Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Сравнительная эффективность методов идентификации возбудителей заболеваний урогенитального тракта у мужчин

На правах рукописи

ЧЕКМАРЕВ АЛЕКСЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

«Сравнительная эффективность методов идентификации возбудителей заболеваний урогенитального тракта у мужчин»

14.01.10 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 МАЙ 2Ш

Москва-2012

005016736

Работа выполнена на кафедре дерматовенерологии, микологии и косметологии ГБОУ ДПО «Российская Медицинская Академия Последипломного Образования» Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Липова Елена Валериевна

Научный консультант:

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник ФГБУ «ГНЦ Институт Иммунологии» ФМБА России

Болдырева Маргарита Николаевна

Официальные оппоненты:

Дубенский Валерий Викторович

доктор медицинских наук,

профессор, заведующий кафедрой

дерматовенерологии

ГБОУ ВПО «Тверская государственная

медицинская академия»

Минздравсоцразвития России

кандидат медицинских наук, Чернова Надежда Ивановна

доцент кафедры

кожных и венерических болезней ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России

Ведущая организация: Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва

Защита диссертации состоится «11» А^дУ 2012 года на заседании Диссертационного совета (Д 208.115.01) при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр дерматологии и косметологии» Минздравсоцразвития России по адресу:107076, г. Москва, ул. Короленко, д.З, стр.6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан «3-"( » 0 Ч 2012г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова

Актуальность темы Актуальность изучения проблемы урогенитальных заболеваний, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, связана с их широким распространением у мужчин репродуктивного возраста, отсутствием стандартов лабораторной диагностики, риском развития осложнений (H.A. Лопаткин, 2004; A.B. Сивков и соавт., 2004; K.G. Naber, W. Weidner, 2000; W. Weidner, 2003; V. Magri et al., 2007). Фактор мужского бесплодия составляет от 30 до 60% и имеет тенденцию к увеличению (С.Р. Исраилов, 19В2; Т.Я. Пшеничникова, 1990; Е.Е. Брагина, 2002), что связано с инфекционно-воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, развитием аномалий органов репродуктивной системы, влиянием вредных факторов окружающей среды, аллергизацией населения (Н.К. Абудуев, 2001, В.А. Божедомов, О.В. Теодорович, 2005; М.В. Торопцева, 2009). Одной из ведущих причин нарушения фертильности мужчин и развития патоспермии является повышение количества условно-патогениых микроорганизмов в урогениталыюм тракте мужчин, способных вызывать хронический инфекциошю-воспалительный процесс или запускать каскад аутоиммунных реакций с необратимыми трофическими и патоморфологическими изменениями в органах репродуктивной системы (С.Р. Исраилов, 1982; Л.Г. Кейт и др., 1988; О.В. Бухарин с соавт., 2001; И.И. Долгушин, с соавт., 2006).

Лабораторная идентификация условно-патогенных микроорганизмов урогенитального тракта имеет ряд объективных ограничений, заключающихся в недостаточной информативности применяемых методов лабораторного обследования, трудности интерпретации полученных результатов, отсутствии критериев нормоценоза и дисбалансов микрофлоры уретры мужчин, высокой стоимости лабораторного оборудования и комплектующих и т.д., а также высоких требований к профессиональной квалификации исследователей.

Современные лабораторные технологии, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, позволяют идентифицировать ДНК и РНК различных микроорганизмов, обладают высокой чувствительностью и специфичностью, но также имеют ряд объективных ограничений. Для получения объективных данных о качественном и количественном составе микроорганизмов урогенитального тракта необходимо использование методик позволяющих проводить количественную оценку условно-патогенных микроорганизмов, что является определяющим в решении вопроса об этиологической роли выявленных микроорганизмов и их ассоциаций.

Все вышесказанное, обуславливает необходимость создания новых высокоспецифичных и высокочувствительных лабораторных подходов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, позволяющих оценить как качественные, так и количественные показатели условно-патогенных микроорганизмов урогенитального тракта мужчин.

Целью настоящего исследования является оптимизация клинико-лабораторной диагностики урогенитальных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин.

Задачи исследования:

1. Изучить клинико-этиологические особенности урогенитальных инфекций у мужчин репродуктивного возраста.

2. Оценить диагностическую эффективность метода полимеразной цепной реакции в реальном времени с количественньм определением условно-патогенных микроорганизмов путем сравнительного анализа со стандартным комплексом клинико-лабораторных методов диагностики урогенитальных заболеваний у мужчин репродуктивного возраста.

3. Установить критерии нормоценоза и дисбаланса условно-патогенных микроорганизмов уретры мужчин репродуктивного возраста методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с количественным определением.

4. Выявить этиологически значимые условно-патогенные микроорганизмы в развитии дисбалансов уретры мужчин репродуктивного возраста.

5. Изучить прогностическую ценность показателей экспрессии генов иммунной системы в отделяемом уретры пациентов с уретритом и у практически здоровых мужчин.

6. Разработать алгоритм клинико-лабораторной диагностики и терапии уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраст при отсутствии облигатных патогенов.

Научная новизна

Впервые в процессе научно-исследовательской работы выявлены особенности клинического течения урогенитальных заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами у мужчин. С учетом современных данных об этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов с помощью метода ПЦР в реальном времени с количественным определением изучен качественный и количественный состав микрофлоры уретры у мужчин. На основании количественной оценки показателей результатов исследования отделяемого уретры мужчин методом ПЦР в реальном времени с количественным определением установлена этиологическая роль отдельных микроорганизмов и их ассоциаций в развитии инфекционно-воспалительных процессов. Определены критерии нормоценоза уретры мужчин и различных вариантов дисбаланса условно-патогенных микроорганизмов, приводящих к развитию уретритов. С учетом полученных данных дано научное обоснование этиологически направленной терапии уретритов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами и их ассоциациями.

Разработаны и обоснованы показания к применению метода ПЦР РВ с количественным определением условно-патогенных микроорганизмов у мужчин с наличием клинических симптомов уретритов различной степени выраженности при отсутствии облигатных патогенов. Разработан алгоритм клинико-лабораторной диагностики уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами у мужчин, позволяющий объективно установить диагноз в 95% случаях, что в 5,98 раз эффективнее комплекса традиционного клинико-лабораторного обследования, используемого в практическом здравоохранении.

На основании анализа результатов исследования экспрессии ряда генов иммунной системы отделяемого уретры практически здоровых мужчин и больных уретритом сделан вывод о возможности использования показателей экспрессии генов иммунной системы (IL8, TLR2, CD68, RORC2) с целью объективной оценки степени выраженности инфекционно-воспалительного процесса в уретре и, соответственно, выбора адекватной терапии. Практическая значимость работы

Получены новые данные о качественном и количественном составе микрофлоры уретры мужчин, выявлены особенности клинического течения уретритов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами.

В результате проведенных исследований достоверно установлена высокая диагностическая эффективность метода ПЦР в реальном времени с количественным определением условно-патогенных микроорганизмов.

Разработан алгоритм клинико-лабораторного обследования мужчин, позволяющий повысить эффективность выявления этиологически значимых условно-патогенных микроорганизмов, как причины уретритов на ранних стадиях до формирования осложнений.

Обоснована этиологическая терапия, что позволяет индивидуализировать и минимизировать объем терапевтического вмешательства в соответствии с принципом «необходимости и достаточности». Положения, выносимые па защиту

1. Уретриты, вызванные условно-патогенными микроорганизмами у мужчин, в большинстве случаев характеризуются стертой клинической симптоматикой. Специфических патогаомоничных клинических симптомов урогенитальных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, не выявлено.

2. Установлено, что инфекционно-воспалительный процесс, при доказанной роли условно-патогенных микроорганизмов, регистрируется в 2,7 раза чаще, чем обусловленный облигатными патогенами.

3. Результаты лабораторного исследования убедительно доказали полиэтиологическую структуру инфекционно-воспалительного процесса, вызванного условно-патогенными микроорганизмами с превалированием анаэробной группы микроорганизмов.

4. Применение разработанного алгоритма клинико-лабораторного обследования мужчин на урогенитальные заболевания, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, позволяет достоверно повысить эффективность диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний мочеполового тракта на ранних стадиях до развития осложнений с нарушением репродуктивной функции.

Внедрение результатов работы Результаты исследования и разработанные практические рекомендации внедрены в работу венерологического отделения ГБУ филиала «Савеловский» «МНЦЦК» Департамента здравоохранения города Москвы и кафедры дерматовенерологии, микологии и косметологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России. Получено решение о выдаче патента в Роспатенте от 27.02.2012 № 2011-126652 «Способ дифференциальной

диагностики манифестной и асимптомной форм уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста».

Апробация работы Основные результаты работы доложены и обсуждены на 6 научно-практических конференциях.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 16 рисунков и 16 таблиц. Указатель литературы содержит 190 источников, из них 110 отечественных и 80 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследование выполнялось с 01. 2009г. по 10. 2011г. Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 181 (100%) мужчины, обратившихся в кожно-венерологическое отделение ФГУ «3 Центральный Военный Клинический Госпиталь им. АЛ. Вишневского» Министерства обороны РФ и ГБУ «МНЦДК» филиал «Савеловский» Департамента здравоохранения города Москвы, с лечебной или профилактической целью. Возраст пациентов составлял от 18 до 45 лет, средний возраст 29,2±6,4 лет.

Критерии включения в группу обследования: возраст от 18 до 45 лет, наличие клинико-анамнестических данных различной степени выраженности; отсутствие облигатных патогенов (сифилис, ВИЧ, гепатит В, С). Критерии исключения: возраст до 18 и старше 45 лет, наличие соматических заболеваний в стадии декомпенсации, онкологических заболеваний, эндокринопатии, прием системных антибактериальных препаратов в течение 2-х месяцев или местных лекарственных препаратов в течение 3-х недель, предшествующих обследованию. Все пациенты были информированы о цели исследования и дали письменное согласие на участие в клинико-лабораторном обследовании. Методы исследования

Методы клинического обследования включали: выяснение жалоб, сбор анамнеза и проведение объективного клинического осмотра.

Методы лабораторного исследования: 1) микроскопия мазков окрашенных, метиленовым синим и по Граму (Приказ МЗ РФ от 20.08.2003 № 415); 2) обследование на сифилис (Приказ МЗ РФ от 26.03.2001 №87); 3) обследование на ВИЧ, гепатит В, С (Приказ Департамента здравоохранения г. Москвы от 28.11.94 г. № 606, приложение № 4); 4) культуральное исследование для выделения и идентификации аэробных и анаэробных микроорганизмов, грибов (5% и 10% кровяной агар, среда Эндо, желточно-солевой агар, шоколадный агар, среда Конго, энтерококкус агар, селективные угольные питательные среды, «Бифидумаг», питательную среду для бактероидов, «Анаэробик» агар, среда MPC, Сабуро); 5) полимеразная цепная реакция (ПЦР) без количественного определения для выявления ДНК облигатных патогенов

(Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Herpes simplex virus, Cytomegalovirus, HPV) выполнялась на амплификаторе ДТ 96 (ООО НПФ «ДНК-Технологии», Россия №ФСР 2007/01250 ТУ 9443-002-96301278-2007); 6) полимеразная цепная реакция в режиме реального времени с количественным определением условно-патогенных микроорганизмов урогенитального тракта, проводилась с использованием амплификатора ДТ-322 (ООО НПФ «ДНК-Технологии», Россия №ФСР 2010/08040 ТУ 9443-00746482062-2005); 7) методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией определяли мРНК генов иммунной системы в отделяемом уретры мужчин, регистрация результатов с помощью флуоресценции проводилась на оборудовании (ООО НПФ «ДНК-Технология» №ФСР 2007/01249 ТУ 9443-001-96301278-2007).

Статистический анализ проводили с использованием непараметрических методов в программе STATISTICA-S. Различия считались значимыми при р<0,05. Определение референтных интервалов проводилось согласно методическим рекомендациям В.В. Меньшикова (1983), где референтный интервал для медианы рассчитывается как интервал, включающий 95% всех величин (2,5 - 97,5 процентилей). Оценка диагностической эффективности клипико-лабораторных методов, произведена по формуле (а + d) / (а + b + с + d) х 100%, где а - истинно положительный; b - ложноположительный; с -ложноотрицательный; d - истинно отрицательный (ГОСТ Р 53022.3-2008 Часть 3. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов). Методом логистической регрессии в программе SAS 9.3, оценивалось влияние качественных и количественных признаков на вероятность распределения мужчин по группам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Общая характеристика группы обследованных пациентов Обследовано 181 (п=100%) мужчина, в возрасте от 18 до 45 лет, средний возраст 29,2±6,4 лет, из них 61,3% (п=111) мужчин обращались в возрасте наиболее высокой репродуктивной активности, от 21 до 30 лет.

Таблица 1

Возраст до 20 лет 21-30 лет 31-40 лет после 40 лет

Число пациентов (абс.) 7 111 48 15

Число пациентов (относит.%) 3,9% 61,3% 26,5% 8,3%

В браке состояло 40,3% (п=73) мужчин, 59,7% (п=108) были холосты. Данные анамнеза продемонстрировали, что мужчины с одинаковой частотой (Рг-0,326/0,354; р=0,7440) указывали на наличие одного постоянного полового партнера в 32,6% (п=59) и более 2-х - в 35,4% (п=64), у 32% (п=58) мужчин сексуальные отношения отсутствовали в течение последних 6 месяцев. У 18 (9,9%) пациентов были незащищенные контакты в течение 6 месяцев, предшествовавших обследованию, в 75,7% (п=137) случаев мужчины использовали в сексуальной практике незащищенные орогенитальные контакты, применение средств барьерной контрацепции отметили 85,6% (п=155) мужчин. В большинстве наблюдений 77,9% (п=141) возраст полового

дебюта составил от 17 до 23 лет, в 22,1% (п=40) - от 12 до 16 лет. Более 1/3 мужчин (38,1% ;п=69) указали на перенесенные ИППП, из них хл&мидийную инфекцию - 39, инфекцию, ассоциированную с микоплазмой - 24, гонорею -21, трихомоноз - 13, генитальный герпес - 5, сифилис- 1. При этом у 35 (51%) мужчин в анамнезе был один эпизод инфицирования облигатным патогеном, у 19 (27%) - два эпизода инфицирования, 9% мужчин (п=6) трижды перенесли ИПГ1П, 9 (13%) пациентов указали на наличие в анамнезе ИППП, вызванного одновременно несколькими облигатными патогенами. У 13,8% (п=25) пациентов до нашего обследования был диагностирован хронический простатит.

Полученные нами данные подтверждают известный факт, что раннее начало половой жизни и наличие нескольких половых партнеров повышают риск инфицирования урогенитальными заболеваниями и, соответственно, объясняют необходимость информирования подростков и молодых мужчин о рисках, связанных с ИППП и нарушениями репродуктивной функции.

Среди всех обследованных мужчин (п=181;100%) более половины пациентов (п=102; 56,3%) предъявили жалобы со стороны урогенитального тракта, в то время как, объективные клинические симптомы на момент осмотра были отмечены только в 33,7% (п=61) случаев (Рисунок 1).

Анализ клинической симптоматики продемонстрировал, что субъективные симптомы регистрировались в 1,7 раза чаще, чем объективные клинические проявления (р=0,0058; Рг-0,563/0,337). Наличие или отсутствие жалоб в данной выборке регистрировалось с одинаковой частотой (р=0,0944; Рг-0,563/0,437).

Жалоб нет (п=79) Жалобы в анамнезе (п=14) Жалобы на момент обращения (п=88) Объективные симптомы (п=61)

Рис.1 Распределение мужчин в зависимости от клинико-анамнестических данных (п=181;100%)

Анализ частоты встречаемости различных жалоб представлен на рисунке 2. Объективные клинические симптомы на рисунке 3.

зуд/жженис/дискомфортв уретре (п=61) выделения из уретры (п=24) налет/выделения на птч или кп (п=23) дизурия (п=23)

боль/дискомфорте промежности/мошонке (п=16) высыпания на шч или кп (п=13)

Рис.2 Частота встречаемости субъективных клинических симптомов (л=102;100%)

В большинстве случаев мужчины предъявляли жалобы на чувство зуда'жжения или дискомфорта (60%) в уретре в сочетании с другими субъективными

55553 7,7%-

Ш^Шл] 43,7% 56,3% (11=102)

48,6%

133,7%

симптомами, объективно наиболее часто (60%) отмечались гиперемия, отечность губок уретры, реже выделения

гиперемия, отечность губок уретры (п=37)

выделения из уретры (0=26)

гиперемия гпч или кп (п-24)

налет и/или отделяемое на гпч и/или кп (п=14)

высыпания на гпч и/или кп (п=6)

Рис.3 Частота встречаемости объективных клинических симптомов в группе обследованных мужчин (л=61;100%)

Обозначения: ГПЧ-головка полового члена, КП-крайняя плоть.

В целом, в группе (п=181;100%) обследованных пациентов у 58,6% (п=106) мужчин отмечались клинические симптомы иифекционно-воспалительного процесса мочеполовой системы различной степени выраженности, при этом стертые клинические симптомы регистрировались в 1,7 раз чаще, чем выраженные, 63,1% (п=67) и 36,8% (п=39) соответственно (Рг-0,631/0,368; р=0,0102). Заслуживает внимания факт наличия жалоб различной степени выраженности при отсутствии объекгивных клинических симптомов в 42,4% (п=45).

Распределение пациентов на группы в зависимости от наличия или отсутствия клинических симптомов заболевания

Все мужчины (181; 100%) были распределены на группы в зависимости от результатов клинико-анамнестического обследования. Выделены следующие группы: «Норма-?» (46,5%; п=84) - отсутствие клинико-анамнестических данных в пользу инфекционно-воспалительного процесса; «Патология» (21,5%; п=39) -наличие субъективных и объективных симптомов воспаления разной степени выраженности; «Серая зона» (32%; п=58) - субъективные или объективные симптомы воспаления незначительной степени выраженности, пограничные с физиологической нормой.

В группе «Патология» (п=39;100%) наиболее часто был диагностирован уретрит (п=24;61,5%), реже баланопостит (п=12; 30,8%) и сочетания уретрита и баланопостита (п=3; 7,7%). В группе «Серая зона» (п=58; 32%) убедительно установить клинический диагноз не удалось.

Результаты микроскопии мазков окрашенных, метиленовым синим и по Г'раму, представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты микроскопии в группах обследованных мужчин (п=181;100%)

Группа пациентов Кол-во паниектов в группе (абс./отнс%) Результаты микроскопии мазков окрашенных, метиленовым синим и по Граму. (количество лейкоцитов в полях зрения)

менее 5 от 5 до 10 от 10 до 20 более 20 всего более 5

«Норма?» 84 (46,5%) 80 1 1 2 4

«Патология» 39(21,5%) 9 6 7 17 30

«Серая зона» 58 (32%) 40 4 9 5 18

Всего 181 (100%) 129 (71,3%) 11 (6,1%) 17 (9,4%) 24 (13,2%) 52 (28,7%)

из уретры (42%) и др.

В группе «Норма-?» лейкоцитарный признак воспаления (от 5 до 20 и более лейкоцитов в полях зрения) выявлен у 4 (4,8%) из 84 (100%) мужчин, что может свидетельствовать об инаппарантном течении инфекционно-воспалителыюго процесса. В группе «Патология» (п=39;100%) в 76,9% (п=30) клинические симптомы сопровождались лабораторными признаками воспалениям, однако в 23,1% (п=9) при наличии выраженных клинических симптомов результаты микроскопии оставались в пределах нормы (менее 5 лейкоцитов в полях зрения). Особый интерес представляли пациенты «Серая зона» (п=58;100%), у которых лабораторные признаки воспаления были выявлены в 31,1% (п=18) случаев, в 68,9% (п=40), результаты микроскопии оставались в пределах нормы. Частота выявления облигатных патогенов представлена в таблице 3.

Таблица 3

Выявление облигатных патогенов методом ПЦР без количественного определения в

группах обследованных пациентов (п=181)

«Норма-?» п=84 абс. «Патология» п=39 абс. «Серая зона» п=58 абс.

Т. vaginalis 1 С. trachomatis 6 С. trachomatis 2

С. trachomatis 1 С. trachomatis+ М. genitalium 3 М. genitalium 2

T.vaginalis* HPV 2 С. trachomatis+ HPV 2 Т. vaginalis* HPV 1

HSV 1 М. genitalium 2 N. gonorrhoeae+ С. trachomatis 1

HPV 13 К gonorrhoeae ^ C.trachamatis 1 С. trachomatis+ CMV 1

HPV 5 CMV 1

Всего выявлено HSV 1

патогенов HPV 8

5» 14* 9*

*общее количество выявленных патогенов указано без HPV.

Методом ПЦР без количественного определения облигатные патогены (Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Herpes simplex virus, Cytomegalovirus, HPV) в группе «Норма-?» были обнаружены у 5 (5,9%) мужчин из 84 (100%), при этом результат микроскопии оставался в пределах нормы, что подтверждает наличие инаппарантных форм ИППП. В группе «Патология» выявить этиологически значимые патогены удалось только у 14 (35,9%) пациентов из 39 (100%), в группе «Серая зона» - у 9 (15,5%) из 58 (100%), из них лейкоцитоз определялся только у 4 (6,9%).

Таким образом, на основании традиционных методов клинико-лабораторного обследования, используемых в практическом здравоохранении, из 181-го обследованного пациента 41,4% (п=75) мужчин не имели клинико-лабораторных признаков воспаления. Диагноз урогениталыюй инфекции достоверно установлен только в 15,5% (п=28), при этом в 43,1% случаев (п=78) на основании результатов первичного клинико-лабораторного обследования не удалось убедительно диагностировать урогенитальное заболевание или констатировать его отсутствие. Следовательно, на современном этапе существует объективная необходимость внедрения в практическое здравоохранение новых высокочувствительных и специфичных методов лабораторной диагностики, позволяющих в короткие сроки дифференцировать состояние заболевания, нуждающееся в лечении, и состояние транзиторного носительства, пограничное с физиологической нормой, не требующее лекарственной терапии.

Оценка диагностической ценности результатов культурального исследования отделяемого уретры мужчин на условно-патогенные микроорганизмы.

Выполнено бактериологическое исследование 54 (100%) образцов отделяемого уретры мужчин, из них 24 (44,4%) в «Лаборатория XXI век» и 30 (55,6%) в отделении бактериологических исследований клинико-диагностической лаборатории ГКБ им. С.П. Боткина (заведующий отделением к.м.н., В.Г. Жуховицкий).

В «Лаборатории XXI век» в 14 (58,3%) биопробах из 24 (100%) удалось выявить по одному условно-патогенному микроорганизму (УПМ) в каждом образце. В диагностически значимом титре (от 10 до Ю7КОЕ/мл) в 8 случаях был выявлен Etiterococcus faecalis, в остальных Escherichia coli, Streptococcus agalacticae (Group В), Staphylococcus aureus, Stenotrophpmonas (X.) maltophilia, Lactobacillus spp., Acinetobacter baumannii. При исследовании 30 биопроб в бактериологической лаборатории ГКБ им. С.П. Боткина рост различных условно-патогенных микроорганизмов был получен во всех 30 (100%) образцах, в количестве от 102 до 106 КОЕ/мл. (Рисунок 5).

Таким образом, результаты бактериологического исследования, выполненные в разных лабораториях, продемонстрировали различную информативность по количеству и видовому составу выявленных микроорганизмов в образце. Из чего следует, что диагностическая эффективность культурального исследования в пределах данной работы оказалась вариабельной и составила от 58,3% до 100%. Учитывая все вышесказанное, внедрение новых высокочувствительных и специфичных способов детекции условно-патогенных микроорганизмов, позволяющих, в том числе, идентифицировать и труднокультивируемые микроорганизмы, необходимо для объективной и полноценной диагностики урогенитальных заболеваний, вызванных УПМ, у мужчин.

Анализ диагностической эффективности метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с количественным определением условно-патогенных микроорганизмов Описание метода ПЦР РВ с количественным определением условно-патогенных микроорганизмов

Впервые метод ПЦР РВ с количественным определением УПМ был использован для диагностики урогенитальных заболеваний (УГЗ), обусловленных УПМ, у женщин. Принцип метода, клиническая интерпретация результатов исследования, выполненных методом ПЦР РВ с количественным определением УПМ, описаны в патенте на изобретение №-2362808 от 27.07.2009 «Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности».

В рамках данного научного исследования впервые с помощью метода ПЦР РВ с количественной характеристикой в отделяемом уретры мужчин определяли более 30 различных условно-патогенных микроорганизмов (Таблица 4) с учетом современных данных об этиологическом значении условно-патогенных микроорганизмов уретры мужчин. Кроме того, оценивался параметр «Контроль

взятия материала» (КВМ) и параметр «Общая бактериальная масса» (ОБМ) в исследуемом образце.

Абсолютные значения показателей ОБМ, КВМ и выявленных условно-патогенных микроорганизмов с помощью метода ПЦР РВ с количественным определением представлены в виде логарифма (Igio ). который рассчитан по номеру порогового цикла и ориентировочно соответствуют КОЕ/мл. Например, абсолютный показатель изучаемого микроорганизма равен (lgio_-3,0) то есть 103 КОЕ/мл. Разница абсолютных показателей общей бактериальной массы и конкретного микроорганизма в исследуемом образце является относительным показателем. При определении этиологического значения конкретного условно-патогенного микроорганизма в развитии инфекционно-воспалительного процесса именно относительный показатель имеет решающее диагностическое значение. Данный метод разработан ООО НПО ДНК - Технология, Россия.

С целью оценки диагностической эффективности метода ПЦР-РВ с количественным определением УПМ, было проведено сравнительное исследование 30 (100%) образцов отделяемого уретры мужчин методом ПЦР РВ с количественным определением и культуральное исследование биопроб, полученных от одних и тех пациентов. Культуральное исследование 30 образцов проводилось в отделении бактериологических исследований клинико-диагностической лаборатории ГКБ им. С.П. Боткина (заведующий отделением к.м.н., В.Г. Жуховицкий), где специально готовились селективные питательные среды для аэробных и анаэробных микроорганизмов и грибов.

В процессе сопоставления полученных результатов (Рисунок 5), установлено, что минимальное число идентифицированных микроорганизмов при культуральном исследовании в образце составило 3, максимальное 12, медиана 7 (25 квартиль-6, 75-9). В результатах ПЦР РВ с количественным определением этих же образцов минимальное число выявленных УПМ составило 4, максимум 15, медиана 10 (25 квартиль -9, 75-12). В клиническом материале, исследованном методами ПЦР РВ с количественным определением и культуральным методом, чаще всего выявляли 1рибы рода Candida spp., в сочетании с другими аэробными и анаэробными микроорганизмами в количестве от 102 до 10б КОЕ/мл (Рис.5).

j Пкультуральный Ш ПЦР в реальном времени]

Рис. 5 Сравнительный анализ диагностической эффективности метода ПЦР РВ с количественным определением и культурального метода (¡1=3(1:100%)

Как видно из рисунка 5, метод ПЦР РВ с количественным определением является высокочувствительным и высокоспецифичным методом, что продемонстрировано путем сравнительного анализа с результатами культурального исследования (р=0,0022). Полученные данные о более высокой диагностической эффективности ПЦР РВ с количественным определением в сравнении с культуральным исследованием, особенно в отношении анаэробных и труднокультивируемых микроорганизмов, позволили нам в дальнейшем для верификации диагноза использовать метод ПЦР РВ с количественным определением. Преимуществом метода ПЦР РВ с количественным определением является возможность идентификации и определение этиологического значения труднокультивируемых микроорганизмов, которые в подавляющем большинстве случаев не дают роста даже при выполнении исследования в специализированных лабораториях по выращиванию анаэробов. Однако культуральное исследование по-прежнему остается «золотым стандартом» лабораторной диагностики, позволяющим идентифицировать микроорганизмы до вида и определять чувствительность выявленных штаммов к антибактериальным препаратам.

Оценка параметра «Контроль взятия биоматериала» метода ПЦР РВ Условием объективной количественной оценки УПМ методом ПЦР РВ с количественным определением является достаточное количество биоматериала в образце, которое определяется количеством геномной ДНК человека в исследуемой пробе и определяет величину показателя КВМ. Оптимальная величина КВМ должна составлять не менее 104 (4,0), значения КВМ меньше, чем 104 (4,0), свидетельствуют о том, что материал получен, не адекватно и требуется повторное взятие биоматериала.

В ходе оценки параметра КВМ 181 (100%) образцов было отмечено, что в 13 (7,2%) биопробах значение КВМ было ниже порогового <104 (4,0). Поэтому, для дальнейшего анализа были использованы 168 (100%) образцов со значением КВМ >104 (4,0). Полученные нами данные по анализу качества получения биопробы еще раз подтверждают постулат о том, что «ключевым моментом любого лабораторного исследования является момент получения клинического образца».

Изучение качественного и количественного состава условно-патогенных микроорганизмов отделяемого уретры мужчин методом ПЦР РВ с количественным определением

Частота выявления условно-патогенных микроорганизмов в уретре обследованных мужчин методом ПЦР РВ

В группе пациентов (п=168;100%) методом ПЦР РВ во всех образцах были выявлены условно-патогенные микроорганизмы в различных титрах (от 10 до 107) представлены в таблице 4.

Пояснения к таблице 4. *Диагносгически значимый тигр микроорганизма - это разница порядков между абсолютным показателем количества общей бактериальной массы и абсолютным показателем конкретного условно-патогенного микроорганизма в образце. На основании проведенных клинико-анамнестических и клинико-лабораторных сопоставлений было достоверно установлено, что при разнице порядков от 0 до 1 изучаемый микроорганизм имеет диагностическое значение, и назначение лекарственной терапии имеет этиологическое обоснование. Разница порядков от 1 до 2 свидетельствует о дисбалансе, который может

являться траюиторным и не требовать лечения или являться началом инфекционно-воспалительного процесса. При разнице порядков более 2-х изучаемый микроорганизм не имеет диагностического значения и рассматривается в качестве участника нормобиоценоза (патент на изобретение №-2362808 от 27.07.2009 «Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности»).

Таблица 4

Частота выявления условно-патогенных микроорганизмов уретры мужчин

(п-168;100%)

Выявляемые микроорганизмы/показатели частота выявления Абс./Отн.% частота выявления в диагностически значимом титре* Абс./Отн.%

Corynebacterium spp./Mobiluncus spp 164 97,6% 149 88,7%

Eubacterhim spp. 158 94,5% 119 70,8%

BPP группа 144 85,7% 104 61,9%

Anaerococcus spp., 155 92,3% 96 57,1%

Gardnerella vaginalis/Prevotella bixia'Porphvromonas spp. 123 73,2% 87 51,8%

Streptococcus spp. 101 60,1% 83 49,4%

Peptostreptococcus spp 145 86,4% 76 45,3%

Staphylococcus spp. 101 60,1% 74 44,0%

Megasphaera spp./Veillonella sppJDialister spp. 123 73,2% 70 41,6%

Enterobacterium spp 165 98,2% 58 34,5%

Haemophilus spp. 91 54,2% 52 30,9%

Gardnerella vaginalis 87 51,8% 43 25,6%

Lactobacillus spp. 87 51,8% 39 23,2%

Atopobium claster 146 86,9% 35 20,8%

Candida spp. 153 91,1% 30 17,8%

Fusobacterium spp. 51 30,4% 28 16,6%

Lachnobac-spp/Clostridium spp. 134 79,8% 27 16,1%

Ralstonia & Burkholderia spp. 37 22,1% 27 16,1%

Ureaplasma furealyticum + parvum) 45 26,8% 22 13,1%

Aerococcusspp 55 32,8% 21 12,5%

Leptotrihia spp. /Sneathia sppJFusobacterium spp. 81 48,2% 19 11,3%

Actinomicetes spp 98 58,3% 16 9,5%

Snterococcus spp 36 21,5% 12 7,1%

Atopobium spp. 42 25,0% 10 5,9%

Mycoplasma hominis 13 7,7% 6 3,6%

Neiseria spp 60 35,7% 5 2,9%

Pseudomonas aeroginosa 13 7,7% 4 2,4%

Минимальное число выявленных УПМ в образцах, полученных из уретры мужчин, составило - 4, максимальное - 25, медиана - 16, (25 квартиль - 13,75 - 19). В диагностически значимых титрах* в образце минимальное число диагностируемых УПМ составило 1, максимум 17, медиана 8 (25 квартиль - 6,75 -10). Из чего следует, что количество выделяемых УПМ в исследуемых образцах вариабельно, что указывает на разную степень обсеменения уретры мужчин условно-патогенными микроорганизмами. Проведенный анализ клшшко-анамнестических и лабораторных сопоставлений позволяет сделать вывод о том, что верифицировать диагноз урогенитального заболевания, вызванного условно-патогенными микроорганизмами, возможно только при проведении количественной оценки абсолютных и, главным образом, относительных

показателей выделенных УПМ с помощью метода ПЦР РВ с количественным определением. Решающее значение в установлении этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов и их ассоциаций в развитии уретрита мужчин имеют именно относительные показатели, то есть разница порядков между абсолютными значениями общей бактериальной массы (ОБМ) и абсолютным значением конкретного условно-патогенного микроорганизма.

Наиболее часто, в диагностически значимых титрах от 103 до 107 в исследованных образцах отделяемого уретры мужчин были выявлены анаэробные микроорганизмы Corynebacterium spp./Mobiluncus spp, Eubacterium spp., BPP группа, Anaerococcus spp., Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Peptostreptococcus spp., Megasphaera spp./Veillonella sppJDialister spp., аэробы Staphylococcus spp., Streptococcus spp., реже выявлялись Enterococcus spp., Gardnerella vaginalis, и молликуты Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum. Заслуживает внимания факт выявления грибов рода Candida spp. в 91,1% случаев, при этом в диагностически значимых титрах только у 17,8% мужчин. Таким образом, относительный показатель условно-патогенного микроорганизма позволяет избегать гипердиагностики и необоснованной лекарственной терапии.

Критерии иормоценоза уретры мужчин, установленные с помощью метода ПЦР РВ с количественным определением.

С целью определения критериев нормоценоза уретры мужчин с помощью метода ПЦР РВ с количественным определением из числа обследованных мужчин была сформирована группа пациентов, не имеющих клинико-анамнестических и лабораторных признаков заболевания. Перераспределение пациентов на группы представлено в таблице 5.

Таблица 5

Критерии формирования групп сравнения_i__

Группа пациентов Субъективные клинические симптомы Объективные клинические симптомы Простатит в анамнез Результаты микроскопии кол-во лейкоцитов Облигатные патогены

«Норма» 31,6% (п=53) нет нет нет <5 в п/з Нет

«Патология без патогенов» 27,9% (п=47) да/нет да/нет да/нет >5 в п/з* Нет

«Серая зона без патогенов» 24,4% (п=41) да/нет да/нет да/нет <5 в п/з Нет

«И1ШП» 16,1% (п=27) да/иет да/пет да/нет Да

Пояснение к таблице 5 *при выраженных симптомах и результатах микроскопии менее 5 лейкоцитов в полях зрения, пациенты распределялись в группу «Патология без патогенов».

Соответственно, группу «Норма» составили - 31,6% (п=53) мужчин, не имеющих клинико-лабораторных данных в пользу воспалительного процесса. «Патология без патогенов» (27,9%;п=47) - пациенты с клиническими симптомами и/или положительными результатами микроскопии, при отсутствии облигатных патогенов. «Серая зона без патогенов» (24,4%;п=41) - мужчины с разнообразными субъективными жалобами или объективными симптомами, пограничными с физиологической нормой, результаты микроскопии - менее 5 лейкоцитов в полях зрения и отсутствие облигатных патогенов при исследовании методом ПЦР без количественного определения. Отдельно сформирована группа «ИППП» (16,1%;п=27) - мужчины с верифицированным диагнозом урогенитального

заболевания обусловленным облигатным патогеном. После чего, в группе «Норма» и «Патология без патогенов» определили диапазон показателей абсолютных значений результатов ПЦР РВ с количественным определением в виде медианы (Ме) и 95% доверительного интервала медианы 2,5-97,5% процентилей, т.е. в данный диапазон вошли 95% всех наблюдений (Таблица 6).

Таблица 6

Референтные значения абсолютных количественных показателей условно-

Определяемые показатели «Норма» и -53 «Патология без патогенов» nl 7 значимые различия при р<0,05

медиана Медиаиа 2,5% - 97,5% медиана Медиана 2,5%-97,5%

Общая бактериальная масса 4,8 3,7-5,8 5,3 3,7-6,9 0,0004

Lactobacillus spp. 0.0 0-5,0 1.7 0-5,5 0,3067

Enterobacterium spp 2,5 1,2-3,7 2,9 1,8-5,2 0,0020

Streptococcus spp. 3,3 0-4,6 3,2 0-4,4 0,3336

Staphylococcus spp. 3,6 0-5,5 3,2 0-5,4 0,1287

SPP группа 2,9 0-5,1 3,9 0-6,5 0,0116

Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia^Porphyromonas spp. 2,8 0-4,7 3,4 0-6,0 0,0283

Gardnerella vaginalis 0,0 0-4,6 2,2 0-6,3 0,0486

Eubacterium spp. 3,2 0-4,9 4,4 0-5,8 0,0016

Atopobium claster 2,3 0-3,8 2,9 0-5,7 0,0177

Atopobium spp. 0,0 0-3,3 0,0 0-4,9 0,0106

Leptotrihia sppJSneathia spp. Fusobacterium spp. 0,0 0-4,6 1,7 0-6,1 0,0021

Fvsobacterium spp. 0,0 0-5,3 0,0 0-6,2 0,0667

Megasphaera spp. 'Veilonella sppJDialister spp. 1,9 0-5,3 3,1 0-6,4 0,0115

Corynebacterium sppJMobiluncus spp 2,0 0-3,6 2,4 0-4,6 0,0926

Lachnobac.spp/Clostridium spp. 4,1 1,2-5,3 4,6 0-5,6 0,0566

Peptostreptococcus spp 2,6 0-4,5 3,4 0-5,7 0,0101

Aerococcus spp 0,0 0-3,3 0,0 0-4,3 0,1261

Anaerococcus spp., 0,0 0-3,7 0,0 0-3,9 0,5712

Enterococcvs spp 3,1 0-5,2 3,6 0-5,7 0,0494

Ralstonia & Burkholderia spp. 0,0 0-4,4 0,0 0-5,5 0,0571

Neiseria spp 0,0 0-2,6 0,0 0-2,9 0,8521

Pseudomonas aeroginosa 0.0 0-2,2 0,0 0-3,1 0,5526

Haemophilus spp. 1,6 0-5.2 0,0 0-5,3 0,7771

Actinomicetes spp 0,0 0-3,4 2,4 0-3,9 0,0008

Candida spp. 2,5 0-4,0 2,7 0-3,6 0,1709

Представленные в таблице 6 абсолютные показатели УПМ вариабельны и в ряде случаев находятся в широком числовом диапазоне. При сравнении полученных показателей с использованием непараметрического теста (U-test Mann - Whitney), были выявлены значимые различия между абсолютными показателями условно-патогенных микроорганизмов в группах «Норма» и «Патология без патогенов». В группе «Норма» ряд определяемых абсолютных показателей был ниже, чем в группе «Патология без патогенов»: общая бактериальная масса, Enterobacterium spp, ВРР - группа, Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Atopobium claster, Atopobium spp, Leptotrihia sppJSneathia spp./Fusobacterium spp, Megasphaera

spp./Veilonella spp./Dialister spp. Actinomicetes spp., Peptostreptococcus spp. Пограничный уровень (p) - имели следующие микроорганизмы Ralstonia & Burkholderia spp., Enterococcus spp., Lachnobac.spp/Clostridium spp, Gardnerella vaginalis т.е, при увеличении выборки возможно изменение уровня статистической значимости.

Таким образом, статистически значимые различия абсолютных показателей условно-патогенных микроорганизмов группы «Норма» и группы «Патология без патогенов» позволили разработать критерии нормоценоза уретры мужчин и критерии дисбаланса условно-патогенных микроорганизмов. Следовательно, диапазон абсолютных значений УПМ группы «Норма» в виде медианы 2,5-97,5 процентилей характеризует состояние нормоценоза. Верхняя граница данного диапазона использовалась как критический уровень, превышение данных значений при дальнейшем анализе результатов ПЦР РВ с количественным определением обследованных пациентов расценивалось как признак наличия дисбаланса УПМ.

Таблица 7

Интерпретация показателей результатов ПЦР РВ_

ПОКАЗАТЕЛИ Абсолютный показатель* Оценка показателя Показатели КВМ, ОБМ, микроорганизмы МЛот/л«, и.игеЫуИсит, и.рапит оцениваются только по абсолютным показателям результатов ПЦР РВ с количественным определением УПМ.

Контроль взятия материала более 104 Нормальный уровень

менее 104 требуется повторное взятие материала

Общая бактериальная масса (ОБМ) юМо5 нормальный уровень

более 105 увеличенный уровень - признак дисбаланса

менее 103 сниженный уровень - возможно после антибиотикотерагаш или при индивидуальных особенностях

Ai.hominis, UMreatyticum, U.parvum менее 104 диагностически незначимый уровень,

более 104 диагностически значимый уровень, могут иметь этиологическое значение

ПОКАЗАТЕЛИ Абсолютный показатель* Относительны й показатель Оценка показателя

Streptococcus spp., Staphylococcus spp. 103-104 от 0 до 1 нормальный уровень - признак нормоценоза

от 1до 2 умеренно сниженный уровень - транзигорный вариант или признак дисбаланса

более 2 значительно сниженный уровень - признак дисбаланса

ОПРЕДЕЛЯЕМЫЕ УПМ менее 10^ более 2 нормальный уровень - признак нормоценоза

более 10^ от 1 до 2 слабо увеличенный уровень - транз игорный вариант изменения или раннее начало дисбаланса

от 0 до 1 значительно увеличенный уровень - признак дисбаланса

♦Абсолютный показатель ориентировочный и приблизительно равен КОЕ/мл.

Варианты дисбаланса условно-патогенных микроорганизмов уретры мужчин и степень его выраженности

На основании результатов лабораторного определения количества УПМ, выявленных при исследовании отделяемого уретры, методом ПЦР РВ с количественным определением и наличии клинических симптомов предложено разделить дисбалансы по степени выраженности и этиологической структуре.

Превышение количества (повышенные значения абсолютных и относительных показателей) выявленных аэробных и/или анаэробных условно-

патогенных микроорганизмов и/или грибов в исследуемом образце относительно значений нормы и относительно друг друга (см. Таблица 7) позволяет провести деление дисбалансов по этиологическому признаку: 1) анаэробный - вызванный анаэробными микроорганизмами (Gardnerella vaginalis /Prevotella bivia/Porphyromonas spp; Atopobium spp; Eubacterium spp; Leptotrichia sppJSneathia spp./Fusobacterium spp; Megasphera spp/Veilonella spp/Dialister spp; Lachnob acterium spp/Clostridium spp; Mobiluncus spp/Corynebacterium spp; Peptostreptococcus spp., Actinomicetes spp., Haemophilus spp.); 2) аэробный — вызванный Pseudomonas aeroginosa, Aerococcus spp., Enterococcus spp. * Ralstonia & Burkholderia spp*. *(могут проявлять себя как факультативные анаэробы); 3) Смешанный - вызванный аэробными и/или анаэробными УПМ и дрожжевыми грибами рода Candida.

В процессе данной научной работы не удалось конкретизировать условно-патогенные микроорганизмы, характерные именно для манифестной или именно для асимптомной форм инфекционно-воспалительного процесса, т.е., не удалось установить статистически значимых различий в качественном и количественном составе выявленных УПМ у мужчин с различным клиническим течением заболевания (р>0,05). С учетом полученных результатов можно сделать предположение о различных вариантах клинического ответа на одни и те же условно-патогенные микроорганизмы и их ассоциации с учетом исходной иммунологической резистентности организма пациента. Соответственно, данный факт подтверждает известное положение о необходимости клинической интерпретации результатов лабораторных исследований с учетом клинико-анамнестических данных конкретного пациента.

На основании результатов проведенных исследований были выделены критерии дисбаланса условно-патогенных микроорганизмов уретры: 1) повышение общей бактериальной массы более 105 2) повышение абсолютных значений УПМ более 103-104 при относительных значениях от 0 до 1 (Таблица 7).

Следовательно, предложено выделить: дисбаланс УПМ уретры мужчин умеренной степени выраженности, который характеризуется совокупностью абсолютных и относительных показателей, превышающих установленные значения нормы для результатов ПЦР РВ с количественным определением, и незначительно или умеренно выраженными клиническими симптомами; дисбаланс УПМ уретры мужчин выражешшй - характеризуется совокупностью абсолютных и относительных показателей, превышающих установленные значения нормы для результатов ПЦР РВ с количественным определением, и выраженными клиническими симптомами.

Новый инструмент лабораторной диагностики - ПЦР РВ с количественным определением более 30 известных условно-патогенных микроорганизмов уретры мужчин, позволяет, с одной стороны выявить заболевание на ранних стадиях, до развития осложнений, с другой - избежать необоснованной лекарственной терапии, полипрагмазии и ятро гении.

Таким образом, в группе обследованных мужчин (п=168;100%) дисбалансы УПМ были выявлены у 42,8% (п=72) пациентов, из них (72; 100%) выраженный дисбаланс диагностирован в 34,7% (п=25), дисбаланс умеренный в 65,3% (п=47).

Кроме этого, из группы практически здоровых мужчин удалось выделить 6,5% (п=11) пациентов без клинико-лабораторных признаков воспаления, однако в результатах ПЦР РВ с количественным определением у этих мужчин были выявлены различные УПМ в значениях, превышающих установленные границы нормоценоза. В 34,5% (п=58) констатировано состояние нормоценоза УПМ. Характеристика дисбалансов по этиологическому признаку и степени выраженности представлена на рисунке 7.

анаэробный дисбаланс(п=56)

смешанный дисбаланс(п=16)

128%

ЕЗ Дисбаланс выраженный (п=25; 100%) ЕЭ Дисбаланс умеренный (п=47;100%)

Рис.7 Характеристика дисбалансов по этиологическому признаку и степени выраженности

Как видно из рисунка 7, для дисбаланса умеренной или выраженной степени п=72 (100%) характерно преобладание анаэробных микроорганизмов, 78% (п=56) и 22% (п=16) соответственно (р<0,0001). Однако при абсолютном количественном превалировании анаэробных микроорганизмов (56; 100%) в образцах в 44,6% (п=25) случаях в этих же биопробах были выявлены аэробные микроорганизмы в значениях от 102 до 104 при разнице с общей бактериальной массой более 2 (диагностически не значимы). Полученные данные подтверждают известный факт обязательного присутствия аэробных микроорганизмов в биотопе для поддержания активного роста и развития анаэробов.

Оценка результатов исследования с помощью метода логистической

регрессии.

В процессе анализа результатов исследования (п=168;100%) методом логистической регрессии, были выявлены 13 признаков из 48 изучаемых, которые оказали максимальное влияние на распределение пациентов на группу без урогенитальных заболеваний (п=79; 47,1%) и группу, имеющих урогенитальное заболевание (п=89; 52,9%). Выявленные признаки перечислены в порядке убывания силы влияния на вероятность распределения мужчин по группам (наличие патогенных микроорганизмов, ОБМ, объективные клинические симптомы, Streptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Ralstonia & Burkholderia spp., Candida spp., Lept.spp./Sneath.spp./Fusobac. spp., Neiseria spp., результат микроскопии, жалобы в анамнезе, Enterobacterium spp., Ureaplasma parvum). Для всех выявленных признаков достигнутый уровень значимости коэффициентов регрессии составил от 0,0001 до 0,0420, однако наибольшее влияние оказали первые 2 признака ОБМ, и наличие патогенных микроорганизмов, в меньшей степени остальные. Установлено, что наиболее чувствительным критерием, характеризующим нормоценоз или дисбаланс, является ОБМ (пограничное значение в результатах ПЦР РВ с количественным определением 105 или (5,0), превышение данного значения является одним из признаков дисбаланса УПМ). Выявление перечисленных микроорганизмов в диагностически значимых титрах -более 103 и относительном показателе от 0 до 1, кроме Streptococcus spp.,

Lept.spp./Sneath.spp./Fusobac. spp., а также положительные результаты микроскопии, жалобы в анамнезе, свидетельствует о наличии дисбаланса. Процент конкордации данного уравнения составил 88,5 коэффициент D-Зомера (Somers' D)-0,761. В последующем, отдельно от всех групп обследования, было составлено уравнение логит регрессии для мужчин (п=58; 44,6%) без клинико-лабораторных признаков воспаления мочеполовой системы и мужчин с диагностированными дисбалансами уретры (п=72; 55,4%), всего (п=130;100%). Анализ данного уравнения позволил выявить микроорганизмы и признаки, оказавшие максимальное влияние на вероятность отнесения мужчин к практически здоровым или к группе пациентов с дисбалансами (процент конкордации уравнения 93,3 коэффициент D-Зомера (Somers1 D)-0,865).

Согласно полученным результатам, в данной выборке наибольшее этиологическое значение имели микроорганизмы Mycoplasma hominis- (Рг > ChiSq;0,0122), Gardnerella vaginalis - (Рг > ChiSq;0,0045), Enterococcus spp. - (Pr > ChiSq;0,0832), выявляемые в диагностически значимых абсолютных и относительных показателях, а также параметр OEM (Pr > ChiSq; <0,0001), превышающий 105 и переменная вероятность патологии (Pr > ChiSq; 0,0004). В меньшей степени влияние на вероятность наличия патологического процесса среди обследованных мужчин оказали следующие микроорганизмы и признаки (перечислены от менее сильных к более сильным): Lactobacillus spp., «Возраст пациента», «Жалобы в анамнезе», GarcLvagJPrev.biv./Porhyr.spp., Eubacterium spp., Corynebacterium spp./Mobiluncus spp., Fusobac. spp., Anaerococcus spp., BPP-группа, Pseudomonas aeroginosa, Ralstonia & Burkholderia spp., Haemophilus spp., «Жалобы на момент обращения», Enterobacterium spp., Actinomicetes spp., Ureaplasma parvum, «Жалобы со стороны предстательной железы» Atopobium claster, Atopobium spp. Однако это не исключает этиологической роли перечисленных микроорганизмов или влияния клинических признаков, в данной или другой выборке. Данный факт лишь свидетельствует о полиэтиологической структуре инфекционно-воспалительных процессов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, и указывает на особенности этиологической структуры и клинических симптомов, выявленных при обследовании конкретных пациентов, учитывая, что большинству УПМ присуще убиквитарность и двойственность в реализации своих патогенных свойств.

Оценка диагностической эффективности клинико-лабораторных методов обследования мужчин, использованных в данном исследовании.

Таблица 8

Название метода диагностическая эффективность

Клинический осмотр 67%

микроскопия 65%

ПЦР на облигатные патогены* 37%*

ПЦР РВ с количественным определением УПМ 83%

Комплекс методов 95%

* Низкая диагностическая эффективность была ожидаема вследствие ограниченного числа мужчин, у которых были выявлены облигатаые патогены.

Таким образом, метод ПЦР в реальном времени с количественным определением условно-патогенных микроорганизмов в данном исследовании продемонстрировал наибольшую диагностическую эффективность равную 83%. Однако наиболее информативным является комплекс клинико-лабораторных методов обследования (клинический осмотр, микроскопия, ПЦР на облигатные патогены, ПЦР PB с количественным определением УПМ), который позволяет объективно установить диагноз в 95% случаях.

Результаты определения показателей мРНК генов иммунной системы методом ПЦР PB с обратной транскрипцией в отделяемом уретры мужчин

При исследовании отделяемого уретры практически здоровых мужчин (п=16) и пациентов с верифицированным диагнозом урогенитального заболевания (п=24), установлено, что количественные характеристики уровня экспрессии определяемых генов вариабельны. Однако были выявлены значимые различия по некоторым показателям. Так, в группе мужчин с воспалением суммарный уровень экспрессии гена IL8, участвующего в реализации воспаления, был в 4,9 (р=0,0266) раза выше, чем у практически здоровых мужчин. Экспрессия гена TLR2, одного из рецепторов врожденного иммунитета (CD282) - в группе мужчин с воспалением в 3,7 (р=0,0287) раза превышала аналогичный показатель у практически здоровых мужчин. Экспрессия гена CD68, считающегося маркером моноцитов/макрофагов, у мужчин с воспалением в 3,1 раза (р=0,0358) превышал аналогичный показатель практически здоровых. Уровень экспрессии гена RORC2, участвующего в обратной регуляции воспаления, в группе мужчин с воспалением был в 1,2 (р=0,0219) раза снижен, по сравнению с практически здоровыми мужчинами. Полученные результаты позволяют использовать количественное определение мРНК генов IL8, TLR2, CD68, RORC2 для оценки местной воспалительной реакции. Исследование активации генов, участвующих в реализации местного иммунного ответа на инфекционные возбудители, является перспективным направлением для дальнейших исследований с целью установления патогенеза урогенитальных воспалительных заболеваний различной этиологии у мужчин.

Алгоритм диагностики и терапии урогенитальных заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, мужчин

Схема 1 Алгоритм обследования мужчин

Схема 2 Назначение этиологически направленной терапии в зависимости от этиологической структуры дисбаланса и степени выраженности клинических

симптомов

Сокращения Ж-жалобы. К-клиника. М-резулътат микроскопии. А-анзмпез. (+ или -Уналичие или отсутствие признака. 5-НИМЗ- 5-Нитроимидазолы- А/Б - антибактериальный препарат широкого спектра действия.

Оценка эффективности алгоритма обследования мужчин на урогенитальные заболевания с применением ПЦРРВ (п=181;100%)

Согласно полученным результатам исследования с помощью традиционных методов клинико-лабораторного обследования (микроскопия и ПЦР на облигатные патогены), установить этиологический диагноз удалось только у 15,5% (п=28) пациентов из 181 (100%). Применение алгоритма с использованием метода ПЦР РВ с количественным определением УПМ, позволило достоверно установить этиологический диагноз, или объективно констатировать, что пациент практически здоров в 92,8% случаев (Рисунок 8). Использование алгоритма позволило повысить эффективность клинико-лабораторной диагностики в 5,98 раз, в сравнении с традиционным комплексом клинико-лабораторного обследования, 92,8% и 15,5% соответственно.

Таким образом, на основании проведенного клинико-лабораторного исследования (п=181;100%) у 32,1% (п=58) мужчин достоверно не было выявлено воспалительного процесса мочеполовой системы, у 49,1% (п=89) -был диагностирован уретрит, требующий направленной этиологической терапии, из них (п=89;100%) в 31,5% (п=28) вследствие наличия облигатных патогенов и в 68,5% (п=61) по причине инфекционно-воспалительного процесса, обусловленного УПМ. Динамическое наблюдение было рекомендовано в 11,6% (п=21), т.е, имели место начальные формы дисбалансов УПМ или транзиторный вариант повышения абсолютных значений УПМ, в 13 (7,2%) случаях возникла необходимость повторного взятия биопробы.

ЩШ& ШЩ&, 7,2% В "Повторное взятие биоматериала (п=13;7,2%)

EgSffiKg 11,6%

ы 92,8% 4 Н "Динамическое наблюдение" (п=21;11,6%)

|:32,1%$ И "Необходимо дообследовать" (п=78;43,1%)

ЕЭ "Практически здоров" (п=58;32,1%)

ЩннНк

t 41,4%' IIIIIIр ИЗ "Возможно здоров?" (п=75;41,4%) ЕЭ "необходимо лечить, диагностировано УГЗ" (п=28; 15,5%) и (п=89;49,1%)

1 ; \ ' !,

Bl5,5%i } 15,5%

без ПЦР РВ с применением ПЦР РВ

Рис.8 Распределение мужчин до и после обследования методом ИЦР РВ (п=181;100%)

Выводы:

1. Урогенитальные заболевания, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста не имеют специфических клинических симптомов. Стертая форма заболевания регистрируется в 1,7 раза чаще, чем клиническая манифестация, 63,1% и 36.9% соответственно. При наличии клинико-лабораторных признаков уретрита условно-патогенные микроорганизмы выделяются в диагностически значимых титрах в 2,7 раз чаще, чем облигатные патогены, 39.8% и 15,5% соответственно.

2. Диагностическая эффективность комплекса клинико-лабораторных методов обследования с применением ПЦР РВ с количественным определением условно-патогенных микроорганизмов в 1,7 раз выше в сравнении с традиционными методами клинико-лабораторной диагностики, 95% и 56% соответственно.

3. Критериями нормоценоза уретры мужчин репродуктивного возраста являются: общая бактериальная масса (ОБМ) до 10s, абсолютные значения Staphylococcus spp., Streptococcus spp. от 103 до 10s при относительных показателях от 0 до 1, абсолютные значения других условно-патогенных микроорганизмов уретры составляют до 103-104 при относительных значения более 2, при условии показателя контроля качества взятия материала (КВМ) более 104. Дисбаланс уретры характеризуется повышением общей бактериальной массы более 105 и повышении абсолютных значений УПМ более 103-104 при относительных значениях от 0 до 1, при этом незначительные или умеренно выраженные клинические симптомы регистрировались в 1,9 раз чаще, чем манифестные формы инфекционно-воспалительного процесса, 65,3% и 34,7% соответственно.

4. Этиологически значимыми условно-патогенными микроорганизмами в развитии дисбалансов уретры мужчин репродуктивного возраста являются представители анаэробной группы, из них Gardnerella vaginalis, Enterococcus spp. при абсолютных значениях 103-105 и более и относительных от 0 до 1, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis в значениях более 104.

5. У пациентов с уретритом уровень экспрессии мРНК генов 1Ь8, ТЬЮ, СП68 в сравнении с пациентами без клинико-лабораторных признаков уретрита повышен в 4,9 и 3,7 и 3,1 раз соответственно, уровень экспрессии Я(ЖС2, напротив, снижен в 1,2 раза, что в определенной степени отражает степень выраженности инфекционно-воспалительного процесса в уретре.

6. Разработан алгоритм обследования мужчин на урогенитальные инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, заключающийся в комплексном использовании традиционных клинико-лабораторных методов обследования и ПЦР РВ с количественным определением, позволяющий повысить эффективность диагностики урогенитальных заболеваний в 5,98 раз, 15,5% и 92,8% соответственно.

Практические рекомендации

1. У мужчин репродуктивного возраста с целью своевременной диагностики урогенитальных заболеваний на ранних стадиях, до развития осложнений с нарушением репродуктивной функции целесообразно использование алгоритма клинико-лабораторного обследования, включающего наряду со стандартными методами диагностики новый высокоспецифичный и чувствительный метод ПЦР РВ с количественным определением условно-патогенных микроорганизмов.

2. Направленная этиологическая терапия уретритов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин должна проводиться при условии выделения последних в диагностически значимых количествах, с учетом не только абсолютных количественных показателей, но и относительных количественных значений конкретных микроорганизмов в исследуемом клиническом образце.

3. Объем терапевтического вмешательства определяется на основании комплексной оценки клинико-анамнестических данных и результатов лабораторных методов исследования согласно принципу «необходимости и достаточности».

4. Применение метода ПЦР РВ с количественным определением условно-патогенных микроорганизмов при обследовании мужчин на урогенитальные заболевания позволяет избежать с одной стороны гипердиагностических ошибок, полипрагмазии, и необоснованного назначения лекарственных препаратов, с другой стороны - способствует своевременному выявлению урогенитальных заболеваний, на ранних стадиях до развития осложнений с нарушением репродуктивной функции.

Список, опубликованных научных работ по теме диссертации

1. Липова Е.В. Диагностика негонококковых уретритов у мужчин на современном этапе. / Е.В. Липова, М.Н.Болдырева, A.C. Чекмарев и др. // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2012. - №1. - С.62-64.

2. Липова Е.В. Современные проблемы диагностики урогенитальных заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста. / Е.В. Липова, М.Н. Болдырева, A.C. Чекмарев и др.// Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2011. - №3. - С.52-56.

3. Липова Е.В. Особенности клинического течения урогенитальных инфекций мужчин на современном этапе/ Е.В. Липова, Э.А. Баткаев, A.C. Чекмарев и др. // Вестник последипломного медицинского образования. - 2009. - №2. - С.38-41.

4. Липова Е.В. Особенности клинического течения инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта мужчин на современном этапе./ Е.В. Липова, Э.А. Баткаев, A.C. Чекмарев // Ш Всероссийский конгресс дерматовенерологов. Тез. науч. работ. Казань. - 2009. - С.85-86.

5. Липова Е.В. Особенности клинического течения инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта мужчин на современном этапе./ Е.В. Липова, М.Н. Болдырева, A.C. Чекмарев и др.// Ш Всероссийский конгресс дерматовенерологов. Тез. науч. работ. Казань. - 2009. - С.100.

6. Чекмарев A.C. Современные особенности течения урогенитальных инфекций у мужчин. / Е.В. Липова, М.Н. Болдырева, A.C. Чекмарев // Сборник материалов конференции. 4-я научно-практическая конференция «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия». Москва -2011. -С.40-42.

7. Чекмарев A.C. Лабораторная диагностика урогенитальных заболеваний, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами у мужчин./ А.С.Чекмарев // Материалы конференции молодых ученых ГОУ ДПО РМАПО, Москва. - 2011. - С.49-50.

8. Чекмарев A.C. Особенности клинического течения урогенитальных заблеваний, у мужчин репродуктивного возраста./ А.С.Чекмарев // Материалы конференции молодых ученых РМАПО, Москва. - 2011. - С.51.

9. Липова Е.В. Использование метода ПЦР PB для диагностики урогенитальных заболеваний, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами./ Е.В. Липова, М.Н. Болдырева, A.C. Чекмарев // Тезисы докладов 1 Московский Форум «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики». Москва. - 2011. - С.61-

10. Липова Е.В. Лабораторная диагностика урогенитальных заболеваний, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами./ Е.В. Липова, М.Н. Болдырева, А.С. Чекмарев // Тезисы докладов 1 Московский Форум «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики». Москва - 2011. - С.62-63. Список использованных сокращений ИППП - инфекции, передаваемые половым путем УПМ- условно-патогенные микроорганизмы УГЗ - урогенитальные заболевания УГТ-урогенитальный тракт ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

КВМ - контроль взятия материала

HPV - human papillomavirus (вирус папилломы человека)

CMV - cytomegalovirus (цитомегаловирус)

HVS - herpes simplex virus (вирус простого герпеса)

ГПЧ - головка полового члена

КП - крайняя плоть

62.

Подписано в печать:

20.04.2012

Заказ № 7237 Тираж -110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru