Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль метаболических нарушений в патогенезе ангио- и нефропатии, вызванных хронической интоксикацией хлоридом кобальта в эксперименте

ТЕДТОЕВА АНЖЕЛИКА ИРАКЛИЕВНА

РОЛЬ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В ПАТОГЕНЕЗЕ АНГИО- И НЕФРОПАТИИ, ВЫЗВАННЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИЕЙ ХЛОРИДОМ КОБАЛЬТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14. 03. 03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степенн кандидата медицинских наук

2 4 023 2011

Владикавказ - 2011

4856084

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Учреждении Российской академии наук «Институт биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства Республики Северная Осетия-Алания»

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РСО-Алания,

доктор медицинских наук, профессор ДЗУГКОЕВА Фира Соломоновна

Официальные оппоненты: заслуженный работник Высшей школы РФ,

заслуженный деятель науки PCO - Алания, доктор медицинских наук, профессор ХЕТАГУРОВА Лариса Георгиевна

доктор медицинских наук, профессор ПАВЛЮЧЕНКО Иван Иванович

Ведущая организация: государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы»

Защита состоится « / 11 года в /^часов на заседании

диссертационного совета Д 20^.095.01 в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 362019, РСО-Алания, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО СОГМА Росздрава (362019, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

Автореферат разослан « 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор / И.Г. Джиоев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Рост загрязнения окружающей среды такими токсичными, легко накапливающимися в организме веществами, как тяжелые металлы, обусловливает насущную необходимость изучения механизма влияния, разработки и внедрения новых способов профилактики поступления и усиления их выведения из организма.

Органы выделительной системы являются наиболее уязвимыми как к эндогенным, так и к экзогенным токсикантам, поскольку все ксенобиотики экс-кретируются почками (Брин В.Б., Албегова Н.Р., Албегова Ж.К. и др., 2002). Нарастающие неблагоприятные экологические воздействия, как правило, антропогенного характера, заставляют по-новому взглянуть на те заболевания, с которыми приходится иметь дело в начале XXI века (Антонова И.В., Богачева Е.В., Китаева Ю.Ю., 2010). При нарастании концентрации ксенобиотиков, интенсивности и длительности воздействия или их сочетания адаптационные системы работают в условиях напряжения. В ряде случаев компенсаторные возможности организма истощаются, и развивается нарушение функциональных возможностей организма или отдельных систем. (Валеева Э.Т., Бакиров А.Б., Каримова J1.К. и др., 2009).

Кобальт жизненно важный микроэлемент, участвующий во многих процессах жизнедеятельности организма. Однако, при экзогенных воздействиях кобальт обладает высокой повреждающей способностью (E.Szakmary et all., 2001) и его относят к веществам 1 класса опасности (Э.К. Орджоникидзе., A.B. Рощин., 1991). Несмотря на то, что токсическое действие кобальта доказано многократно, молекулярные механизмы его токсичности до конца не изучены. Кобальт гено-токсичен (Бондаренко J1.B., 2007), имитирует в клетке состояние гемической гипоксии (Бурдин Н.В., Гребенникова В.В., Лебедев В.И. и др., 2008), активирует гликолиз, ангиогенез и эритропоэз, индуцирует окислительный стресс (Гичев Ю.П., 2003), апоптоз и даже некроз (Валиев B.C., Сафина А.И., Сироткин Е.А., 1996). Токсические эффекты кобальта проявляются полиморфным поражением кроветворной, сердечно-сосудистой, дыхательной, иммунной систем, а также

/

поражением почек, поскольку почки, вследствие морфологических и функциональных особенностей, являются одним из главных органов-мишеней для ксенобиотиков (A. Goyer. 1990; D. Czock, U. Hausler, Aymanns et all., 2005). Являясь главным экскреторным органом, почки становятся мишенью многих ксенобиотиков, в том числе цветных тяжелых металлов, в частности, кобальта (Албегова Ж.К., Брин В.Б., 2007; Албегова Ж.К., Брин В.Б., Гаглоева Э.М. и др., 2009). По многочисленным литературным данным (Павловская H.A., Кирьяков В.А., Савельев С.И., 2002; Дзугкоева Ф.С, Дзугкоев С.Г., Такоева Е.А. и др., 2009) длительное воздействие хлорида кобальта в эксперименте приводит к развитию хронической необратимой нефропатии, переходящей в почечную недостаточность.

В доступной литературе представлены данные о функциональных и па-томорфологических изменениях почек на фоне интоксикации хлоридом кобальта, но весьма недостаточны сведения литературы о механизмах развития ангио - и нефропатии и участия в них перекисного окисления липидов, антиокислительной системы клеток и активности №+,К+-АТФ-азы почечной ткани в условиях хронической кобальтовой интоксикации в эксперименте.

Цель работы: изучение роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активности ферментов антиоксидантной защиты клеток (АОЗ) в механизмах нарушения водо- и электролито-выделительной функции почек, гемодинамиче-ских изменений на фоне интоксикации хлоридом кобальта в эксперименте.

Для достижения цели исследования решали следующие задачи:

1. Воспроизвести модель нефропатии при парентеральном введении различных дозировок хлорида кобальта в течение двух недель и одного месяца.

2. Изучить изменения показателей водо- и электролито-выделительной функции почек на фоне спонтанного и водного диуреза, вызванные интоксикацией хлоридом кобальта в хроническом эксперименте.

3. Исследовать активность Ыа+,К+-АТФ-азы в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани на фоне хронической интоксикации хлоридом кобальта у крыс.

4. Исследовать характер изменения гемодинамики методом допплерографии на фоне экспозиции хлоридом кобальта.

5. Изучить состояние активности ПОЛ в мембранах эритроцитов и гомоге-натах коркового и мозгового вещества почечной ткани и активность ферментов антиокислительной системы (АОС) клетки.

6. Выяснить роль сопряжённых систем ПОЛ и АОС в механизмах нарушения активности мембранного фермента Ыа,К-АТФ-азы и гемодинамических изменений.

Научная новизна данной работы заключается в выяснении новых звеньев патогенеза кобальтовой нефроиатии и ангиопатии, установлении роли ПОЛ, как фактора, изменяющего физико-химические свойства липидного мат-рикса клеток, в частности, эритроцитов, клеток почечной ткани и сосудистой стенки. Впервые показано, что в генезе нарушения канальцевого транспорта натрия при хронической кобальтовой интоксикации, важную роль играет снижение активности №+,К+-АТФ-азы почечных канальцев вследствие изменения липидного микроокружения фермента. Выявлена впервые взаимосвязь между накоплением малонового диальдегида и активностью № ,К'-АТФ-азы в клетках почечной ткани. Установлен характер микроциркуляторных гемодинамических изменений, сопровождающихся нарушением перфузии (жидкостного обмена). Показано, что в развитии окислительного стресса играет роль угнетение активности супероксиддисмутазы, хотя активность каталазы в сыворотке крови компенсаторно повышается.

По теме диссертационной работы на основании полученных данных поданы две заявки на изобретение в Федеральный институт промышленной собственности: «Способ моделирования хронической токсической нефропатии» и «Способ диагностики кобальтовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении», по которым получены две приоритетные справки № 2010148217/(069658) от 25.11.2010; № 2010148218/(069659) от 25.11.2010, соответственно.

Научно-практическая значимость. Результаты настоящего исследования имеют научно-практическое значение, так как по активности перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов - аналогах тканевых клеток, можно косвенно судить о состоянии этого процесса в почечной ткани, что может быть использовано с целью ранней диагностики кобальтовой нефропатии у лиц, подвергающихся хроническому воздействию кобальта.

Личное участие автора в получении результатов исследования. Автором лично проведено моделирование токсической кобальтовой ангио- и нефропатии, изучение функциональной способности почек, характера изменения макро- микрогемодинамики, активности ПОЛ и АОС. Автором освоены и выполнены все методы исследования, включая корреляционный анализ и статистическую обработку. Обобщение экспериментальных данных и их анализ проведены автором лично.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На фоне хронической кобальтовой интоксикации угнетается спонтанный диурез вследствие снижения скорости клубочковой фильтрации и достоверно не меняющейся канальцевой реабсобции воды, хотя и обнаруживающей тенденцию к снижению.

2. Хроническая интоксикация хлоридом кобальта вызывает повышение экскреции N3 и К с мочой, при этом фильтрационный заряд катионов снижается, но одновременно выявляется снижение уровня канальцевой реабсорбции N8.

3. При формировании хронической кобальтовой нефропатии нарушается способность почек экскретировать водную нагрузку, что проявляется снижением процента ее выведения за 3 часа и падением суммарного трехчасового диуреза на фоне 5 % водной нагрузки. Снижение уровня канальцевой реабсорбции № обусловлено падением активности Ыа,К-ЛТФ-аг5ы почечной ткани - основного компонента N3 - насоса, функционирующего в толстом восходящем колене петли Генле.

4. На фоне хронической кобальтовой интоксикации развивается окислительный стресс, повышается концентрация малонового диальдегида (МДА) в

эритроцитах и гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани и угнетается активность ферментов АОС - супероксиддисмутазы (СОД), а активность каталазы компенсаторно повышается.

5. Активные метаболиты кислорода (АМК) и продукты окислительного стресса на фоне хронической интоксикации хлоридом кобальта повреждают эндотелий сосудов, что приводит к нарушению макро- и микрогемодинамики и формированию токсических ангиопатий.

Апробация диссертации. Материалы диссертации докладывались на общероссийской научной конференции «Инновационные медтехнологии» (Москва, 2009г.), 1 региональной конференции молодых ученых «Наука-обществу», посвященную 10-летию ВНЦ РАН и РСО-А (Владикавказ, 2010г.), VII международной конференции «Устойчивое развитие горных территорий в условиях глобальных изменений» (Владикавказ, 2010г.), конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 5 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах, включая библиографию и приложение. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трёх глав собственных данных, заключения, общих выводов, списка использованной литературы и приложения. Библиографический указатель включает 297 источников литературы, из них 220 отечественных и 79 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 83 рисунками и 13 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Исследования проводились на 342 крысах самцах линии \Vistar одной возрастной группы (10-14 мес.), массой 190250 грамм интактных и с интоксикацией хлоридом кобальта. Во время экспериментов крысы находились на стандартном пищевом рационе со свободным доступом к воде, с естественным световым режимом. В качестве объектов ис-

следования использовали плазму крови, эритроциты, гомогенаты коркового и мозгового вещества почечной ткани, мочу. Эксперименты проводили в одно и то же время суток, сезоны года в хронических опытах, всего провели 3184 исследования. Гемодинамику исследовали в магистральных сосудах - брюшной аорте (БА), нижней полой вене (НПВ), почечных артериях (ПА) и микроцирку-ляторном звене допплерографически с помощью ультразвукового портативного допплерографа ММ-Д-Ф фирмы «МИНИМАКС» С.-Пб. у наркотизированных животных, используя 6 основных точек локации. Для изучения водо-выделительной функции почек исследовали 6-ти часовой спонтанный диурез и определяли в моче содержание креатинина, натрия, калия и кобальта. По истечении времени эксперимента животных забивали под внутрибрюшинным тио-пенталовым наркозом в дозе 20 мг/100г массы тела. Кровь забирали из левого желудочка, в плазме крови определяли концентрацию креатинина, натрия, калия, кобальта, активность супероксиддисмутазы и каталазы. Расчетным путем, используя формулы Наточина Ю.В. (1974), вычисляли скорость клубочковой фильтрации, экскрецию воды и электролитов, их фильтрационные заряды и ка-нальцевую реабсорбцию. Интенсивность перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов и в почечной ткани исследовали по данным изменения концентрации малонового диальдегида колориметрическим методом с тиобар-битуровой кислотой по методу Asacawa Т., (1980). Состояние антиоксидантной системы оценивали по активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови методом аутоокисления адреналина и каталазы в сыворотке крови методом М.А. Королюка и соав., (1988). Активность №,К,АТФ-азы определяли по методу Scow JC, (1957). Удельную активность фермента рассчитывали на мг белка в час (мкмоль/Рн/мг белка/час). Белок в пробах определяли по методу Lowry ОН., (1951). Статистическую обработку результатов производили методом вариационной статистики, принимая во внимание коэффициент вариации динамических рядов, и оценивали корреляцию с использованием компьютерной программы статанализа Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Во всех исследуемых группах экспериментальных животных изучение водо-выделительной функции почек на фоне подкожного введения разных дозировок хлорида кобальта показало, что происходит достоверное уменьшение спонтанного диуреза. Анализ данных основных процессов мочеобразования показал, что скорость клубочковой фильтрации достоверно снижалась, тогда как канальцевая реабсорбция воды имела лишь тенденцию к уменьшению (табл.1). Следовательно, угнетение диуреза обусловлено достоверным снижением скорости клубочковой фильтрации.

Таблица №1

Показатели водо-выделительной функции почек в условиях спонтанного диуреза на фоне подкожного введения хлорида кобальта в разных дозах в

Группы животных Диурез Клубочковая фильтрация Канальцевая реабсорбция воды

мл/ч/100г мл/ч/100г %

Контрольная группа 0,091±0,003 14,74±0,38 99,37±0,037

СоС12 -2 мг/кг 2 нед 0,078±0,003 ") 11,54±0,31 99,32±0,01

СоС12 -2 мг/кг 1 месяц 0,071±0,006 пи^ 11,20±0,14 99,36±0,01

СоС12 -4 мг/кг 2 нед 0,076±0,005 11,02±0,35 99,34±0,03

СоС12 -4 мг/кг 1 месяц 0,069±0,004 1Ш I 10,84±0,21 99,35±0,04

СоС12-6 мг/кг 2 нед 0,065±0,005 10,62±0,67 пп^ 99,34±0,05

СоС12 -6 мг/кг 1 месяц 0,060±0,007 10,23±0,02 1111-^ 333^ 99,40±0,01

Примечание: "") - р<0,001; '") - р<0,01; ") - р<0,02; ') - р<0,05 достоверность относительно контроля; 2222) - р<0,001; 222) - р<0,01;22) - р<0,02;2) - р<0,05 достоверность относительно дозы 2 мг/кг веса; 3) - р<0.001; ) - р<0,01;33) - р<0,02;3) - р<0,05 достоверность относительно дозы 4 мг/кг веса; 4444) - р<0,001; 444) - р<0,01;44) - р<0,02; 4) - р<0 ,05 достоверность относительно 2 недель.

На фоне 5% водной нагрузки происходит достоверное снижение суммарного трехчасового диуреза у животных как при введении хлорида кобальта в течение двух недель, так и в течение одного месяца. При анализе суммарного 3-х

часового водного диуреза выявлено, что его почасовые изменения характеризуются повышением на 1 часе в результате увеличения скорости клубочковой фильтрации, а на 2 и 3 часах диурез стал ниже уровня контроля вследствие угнетения гломерулярной фильтрации. Процент выведения водной нагрузки соответственно уменьшается по сравнению с данными контрольной группы, что подтверждает нарушение функциональной способности почек.

Таблица №2

Показатели электролито-выделительной функции почек в условиях спонтанного диуреза на фоне подкожного введения хлорида кобальта в разных

Группы животных Экскреция N8 Фильтрационный заряд N8 Реабсорб-ция N3 Экскреция К Фильтрационный заряд К

мкмоль/ч/100г % мкмоль/ч/100г

Контрольная группа 9,38±0,26 1658,16±52,93 99,49±0,092 6,32±0,36 53,85±1,47

СоС12 - 2 мг/кг 2 нед 9,96±0,07 1490,61±33,65 Ш) 99,28±0,017 6,63±0,02 49,71±0,91

СоС12 - 2 мг/кг 1 месяц 10,21±0,18 1481,55±21,56 99,16±0,011 111)4444) 7,10±0,10 1) 4444, 48,88±1,48

СоС12 - 4 мг/кг 2 нед 10,08±0,05 1475,64±43,34 "V 99,01 ±0,05 1111) 2222) 7,16±0,11 1) 2222, 47,93±0,58

СоС12 - 4 мг/кг 1 месяц 10,41±0,09 11 1)444) 1451,76±13,30 98,90±0,062 1111)2222) 7,29±0,18 Ш) 45,43±0,87 1111) 2)44)

СоС12-6 мг/кг 2 нед 10,18±0,19 1424,10±78,21 97,99±0,076 1 111) 2222) 3333) 7,50±0,14 43,88±3,04 и,)

СоС12 - 6 мг/кг 1 месяц 10,48±0,08 1349,08±2,36 97,55±0,067 1111) 2222) 4444) 7,61 ±0,05 111-) 2222) 41,59±0,49 1111) 2222) 3333)

контроля; 2222) - р<0,001; 222) - р<0,01;22) - р<0,02;2) - р<0,05 достоверность относительно дозы 2 мг/кг веса; зш) - р<0,001; 333) - р<0,01; 33) - р<0,02; 3) - р<0,05 достоверность относительно дозы 4 мг/кг веса; 4444) - р<0,001; 444) - р<0,01;44) - р<0,02;4) - р<0 ,05 достоверность относительно 2 недель.

Исследование электролито-выделительной функции показало, что происходит повышенная экскреция натрия и калия с мочой в условиях спонтанного диуреза (табл. 2). Ответственным за повышенную экскрецию натрия является снижение канальцевой реабсорбции катиона, несмотря на то, что величина его фильтрационного заряда у исследуемых животных оказалась сниженной.

Исследование характера кровотока в крупных сосудах и в микроциркуля-торном русле показало, что при анализе перфузии тканей при кобальтовой интоксикации во всех точках локации снижается средняя скорость кровотока (М) за счет снижения систолической (8) и диастолической (Э) скоростей кровотока (табл. 3). Географические показатели характеризуются повышением индекса Гослинга (Р1), который отражает повышение упруго-эластических свойств (плотности) сосудистой стенки и снижение градиента давления (вЭ) в сосудах микроциркуляторного русла. Одновременно повышался реографический индекс (Ш - индекс Пурсело), свидетельствующий о нарастании удельного периферического сосудистого сопротивления.

Таблица №3

Динамика показателей перфузии на фоне подкожного введения хлорида кобальта в разных дозах в эксперименте

Точка локации 1М в И Р1 С. О К1

ем/с см/с ем/с см/с мм.рт.ст. у.ед.

контроль М 2,81 11,94 4,52 4,82 0,051 0,53

±т ±0,08 ±0,12 ±0,13 ±0,19 ±0,006 ±0,02

СоСЬ - 2 мг/кг 2 нед М 2,56 11,68 3,68 6,93 0,039 0,67

±т ±0,06 ±0,07 ±0,11 ±0,07 ±0,004 ±0,009

СоС12-2 мг/кг 1 месяц М 2,49 11,53 зМ 7,06 0,030 0,71

±т ±0,10 ±0,19 ±0,23 111^ ±0,08 ±0,002 ±0,01 пп^

СоС1г - 4 мг/кг 2 нед М 2,37 11,44 2,95 7,25 0,026 0,74

±ш ±0,06 1111^ ±0,07 т) ±0,22 ±0,08 ±0,002 111^ ±0,02 пп^

СоСЬ - 4 мг/кг 1 месяц М 2,26 11,38 2,56 7,70 0,021 0,77

±т ±0,06 пп^ ±0,07 111^ ±0,11 ±0,05 пп^ ±0,001 пп^ ±0,009

СоСЬ- 6 мг/кг 2 нед М 2,13 11,25 2,34 8,09 0,017 0,79

±т ±0,05 ±0,07 ±0,06 ±0,06 ±0,0004 1111ч ±0,007 пп^

СоС12 - 6 мг/кг 1 месяц М 2,01 10,88 2,15 8,46 0,013 0,80

±т ±0,05 ±0,06 ±0,07 ±0,05 ±0,0002 ж 111 ±0,006

Примечание: "") -р<0,001; '") -р<0,01;)-р<0,02; )-р<0,05 достоверность относитель-

110 контроля.

В магистральных сосудах (БА и почечные артерии) выявлено повышение средней (М) и систолической (S) скоростей кровотока, направленное на улучшение доставки кислорода и метаболитов в клетки тканей.

На фоне 5% водной нагрузки почасовые изменения приводят к достоверному увеличению суммарной экскреции с мочой как натрия, так и калия. При этом отмечается снижение концентрации натрия в крови, а содержание калия достоверно повышается. Как известно, реабсорбция натрия в почечных канальцах является активным процессом и в нем принимает участие Na+,K+-ATO-a3a, являющаяся основным компонентом натриевого насоса. Фермент расщепляет макроэргические фосфатные связи АТФ, обеспечивает энергией активный транспорт Na+ и К+. Однако, в доступной нам литературе отсутствуют данные о состоянии Ыа+,К+-АТФ-азы в клетках почечной ткани, а особенно в различных ее слоях при хроническом воздействии кобальта на организм.

Данные, полученные в нашей лаборатории, свидетельствуют о том, что в норме активность Ыа+,К'-АТФ-азы зависит от состояния липидного микроокружения (Дзугкоева Ф.С. и соавт., 1996; 2003; 2004; 2008; 2009), ионных регуляторов, нуклеотидов, являющихся субстратами фермента, гормональных ингибиторов и активаторов (Наточин Ю.В., 1982; Слесаренко Е.Г., Корсуновская Г.А., Гарец B.J1. и др., 1991; Сумакова И.А., 1996). Уменьшение активности данного фермента может быть обусловлено изменением конформации энзима в результате нарушения состояния фосфолипидов мембран клеток канальцев почек, так как каталитическая активность его находится в зависимости от качественного и количественного состава мембранных фосфолипидов (рис. 1). Как известно, важную роль в структурно-функциональной модификации биологических мембран, изменении их физико-химических свойств и проницаемости играет перекисное окисление липидов - универсальный процесс, протекающий в мембранах в физиологических условиях. При ряде патологических состояний, включая кобальтовую интоксикацию, происходит активация перекисного окисления липидов, которая может привести к целому ряду отклонений, в частности, к структурной перестройке мембран и нарушению клеточного метаболизма, изменению активности мембраносвязанных ферментов (Павловская H.A.,

Кирьяков В.А., Савельев С.И., 2002; Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин В.Ю. и др., 2004).

ё ю

L_

S I 0_

А С О

s

*

г

те

I

1

2,0 мг/кг 4,0 мг/кг 6,0 мг/кг 2,0 мг/кг 4,0 мг/кг 6,0 мг/кг корковое в-во мозговое в-во

□ норма Н2 недели Ü1 месяц

Рис.1. Показатели активности Na+,K+-ATO-a3bi в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани

При количественной оценке процессов липопероксидации в клетках крови, гомогенатах тканей печени в динамике экспериментальной нефропатии зарегистрированы существенные изменения активности системы свободноради-кального окисления (Конторщикова К.Н., 2000; Дубинина Е.Е., 2001; Павловская H.A., 2001; Скулачев В.П., 2001; Шевцов A.A., Заблова Т.А., Бондаренко O.A. и др.., 2005). Вместе с тем в доступной нам литературе мы не обнаружили данных об изменении процессов перекисного окисления липидов в почечной ткани и их влиянии на активность Na-Hacoca, ответственного за реабсорбцию натрия в почечных канальцах.

Интенсивность перекисного окисления липидов при кобальтовой нефропатии оценивали по концентрации конечного продукта ПОЛ - малонового ди-апьдегида - в мембранах эритроцитов и клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани. У экспериментальных крыс на фоне экспозиции хлоридом кобальта повышается концентрация МДА в эритроцитах, причем более выраженное повышение МДА отмечено при подкожном введении хлорида кобальта в дозе 6 мг/кг в течение одного месяца. Аналогичные изменения выявлены и в клетках почечной ткани: происходит достоверное повышение концентрации МДА как в корковом, так и в мозговом веществе почечной ткани во всех вари-

антах исследований (табл. 4). Более выраженное повышение активности ПОЛ отмечается при кобальтовой интоксикации так же в течение одного месяца. Усиление процессов липопероксидации при кобальтовой интоксикации вызывает дезинтеграцию липопротеиновых комплексов, усиливает их гидрофиль-ность и приводит к нарушению проницаемости мембраны и изменению кон-формации мембраносвязанного фермента Ш+,К+-АТФ-азы. Полученные нами данные свидетельствуют о взаимосвязи между повышением концентрации МДА и снижением активности №+,К+-АТФ-азы в клетках почечной ткани. Отмечается сильная отрицательная корреляционная связь между интенсивностью перекисного окисления липидов и активностью №+,К+-АТФ-азы в корковом (г = -0,678 в 1 группе животных; г = -0,721 во 2 группе животных; г = -0,658 в 3 группе животных; г = -0,771 в 4 группе животных; г = -0,684 в 5 группе животных; г = -0,767 в 6 группе животных) и мозговом (г = -0,652 в 1 группе животных; г = -0,714 во 2 группе животных; г = -0,681 в 3 группе животных; г = -0,709 в 4 группе животных; г = -0,717 в 5 группе животных; г = -0,731 в 6 группе животных) веществе почечной ткани. Кроме того, установлены однонаправленные изменения процессов липопероксидации в эритроцитах и клетках почечной ткани.

Во взаимосвязи с процессами свободнорадикального окисления находится антиоксидантная система организма, основная функция которой заключается в ограничении процессов перекисного окисления липидов практически во всех его звеньях.

Чтобы оценить реакцию системы антиоксидантной защиты организма в ответ на развитие оксидативного стресса при хронической кобальтовой интоксикации, мы определяли активность супероксиддисмутазы, превращающей су-пероксиданионрадикал в перекись водорода и одновременно каталазы, расщепляющей Н2Ог до молекулярного 02 и Н20. Данные показали достоверное снижение активности супероксиддисмутазы, хотя отмечалось повышение активности каталазы в сыворотке крови (табл. 4). Эти данные свидетельствуют о том, что причиной активации процессов ПОЛ, наряду с образованием активных форм кислорода, является угнетение антиокислительной системы клеток, что

проявляется угнетением активности супероксиддисмутазы, хотя происходило компенсаторное повышение активности каталазы.

Таблица №4

Изменение активности перекисного окисления липидов в эритроцитах и почечной ткани и активности ферментов супероксиддисмутазы и каталазы в сыворотке крови на фоне подкожного введения хлорида кобальта в

Группы животных Концентрация МДА Активность каталазы в сыворотке крови Активность СОД в сыворотке крови

в эритроцитах в почечной ткани

корк. в-ва мозг. в-ва

имоль/мл нмоль/мг белка м кат/л ед.активпос ти

Контрольная группа 4,54±0,16 1,26±0,06 2,73±0,1 225,56±29,09 2,38±0,25

СоСЬ-2 мг/кг 2 нед 4,91±0,02 2,13±0,04 4,41±0,09 304,89± 1,52 1,62±0,16

СоС1г - 2 мг/кг 1 месяц 5,26±0,1 1111^ 444^ 2,49±0,12 111^ 444^ 4,5 6±0,06 1ш 1 318,04± 12,51 1,54±0,18

СоС12-4 мг/кг 2 нед 5,54±0,12 1111) 2222^ 2,57±0,04 1111^ 2222^ 4,68±0,06 1111^22^ 328,90± 11,50 "У) 1,47±0,13

СоС12-4 мг/кг 1 месяц 5,74±0,02 1111^ 2222^ 2,69±0,02 4,79±0,04 1111^ 222^ 340,16±11,57 111 1,38±0,И

СоС12-6 мг/кг 2 нед 5,83±0,06 1111^ 2222^3^ 2,73±0,03 1111^ 2222^ 333^ 4,85±0,02 1111^ 2222^ 333^ 357,89±21,40 1111^22^ 1,23±0,11

СоС12-6 мг/кг 1 месяц 5,97±0,14 1111^ 2222^ 2,87±0,06 1111^222^ 333^ 5,25±0,08 1111^2222^ 3333^ 4444^ 370,13±13,09 1111^ 333) 0,82±0,12 1 111^ 222^ 333^ 44^

контроля; 2222) - р<0,001; 222) - р<0,01;22) - р<0,02;2) - р<0,05 достоверность относительно дозы 2 мг/кг веса; )- р<0,001; ) - р<0,01; 33) - р<0,02; 3) - р<0,05 достоверность относительно дозы 4 мг/кг веса; 4444) - р<0,001; 444) - р<0,01;44) - р<0,02;4) - р<0,05 достоверность относительно 2 недель.

Таким образом, патогенетической основой повреждения нефрона и других клеток тканей при экспериментальной кобальтовой интоксикации, является пе-рекисное окисление липидов, вследствие образования активных форм кислорода и метаболитов ПОЛ. Развитию этого процесса также способствует дисбаланс между активностью системы свободно-радикального окисления и ферментов антиокислительной защиты.

Для выяснения токсичности кобальта, содержащегося в крови и тканях, исследовали содержание кобальта в плазме крови, моче и почечной ткани (табл. 5). Данные показали, что во всех биологических средах концентрация кобальта повышалась статистически достоверно (р<0,001). Более того, корреляционный анализ показал положительную корреляционную связь между дозой вводимого хлорида кобальта и его содержанием в крови (г = +0,66 в 1 группе животных; г = +0,61 во 2 группе животных), в моче (г = +0,57 в 1 группе животных, г = +0,72 - во 2 группе животных) и в почечной ткани (г = +0,63 в 1 группе животных, г = +0,78 — во 2 группе животных). Возрастание содержания металла в биологических средах в течение одного месяца было пропорционально вводимой дозе.

Таблица №5

Содержание кобальта в плазме крови, моче и почечной ткани на фоне под-

Дозы и длительность введения Плазма, Моча, Почка,

мкг/мл мкг/мл мкг/г

контроль 1,71 ±0,22 0,064+0,005 0,03+0,005

СоС12- 2 мг/кг 2 недели 3,87±0,8 2,93+0,17 0,28+0,09 '")

СоС12 - 2 мг/кг 1 месяц 4,98±0,9 3,61+0,12 |Шу144> 0,30+0,03

СоС12 - 4 мг/кг 2 недели 4,27+0,11 ич^ 3,46+0,11 1111^222^ 0,36+0,04

СоС12 - 4 мг/кг 1 месяц 5,16+0,9 3,91+0,09 111'у144)2) 0,41+0,09

СоС12- 6 мг/кг 2 недели 4,89+0,16 ННуОТ^ 4,09+0,13 1111^2222^333^ 0,45+0,11 ш.

СоС12- 6 мг/кг 1 месяц 5,37+0,7 4,31+0,16 МП ^222^ 0,55+0,08 1111^222^

контроля; 2222) - р<0,001; 222) - р<0,01;22) - р<0,02;2) - р<0,05 достоверность относительно дозы 2 мг/кг веса; )- р<0,001; "3) - р<0,01;33) - р<0,02;3) - р<0,05 достоверность относительно дозы 4 мг/кг веса; 4444) - р<0,001; 444) - р<0,01;44) - р<0,02;4) - р<0,05 достоверность относительно 2 недель.

Для наглядного представления механизмов развития ангио- и нефропатии на фоне хронической кобальтовой интоксикации представлена следующая патогенетическая схема:

Схема 1. Молекулярио-клеточные биохимические механизмы в патогенезе экспериментальной кобальтовой нефропатии

18

ВЫВОДЫ

1. При хронической кобальтовой интоксикации, вызванной подкожным введением хлорида кобальта в дозах 2, 4 и б мг/кг массы животного в течение двух недель и одного месяца в эксперименте отмечается уменьшение спонтанного диуреза, сопровождающееся снижением скорости клубочковой фильтрации. В условиях 5% водной нагрузки функционирующая способность почек также нарушается.

2. Экскреция натрия в условиях спонтанного и водного диуреза при хронической кобальтовой интоксикации повышена. Это обусловлено падением уровня относительной канальцевой реабсорбции катиона, несмотря на снижение его фильтрационного заряда. Экскреция калия повышается на фоне снижения его фильтрационного заряда.

3. При нефропатии, вызванной введением хлорида кобальта, отмечается снижение активности №+,К+-АТФ-азы коркового и мозгового вещества почечной ткани, что и является одной из причин снижения уровня канальцевой реабсорбции натрия и, соответственно, его повышенной экскреции.

4. Экспозиция хлоридом кобальта в дозах 2, 4 и 6 мг/кг веса животного сопровождается активацией перекисного окисления липидов в эритроцитах и в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани - концентрация малонового диальдегида повышается, при этом снижается активность супероксиддисмутазы, а катапазы компенсаторно повышается.

5. Усиление перекисного окисления липидов сопровождается изменениями функциональных свойств липидного матрикса клеточной мембраны, приводящее к нарушению конформации фермента Ыа+,К+-АТФ-азы и снижению её активности.

6. Подкожное введение различных дозировок хлорида кобальта вызывает дозо-зависимое повышение содержания кобальта в плазме крови, моче и почечной ткани, сопровождающееся усилением упруго-эластических свойств сосудистой стенки и удельного периферического сосудистого сопротивления в микроциркуляторном русле и одновременным повышением средней и сис-

толической скоростей кровотока в артериальных сосудах (брюшная аорта, почечные артерии).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дзугкоева Ф.С, Дзугкоев С.Г., Такоева Е.А., Тедтоева А.И., Битарова Ж.Р., Можаева И.В. Влияние солей тяжелых и цветных металлов на водо-и электролито-выделительную функцию почек // Фундаментальные исследования. -2009. -№9. -С.40-42

2. Дзугкоева Ф.С., Дзугкоев С.Г., Такоева Е.А., Можаева И.В., Тедтоева А.И., Битарова Ж.Р. Изменение функционирования висцеральных систем при экспериментальном сахарном диабете и на фоне экспозиции солями цветных и тяжёлых металлов // Тезисы VII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 160-летию со дня рождения И.П.Павлова «Механизмы функционирования висцеральных систем». -Санкт-Петербург. -2009. -С.146-147

3. Тедтоева А.И., Дзугкоева Ф.С., Можаева И.В., Дзугкоев С.Г. Перекисное окисление липидов, активность Na+,K+-ATP-a3bi и ферментов антиокси-дантной защиты при нефропатии у крыс, индуцированной хлоридом кобальта// Биомедицинская химия. -2010. -Т. 56. -С.540-544.

4. Дзугкоева Ф.С., Можаева И.В., Такоева Е.А., Дзугкоев С.Г., Тедтоева А.И., Битарова Ж.Р. Патогенетические механизмы формирования токсических ангио-нефропатий в экспериментах // Владикавказский медико-биологический вестник. -2009-2010. -T.IX. -С.87-92.

5. Тедтоева А.И., Дзугкоева Ф.С. Механизмы формирования токсической нефропатии под влиянием хлорида кобальта. // Тезисы I региональной конференции молодых ученых «Наука-обществу», посвященной 10-летию ВНЦ РАН и РСО-А. -Владикавказ. -2010. -С.5-6.

6. Тедтоева А.И., Можаева И.В., Дзугкоева Ф.С. Изменения водо- и элек-тролито-выделительной функции почек, показателей перекисного окисления липидов и антиокислительной системы клеток на фоне хрониче-

ской интоксикации хлоридом кобальта у крыс в эксперименте // Тезисы VII международной конференции «Устойчивое развитие горных территорий в условиях глобальных изменений». -Владикавказ. -2010. -С.43-44.

7. Тедтоева А.И., Можаева И.В., Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С., Такоева Е.А., Битарова Ж.Р. Роль перекисного окисления липидов в формировании гемодинамических нарушений на фоне хронической кобальтовой интоксикации в эксперименте у крыс // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. -2010. -Т.12. - №1(7). -С.1784-1787.

8. Дзугкоева Ф.С., Хетагурова Л.Г., Дзугкоев С.Г., Чопикашвили Л.В., Такоева Е.А., Битарова Ж.Р., Тедтоева А.И., Касохов А.Б. Механизмы влияния экотоксикантов на здоровье населения г. Владикавказа // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. -2010. -Т. 12. -№1(8). -С.1964-1969.

9. Битарова Ж.Р., Дзугкоева Ф.С., Такоева Е.А., Дзугкоев С.Г., Тедтоева А.И. Изменения макро- и микрогемодинамики в нефроне и периферической сосудистой системе в условиях оксидативного стресса при кадмиевой интоксикации // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. -2010. -Т.12. -№1(7). -С.1718-1721.

10. Дзугкоева Ф.С., Дзугкоев С.Г., Такоева Е.А., Можаева И.В., Битарова Ж.Р.,Тедтоева А.И. Влияние коэнзима Q,o и афобазола на биохимические показатели эндотелиальной дисфункции при ЭСД // Тезисы конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». -Санкт-Петербург. -2010. -Т.З. -С.102-103.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

• АОС - антиоксидантная система;

• АМК - активные метаболиты кислорода;

• БА - брюшная аорта;

• КФ - клубочковая фильтрация;

• МДА - малоновый диальдегид;

• МЦ - микроциркуляция;

• НПВ - нижняя полая вена;

• ПА - почечная аорта;

• ПОЛ - перекисное окисление липидов;

• СОД - супероксиддисмутаза;

• СРО - свободнорадикальное окисление;

• Ыа+,К+-АТФ-аза - натрий, калиевая аденозинтрифосфатаза;

• М - средняя скорость кровотока

• S - систолическая скорость кровотока

• D - диастолическая скорость кровотока

• PI - пульсаторный индекс (индекс Гослинга)

• GD-градиент давления

• RI - реографический индекс

• R-H20 - реабсорбция воды

• R-Na - реабсорбция натрия

• ENa - экскреция натрия

• Фзма - фильтрационный заряд натрия

• Ек - экскреция калия

• Фзк - фильтрационный заряд калия

• Со - кобальт

• СоС12 - хлорид кобальта

Информационно-технический отдел ГОУ ВПО СОГМА Росздрава Подписано в печать 25.01.2011 Тираж 100 экз. Формат издания 60X90 усл.печ.л.1,0 Заказ № 2

Актуальность проблемы. Здоровье человека во многом определяется состоянием окружающей среды. Ее вклад в формирование и сохранение здоровья населения составляет около 10-20% (Лапухипа Г.Г., Бондарь О.В., 2009). Экопатогенные факторы, особенно в сочетании с другими причинными агентами, увеличивают риск развития хронических болезней (Ладнова Г.Г., Гладских М.Н., Тюрикова Ю.Б., 2008). Эффект ксенобиотиков определяется, в первую очередь, классом токсичности вещества, длительностью его действия, возрастом и индивидуальной чувствительностью организма (Криушкина Д.С., 2006; Мотузова Г.В., Безуглова О.С., 2007).

Любое экологическое воздействие (извне) вызывает цепь последовательных адаптивных реакций, направленных на сохранение гомеостатических механизмов. Концентрации веществ, даже жизненно необходимых для функционирования организма, имеют свои предельно допустимые нормы, выход за рамки которых, будь то избыток или недостаток, приводит к комплексу локальных и системных реакций, направленных на устранение результатов этого выхода.

Тяжелые металлы - это элементы периодической системы Д. И. Менделеева с относительной молекулярной массой больше сорока. Решением Европейской экономической комиссии ООН в группу наиболее опасных (и, следовательно, приоритетных для целей наблюдения, контроля и регулирования) тяжелых металлов включены ртуть, свинец, кадмий, хром, марганец, никель, кобальт, ванадий, медь, железо, цинк, сурьма, а также типичные металлоиды: мышьяк и селен.

Одним из существенных для функционирования живых организмов микроэлементов является представитель VIII группы периодической системы элементов Д.И. Менделеева кобальт. Кобальт относится к группе микроэлементов, т.е. является жизненно необходимым для функционирования живых организмов. Вместе с тем, в избытке, как и многие другие элементы или более сложные вещества, он для организма токсичен и даже может быть губителен.

Данные по содержанию кобальта в крови и различных органах животных и человека приводятся в очень многих работах. Приведем лишь некоторые из них. В крови человека содержание кобальта составляет в среднем 0,238 мг/кг, при этом в эритроцитах оно варьирует от 0,059 до 0,13, а в сыворотке - от 0,0055 до 0,40 мг/кг. В органах животных наибольшая концентрация кобальта приходится на печень (0,076 - 0,201 мг/кг), затем идут почки, поджелудочная железа, селезенка. Выводится кобальт из организма животных и человека в основном почками. Среднее поступление кобальта в организм человека с пищей около 0.03 - 0.3 мг в день, причём достаточно для нормального метаболизма низшей дозы -0.03 мг (Хантурина Г.Р., Хантурин М.Р., 2006). Несмотря на доказательность токсического действия кобальта, молекулярные механизмы его токсичности до конца не изучены. При избыточном поступлении кобальт генотоксичен (Бондаренко Л.В., 2007), имитирует в клетке состояние гемической гипоксии (Бурдин Н.В., Гребенникова В.В., Лебедев В.И., Монгуш А.А., Бурдин В.Н., 2008), активирует гликолиз, ангиогенез и эритропоэз, индуцирует окислительный стресс (Гичев Ю.П., 2003), апоптоз и даже некроз (Валиев B.C., Сафина А.И., Сироткин Е.А., 1996). Кобальт связывается с сульфгидрильными группами специфических белков, выполняющих транспортную функцию (Iwata К. et al., 2003, Брин В.Б., Бузоева М.Р., Гаглоева Э.М., 2007), обусловливающие нефротоксичность металла при его избыточном поступлении в организм. Образующийся комплекс металл-протеин, попадая нефрон, повреждает его фильтрационно-реабсорбционный аппарат (Игнатова М.С., Харина Е.А., Солбирова Т.Н. и др., 2004). В экспериментальных исследованиях установлено, что кобальт может депонироваться в матриксе лизосом в результате комплексообразования с анионными группами и конкурировать с ионами Ca2f и Mg~ за связывание с активными центрами протонной помпы (Кузубова Л.И., Шуваева О.В., Аношин Г.Н., 2000). Со индуцирует ПОЛ, подавляет синтез ДНК в лимфоцитах (Malard V., Berenguer F., Pratt О. et al., 2007). В эксперименте на животных показано, что введение высоких доз кобальта в организм приводит к окислительному стрессу (Калиман П.А., Охрименко С.М., 2005), который сопровождается повреждением различных биологических макромолекул, мембранных структур, изменением содержания восстановленного глугатиона и макроэргических соединений в клетке (Охрименко С.М. и др., 2005). Избыточное поступление кобальта приводит к аллергическим реакциям, заболеваниям верхних дыхательных путей (Георгиади Г. А., 2007) и к развитию кардиомиопатии (Суворов И.М., 1978). Установлено, что Со в повышенной концентрации оказывает ферментотоксическое и цитотоксическое действие (Кузубова Л.И., Шуваева О.В., Аношип Г.Н., 2000), связанное с влиянием на митохондрии клеток (Игнатова М.С. и др., 2004).

Одним из основных механизмов повреждающего действия избыточных концентраций солей кобальта является генерация активных форм кислорода, инициирование процессов ПОЛ и других типов биомолекул. При этом равновесие в системе прооксидангы-антиоксиданты сдвигается в сторону накопления молекул с прооксидантными свойствами и приводит к развитию оксидативного стресса (Саприн А.Н., Калинина Е.В., 1999). Адаптация организма к этому состоянию проявляется компенсаторным усилением синтеза антиоксидантных ферментов, обновлением мембранных фосфолипидов, мобилизацией энергетических резервов и т.д.

В доступной литературе представлены данные о функциональных и патоморфологических изменениях почек на фоне интоксикации хлоридом кобальта, но весьма недостаточны сведения литературы о механизмах развития ангио — и нефропатии и участия в них ПОЛ, АОС клеток и активности АТФ-азы почечной ткани в условиях хронической кобальтовой интоксикации в эксперименте.

Цель работы. Изучение роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активности ферментов антиоксидантной защиты клеток (АОЗ) в механизмах нарушения водо- и электролито-выделительной функции почек, гемодинамических изменений на фоне интоксикации хлоридом кобальта в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Воспроизвести модель нефропатии при парентеральном введении различных дозировок хлорида кобальта в течение двух недель и одного месяца.

2. Изучить изменения показателей водо- и электролито-выделительной функции почек на фоне спонтанного и водного диурезов, вызванные интоксикацией хлоридом кобальта в хроническом эксперименте.

3. Исследовать активность Ыа+,К+-АТФ-азы в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани на фоне хронической интоксикации хлоридом кобальта у крыс.

4. Исследовать характер изменения гемодинамики методом допплерографии на фоне экспозиции хлоридом кобальта.

5. Изучить состояние активности ПОЛ в мембранах эритроцитов • и гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани и активность ферментов антиокислительной системы (АОС) клетки.

6. Выяснить роль сопряжённых систем ПОЛ и АОС в механизмах нарушения активности мембранного фермента Ка,К-АТФ-азы и гемодинамических изменений.

Научная новизна исследований заключается в выяснении новых звеньев патогенеза кобальтовой нефропатии и ангиопатии, установлении роли ПОЛ, как фактора, изменяющего физико-химические свойства липидного матрикса клеток, в частности, эритроцитов, клеток почечной ткани и сосудистой стенки. Впервые показано, что в генезе нарушения канальцевого транспорта натрия при хронической кобальтовой интоксикации, важную роль играет снижение активности Ыа^,К+-АТФ-азы почечных канальцев вследствие изменения липидного микроокружения фермента. Выявлена впервые взаимосвязь между накоплением малонового диальдегида и активностью Ыа^К'-АТФ-азы в клетках почечной ткани. Установлен характер микроциркуляторных гемодинамических изменений, сопровождающихся нарушением перфузии (жидкостного обмена).

Показано, что в развитии окислительного стресса играет роль угнетение активности супероксиддисмутазы (СОД), при этом активность каталазы в сыворотке крови компенсаторно повышается. По теме диссертационной работы на основании полученных данных поданы две заявки на изобретение в Федеральный институт промышленной собственности: «Способ моделирования хронической токсической нефропатии» и «Способ диагностики кобальтовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении», по которым получены две приоритетные справки № 2010148217/(069658) о г 25.11.2010; № 2010148218/(069659) от 25.11.2010, соответственно.

Научно-практическая значимость.

Результаты настоящего исследования имеют научно-практическое значение, так как по активности ПОЛ в мембранах эритроцитов — аналогах тканевых клеток, можно косвенно судить о состоянии этого процесса в почечной ткани, что может быть использовано с целью ранней диагностики кобальтовой нефропатии у лиц, подвергающихся хроническому воздействию кобальта.

Личное участие автора в получении результатов исследования.

Автором лично проведено моделирование токсической кобальтовой ангио-и нефропатии, изучение функциональной способности почек, характера изменения макро- микрогемодинамики, активности ПОЛ и АОС. Автором освоены и выполнены все методы исследования, включая корреляционный анализ и статистическую обработку. Обобщение экспериментальных данных и их анализ проведены автором лично.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На фоне хронической кобальтовой интоксикации угнетается спонтанный диурез вследствие снижения скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и достоверно не изменяющейся канальцевой реабсобции воды, хотя и обнаруживающей тенденцию к снижению.

2. Хроническая интоксикация хлоридом кобальта вызывает повышение экскреции Ыа и К с мочой, при этом фильтрационный заряд катионов снижается, но одновременно выявляется снижение уровня канальцевой реабсорбции N3.

3. При формировании хронической кобальтовой нефропатии наруххлается способность почек экскретировать водную нагрузку, что проявляется процента ее выведения за 3 часа и падением суммарного трехчасового ди>^р<еза на фоне 5 % водной нагрузки. Снижение уровня канальцевой реабсор^И-Х^^г и Na обусловлено падением активности Ыа,К-АТФ-азы почечной ткани — оснсо1вного компонента Ыа - насоса, функционирующего в толстом восходящем ^сг«<олене петли Генле.

4. На фоне хронической кобальтовой интоксикации развивается окислительный стресс, повышается концентрация малонового ди гит Ьэ-.^заг«^ гида (МДА) в эритроцитах и гомогенатах коркового и мозгового вещества, по^ч^чнои ткани и угнетается активность ферментов АОС - супероксиддисмут^^-^^зы, а активность катал азы компенсаторно повышается.

5. Активные метаболиты кислорода (АМК) и продукты окислите-л^>ного стресса на фоне хронической интоксикации хлоридом кобальта повре^жглают эндотелий сосудов, что приводит к нарушению макро- и микрогемодина-тч-^в:л&-я ки и формированию токсических ангиопатий.

Внедрение результатов исследования в практику и учебный процесс.

Исследование носит экспериментальный характер и получг'&^ииые результаты демонстрируют патогенетические механизмы нарудгтттения функциональной способности почек и гемодинамики при интоксипкг^дии хлоридом кобальта, относятся к области фундаментальных знаний, что позволяет их внедрить в учебный процесс на кафедрах патофизиологии, 6иох:>е:мии> нормальной физиологии. Разработанный метод диагностики токси~чге^ских нефропатий представляет интерес для клинической медицины (профпатол'оггии). Получены приоритеты на две заявки в Федеральный институт промышлс«&^нои собственности: «Способ моделирования хронической токсической нефрог^г ^Э-гтии» и «Способ диагностики кобальтовой нефропатии у эксперимента,^ &»нь1х животных при хроническом отравлении» № 2010148217/(069658) от 25-1 1 —О; № 2010148218/(069659) от 25.11.2010 соответственно.

Общие выводы.

1. При хронической кобальтовой интоксикации, вызванной подкожным введением хлорида кобальта в дозах 2, 4 и 6 мг/кг массы животного в течение двух недель и одного месяца в эксперименте отмечается уменьшение спонтанного диуреза, сопровождающееся снижением скорости клубочковой фильтрации. В условиях 5% водной нагрузки функционирующая способность почек также нарушается.

2. Экскреция натрия в условиях спонтанного и водного диуреза при хронической кобальтовой интоксикации у экспериментальных животных повышена. Это обусловлено падением уровня относительной канальцевой реабсорбции катиона, несмотря на снижение его фильтрационного заряда. Экскреция калия повышается на фоне снижения его фильтрационного заряда.

3. При нефропатии, вызванной введением хлорида кобальта, отмечается снижение активности Ыа+,К+-АТФ-азы коркового и мозгового вещества почечной ткани, что и является одной из причин снижения уровня канальцевой реабсорбции натрия и, соответственно, его повышенной экскреции.

4. Экспозиция хлоридом кобальта в дозах 2, 4 и 6 мг/кг веса животного сопровождается активацией перекисного окисления липидов эритроцитах и в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани - концентрация малонового диальдегида повышается, при этом снижается активность супероксиддисмутазы, а каталазы компенсаторно повышается.

5. Усиление перекисного окисления липидов сопровождается изменениями функциональных свойств липидного матрикса клеточной мембраны, приводящее к нарушению конформации фермента Ыа^К'-АТФ-азы и снижению её активности.

6. Подкожное введение различных дозировок хлорида кобальта вызывает дозозависимое повышение содержания кобальта в плазме крови, моче и почечной ткани, сопровождающееся усилением упруго-эластических свойств сосудистой стенки и удельного периферического сосудистого сопротивления

Заключение.

Органы выделительной системы являются наиболее уязвимыми как к эндогенным, так и к экзогенным токсикантам, поскольку большая часть ксенобиотиков экскретируются почками (Брин В.Б., Албегова Н.Р., Албегова Ж.К., Епхиев A.A., 2002). Нарастающие неблагоприятные экологические воздействия, как правило, антропогенного характера, заставляют по-новому взглянуть на те заболевания, с которыми приходится иметь дело в начале XXI века (Антонова И.В., Богачева Е.В., Китаева Ю.Ю., 2010). В 30% случаев неясна причина развития гломерулонефрита и в 5% — тубулоинтерстициального нефрита, что позволяет предполагать определенную роль в их развитии различных ксенобиотиков (Даутов Ф.Ф. и соавт., 2000).

При нарастании концентрации ксенобиотиков, интенсивности и длительности воздействия или их сочетания адаптационные системы работают в условиях напряжения. В ряде случаев компенсаторные возможности организма истощаются и развивается нарушение функциональных возможностей организма или отдельных систем (Валеева Э.Т., Бакиров А.Б., Каримова JI.K., Галимова P.P., 2009).

Особое внимание на современном этапе развития науки привлекаем проблема загрязнения окружающей среды солями тяжелых металлов, так как они обладают широким спектром патогенного влияния (Гичев Ю.П., 2003). Прежде всего, оно выражается в блокировании сульфгидрильных групп более 100 ферментов, причем наиболее существенно поражаются ферментные системы, участвующие в энергетическом обмене. Кроме того, блокада сульфгидрильных групп приводит к деформации липопротеидного каркаса мембран клеток и, как следствие, к нарушению гормональной регуляции, ввиду того, что становится невозможной адекватная рецепция гормонов, обладающих мембрано-цитозольным механизмом действия. Другой стороной токсического действия тяжелых металлов является их дестабилизирующее действие на тканевые рецепторы к липопротеиновым комплексам, вызывающие нарушение липидного обмена (Игнатова М.С., Харина Е.А., Солбирова Т.Н. и др., 2004).

Кобальт жизненно важный микроэлемент, участвующий во многих процессах жизнедеятельности организма. Однако, при экзогенных воздействиях кобальт обладает высокой повреждающей способностью (Szakmary Е. el all., 2001) и его относят к веществам 1 класса опасности (Орджоникидзе Э.К., Рощин A.B., 1991). Токсические эффекты кобальта проявляются полиморфным поражением кроветворной, сердечно-сосудистой, дыхательной, иммунной систем, а также поражением почек, поскольку почки, вследствие морфологических и функциональных особенностей, являются одним из главных органов-мишеней для ксенобиотиков (Goyer А., 1990; Czock D., Hausler U. et all., 2005).

Накопление кобальта в тканях почек приводит к дистрофическим и некробиотическим изменениям почечного эпителия (Szakmary Е. et al., 2001), трансмембранного транспорта воды и электролитов (Гончаревская О.Л. и соавт., 1985; Наточин Ю.В., 1985; Schwartzman М. et al., 1986; Jungwirt А. et al., 1990; Zhang Y.B. et al.,1998).

Рост загрязнения окружающей среды такими токсичными, легко накапливающимися^ в организме веществами, как тяжелые металлы обусловливает насущную необходимость изучения механизма влияния, создания, разработки и внедрения новых способов профилактики поступления и усиления их выведения из организма.

Анализ результатов информационно-патентного поиска послужил основанием для изучения мембранных механизмов развития кобальтовой нефро- и ангиопатии, определяющих функциональное состояние почек. Являясь главным экскреторным органом, почки становятся мишенью многих ксенобиотиков, в том числе цветных тяжелых металлов, в частности, кобальта (Албегова Ж.К., Брин В.Б., 2007; Албегова Ж.К., Брин В.Б., Гаглоева Э.М., Молдован Т.В., Албегова Н.Р., 2009). По многочисленным литературным данным (Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С., 2009; Дзугкоева Ф.С., Битарова Ж.Р., 2008; Длин В.В., Османов И.М., 1996; Игнатова М.С., Длин В.В. и др., 1997; Павловская H.A., Кирьяков В.А., Савельев С.И., 2002) длительное воздействие солей тяжелых металлов в эксперименте приводит к развитию хронической необратимой нефропатии, переходящей в почечную недостаточность. Однако, в доступной литературе недостаточно данных по комплексному изучению в динамике микроциркуляторных изменений в почках и периферической сосудистой системы, ПОЛ, АОС и активности Naf,Kf-ATO-a3bi почечной ткани.

Поэтому целью исследования было изучение водо- и электролито-выделительной функции почек, активности Ыа,К,АТФ-азы почечной ткани, макро- и микрогемодинамики, сопряженных систем ПОЛ и АОЗ на фоне хронической интоксикации хлоридом кобальта в эксперименте у крыс.

Опыты проводили на крысах-самцах линии Вистар. Хроническую кобальтовую интоксикацию вызывали путем ежедневного введения раствора хлорида кобальта подкожно в дозах 2, 4 и 6 мг/кг веса животного в течение 2-х недель и 1 месяца. В завершении эксперимента провели изучение водо- и электролито-выделительной функции почек на фоне шестичасового спонтанного и трехчасового водного диурезов (5% водная нагрузка).

При изучении влияния кобальтовой интоксикации на водо-выделительную функцию почек в условиях спонтанного диуреза выявили снижение величины спонтанного диуреза, из-за снижения скорости клубочковой фильтрации, хотя при этом канальцевая реабсорбция воды обнаружила лишь тенденцию к снижению. На фоне 5% водной нагрузки данные показали, что суммарный трехчасовой диурез достоверно понижается у животных как при введении хлорида кобальта в течение 2-х недель, так и в течение 1 месяца. При анализе суммарного 3-х часового водного диуреза выявлено, что почасовые изменения диуреза характеризуются его повышением на 1 часе в результате рефлекторного увеличения скорости клубочковой фильтрации. На 2 и 3 часах водной нагрузки диурез ниже контроля вследствие угнетения скорости клубочковой фильтрации. Процент выведения водной нагрузки тоже падает по сравнению с данными контрольной группы, что подтверждает недостаточную функциональную способность почек.

Данные, свидетельствующие о понижении градиента давления (СО) и диастол и ческой скорости кровотока в НПВ, характеризуют венозный застой на фоне повышения средней (М) и систолической (Б) скоростей кровотока в магистральных сосудах (БА и почечные артерии). Возможно, это является компенсаторным механизмом для поддержания жидкостного обмена в сосудах. Все эти изменения микроциркуляторного русла и макрогемодинамики направлены на улучшение доставки кислорода и метаболитов в сосуды микроциркуляции.

На фоне спонтанного диуреза электролито-выделительная функция почек характеризуется повышением экскреции натрия при введении хлорида кобальта во всех дозировках (2, 4 и 6 мг/кг веса), что обусловлено падением уровня относительной канальцевой реабсорбции данного катиона, хотя фильтрационный заряд натрия снижается. Экскреция калия повышена при введении хлорида кобальта во всех исследуемых группах.

Экскреция натрия суммарно за 3 часа на фоне 5% водной нагрузки значительно повышается при введении хлорида кобальта в дозах 2, 4 и 6 мг/кг веса в течение 2 недель и 1 месяца, более выражено на фоне дозы 6 мг/кг веса, т.е. отмечается дозозависимость. Более того, эти изменения наиболее выражены при введении хлорида кобальта в течение 1 месяца.

Суммарная 3-х часовая экскреция калия на фоне 5% водной нагрузки достоверно выше контрольного уровня, что обусловлено повышением экскреции катиона на 1 и 2 часах водной нагрузки у животных с введением хлорида кобальта в дозах 4 и 6 мг/кг массы в течение 2-х недель и 1 месяца.

Определение содержания электролитов в плазме крови выявило, что во всех исследуемых группах экспериментальных животных концентрация натрия в плазме крови понижается сравнительно с контролем, при этом повышена экскреция натрия вследствие угнетения его канальцевой реабсорбции. Что касается концентрации калия в плазме крови, то введение хлорида кобальта в течение 2-х недель и 1 месяца вызывают повышение уровня калия в крови.

Как известно, реабсорбция натрия в почечных канальцах является активным процессом. В нем принимает участие Ыа+,К+-АТФ-аза, являющаяся составной частью натриевого насоса, которая играет основную роль в реабсорбции натрия в почечных канальцах. Этот фермент является непосредственным участником процесса и, расщепляя макроэргические фосфатные связи АТФ, обеспечивает энергией активный транспорт Na1 и Kf. Ыа+,К'-АТФ-аза стимулируется одновременным повышением концентрации натрия и АТФ внутри клетки и калия снаружи (Наточин Ю.В., 1972; Болдырев A.A., Булыгине Е.Р., Волонская Е.А.,. Курелла Е.Г, Тюлина О.В., 1995), то есть гидролитический центр и центр активации Na+ обращены в сторону цитоплазмы, а калиевый - в межклеточную среду. При этом при гидролизе одной молекулы АТФ фермент выбрасывает три иона Nab из клетки, обменивая их на два иона К+ (Болдырев A.A., 1992; Наточин Ю.В., 1969).

В доступной литературе не найдено данных о состоянии Naf,K*-АТФ-азы в клетках почечной ткани, а особенно в различных ее слоях при хроническом воздействии кобальта на организм.

Проведенные нами эксперименты по определению активности Na ,К -АТФ-азы в гомогенагах коркового и мозгового вещества почечной ткани в s условиях кобальтовой интоксикации выявили, что введение хлорида кобальта в течение 2-х недель и 1 месяца сопровождается достоверным снижением её активности как в мозговом, так и в корковом веществе почечной ткани.

Данные литературы и полученные в нашей лаборатории, свидетельс1вуют о том, что в норме активность NaКАТФ-азы зависит от состояния липидного микроокружения (Дзугкоева Ф.С. и соавт., 1996; 2003; 2004; 2008; 2009), ионных регуляторов, нуклеотидов, являющихся субстратами фермента и гормональных ингибиторов и активаторов (Наточин Ю.В., 1982; Сумакова H.A., 1996; Слесаренко Е.Г., Корсуновская Г.А., Гарец B.JL, Литвин B.C., Масалыгина Л.С., 1991). Уменьшение активности данного фермента может быть обусловлено изменением конформации энзима в результате нарушения состояния фосфолипидов мембран канальцев почек, так как каталитическая активность его находится в зависимости от качественного и количественного состава мембранных фосфолипидов. Как известно, важную роль в структурно-функциональной модификации биологических мембран и изменении их физико-химических свойств и проницаемости играет ПОЛ - универсальный процесс, протекающий в мембранах в физиологических условиях. При ряде патологических состояний происходит активация ПОЛ, которая может привести к целому ряду отклонений, в час гное ги, к структурной перестройке мембран и нарушению клеточного метаболизма, изменению активности мембраносвязанных ферментов.

Литературные данные свидетельствуют о повышении активности процессов ПОЛ при кобальтовой интоксикации (Васильева О.В., 1998; Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин В.Ю., Горобец Н.И., 2004; Павловская H.A., Кирьяков В.А., Савельев С.И., 2002; Ушакова В.Н., 1993;). При количественной оценке процессов липопероксидации в клетках крови, гомогенатах тканей печени, миокарда в динамике экспериментальной нефропатии зарегистрированы существенные изменения функционального состояния системы свободнорадикального окисления (Дубинина Е.Е., 2001; Конторщикова К.Н., 2000; Осипов А.Н., 1990; Павловская H.A., 2001; Скулачев В.П., 2001; Шевцов A.A., Заблова Т.А., Бондаренко O.A., Фролова Л.А., 2005). Вместе с тем мы не обнаружили в доступной нам литературе данных об изменении процессов ПОЛ в почечной ткани и влиянии его на активность Na-Hacoca, ответственного за реабсорбцию натрия в почечных канальцах.

Для выяснения роли ПОЛ в развитии кобальтовой нефропатии в наших экспериментах мы проводили количественную оценку процессов липопероксидации в мембранах клеток коркового и мозгового вещества почечной ткани и в эритроцитах. Активность ПОЛ оценивали по концентрации МДА -конечного продукта ПОЛ. Состояние свободнорадикальных процессов в эритроцитах оценивалось, поскольку они являются доступной моделью тканевых клеток в клинических и экспериментальных исследованиях. У экспериментальных крыс на фоне кобальтовой экспозиции различными дозами повышается концентрация МДА в эритроцитах сравнительно с контрольной группой

Аналогичные изменения выявлены и в клетках почечной ткани: происходит достоверное повышение концентрации МДА как в корковом, так и в мозговом веществе почечной ткани во всех группах животных. Более выраженное повышение активности ПОЛ отмечается при введении хлорида кобальта в дозе 6 мг/кг веса животного в течение 1 месяца. Усиление процессов липопероксидации при кобальтовой интоксикации вызывает дезинтеграцию липопротеиновых комплексов, усиливает их гидрофильность и приводит к нарушению проницаемости мембраны и изменению конформации мембраносвязанного фермента Ыа',К+-АТФ-азы, ответственного за канальцевый транспорт натрия.

Более того полученные нами данные свидетельствуют о взаимосвязи между повышением концентрации МДА и снижением активности №+,К'-АТФ-азы в клетках почечной ткани, выявляется сильная отрицательная корреляционная связь между интенсивностью ПОЛ и активностью №+,К+-АТФ-азы в корковом веществе почечной ткани (г= -0,697 при введении дозы 4 мг/кг веса- животного в течение 2-х недель, г= -0,769 при введении этой же дозировки в течение 1 месяца, г= -0,697 и г= -0,788 соответственно при введении хлорида кобальта в дозе 4 мг/кг веса в течение 2-х недель и 1 месяца) и в мозговом веществе (г= -0,673 и г= -0,712 при введении дозы 4 мг/кг веса соответственно через 2 недели и 1 месяц; г= -0,702 и г= -0,725 соответственно при введении дозы 6 мг/кг веса). Кроме того, нами установлены однонаправленные изменения процессов липопероксидации в эритроцитах и клетках почечной ткани, что возможно использовать в клинике для более раннего выявления нарушения электролито-выделительной функции почек при кобальтовом отравлении.

В тесной связи с процессами СРО находится АОС организма, основная функция которой заключается в ограничении процессов ПОЛ практически во всех его звеньях. Система ПОЛ - антиоксиданты работает по принципу обратной связи. Повышение уровня антиоксидантов, как правило, приводит к торможению процессов ПОЛ, что в свою очередь влияет на состояние фосфолипидов клеточных мембран.

В условиях оксидативного стресса у крыс с интоксикацией хлоридом кобальта выявлено снижение активности СОД в крови (р<0,01), тогда как активность каталазы существенно возросла (р<0,01). Нами было выявлено, что 2-х недельное и введение в течение 1 месяца всех дозировок сопровождается достоверным повышением активности каталазы, причем при 2-х недельной затравке активность каталазы ниже. Сравнивая характер окислительной модификации активными формами кислорода СОД и каталазы, мы предположили на основании данных литературы, что специфика процесса определяется особенностью уникальной структурной организации биомолекул данных ферментов. По сравнению с СОД каталаза, содержащая 4 группы гема и 4 молекулы НАДФН1, оказывается более устойчивой к инактивирующему действию Н2О2 и компенсаторно препятствует образованию радикала - ОН" путем метаболического удаления перекиси водорода и может неспецифически стимулировать распад гидроперекисей липидов. Т.о., патобиохимической составляющей в генезе кобальтовой нефропатии является активация ПОЛ, которое индуцируется активными метаболитами кислорода: супероксиданионрадикалом 02~, перекисью водорода Н2О2, продуктами реакции Хабера-Вейса и Фентона -радикалом гидроксила ОН", которые считаются наиболее активными инициаторами ПОЛ.

Исследование характера кровотока в крупных сосудах и в микроциркуляторном русле показало, что при анализе перфузии тканей при кобальтовой интоксикации во всех точках локации снижается средняя скорость кровотока (М) за счет снижения систолической (Б) и диастолической (Э) скоростей кровотока. Географические показатели характеризуются повышением индекса Гослинга, который отражает повышение упруго-эластических свойств (плотности) сосудистой стенки и снижение градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. Одновременно повышался реографический индекс

RI - индекс Пурсело), свидетельствующий о нарастании регионарного периферического сосудистого сопротивления.

Т.о., патогенетической основой повреждения нефрона и других клеток тканей при экспериментальной кобальтовой интоксикации является ПОЛ, вследствие губительного образования АМК и нарушения функционирования компонентов АОЗ клетки. Развитию этого процесса также способствует дисбаланс между этими системами.

Нами проведены исследования по определению содержания кобальта в почках, плазме крови и моче. Результаты исследований выявили прямые корреляционные связи между дозой вводимого хлорида кобальта и содержанием в плазме крови (г = +0,66 при подкожном введении хлорида кобальта в течение 2-х недель и г = +0,61 - спустя 1 месяц), ткани почек (г = +0,63 при введении хлорида кобальта в течение 2-х недель, г = +0,78 через 1 месяц после введения соли) и в моче (г = +0,57 при введении хлорида кобальта в течение 2-х недель, г = +0,72 -через 1 месяц после введения соли). Возрастание содержания металла было более выражено при введении возрастающих доз хлорида кобальта в течение 1 месяца. Кроме того, мы изучили корреляционные взаимосвязи между содержанием кобальта в плазме крови и активностью ПОЛ в мембранах эритроцитов и выявили прямую корреляционную связь между этими показателями при затравке хлоридом кобальта в течение 2-х недель (г = +0,61 в дозе 2 мг/кг веса, г = +0,49 в дозе 4 мг/кг веса, г = +0,52 в дозе 6 мг/кг веса) и через 1 месяц после введения соли (г = +0,54 в дозе 2 мг/кг веса, г = +0,63 в дозе 4 мг/кг веса, г = +0,75 в дозе 6 мг/кг веса).

Таким образом, при хронической кобальтовой интоксикации при парентеральном введении различных дозировок хлорида кобальта отмечаются нарушения водо- и электролито-выделительной функции почек, выражающиеся в угнетении спонтанного диуреза, снижения скорости клубочковой фильтрации и повышения экскреции Na и К. Выясняя механизм нарушения электролито-выделительной функции почек, нами установлено, что ответственным является фермент №+,К+-АТФ-аза, активность которой снижается, следовательно, соответственно падает и канальцевая реабсорбция натрия. Помимо токсической нефропатии развиваются сосудистые нарушения: снижается скорость кровотока в микроциркуляторном русле, повышается плотность сосудистой стенки и общее периферическое сосудистое сопротивление. В отличие от этого в магистральных сосудах наблюдается гиперперфузия, сопровождающаяся повышением средней и систолической скоростей кровотока. В механизме всех этих процессов играет основную роль ПОЛ, интенсифицируемое интоксикацией хлоридом кобальта, накопление продукта ПОЛ - МДА, изменение гидрофобности липидного матрикса клеточной мембраны и сосудистой стенки канальцев почек и, соответственно, снижение Na и К и нарушения гемодинамики.