русской популяции

Установлена частота антител, обладающих гемолизирующей активностью, а также зависимость этого свойства от принадлежности антител к субклассам Показано, что уровень гемолизирующей активности антител не коррелирует с их специфичностью и титром, однако зависит от принадлежности антител к ^О1, ^03 или 1«04 субклассам

ПУТИ ПРАКТИЧЕСКОЙ РЕАЛИЗАЦИИ

Полученные данные показывают реальные возможности серологических методов детекции антиэритроцитарных антител и могут быть использованы в системе обеспечения иммунологической безопасности гемотранс-фузий, в частности при подборе совместимых пар донор - реципиент, прогнозировании степени риска посттрансфузионных осложнений

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1 Полиморфизм антиэритроцитарных антител обусловливает неодинаковую их способность детектироваться разными серологическими методами

2 С помощью какого-либо одного метода скрининга антиэритроци-тарных антител не всегда удается выявить трансфузионно опасные антитела, относящиеся к IgGl и IgG3

3 Антитела, имеющие относительно низкую активность и титр, представляют собой не меньший фактор риска посттрансфузионных гемолитических осложнений, чем антитела с высокой серологической активностью

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения работы доложены на заседании проблемной комиссии «Проблемы донорства, производства и контроля компонентов и препаратов крови» (13 03 08) и на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической трансфузиологии» (17 04 08) в ГНЦ РАМН Материалы диссертации представлены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (13-15 июня 2007 г) С -Петербург, на научно-практической конференции «Современная гематология Проблемы и решения» (29-30 ноября 2007) Москва

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Работа изложена на 113 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, приложения Библиография включает 63 отечественных и 139 зарубежных источников Работа иллюстрирована 22 таблицами и 5 рисунками

Отдельные разделы работы выполнены совместно с канд мед наук Н И Васильевым, канд мед наук Н М Михайловой, докт мед наук, проф С И Донсковым, за что автор выражает им свою признательность

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследования служили 356 сывороток крови, содержащих аллоиммунные антиэритроцитарные антитела с титром от Ц (реакция с цельной сывороткой) до 1 8192, предоставленные 19 учреждениями службы крови Российской Федерации и стандартные эритроциты, содержащие групповые антигены в различных сочетаниях (табл 1)

Таблица 1

Характеристика исследованного материала

Материал Исследуемый показатель Количество образцов Количество исследований

Сыворотки Специфичность антител 356 1232

Титр 356 2492

Субкласс и титр 1«С 237 332

Гемолизирующая активность 204 408

Эритроциты Фенотип Резус, Келл и др 180 1260

Всего 1333 5724

Отдельные сыворотки с относительно высоким титром антител представляли собой образцы, взятые из большого объема сырья, предназначенного для производства тестовых реактивов, другие сыворотки были заготовлены в небольших объемах в процессе скрининга антител у пациентов лечебно-профилактических учреждений РФ и имели низкую активность и титр

Тестирование сывороток проводили с использованием стандартных нативных и консервированных эритроцитов, имеющих различные сочетания групповых антигенов, собственного производства, а также 3-11 клеточных панелей стандартных эритроцитов с известной антигенной структурой производства Вю-Лас! (Франция), ОгуйэЬ (Испания), От-Мес1 (Швейцария)

Использовали стандартные поли- и моноклональные реагенты для ти-пирования групповых антигенов эритроцитов отечественных и зарубежных фирм, антиглобулиновые сыворотки, 33% полиглюкин, 10% желатин, Ю-карты (Вю-Яас1, Бт-Мес!) для скрининга и идентификации антител в непрямой пробе Кумбса, Ш-карты (Бт-Мес!) для определения субклассов иммуноглобулинов и ^03, протеазу-С

Сравнивали 7 принятых в РФ методов выявления антиэритроцитар-ных антител, используя их в соответствии с действующими инструкциями, методическими рекомендациями и другими источниками экспресс-метод с 33% полиглюкином, реакцию конглютинации в пробирках с 10% желати-

ном, непрямой антиглобулиновый тест, 2-этапную модернизированную пробу, гелевый тест, ферментный метод (И Н Крестьянова и соавт, 1986) и его модификацию с добавлением преципитирующей антиглобулиновой сыворотки - Кумбс-фермент (игще!, 1951)

Определяли активность, специфичность и титр антител, их принадлежность к субклассам 1§С1 и 1«СЗ

В последнее десятилетие уделяется большое внимание валидации методов анализа Нормативных документов, касающихся валидации серологических методов, применяемых в иммуногематологии, нам найти не удалось, поэтому валидация методик проводилась только по двум параметрам

Под чувствительностью (пределом определения) понимали способность метода детектировать антиэритроцитарные антитела в низком титре Чувствительность методов оценивали как визуально, по авидности антител, агглютинирующих эритроциты, так и путем микроскопирования при сомнительных или отрицательных результатах За титр антител принимали максимальное разведение сыворотки, при котором определялась агглютинация эритроцитов к 10 минутам наблюдения

Воспроизводимость результатов иммуносерологических реакций оценивалась путем двукратного повторения серий исследований с одними и теми же реактивами при одних и тех же рабочих условиях в течение короткого периода времени

С целью определения субкласса иммуноглобулинов стандартные эритроциты инкубировали с исследуемыми сыворотками, отмывали и затем тестировали с сыворотками анти-1°С 1 и анти-^ОЗ О наличии антител, относящихся к субклассу и ^СЗ, судили по агглютинации эритроцитов, нагруженных соответствующими антителами Отсутствие агглютинации эритроцитов с сыворотками анти-1§01 и анти-^СЗ служило показателем того, что антитела, адсорбированные на эритроцитах, относятся к субклассу и/или ^04

Для характеристики серологических параметров антиэритроцитарных антител исследовали их способность агглютинировать эритроциты на плоскости в комбинации с фиколл-верографином - конглютинином, способствующим проявлению агглютинирующей активности неполных антител на плоскости при комнатной температуре Исследование проводили путем смешивания тестируемой сыворотки с фиколл-верографином 3 к 1, и далее 1 каплю смеси соединяли на плоскости с нативными эритроцитами Результат реакции учитывали визуально через 5 минут по наличию или отсутствию агглютинации при покачивании пластинки

Для ферментного метода использовали 0,1 % раствор протеазы-С Трижды отмытые 0,9% ЫаС1 эритроциты инкубировали с пятью объемами раствора протеазы-С в течение 45 минут при температуре 37°С Затем эритроциты дважды отмывали 0,9% ИаС1 и готовили 5-7% взвесь в физиологическом растворе Исследование проводили на плоскости путем смешивания

равных объемов исследуемой сыворотки и энзимированных эритроцитов Результат реакции учитывали визуально через 10 минут при осторожном покачивании пластинки по наличию или отсутствию агглютинации О достаточности энзимирования эритроцитов судили по их способности агглютинироваться неполными анти-О-антителами на плоскости в солевой среде В качестве контроля на специфичность реакции энзимированных эритроцитов использовали сыворотки, свободные от антител

Комплементсвязывающую активность сывороток оценивали по степени гемолиза (от 3% до 50% по шкале гемолиза)

Для этого к трижды отмытым 0,9% NaCl эритроцитам, нагруженным исследуемыми антителами, добавляли свежую сыворотку AB(IV), содержащую комплемент Смесь выдерживали в течение 10 часов при температуре 6 - 8°С, далее инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С, после чего учитывали степень гемолиза путем сравнения испытуемого образца с контрольными образцами, имеющими окраску, соответствующую гемолизу 6%, 12%, 25% и 50%

Приготовление контрольных образцов осуществляли путем добавления 2 объемов 5% уксусной кислоты к 1 объему плотно упакованного осадка эритроцитов (100 % гемолиз) Контрольные образцы 50%, 25%, 2%, 6% гемолиза готовили из образца со 100% гемолизом путем разведения его дистиллированной водой в 2,4, 8, 16 раз соответственно

Статистическую обработку данных и построение диаграмм осуществляли с помощью программы Microsoft Access, Microsoft Exel и статистического пакета SPSS 12 для Windows (программа автоматизированной статистической обработки) Для удобства обработки данных титр антител выражали в ступенях разведения (1 2 - 1-я ступень, 1 4 - 2-я ступень и так далее до 13 ступени, соответствующей разведению 1 8192) Статистическую значимость (достоверность) различий между группами устанавливали посредством описательного (дескриптивного) анализа (с вычислением медианы и квартилей), использовали критерий Колмогорова-Смирнова, критерий Уил-коксона для сравнения 2-х зависимых выборок (С Гланц, 1998) Различия между выборками считали статистически значимыми при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ОЦЕНКА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ СЫВОРОТОК

Прежде чем приступить к оценке особенностей реагирования разных образцов антител и методов их выявления представлялось целесообразным установить частоту распределения антител в зависимости от их специфичности (табл 2)

Таблица 2

Распределение антиэритроцитарных антител по специфичности

Специфичность антител Количество сывороток, содержащих антиэритроцитарные антитела

в абсолютных цифрах в%

анти-О 166 46,5

анти-ОС 71 20

анти-БЕ 4 1,1

анти-БСЕ 16 4,5

анти-ОС+К 1 0,3

анти-ОСЕ+К о 0,9

анти-О+К 2 0,6

анти-К 28 7,8

анти-с 18 5

анти-Е 23 6,5

анти-С" 6 1,7

анти-С 11 3,1

анти-Е+К 1 0,3

анти-С"+е 1 0,3

анти-С+е 2 0,6

анти-с+К 1 0,3

Специфичность не установлена 2 0,6

Всего 356 100

По частоте встречаемости в порядке убывания антитела располагались в следующей последовательности анти-О > анти-К > анти-Е > анти-с > анти-С > анти-С™, что совпадает со шкалой приоритета трансфузионно опасных антигенов эритроцитов, рассчитанной ранее (С И Донсков, 2006)

Новым важным свойством, характеризующим серологические параметры антиэритроцитарных антител, явилась их способность агглютинировать эритроциты на плоскости при комнатной температуре в комбинации со

смесью конглютининов Далеко не все сыворотки проявляли эти свойства (табл 3)

Таблица 3

Протокол исследования сывороток на плоскости в комбинации с фиколл-

верографином

Специфичность антител Количество исследованных образцов Частота антител

реагирующих на плоскости не реагирующих на плоскости

в абсолютных цифрах в % в абсолютных цифрах в %

анти-D 31 3 9,6 28 90,4

анти-DC 4 0 0 4 100

анти-Е 6 0 0 6 100

анти-с 6 j 50 3 50

анти-К 4 2 50 2 50

Всего 51 8 15,6 43 84,4

Только 15,6 % образцов агглютинировали нативные эритроциты на плоскости в присутствии конглютинина

Из всех исследованных сывороток агглютинация на плоскости чаще регистрировалась с образцами, содержащими антитела к антигенам системы Rhesus В частности, сывороток с анти-Б-антителами, реагирующими на плоскости было 3 (5,8%) из 51 Образцы с анти-с-антителами также встречались в 5,8% случаев Подобные серологические свойства антител наблюдали также с 2 (3,9%) образцами анти-К-антител

Количество сывороток анти-D (анти-DC), реагирующих на плоскости, равнялось 3 из 35, что составило 8,5% Из сывороток анти-с на плоскости в комбинации с фиколл-верографином реагировала половина образцов 3 (50%) из 6 Такое же распределение наблюдали при исследовании сывороток анти-К 2 образца (50%) агглютинировали эритроциты, 2 - не агглютинировали Сыворотки анти-Е, взятые в комбинации с фиколл-верографином, с эритроцитами на плоскости при комнатной температуре не реагировали

Среди исследуемых образцов были 4 категории активности сывороток (табл 4) Первая категория включала сыворотки с низким титром антител (Ц - 1 16), вторая - со средним титром (1 32 - 1 256) В третьей категории объединены сыворотки с титром 1 512 и выше Особую (четвертую) категорию составили сыворотки, антитела в которых выявлялись не всеми методами

Таблица 4

Протокол исследования титра сывороток разными методами

Метод исследования Всего сывороток Количество сывороток с титром антител

0 ц-1 16 1 321 256 1 512 и выше

реакция с 33% полглю-кином 356 34 152 139 31

реакция с 10% желатином 356 14 127 161 54

непрямая проба Кумбса 356 8 116 162 70

2-этапная проба 356 7 115 162 72

ферментный метод 249 4 67 125 53

Кумбс-фермент 248 2 56 128 62

гелевый метод 329 1 80 164 84

Реакция конглютинации с 33% полиглюкином оказалась наименее чувствительной Число сывороток, в которых антитела не были выявлены этим методом, составило 34 из 356 В то же время антитела в большинстве из этих сывороток выявлялись другими сравниваемыми методами

Число сывороток, показавших титр Ц - 1 16 при использовании реакции с 33% полиглюкином, равнялось 152, что составило 42,7% всех исследованных образцов При использовании других методов число сывороток с указанным диапазоном титра было меньшим 127 сывороток при использовании реакции с 10% желатином, 115 и 116 образцов при использовании непрямой пробы Кумбса и 2-этапной пробы, 67, 56, 80 образцов при использовании соответственно ферментного метода, метода Кумбс-фермент и геле-вой технологии

Число сывороток с высоким титром, 1 32-1 256 и 1 512 и выше, при использовании реакции с 33% полиглюкином, соответственно, уменьшалось по сравнению с другими методами

Наибольшее число сывороток с высоким титром регистрировалось при использовании гелевой технологии, пробы Кумбса и метода Кумбс-фермент Желатиновый метод уступал по чувствительности этим методам и располагался на шестом месте перед реакцией с 33% полиглюкином

По чувствительности практически одинаковыми оказались ферментный метод - 50,2% сывороток с титром антител 1 32 - 1 256 (125 сыворотки из 249), гелевая технология - 49,8% сывороток с титром антител 1 32 - 1 256 (164 сыворотки из 329) и метод Кумбс-фермент - 51,6% сывороток с титром антител 1 32 - 1 256 (128 сывороток из 248)

Наибольший интерес представляла четвертая категория сывороток, к которой были отнесены образцы с антителами, не выявлявшимися каким-либо из методов

Проведенные исследования показали, что наибольший процент невы-явленных антиэритроцитарных антител имел место при использовании метода с 33% полиглюкином (9,6%) Далее следует метод с 10% желатином этим методом не выявлены антитела в 14 сыворотках (3,9%) В непрямой пробе Кумбса, 2-этапной модернизированной пробе и ферментном методе антитела не выявлялись в 8 (2,2%), 7 (2%) и 4 (1,6%) сыворотках соответственно В противоположность этому в более чувствительных методах -Кумбс-фермент и гелевом - не были выявлены антитела всего в 2 (0,7%) и 1 (0,4%) сыворотке

Таблица 5

Протокол титрования антител, которые были выявлены не всеми методами

№ п/п Антитела к антигену Титр антител при использовании методов

1 2 -> J 4 5 6 7

1 Б 0 2 2 2 4 4 4

2 Б 0 2 2 2 4 8 8

3 Б 0 2 2 2 4 8 4

4 Б 0 0 Ц ц 4 4 2

5 О 0 0 ц ц 4 4 2

6 Б 0 0 2 2 2 4 2

7 В 0 2 2 4 8 8 4

8 В 0 2 2 2 4 4 4

9 Э 0 2 4 4 4 4 8

10 Э 0 4 4 4 4 8 8

11 Б 0 2 4 4 4 8 4

12 Э 0 0 0 0 ц Ц 0

13 О 0 Ц Ц Ц 2 4 2

14 в 0 0 0 0 2 4 2

15 в 0 0 2 2 2 4 4

16 в 0 0 0 0 2 4 4

17 Б 0 0 0 0 2 4 2

18 Б 0 0 0 0 2 4 2

19 С 0 0 ц ц 4 4 2

20 С 0 2 2 2 2 2 4

21 С 2 2 0 2 2 4 4

22 Е 0 2 4 4 4 8 8

23 Е 0 4 4 4 4 8 16

24 Е 0 2 2 2 2 4 4

25 Е 2 0 4 4 2 4 4

26 с 0 Ц ц ц 2 2 2

27 с 0 0 ц ц ц ц 2

28 с 0 0 0 0 2 2 4

29 С* 0 0 0 0 2 4 2

30 С* 0 2 2 2 4 4 2

31 К 0 4 8 8 0 0 8

32 К 0 2 2 2 8 8 8

-> о JJ К 0 2 4 8 0 0 8

34 к 0 64 128 128 64 256 256

35 к 0 8 8 8 0 8 8

36 к 0 2 4 4 0 4 4

Всего не выявлено 34 14 8 7 4 2 1

1 - метод с 33% полиглюкином

2 - реакция с 10% желатином

3 - непрямая пробы Кумбса

4 - 2-этапная модернизированная проба

5 - ферментный метод

6 - метод Кумбс-фермент

7 - гелевый метод

0 - антитела не выявлены

Ц - антитела выявлены в цельной сыворотке (не титруются) 2, 4, 8 и т д - титр 1 2, 1 4, 1 8 и т д

Сравниваемые методы проявляли неодинаковую чувствительность по отношению к разным образцам сывороток, отличающихся как специфичностью содержащихся в них антител, так и их активностью (табл 5) В частности, антитела, имеющие относительно низкий титр (12-14) при титровании методом с 10% желатином (всего 17 образцов), не всегда удавалось выявить методом с 33% полиглюкином (строки 1 — 3, 7 — 11, 20, 22 — 24, 30 — 33, 36) Из них 8 сывороток с анти-О-антителами (47%), 4 - с анти-К (23,5%), 3-е анти-Е-антителами (17,6%) и по 1 сыворотке (5,8%) с анти-С-и анти-С^-антителами Несмотря на то, что антитела проявляли незначительную активность и присутствовали в низком титре, они хорошо идентифицировались другими методами Исключением служили 2 сыворотки (ан-

ти-С, анти-Е,) с таким же титром антител, но детектируемые этим методом (строки 21, 25) Количество образцов сывороток, содержащих анти-К-ангитела, не детектируемых методом с 33% полиглюкином, составляло 6 (18%) (строки 31 - 36) Напротив, другими методами антитела в этих сыворотках выявлялись Из них в 5 сыворотках (строки 31 - 33 , 35, 36) антитела присутствовали в низком титре (1 2 - 1 8), а в одном образце (строка 34) титр антител был достаточно высоким (1 64)

Отдельные исследованные сыворотки представляли собой исключение Антитела, содержавшиеся в них, не выявлялись высокочувствительными методами В частности с помощью методов, отличающихся, по общему мнению специалистов-иммуносерологов, наибольшей чувствительностью, эти антитела выявлялись с трудом, в то время как с помощью метода Кумбс-фермент они выявлялись четко и титровались Так, в одной из сывороток (строка 12) анти-О-антитела не были выявлены с помощью гелевого метода, однако, методом Кумбс-фермент эти антитела были обнаружены

В образцах анти-D и анти-С (строки 12 - 14, 16 - 19) антитела детектировались и титровались (титр 12-14) при использовании ферментного метода и метода Кумбс-фермент В то же время в непрямой пробе Кумбса и 2-этапной пробе с использованием антиглобулина эти антитела выявить не удалось (строка 12, 14, 16-18)

Сыворотки со слабыми анти-с- и анти-С"-антителами (строки 28, 29) имели титр 12-14 при использовании ферментного метода и метода Кумбс-фермент Эти антитела не выявлялись непрямой пробой Кумбса и 2-этапной пробой Некоторые из антиэритроцитарных антител (в основном анти-К) не детектировались в ферментном методе (строки 31, 33, 35, 36), что, по-видимому, связано с модификацией K-антигена под действием про-теолитических ферментов (Nevauhnna et al, 1978, Scott et al, 1994, H В Ми-неева, 2000, А А Рагимов и соавт, 2000), либо зависит от иных физико-химических свойств как антигенов, так и самих антител В то же время ферментный метод и метод Кумбс-фермент хорошо выявляют слабо реагирующие антитела системы Rhesus, что делает их особенно ценными для скрининга именно этих антител

ЧАСТОТА АНТИЭРИТРОЦИТАРНЫХ АНТИТЕЛ IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

Частота антиэритроцитарных антител, относящихся к субклассу IgGl, в популяции русских составила 51,2%, комбинация антител IgGl+IgG3 зарегистрирована у 39,2% сенсибилизированных (табл 6) Антитела IgG3 без примеси IgGl, IgG2 и IgG4 встречались значительно реже - в 3,9% случаев Частота антител IgG2 и IgG4 без примеси антител IgGl и IgG3 также оказалась невысокой и составила 5,7%

Таблица 6

Частота антиэритроцитарных антител 1§С1 и ^03 у аллосенсибилизирован-ных лиц русской национальности

Принадлежность антител к субклассу Частота антител

в абсолютных цифрах в%

^01 170 51,2

[803 13 3,9

+ ^3 130 39,2

+ без примеси и ^03 19 5,7

Всего исследовано 332 100

Изучение частоты распределения субклассов антител в зависимости от их специфической направленности, позволило выявить некоторые особенности анти-Б-антител, отличающие их от антител другой специфичности (табл 7)

Таблица 7

Частота антиэритроцитарных антител 1аО в зависимости от их специфичности

Специфичность антител Количество образцов Частота антител (%), относящихся к

вз 01+03 в2 и/или 04

анти-Б 179 48,01"4 2,2й34 48,11234 1,71234

анти-С 78 55,3234 6,35^4 29,5234 8,9234

анти-Е 33 42,734 3,0м 36,334 18,134

анти-К 22 86,54 4,б4 0 9,14

анти-с 16 31,2 12,6 56,2 0

анти-С™ 2 100,0 0 0 0

анти-е 2 50,0 0 0 50,0

1 - различия достоверны по сравнению с анти-С-антителами (р<0,05)

2 - различия достоверны по сравнению с анти-Е-антителами (р<0,05) " - различия достоверны по сравнению с анти-К-антителами (р<0,01) 4 - различия достоверны по сравнению с анти-с-антителами (р<0,01)

Анти-Б-антитела с одинаковой частотой были представлены как 1^01 (48,0%) так и комбинацией 1§01+^03 (48,1%) Таким образом, 96% сывороток анти-Б содержали антитела, относящиеся к 1§01 -субклассу Большинство анти-К-антител (86,5%) также было представлено ^01-субклассом, что ставит их в один ряд с анти-Б-антителами

Уместно подчеркнуть, что анти-К-антитела располагаются после ан-ти-Б-антител и по степени клинической значимости

Частота анти-С-антител, относящихся к ^01, достоверно превышала частоту анти-С-антител других субклассов и составляла 55,3%

Для анти-с-антител характерна более высокая частота комбинации ^01+^03 (56,2%)

Обращает на себя внимание относительно высокая частота антител анти-Е, относящихся к субклассам и 1§04 - 18,1% По литературным данным (С И Донсков, 2005), анти-Е-антитела встречаются чаще, чем анти-с, однако по клинической значимости существенно уступают последним В шкале приоритета трансфузионно опасных антител анти-Е-антитела занимают место после антител анти-с Возможно, меньшее клиническое значение анти-Е-антител обусловлено тем, что они чаще, чем другие антитела, представлены иммуноглобулинами субклассов 02 и 04

В связи с небольшой выборкой анти-С*- и анти-е-антител достоверных данных о частоте распределения субклассов в этой категории спе-цифичностей получить не представилось возможным Тем не менее, можно отметить, что даже в столь малой выборке (табл 7) анти-С"-антитела чаще, чем анти-е-антитела, представлены иммуноглобулинами 01 Указанное обстоятельство совпадает с известными данными о том, что анти-С™-антитела в значительно большей степени трансфузионно опасны, чем анти-е

С целью установления ^О-субкласса антител, которые не выявляются каким-либо из методов было исследовано 22 образца Представлялось интересным выяснить, нет ли какой-либо зависимости между способностью антител проявлять себя в том или ином методе и принадлежностью их преимущественно к какому-нибудь одному из ^О-субклассов (табл 8)

Таблица 8

Распределение 1§0-субклассов в образцах антител, не выявляемых каким-либо из методов

Специфичность антител Количество сывороток, в которых антитела выявлены не всеми методами Количество сывороток, антитела которых относились к субклассу ^

в1 03 01+03 02 и/или 04

анти-О 7 4 0 1 2

анти-С 1 0 1 0 0

анти-Е 4 2 0 1 1

анти-С 1 1 0 0 0

анти-с л :> 0 0 0

анти-К 6 4 1 0 1

Всего 22 14 2 2 4

Из 22 трудно детектируемых образцов антител 14 (63,6%) относились к На долю антител ^вЗ пришлось только 2 образца (9,1%) из указанного количества Комбинированные антитела, 1§01+1§03, также встречались в 9,1% случаев Интересно отметить, что 4 образца (более 18%) из не-выявленных антител относились к 1§02, ^04, что свидетельствует в пользу того, что часть не детектируемых антител не принадлежит к клинически значимым Вместе с тем при рутинном скрининге антител имеется высокий риск пропустить трансфузионно значимые антитела, особенно, если используются менее чувствительные методы исследования Основанием для такого заключения служит то обстоятельство, что большая часть из невыявленных антител (82%) относится к 1 и ^ОЗ

Как было установлено (табл 9), из 202 образцов антител ^С1 и ^СЗ в 9% случаев (18 сывороток), антитела не были выявлены Для группы, не содержащей и ^вЗ, процент сывороток с невыявленными антителами был в 3,6 раза выше (36,3%) Из 11 сывороток, в которых антитела были представлены субклассами 1"02 и в 4 образцах антитела не выявля-

лись

Таблица 9

Частота распределения 1§0-субклассов в образцах антител, выявляемых и не выявляемых отдельными методами

Частота ^в-субклассов Частота 1§0-субклассов

Субкласс ДО антител, выявляемых все- антител, выявляемых не

ми методами всеми методами

в абсолютных в % в абсолютных в%

цифрах цифрах

109 51,1 14 63,6

вз 10 4,5 2 9,1

01+03 83 38,9 2 9,1

02 и/или 04 11 5,5 4 18,2

Всего 213 100 22 100

Таким образом, невыявляемые антитела относительно чаще представлены иммуноглобулинами субклассов в2 и 04, трансфузионное значение которых не столь высоко, как антител 1§01 и ^03

Таблица 10

Частота распределения субклассов 1§0 в образцах антител, не выявляемых

каким-либо из методов

Метод исследования Количество исследованных сывороток, в которых антитела не выявлялись Количество сывороток, антитела которых относились к субклассу

01 вз 01+03 02 и/или 04

реакция с 33% полиглюкином 20 14 1 2 3

реакция с 10% желатином 9 6 0 1 2

непрямая проба Кумбса 7 4 1 1 1

2-этапная проба 6 4 0 1 1

ферментный метод 4 2 1 0 1

Кумбс-фермент 2 2 0 0 0

гелевый метод 1 0 0 0 1

Методом с 33% полиглюкином не были выявлены 17 образцов антител (85%), принадлежащих к субклассам I и 1»03 (табл 10) Примерно такое же распределение наблюдали при использовании непрямой пробы Кумбса из 7 сывороток в 6 случаях (85,7%) невыявленные антитела относились к иммуноглобулинам 01 и 03 Из образцов антител, невыявленных желатиновым методом, 7 (около 78%) относились к и ^вЗ Двухэтапной модернизированной пробой не детектировано 5 образцов (83,3%) и ^вЗ из 6 сывороток Для ферментного метода было характерно следующее соотношение из 4 сывороток в 3 (75%) имелись антитела и ^03, в одной антитела этих субклассов отсутствовали Методом Кумбс-фермент не выявлены два образца антител, относящихся к 1§01 В гелевом методе не выявлен один образец антител, принадлежащих к ^02 и/или 1§04

ГЕМОЛИЗИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ

Антитела, как известно, активируют комплемент по классическому пути, который начинается с взаимодействия Clq, компонента комплемента с комплексом антиген - антитело

Фиксация антител на эритроцитах сама по себе не повреждает клетки Однако последующее связывание комплемента с комплексом антиген - антитело может приводить к их разрушению

Femstein et al в 1986 году показали, что первое место по способности взаимодействовать с Clq-компонентом комплемента занимают иммуноглобулины IgG3-субкласса, далее активность убывает в последовательности IgG3 > IgG 1 > IgG2 > IgG4 Иммуноглобулины IgG2 слабо активируют систему комплемента Антитела IgG4-cy6icnacca практически не связываются с Clq-компонентом и, по данным Vlug et al (1989), не способны активировать комплемент по классическому пути

Lynen et al (1994), Garner et al (1995), Asmussen et al (1996) нашли, что IgGl и IgG3 в большей степени активируют комплемент и оказывают сильное разрушающее действие на клетки, что в свою очередь обусловливает клиническое значение этих антител Повреждающее действие IgG2 меньше, а антитела IgG4-cy6miacca слабо разрушают или вообще не разрушают клетки, в связи с чем, клиническое значение этих антител невелико

Опосредованный антителами гемолиз m vitro зависит от активности комплемента, а также от принадлежности антител к той или иной групповой системе Наиболее выраженными гемолитическими свойствами после групповых антител АВО обладают резус-антитела Среди последних более выраженная гемолитическая активность характерна для анти-0-антител Антитела системы Келл не обладают, либо в незначительной степени обладают таковой По данным Mollison et al, (1997) около 20% образцов анти-К-антител активируют СЗ-компонент комплемента, однако гемолиза in vitro не вызывают

Как было установлено (табл 11) из 204 сывороток 19 (9,3%) обладали гемолизирующей активностью

Из всех исследованных сывороток гемолиз чаще регистрировался в образцах, содержащих антитела к антигенам системы Резус (табл 11) В частности, сывороток с анти-О-антителами, проявляющих комплементсвязы-вающую активность, было 10 Гемолиз наблюдали также с 3 образцами ан-ти-К, 2 - анти-Е, по 1 - анти-DCEK, анти-DC, анти-DE и анти-с

Вряд ли можно думать, что гемолиз, вызванный анти-DCEK- и анти-DC-антителами был связан с анти-С-специфичностью По-видимому, он был обусловлен антителами анти-D, анти-Е и анти-К, которым сопутствовали анти-С-антитела Основанием для такого заключения послужили полученные нами данные о том, что ни одна из 5 моноспецифических сывороток ан-ти-С, 5 анти-С" и 2 анти-Се не проявляла гемолизирующей активности

Таблица 11

Частота антител, обладающих и не обладающих гемолизирующими свойствами, в зависимости от их активности (титра)

цифич-ть антител Количество исследованных образцов Количество сывороток

о <и с_> ш с низким титром с высоким титром обладающих гемолизирующими свойствами не обладающих гемолизирующими свойствами

с ни тит 5КИМ ром с выс тит оким ром с ни тит зким ром с выс тит оким ром

абс % абс % абс % абс %

-Э 82 27 55 5 18,5 5 9,1 22 81,5 50 90,9

-С 5 4 1 0 0 0 0 4 100 1 100

-ОС 36 6 30 0 0 1 3,3 6 100 29 96,7

-ОСЕ 13 0 13 0 0 1 7,7 0 0 12 92,3

-ОЕ 4 0 4 0 0 0 0 0 0 4 100

-СЕ 2 2 0 0 0 0 0 2 100 0 0

-с 16 9 7 1 11,1 0 0 8 88,9 7 100

-Е 18 11 7 1 9,1 1 14,3 10 90,9 6 85,7

-Се 2 0 2 0 0 0 0 0 0 2 100

-С" 5 3 2 0 0 0 0 3 100 2 100

-ОСК 2 0 2 0 0 0 0 0 0 2 100

-ОСЕК 4 0 4 0 0 1 25 0 0 3 75

-сК 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 100

-К 13 7 6 2 28,6 1 16,7 5 71,4 5 83,3

-ОК 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 100

о 204 69 135 9 13 10 7,4 60 87 125 92,6

Частота гемолизирующих антител в выборках, сформированных по специфичности, характеризовалась следующими значениями Из 82 сывороток, содержащих анти-О-антитела, 10 (12,2%) обладали, а 72 (87,8%) не обладали гемолизирующими свойствами, среди 13 сывороток анти-К 3 (23%) проявляли гемолизирующую активность, из 18 сывороток, содержащих ан-ти-Е-антитела, зафиксированы две, обладающие гемолизирующей активностью (11,1%), из 16 сывороток, содержащих анти-с-антитела, гемолизирующую активность наблюдали только в 1 случае (6,2%) По специфичности ге-молизирующие антитела распределялись следующим образом анти-0 -68%, анти-К - 21%, анти-Е - 21%, анти-с - 5%

Наибольшая абсолютная частота образцов, проявляющих комплемен-тсвязывающие и гемолизирующие свойства, приходилась на выборку анти-

О-, затем анти-К-антител, что еще раз характеризует анти-Б- и анти-К-антитела как наиболее трансфузионно опасные Третье и четвертое место, исходя из полученных нами данных, занимают анти-Е- и анти-с-антитела Наибольшая относительная частота образцов, проявляющих комплементсвя-зывающие и гемолизирующие свойства, приходилась на анти-К-, затем на анти-О-антитела Далее следовали анти-Е- и анти-с-антитела

Следующая серия экспериментов включала исследование гемолизи-рующих свойств антител в зависимости от их титра (табл 11) С этой целью сыворотки разделили на две группы с высоким и низким титром

- Из 204 исследованных сывороток 69 (33,8%) содержали антитела, проявляющие невысокую специфическую активность (титр 12-1 32), в 135 (66,2%) присутствовали высокоактивные антитела (титр 1 64 - 1 2048)

В первой группе сывороток, с относительно низким титром антител, 13% (9 из 69) обладали гемолизирующими свойствами, 87% сывороток (60 из 69) не проявляли гемолизирующую активность Среди сывороток с относительно высоким титром антител (1 64 - 1 2048) частота образцов, проявляющих гемолизирующие свойства, была почти в 2 раза ниже - 7,4% (10 из 135 сывороток) Антитела, не проявляющие таких свойств, в этой группе составляли 92,6% (125 из 135 сывороток)

Из 135 сывороток с высоким титром антител 121 (89,6%) содержала антитела системы Резус, 8 (6%) содержали помимо антирезус-антител антиК-антитела Из них 9 сывороток обладали гемолизирующими свойствами, что составило 6,6%

Нами было исследовано 13 сывороток с анти-К-антителами 7 с низким и 6 с высоким титром антител Интересной особенностью анти-К-антител оказалось то, что по сравнению с антирезусными антителами они чаще проявляли гемолизирующие свойства

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в противоположность бытующему мнению антиэритроцитарные антитела, имеющие относительно низкий титр, представляют собой не меньший фактор риска развития посттрансфузионных гемолитических осложнений, чем антитела с высокой серологической активностью

Анализ распределения субклассов 1§0 в образцах антител, которые обладали комплементсвязывающими свойствами (табл 12) показал, что все они относились к субклассу и 1§03 или представляли собой смесь

ДО1+ДОЗ 44% (7 образцов) содержали ДО1, 18% (4 образца) - ДОЗ, 38% (5 образцов) приходилось на комбинацию

Среди этих антител образцы, не содержавшие 1§С1 и ^СЗ, как мы и предполагали, обнаружены не были Это объясняется тем, что именно ^01, 1§03 в большей степени обладают комплементсвязывающей активностью и, соответственно, имеют большее клиническое значение

Таблица 12

Распределение ^О-субклассов в антителах, обладающих гемолитическими свойствами

Специфичность антител Количество образцов Частота ^-субкласса

01 03 01+03 02 и/или 04

анти-Б 8 3 1 4 -

анти-ЭС 1 1 - - -

анти-БСЕ 1 - 1 - -

анти-с 1 - 1 - -

анти-Е 1 - - 1 -

анти-БСЕК 1 1 - - -

анти-К -> л 2 1 - -

Всего 16 7 4 5 -

Гемолизирующая активность антител соответствовала 3 - 25% гемолизу (табл 13)

Так, из всех исследованных сывороток 25 % гемолиз наблюдали только в образцах с анти-Б-антителами (строки 3, 9) Из 11 сывороток, содержащих анти-Б-антитела, в том числе комбинированные, в 8 сыворотках активность антиэритроцитарных антител была достаточно высока (титр антител 1 32 - 1 512) (строки I, 2, 6 - 9, 10, 13) Однако лишь в одном образце титр антител в какой-то мере соответствовал степени гемолиза 25% (строка 9) Из 3-х сывороток анти-0 с титром 18-1 16 одна сыворотка служила исключением вызывала 25% гемолиз (строка 3) В сыворотках с антителами других специфичностей 1 анти-с, 1 анти-Е и 3 анти-К также не наблюдалась связь между степенью гемолизирующей активности (6 - 12% гемолиз) и титром антител (14-1 64) (строки 11, 14-16)

Таблица 13

Активность антител, обладающих гемолизирующими свойствами

№ п/п Специфичность антител Титр антител в желатиновом методе Степень гемолиза

1 анти-0 1 64 3%

2 анти-0 1 32 3%

-1 J анти-О 1 8 25%

4 анти-0 1 4 6%

5 анти-0 1 16 6%

6 анти-0 1 256 6%

7 анти-0 1 128 12%

8 анти-О 1 32 3%

9 анти-О 1 128 25%

анти-С 1 32

10 анти-0 1 128 3%

анти-С 1 32

анти-Е 1 2

11 анти-с 1 16 6%

12 анти-Е 1 64 12%

13 анти-О 1 512 6%

анти-С 1 64

анти-Е 1 32

анти-К 1 8

14 анти-К 1 4 6%

15 анти-К 1 8 6%

16 анти-К 1 32 6%

Таким образом, высота титра и специфичность антител не коррелировали с уровнем их гемолизирующей активности Наблюдалась тенденция увеличения степени гемолиза в сыворотках, содержащих анти-О-антитела

ВЫВОДЫ

1 Методы выявления антиэритроцитарных антител, применяемые в Российской Федерации, проявляют неодинаковую чувствительность, что обусловлено полиморфизмом структуры, различной специфичностью и активностью исследуемых антител По степени чувствительности методы располагаются следующим образом в порядке убывания метод Кумбс-фермент, гелевый метод, 2-этапная модернизированная проба, непрямая проба Кумбса в классической постановке, ферментный метод, желатиновый метод, метод с 33% полиглюкином

2 Способность антиэритроцитарных антител детектироваться тем или иным методом связана с их принадлежностью к разным субклассам иммуноглобулинов Антитела, относящиеся к субклассам и 1§03, выявляются лучше, чем антитела, относящиеся к субклассам и

3 Установлена частота распределения антиэритроцитарных антител 1§01,

^СЗ и 1«04 среди аллоиммунизированных лиц русской популяции Частота антител, относящихся к субклассу составляет 51,2%, ^йЗ - 3,9%, ^02 и без примеси 1§01 и ^вЗ - 5,7% Комбинация антител 1+^03 зарегистрирована у 39,2% носителей антиэритроцитарных антител

4 Среди носителей антиэритроцитарных антител в русской популяции 9,3% лиц содержат антитела, обладающие комплементсвязывающими и гемолизирующими свойствами Большинство г емолизирующих антител (68,4%) относятся к системе Резус и представлены анти-О-специ-фичностью Антитела анти-К занимают второе место (15,8%), далее следуют антитела анти-Е (10,5%) и анти-с (5,2%)

5 Наибольшей комплементсвязывающей и гемолизирующей активностью обладают антитела субклассов ^01 и ^03 Высота титра и специфичность антител не коррелирует с уровнем их гемолизирующей активности

6 Полученные данные свидетельствуют о том, что антитела, имеющие относительно низкую активность и титр, представляют собой не меньший фактор риска посттрансфузионных гемолитических осложнений, чем антитела с высокой серологической активностью

7 Результаты сравнения методов детекции антиэритроцитарных антител дают основание поставить вопрос о целесообразности дальнейшего использования метода с 33% полиглюкином в практике работы лечебно-профилактических учреждений Российской Федерации Этот метод не достаточно эффективен - не выявляет антитела в 9,6 % случаев

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 При проведении скрининга и идентификации антиэритроцитарных антител целесообразно применение комбинации серологических проб

2 В случае выявления антиэритроцитарных антител необходимо определять их принадлежность к субклассу IgG с целью прогнозирования степени риска посттрансфузионных осложнений, гемолитической болезни новорожденного и своевременного проведения профилактических мероприятий

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1 Васильев Н И , Михайлова Н М , Моисеенкова Л Г Влияние центрифугирования на чувствительность реакции конглютинации с 10% желатином Вестник Службы крови России - 2004 - № 3 - С 26-28

2 Васильев Н И, Михайлова Н М , Моисеенкова Л Г Оценка чувствительности методов исследования противоэритроцитарных антител Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии Материалы научно-практической конференции С -Петербург - 2007 - С 39

3 Донсков С И , Васильев Н И , Михайлова Н М , Моисеенкова Л Г Сравнительная оценка методов выявления антиэритроцитарных антител Сообщение I Исследование специфичности, активности, принадлежности к субклассам IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 Вестник службы крови России -2007 - № 4 - С 3-10

4 Донсков С И, Васильев Н И , Михайлова Н М, Моисеенкова Л Г Сравнительная оценка методов выявления антиэритроцитарных антител Сообщение II Гемолитическая активность антител Вестник службы крови России -2007 - № 4 - С 10-13

5 Донсков С И , Васильев Н И , Михайлова Н М, Моисеенкова Л Г , Ка-ландаров Р С Сравнительная оценка методов выявления антиэритроцитарных антител Сообщение III Вестник службы крови России - 2008 -№ 1 - С 5-9

6 Моисеенкова Л Г , Васильев Н И , Михайлова Н М , Донсков С И Ге-молизирующая активность антиэритроцитарных антител Современная гематология Проблемы и решения Материалы научно-практической конференции Москва - 2007 - С 32

Подписано в печать 15 05 2008

Формат 60x84 1/16 Уел печ л 5,8 Тираж 50 экз Заказ № 3

Издательство НОУ ВПО "Смоленский институт

бизнеса и предпринимательства" Тел (4812) 65-99-14 Тел /Факс (4812) 65-99-13

214018, г Смоленск, пр Гагарина, 22

Актуальность темы. Аллоиммунизация является одной из причин возникновения посттрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных. Выявление аллоиммунных антиэритроцитарных антител имеет большое значение для пациентов, нуждающихся в многократных трансфузиях эрит-роцитсодержащих компонентов (Walker et al., 1989 [191]; Regan et al., 1997 [159]). Кроме того, наличие аллоиммунных антител к эритроцитарным антигенам у реципиента существенно снижает лечебный эффект проводимой гемо-трансфузионной терапии (Ю. М. Зарецкая 1983 [26]; Е. В. Бутина и соавт., 1998 [8]). Таким образом, аллоиммунизация антигенами эритроцитов представляет собой глобальный популяционный процесс (С. И. Донсков и соавт., 2001 [19]).

До настоящего времени сравнительная оценка (валидация) методов исследования антиэритроцитарных антител, применяемых в Российской Федерации, в полном объеме не проводилась. Рядом авторов осуществлялись работы по сравнению отдельных методов, предназначенных в основном для определения резус-фактора. Так, А. Г. Башлай в 1960 году [5, 6] провела сравнение усовершенствованного ею желатинового метода Фиска-Мак Ги [88] с методом агглютинации в солевой среде Винера [197]. Метод А. Г. Башлай, получивший название: «реакции конглютинации в пробирках с 10% желатином при температуре 46-48°С», до сих пор с успехом используется в учреждениях службы крови Российской Федерации.

А. Я. Ашкенази в 1962 году [3, 4] сравнивала два метода: разработанный ею экспресс-метод определения резус-фактора на предметных стеклах с использованием гепаринизированных сывороток и широко применяемый в то время метод определения резус-фактора в сывороточной среде на чашках Петри, предложенный Н. И. Блиновым и Н. С. Дробышевой [7]. Результаты исследования обоими методами практически совпали за исключением редких случаев трудноопределимого антигена Du.

О. В. Успенская в 1966 году [60] привела данные сравнения метода на пластмассовых тарелках с желатиной, на чашках Петри и ускоренного метода с применением желатины. А. А. Михайлова [36] проводила сравнительную оценку предложенной ею реакции конглютинации в пробирках с 33% полиглюки-ном при комнатной температуре и чашечного метода Н. И. Блинова и Н. С. Дробышевой. Результаты обоих методов были в достаточной степени воспроизводимы.

Имеются данные сравнительной оценки чувствительности методов с 10% желатином, с 33% полиглюкином и антиглобулиновым тестом (Н.В. Минеева, 1991 г. [33]), поликатионного метода выявления антиэритроцитарных антител (Г. В. Скосырев, 1998 [52]), альбуминового метода (С. И. Донсков, 1968 [14, 15]), двухэтапной модернизированной пробы с использованием антиглобулина (Н. И. Васильев, 2002 [9]), гелевой технологии (М. Элламаа и соавт., 1998 [63]), ферментных (С. И. Донсков, 1969 [16]; Р. С. Сахаров, 1968 [48]) и других методов выявления антител.

Упомянутые авторы проводили сравнение воспроизводимости и чувствительности разработанных или модифицированных ими методов лишь с некоторыми, отдельно взятыми методами, применяемыми в РФ. В целом же сопоставление одновременно всех используемых в РФ методов, как уже указывалось выше, не проводилось.

Вторым побудительным мотивом, продиктовавшим необходимость проведения настоящей работы, послужили накопленные в литературе последних лет многочисленные данные о различном химическом строении и своеобразии пространственной структуры антиэритроцитарных антител. Указанные особенности антител, по-видимому, обусловливают неодинаковое их клиническое значение, а также неодинаковую возможность детекции тем или иным методом.

Антиэритроцитарные антитела дифференцируются на три основных класса: IgM, IgA, IgG, и несколько субклассов (Furukawa et al., 1991 [89]). Однако не все классы и субклассы иммуноглобулинов способны вызвать in vivo разрушение эритроцитов (Giblett, 1977 [93]; Walker et al., 1989 [191]). Shaw et al. (1988) [170], Lynen et al. (1994) [131] отметили, что в трансфузиологической и акушерской практике имеют значение антитела, относящиеся к классам М и G и субклассам IgGl и IgG3, что связано с некоторыми особенностями их строения, способностью активировать комплемент.

Morell et al. (1971) [145] и другие авторы (Nieuwenhuys et al., 1989 [148]; Lynen et al., 1994 [131]) показали, что антитела всех субклассов IgG проходят через плаценту, однако, не все вызывают гемолитическую болезнь новорожденных. Последняя обусловлена IgGl и IgG3, причем гемолиз эритроцитов зависит от количества только IgGl. Авторы объясняют это тем, что, по-видимому, только IgGl и IgG3 реагируют с Fc-фрагментами Ig-рецепторов лимфоцитов и в большей степени, чем IgG2 и IgG4, активируют комплемент. По данным Van der Winkel et al., (1991) [186], наибольшую активность при этом проявляют антитела, относящиеся к IgG3. В то же время большинство антител независимо от их класса и субкласса, включая антитела, не имеющие клинического значения, детектируются применяемыми в настоящее время методами.

Имеется и иная точка зрения. По мнению классиков современной трансфу-зиологии Mollison et al., (1997) [143], Voak (1999) [190], Gustafsson et al., (2004) [100] не существует универсального метода выявления всех клинически значимых антител. Очевидно, что методы, детектирующие неполный спектр транс-фузионно опасных антител, неприемлемы, поскольку не исключают риска по-сттрансфузионных осложнений. Так же, по-видимому, неприемлемы и чрезмерно чувствительные методы, выявляющие параллельно с клинически значимыми клинически незначимые антитела. В этом случае дозы эритроцитов, которые фактически являются совместимыми с кровью реципиента, выбывают из арсенала средств трансфузионной помощи, что для некоторых реципиентов может оказаться фатальным, поскольку исключает возможность трансфузион-ного лечения.

В связи с выше перечисленным возникает ряд актуальных для клинической трансфузиологии вопросов. Какую степень чувствительности иммуносерологи-ческих методов следует считать достаточной для детекции антител в клинической практике? Насколько клинически значимы антиэритроцитарные антитела, не детектируемые некоторыми методами? Имеется ли взаимосвязь между часрыми методами? Имеется ли взаимосвязь между частотой распределения антител в популяции и их принадлежностью к тому или иному субклассу иммуноглобулинов? Какова частота субклассов иммуноглобулинов среди антител разной специфичности?

В отечественной литературе отсутствуют данные о частоте антиэритроци-тарных антител IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 у аллосенсибилизированных лиц. Нет сведений о гемолизирующей активности антиэритроцитарных антител, несмотря на то, что именно это свойство антител, как считается, обусловливает гемолиз эритроцитов in vivo и, соответственно, тяжесть посттрансфузионных осложнений.

В 2004 году Гематологическим научным центром РАМН совместно с другими учреждениями службы крови начаты кооперированные исследования под общим названием: «Валидация методов определения антиэритроцитарных антител». Цель этих исследований - оценить эффективность скрининга антиэритроцитарных антител в лечебно-профилактических учреждениях РФ, сравнить на большом материале чувствительность методов выявления антиэритроцитарных антител, дать научно обоснованные рекомендации по совершенствованию проб на индивидуальную совместимость донора и реципиента при переливании эритроцитов.

Целью настоящего исследования в рамках упомянутой программы явилась сравнительная оценка (валидация) методов выявления антиэритроцитарных антител, применяемых в Российской Федерации.

Задачи исследования:

1. Исследовать серологические параметры сывороток (активность, специфичность, титр и др.) семью методами, применяемыми в лечебно-профилактических учреждениях Российской Федерации.

2. Установить частоту антиэритроцитарных антител, относящихся к IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4, у аллосенсибилизированных лиц, а также распределение субклассов иммуноглобулина G в зависимости от специфичности антител.

3. Установить возможную связь между субклассами, к которым относятся антиэритроцитарные антитела, и их способностью детектироваться разными серологическими методами.

4. Исследовать гемолизирующую активность антител в зависимости от их активности, специфичности и принадлежности к тому или иному субклассу IgG.

Научная новизна. Показано, что антиэритроцитарные антитела в силу структурного полиморфизма проявляют неодинаковую способность реагирования при их детекции разными методами. Установлена частота распределения антиэритроцитарных антител IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 среди сенсибилизированных лиц исследуемой популяции.

Установлена частота антител, обладающих гемолизирующей активностью, а также зависимость этого свойства от принадлежности антител к субклассам IgG. Показано, что уровень гемолизирующей активности антител не коррелирует с их специфичностью и титром, однако зависит от принадлежности антител к IgGl, IgG3 или IgG2, IgG4 субклассам.

Научно-практическая ценность. Установлена частота встречаемости субклассов IgG и частота распределения их в зависимости от специфической направленности и гемолизирующей активности антиэритроцитарных антител.

Пути практической реализации. Полученные данные показывают реальные возможности серологических методов детекции антиэритроцитарных антител и могут быть использованы в системе обеспечения иммунологической безопасности гемотрансфузий, в частности, при подборе совместимых пар донор - реципиент, прогнозировании степени риска посттрансфузионных осложнений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Полиморфизм антиэритроцитарных антител обусловливает неодинаковую их способность детектироваться разными серологическими методами.

2. С помощью какого-либо одного из методов скрининга антиэритроцитарных антител не всегда удается выявить антитела, относящиеся к IgGl и IgG3.

3. Антитела, имеющие относительно низкую активность и титр, представляют собой не меньший фактор риска посттрансфузионных гемолитических осложнений, чем антитела с высокой серологической активностью.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на заседания проблемной комиссии «Проблемы донорства, производства и контроля компонентов и препаратов крови» (13.03.08) в ГНЦ РАМН; материалы диссертации представлены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (13-15 июня 2007 г.) С.-Петербург; на научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения» (29-30 ноября 2007) Москва.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 113 траницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, приложения. Библиография включает 63 отечественных и 139 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 5 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Методы выявления антиэритроцитарных антител, применяемые в Российской Федерации, проявляют неодинаковую чувствительность, что обусловлено полиморфизмом структуры, различной специфичностью и активностью исследуемых антител. По степени чувствительности методы располагаются следующим образом в порядке убывания: метод Кумбс-фермент, ге-левый метод, 2-этапная модернизированная проба, непрямая проба Кумбса в классической постановке, ферментный метод, желатиновый метод, метод с 33% полиглюкином.

2. Способность антиэритроцитарных антител детектироваться тем или иным методом связана с их принадлежностью к разным субклассам иммуноглобулинов. Антитела, относящиеся к субклассам IgGl и IgG3, выявляются лучше, чем антитела, относящиеся к субклассам IgG2 и IgG4.

3. Установлена частота распределения антиэритроцитарных антител IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 среди аллоиммунизированных лиц. Частота антител, относящихся к субклассу IgGl, составляет 51,2%, IgG3 - 3,9%, IgG2 и IgG4 без примеси IgGl и IgG3 - 5,7%. Комбинация антител IgGl+IgG3 зарегистрирована у 39,2% носителей антиэритроцитарных антител.

4. Среди носителей антиэритроцитарных антител в русской популяции 9,3% лиц содержат антитела, обладающие комплементсвязывающими и гемоли-зирующими свойствами. Большинство гемолизирующих антител (68,4%) относятся к системе Резус и представлены анти-О-специ-фичностью. Антитела анти-К занимают второе место (15,8%), далее следуют антитела анти-Е (10,5%) и анти-с (5,2%).

5. Наибольшей комплементсвязывающей и гемолизирующей активностью обладают антитела субклассов IgGl и IgG3. Высота титра и специфичность антител не коррелирует с уровнем их гемолизирующей активности.

6. Полученные данные свидетельствуют о том, что антитела, имеющие относительно низкую активность и титр, представляют собой не меньший фактор риска посттраисфузионных гемолитических осложнений, чем антитела с высокой серологической активностью.

7. Результаты сравнения методов детекции антиэритроцитарных антител дают основание поставить вопрос о целесообразности дальнейшего использования метода с 33% полиглюкином в практике работы лечебно-профилактических учреждений Российской Федерации. Этот метод не достаточно эффективен - не выявляет антитела в 9,6 % случаев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении скрининга и идентификации антиэритроцитарных антител целесообразно применение комбинации серологических проб.

2. В случае выявления антиэритроцитарных антител необходимо определять их принадлежность к субклассу IgG с целью прогнозирования степени риска развития посттраисфузионных осложнений, гемолитической болез- " ни новорожденного, и своевременного проведения профилактических мероприятий.