Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль гистамина, гистаминовых рецепторов в регуляции синтеза IgE при тяжелой гормонозависимой бронхиальной астме у детей

ГОУ ВПО «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ»

На правах рукописи

Андреянова Александра Николаевна

РОЛЬ ГИСТАМИНА, ГИСТАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА ^Е ПРИ ТЯЖЕЛОЙ ГОРМОНОЗАВИСИМОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ У ДЕТЕЙ

14 00 36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

0030В4653

Краснодар - 2007

003064653

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО КГМУ Росздрава) и Государственном учреждении здравоохранения «Детская краевая клиническая больница» департамента здравоохранения Краснодарского края

Научный руководитель доктор медицинских наук профессор

Ханферян Роман Авакович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук

Ригер Николай Александрович,

доктор медицинских наук Беловолова Розалия Александровна

Ведущая организация Санкт-Петербургский государственный

медицинский университет имени академика И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита состоится ^-^/¿^ 2007 г в 10 00 на заседании

диссертационного совета К208 038 05 при ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (350063, Краснодар, ул Седина, 4, тел {861} 262-73-75)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава

Автореферат разослан » ¿¿Д^2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета профессор

ИИ Куценко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Практически во всех странах мира растет заболеваемость бронхиальной астмой (БА) и аллергией Частота встречаемости Б А у детей составляет от 5 до 15% Вместе с тем патогенетические механизмы формирования IgE-зависимых заболеваний, в частности тяжелой бронхиальной астмы (ТБА) и ее гормонозависимых вариантов, роль гистамина, рецепторов гистамина различного типа в данных процессах в настоящий момент изучены недостаточно

Учитывая вышеизложенное, целью работы явилось изучение роли гистамина, гистаминовых рецепторов (HI-, Н2-, НЗ/4-) в регуляции синтеза IgE при тяжелой гормонозависимой БА (ТГБА) у детей

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1 Исследовать влияние гистамина на синтез in vitro IgE и IgE-регуляторных цитокинов (интерлейкина 4 и гамма интерферона) при ТГБА у детей 10-16 лет в обострение

2. Исследовать влияние гистамина на синтез in vitro IgE и IgE-регуляторных цитокинов (интерлейкина 4 и гамма интерферона) при ТГБА у детей 10-16 лет в ремиссию (после 3 месяцев подобранной эффективной базисной терапии)

3. Исследовать роль различных типов гистаминовых рецепторов (HI-, Н2-, НЗ/4-) в регуляции синтеза IgE и основных IgE-регуляторных цитокинов при ТГБА у детей 10-16 лет в обострение

4. Исследовать роль различных типов гистаминовых рецепторов (HI-, Н2-, НЗ/4-) в регуляции синтеза IgE и основных IgE-регуляторных цитокинов при ТГБА у детей 10-16 лет в ремиссию (после 3 месяцев подобранной эффективной базисной терапии)

Новизна результатов исследования

В данной работе впервые

1) Проведено сравнительное исследование влияния гистамина и блокады рецепторов гистамина HI-, Н2-, НЗ/4- типов на синтез in vitro IgE в культурах мононуклеаров периферической крови (МПК) здоровых детей 10-16 лет и больных ТБА, ТГБА в

обострение и по достижении ремиссии (после 3 месяцев подобранной эффективной базисной терапии) 2) Проведено сравнительное исследование влияния гистамина и блокады рецепторов гистамина HI-, Н2-, НЗ/4- типов на синтез in vitro IgE-регуляторных цитокинов в культурах МПК здоровых детей 10-16 лет и больных ТГБА, ТБА в обострение и по достижении ремиссии (после 3 месяцев подобранной эффективной базисной терапии)

Теоретическая значимость исследования. Полученные факты углубляют представления о роли гистамина, рецепторов гистамина различных типов (HI-, Н2-, НЗ/4-) и в регуляции синтеза IgE у здоровых детей и у детей, больных ТГБА и ТБА без гормонозависимости

Практическая значимость исследования заключается в установлении механизмов регуляции синтеза IgE, опосредованных медиатором нецитокиновой природы (гистамином), у детей, больных ТГБА, ТБА без гормонозависимости, и их отличительные особенности по сравнению со здоровыми лицами позволяют судить о механизмах формирования IgE-зависимых аллергических заболеваний Полученные данные могут являться основой поиска новых подходов к лечению атопических заболеваний, а также поводом для пересмотра роли уже используемых в терапии данной патологии лекарственных средств (антигистаминных, глюкокортикостероидных препаратов) Структура и объем работы. Диссертация изложена на 165 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав с описанием методики и результатов исследования, заключения, выводов, библиографии (84 источника на русском и 87 на иностранных языках) и приложений Работа содержит 52 рисунка, 21 таблицу

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили 30 больных ТБА, 12 больных ТГБА находившихся на стационарном лечении в Краевой детской клинической больнице г Краснодара по поводу обострения астмы, а также 12 детей, не страдающих атопическими заболеваниями, возраст детей составил от 10 до 16 лет Диагноз и степень тяжести при обострении астмы

устанавливались согласно международным рекомендациям в соответствии с критериями Global Initiativ for Asthma, пересмотр 2002 года (GINA)

Забор крови производился до начала адекватной терапии, кроме того все дети были обследованы через 3 месяца на фоне базисной терапии (клиническая ремиссия) Для всех групп критериями исключения служило наличие интеркуррентных заболеваний Атопическая форма БА была подтверждена наличием повышенного уровня общего IgE (698 + 21 МЕ/мл, наличием диагностического титра специфических IgE к бытовым, грибковым и эпидермальным, пищевым аллергенам (MAST -CLA system, Medland, Голландия), положительными скарификационными пробами со стандартизированными диагностическими аллергенами (Nelco Labs INC, USA), данными семейного и личного анамнеза

В результате применения кластерного анализа уровня синтеза IgE, IgE регуляторных цитокинов МПК группа ТБА разделилась 2 подгруппы, в которых были выявлены различия в ответе МПК на введение гистамина и блокаторов гистаминовых рецепторов

В 1 подгруппе (ТБА1) исходный уровень синтеза IgE МПК in vitro был достоверно (р<0,01) ниже, чем соответствующий уровень 2-й подгруппы (ТБА2) и составил для 1 и 2 подгруппы соответственно Me 7,56 (Low 6,13, Upp 8,56) ME/мл и Me 14,13 (Low 12,45, Upp 14,39) ME/мл Кроме того оказалось, что уровень синтеза сывороточного IgE в подгруппе 1 (18 человек) составил 526+ 24 ME/мл, в подгруппе 2 - 870 + 14 ME/мл (достоверность различий сывороточного IgE 1 и 2 подгруппы - р<0,01) При ретроспективном анализе данных подгрупп было показано, что в подгруппе 1 дети с ТБА имели более широкий спектр сенсибилазации и наличие более двух сопутствующих аллергических заболеваний (аллергический ринит, аллергический конъюктивит, атопический дерматит, гастроинтестинальная аллергия)

МПК выделялись из гепаринизированной крови общепринятым методом на центрифуге РС-6 в градиенте плотности фиколл-пак (1077-78) («Pharmacia», Швеция)

Жизнеспособность лимфоцитов определяли по включению погибшими клетками 0,1% раствора трипанового синего (Serva) [ГП Адаменко, 1975] При выделении лимфоцитов погибало не более 5% клеток Соотношение клеточных популяций в МПК в среднем составляло лимфоцитов - около 75%, моноцитов - около 25%, нейтрофилов - не более 0,5%

После двухкратной отмывки в среде 199 лейкоциты ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 2мМ L-глютамина, 10 мМ Hepes (фирма «Serva», Германия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 40 мкг/мл гентамицина Для определения уровня синтеза IgE культивирование проводилось в 96 луночных планшетах при концентрации 200 тысяч клеток на лунку в объеме 150 мкл, в С02 инкубаторе, содержащем 5% С02, при 96% влажности и 37°С в течение 6 суток [Р М Хаитов, 1998] Для определения цитокинов - культивирование проводили в течение 3 суток Исследование содержания общего IgE в сыворотках и концентрации IgE в супернатантах проводили иммуноферментным методом с использованием стандартных тест-наборов для определения общего IgE человека (IgE-total, FEiA , «Pharmacia») Уровень цитокинов в МПК изучался с помощью стандартных тест-систем для иммуноферментного специфического определения уровня человеческого IL-4, интерферона-гамма («BioSource», США).

Модель избирательной блокады рецепторов Hl-, Н2-, НЗ/4- на фоне специфического модулирующего действия их селективного агониста - гистамина в высокой и низкой концентрации (10"5М и 10"8М, соответственно) была использована для выявления роли гистамина в регуляции синтеза IgE, а также - без введения гистамина извне с учетом предсуществующего уровня гистамина в системе МПК (специфическое связывание, поглощение) [Н В Котова, 2002; С А Котова, ОБ Белова, НМ. Бережная, 1995] Для блокады HI-рецепторов гистамина был использован селективный HI-блокатор лоратадин концентрации 10"5М Для блокады Н2-рецепторов гистамина применялся Н2-блокатор ранитидин в концентрации 10°М Для селективной блокады НЗ/4-гистаминовых рецепторов применялся FUB 181

hydrogenmaleate в концентрации 10"5М Концентрации блокаторов были подобраны на основании предварительно проведенных исследований с использованием диапазона концентраций данных блокаторов от 10°М до 10"8М [R Khanferyn, D Lesik, 2004]

Вследствие небольшого объема выборки нормальность распределения признаков не производилась. Анализ различий признаков проводился с помощью непараметрического критерия Вилкоксона [Г.Ф Лакин, 1994, С Глянц, 1998] Данные представлены в виде Me, Low, Upp, где Me - медиана, Low -нижний квартиль 25% всей выборки, Upp - верхний квартиль 75% всей выборки На представленных в работе рисунках приведены данные о кратности изменения изучаемых показателей в сравнении с К0 (исходным уровнем для каждой группы). Кратность изменения рассчитывалась отдельно для каждого индивида, что позволило оценить не только кратность изменения в группе (Ко), но и ее ошибку (тк), а это позволило оценить достоверность величины К0 при помощи критерия Вилкоксона. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости менее 5% (р<0,05)

Подготовку данных для статистической обработки и построение графиков проводили в программе «Excell 2002» (корпорация MS, США) Статистическую обработку проводили в программе «Statiatica 6 0 for Windows» (фирма StatSoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе проведения сравнительной оценки влияния гистамина и блокады гистаминовых рецепторов на синтез IgE у здоровых детей и больных ТГБА и ТБА было выявлено, что в культурах МПК на момент поступления в стационар у детей с тяжелой астмой, как и у здоровых детей гистамин в низких концентрациях вызывал достоверную стимуляцию синтеза IgE. У больных детей выраженность этой стимуляции более высока, чем у здоровых (рис 1, 2, 4, 6) Вместе с тем после лечения в группе ТГБА кратность стимуляции синтеза IgE относительно соответствующего исходного уровня низкими концентрациями гистамина не изменилась, тогда как подгруппах ТБА1 и ТБА2

возросла с 1,61+0,36 раз до 1,84±0,25 и 1,3±0,06 раз до 1,88+0,53 раз, соответственно (рис 3, 5, 7).

В стадии обострения высокая концентрация гистамина у детей, больных ТБА во всех группах стимулировала синтез рЕ (ТБА1 в 1,19+0,1 раз, ТБА2 в 1,2±0,04 раз, ТГБА в 1,43+0,11 раз), тогда как у здоровых детей наблюдалась супрессия синтеза рЕ (рис 1,2,4,6) После 3-х месячного лечения в подгруппах ТБА 1 и ТБА2 происходило устранение эффекта стимуляции синтеза рЕ высокими концентрациями гистамина с достоверной его супрессией (р<0,01), тогда как в культурах МПК больных ТГБА после лечения высокие концентрации гистамина продолжали продукцию рЕ (1,41+0,10 раз) Кратность этой стимуляции сопоставима с таковой до лечения (рис 3, 5, 7)

Н1-блокада у здоровых детей не приводила к достоверному изменению синтеза рЕ, тогда как во всех изучаемых группах детей с ТБА в данных условиях уровень синтеза рЕ достоверно снижался относительно исходного как в стадии обострения, так и после лечения Н1-блокада у здоровых детей отменяла стимулирующее влияние низкой концентрации гистамина на синтез рЕ, но не влияла на супрессию синтеза рЕ высокой концентрацией гистамина.

В группе ТГБА как до, так и после лечения блокада Н1-рецепторов отменяла стимулирующее действие гистамина на репродукцию (р<0,01) Было выявлено, что уровень синтеза рЕ в данных условиях достоверно выше, чем при изолированном воздействии Н1- блокатора.

В подгруппах ТБА1 и ТБА2 как до лечения, так и после, блокада Н1-рецепторов достоверно снижала уровень синтеза рЕ относительно исходного (р<0,01) До лечения в подгруппе ТБА1 при блокаде Н1-рецепторов происходила отмена стимулирующего влияния гистамина на синтез рЕ При этом гистамин в данных условиях в обеих концентрациях оказывал достоверное супрессирующее влияние на синтез рЕ. В подгруппе ТБА2 в стадии обострения происходила отмена стимулирующего влияния гистамина на синтез рЕ при Н1-блокаде.

После 3-х месячной терапии в подгруппе ТБА1 блокада Н1-рецепторов гистамина приводила к устранению стимулирующего

действия низких концентраций гнетамина и усилению супрессирующего влияния высоких концентраций гистамина (р<0.01) па синтез После лечения блокада Н1-рецепторов в подгруппе ТБА2 утраняла стимулирующее влияние низких концентраций гистамина на синтез (р<0.()! по сравнению с уровнем при воздействии данных концентраций гистамина без блокады Н-рецепторов). Супрессирующее влияние высокой концентрации гистамина на синтез ^Е сохранялось неизменным (рис. 1-7),

Э|дЕ I

Ш

Рис.1 Влияние Н1-антагонистов на синтез и ^Е~регуляторш>1Х

цитокинов МПК здоровых детей

1|3Е I

2 ШЬ Шк жегжггжп.

Рис.2 Влияние Н1-антагонистов на синтез 1а Е и Ц^Е-регул я торных цитокинов МПК группы ТЕБЛ в стадии обострения

2,0 1,5 " 1,0 0,5

о.о

ИдЕ [ ■

пжспш

Рис.3 Влияние Н1-антагонистов на синтез и [§Е-регуляторных

цитокинов МПК группы ТГБЛ после 3-месячной терапии

СГ311_-4 I, _1|дЕ Г"—I р-у КО

2,5 2.0 -

£ Ша юСк ¡-а"!

Г-Я Г-5 Н1 Н1 + Г-8 Н1 + Г-5

Рис.4 Влияние НI-антагонистов на синтез ^Е и ^Е-регуляторных цитокинов МПК подгруппы ТБА1 в стадии обострения

С2Э1Ь4 ' 1— т —*—ко

2,5 2.4 1.5 1,0 0,5

1:1'. ЙГП гаП1 гаП 1 FS.il 1

Г-З Г-5 Н1 Н1 + Г-8 Н1 + Г-5

Рис.5 Влияние НI-антагонистов на синтез !§Е и ^Е-регуляторных цитокинов МПК подгруппы ТЕА1 после 3-месячной терапии

Г-е Г-6 Н1 Н1+1-В Н1 + Г-5

Рис.6 Влияние Н1 -антагонистов на синтез ТуЕ и ^Е-регул яторных цитокинов МПК подгруппы ТБА2 в стадии обострения

Е=3||_-4 I-1Г-У —»—КО

3.0 -

ДЁи Г^П тй№\ РГП!1!

М Г-5 Н1 Н1 + Г-8 Н1 + Г-5

Рис.7 Влияние Н1-антагонистов на синтез и ^Е-регуляторных

цитокинов МПК подгруппы ТВ А 2 после 3-месячной терапии

При блокаде Н2-рецепторов гистамина МПК здоровых детей достоверного изменения уровня синтеза не

происходило Вместе с тем, при блокаде Н2-рецепторов МПК у здоровых детей происходило устранение супрессирующего влияния высоких концентраций гистамина и сохранение стимулирующего влияния низких концентраций

В подгруппе ТГБА при Н2-блокаде как до, так и после лечения достоверного изменения синтеза 1§Е не отмечено. В группе ТГБА в обострении блокада Н2-рецепторов не влияла на стимулирующее влияние гистамина После лечения в условиях Н2-блокады уровень синтеза ^Е при воздействии как низких, так и высоких концентраций гистамина оставался достоверно выше исходного (р<0,01) и отмечался достоверно ниже, чем при воздействии гистамина без блокады Н-рецепторов (р<0,05)

В подгруппе ТБА2 в обострение при блокаде Н2-рецепторов достоверного изменения синтеза 1§Е МПК не выявлено (р>0,1) Кроме того, блокада Н2-рецепторов МПК данной подгруппы детей не влияла на стимулирующее влияние как низких, так и высоких концентраций гистамина (р>0,05) Однако после 3-х месячного лечения блокада Н2-рецепторов вызывала достоверное увеличение синтеза 1§Е (р<0,01) относительно соответствующего исходного уровня Кроме того, Ранитидин в данной подгруппе после лечения устранял супрессирующее влияние высоких концентраций гистамина на синтез ^Е Гистамин в данных концентрациях в при Н2-блокаде оказывал стимулирующее влияние на синтез ^Е в 1,24+0,31 раза.

В подгруппе ТБА1 как до, так и после лечения при блокаде Н2-рецепторов было выявлено достоверное повышение уровня синтеза При добавлении в систему МПК данной подгруппы до лечения как низких, так и высоких концентраций гистамина при Н2-блокаде отмечалась стимуляция синтеза ^Е (р<0,01) После лечения при данных условиях низкие концентрации гистамина достоверно повышали уровень синтеза 1§Е относительно исходного уровня (р<0,01), устранялось супрессирующее влияние на синтез ^Е высоких концентраций гистамина (р<0,01), и была выявлена некоторая стимуляция синтеза относительно соответствующего исходного уровня (р<0,01) (рис. 8-14)

Рис 8 Влияние Н2-антагонистов на синтез ^Е и 1§Е-регуляторных цитокинов МПК здоровых детей

Рис 9 Влияние Н2-антагонистов на синтез Г^Е и ^Е-регуляторных цитокинов МПК группы ТГБА в стадии обострения

VI ц -4 "1 'ф ко

2,0

Г-8 Г-5 Н2 Н2 + Г-8 Н2 + Г-5

Рис 10 Влияние Н2-антагонистов на синтез ¡¿Е и ^Е-регуляторных цитокинов МПК группы ТГБА после 3-месячной терапии

Рис 11 Влияние Н2-антагонистов на синтез ^Е и ^Е-регуляторных цитокинов МПК подгруппы ТБА1 в стадии обострения

Рис 12 Влияние Н2-антагонистов на синтез ^Е и 1цЕ-регуляторных цитокинов М11К подгруппы ТБА1 после 3-месячной терапии

ЕЕЭ 11.-4 Г-—*— <0

Рис. 13 Влияние Н2-антагонистов на синтез 1°Е и 1»Е-регуляторных цитокинов МПК подгруппы ТБА2 в стадии обострения

г....."I -д 1 '' I1 СГЗГ-у —*—ко

пшп

Н2+Г-3 Н2 + Г-5

Рис.14 Влияние Г-12-антагонистов па синтез 1§Е и 1§Е-регуляторных цитокинов МПК подгруппы ТБА2 после 3-месячной терапии

В культурах МПК здоровых детей блокада НЗ/4-рецепторов приводила к достоверному (р<0,01) повышению продукции в 1.45+0.16 раз. Блокада НЗ/4-рецепторов у здоровых детей усиливала стимулирующий эффект низких концентраций и устраняла супрессирующее влияние высоких концентраций гистамина (р<0,0 [}.

В подгруппе ТГБА при блокаде НЗ/4-рецепторов как до, так и после лечения достоверного изменения синтеза пе

выявлено. В обострение при добавлении в систему гистамина и

блокаде НЗ/4-рецепторов сохранялась тенденция к увеличению синтеза рЕ После лечения при воздействии гистамина в условиях НЗ/4-блокады уровень синтеза рЕ оставался достоверно выше исходного (р<0,01) и достоверно ниже, чем при изолированном влиянии гистамина (р<0,05)

Было установлено, что блокада НЗ/4-рецепторов в подгруппе ТБА2, ТГБА до лечения не влияла на синтез 1§Е При добавлении гистамина в низкой и высокой концентрации в условиях блокады НЗ/4-рецепторов уровень рЕ не имел достоверного отличия от уровня рЕ при воздействии соответствующих концентраций гистамина без блокады НЗ/4-рецепторов (р>0,05) После трехмесячной терапии блокада НЗ/4-рецепторов вызывает достоверное (р<0,01) повышение синтеза рЕ относительно исходного. Блокада НЗ/4-рецепторов у данного контингента больных после лечения приводила к отмене супрессирующего влияния высоких концентраций гистамина с достоверным повышением уровня синтеза рЕ как относительно исходного уровня (р<0,01), так и относительно изолированного влияния НЗ/4-антагониста (р<0,01)

В подгруппе ТБА1 в стадии обострения блокада НЗ/4-приводила к достоверному повышению уровня синтеза рЕ относительно исходного уровня (р<0,01), причем степень этого повышения достоверно выше, чем при воздействии Н2-антагониста (р<0,01) Гистамин в высоких концентрациях в условиях блокады НЗ/4-рецепторов повышал уровень синтеза рЕ как относительно исходного (р<0,01), так и относительно изолированного воздействия без блокады НЗ/4-рецепторов (р<0,01) (рис 15-21)

—+~К0

Г-8 Г-5 НЗ/4 НЗ/4 + Г-8 НЗ/4 + Г-5

Рис 15 Влияние НЗ/4-антагонистов на синтез 1§Е и ^Е-регуляторных цитокинов МПК здоровых детей

Рис. 16 Влияние НЗ/4-антагонистов на синтез IgE и lgE-регуляторных цитокинов МПК группы ТГБА в стадии обострения

EE33IL-4 г--ly^, ■—♦—КО

г,о

Рис.17 Влияние НЗ/4-антагоннстов на синтез IgE и lgE-регуляторных цитокинов МПК группы ТЕБА после 3-месячной терапии

Рис.18 Влияние НЗ/4-антагонистов на синтез IgE и lgE-регуляторных цитокинов М11К подгруппы ГБА1 в стадии обострении

E-aiL-t ^^llgE I-'FT —КО

Рис.19 Влияние НЗ/4-антагонистов на синтез IgE и lgE-регуляторных цитокинов МПК подгруппы ТБА1 после 3-месячной терапии

Г-8 Г-5 НЗ/4 НЗ/4 + Г-8 НЗ/4 + Г-5

Рис 20 Влияние НЗ/4-антагонистов на синтез IgE и IgE-регуляторных цитокинов МПК подгруппы ТБА2 в стадии обострения

wjjsm\ 1 -4 СЭ1дЕ ат-у —♦—ко

4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 fjfejjl в_ шкш\

1 х if i\± i (TLB а штлт

Г-8 Г-5 H3/4 НЗ/4 + г-8 НЗ/4 + Г-5

Рис 21 Влияние НЗ/4-антагонистов на синтез IgE и IgE-регуляторных цитокинов МПК подгруппы ТБА2 после 3-месячной терапии

При проведении сравнительной оценки влияния гистамина и блокады рецепторов гистамина Н1-, Н2- и НЗ/4-типа на синтез IgE-регуляторных цитокинов у здоровых детей и больных тяжелой астмой было показано, что у здоровых детей в культурах МПК низкая концентрация гистамина достоверно повышала синтез ИЛ-4 (р<0,05), тогда как высокая супрессировала (р<0,05). В группе ТБА обеих подгруппах ТБА1 и ТБА2, как и в группе ТГБА гистамин в низкой концентрации стимулировал синтез ИЛ-4, причем значительно более выражено, чем у здоровых лиц в тех же условиях Гистамин в высоких концентрациях в обострение в отличие от здоровых лиц не снижал синтез ИЛ-4 в подгруппе ТБА1, а в ТБА2 и группе ТГБА стимулировал синтез ИЛ-4, причем у ТБА2 более выражено

После 3-х месяцев терапии в группе ТГБА гистамин как в низких, так и в высоких концентрациях стимулировал синтез ИЛ-4 относительно соответствующего исходного уровня

В группе ТБА подгруппах ТБА1 и ТБА2 после 3-х месяцев лечения гистамин в высокой концентрации оказывал супрессирующий синтез ИЛ-4 эффект Гистамин в низкой

концентрации стимулировал синтез ИЛ-4 в группе ТБА, в подгруппе ТБА1 кратность стимуляции относительно исходного уровня выше 1,88±0,13 раз, чем в подгруппе ТБА2 1,35±0,21 раз

У здоровых детей в культурах МПК гистамин дозозависимо подавлял синтез ИФНу, низкие концентрации менее выражено, чем высокие В группе детей с ТГБА дозозависимое подавление синтеза ИФНу отмечалось как до, так и после лечения, однако степень подавления синтеза данного цитокина после лечения уменьшалась В подгруппе ТБА1 до лечения гистамин также дозозависимо подавляла синтез ИФНу, после лечения степень подавления уровня синтеза данного цитокина гистамином уменьшалась, причем наблюдалась потеря дозозависимости данного эффекта В подгруппе ТБА2 в стадии обострения гистамин как в низкой, так и в высокой концентрациях супрессировал синтез ИФНу в 3 раза относительно исходного уровня, тогда как после трехмесячного лечения степень подавления уровня синтеза данного цитокина гистамином уменьшалась В подгруппах ТБА1 и ТБА2 после лечения наблюдался эффект инверсии дозозависимого влияния гистамина на синтез ИФНу - низкие концентрации подавляли синтез более выражено, чем высокие

В культурах МПК здоровых детей Н1-блокада устраняла стимулирующее влияние низкой концентрации гистамина на синтез ИЛ-4 и усиливала супрессирующее влияние высокой концентрации гистамина Блокада Н2-рецепторов МПК здоровых детей не влияла на стимуляцию синтеза ИЛ-4 низкой концентрацией гистамина и не отменяла супрессирующего влияния высокой концентрации гистамина на продукцию данного цитокина При блокаде НЗ/4- рецепторов гистамина у здоровых детей отмечался достоверный рост синтеза ИЛ-4 Стимулирующее влияние низкой концентрации гистамина на данный цитокин сохранялось, а супрессирующее влияние высокой концентрации гистамина устранялось

В культурах МПК группы детей с ТГБА как до, так и после лечения блокада рецепторов Н1-типа подавляла синтез ИЛ-4 относительно исходного уровня и отменяла стимулирующее влияние гистамина на синтез данного цитокина, не снижая его относительно исходного уровня Блокада Н2- как и НЗ/4-

рецепторов МПК группы ТГБА значимо не изменяла уровень синтеза ИЛ-4 и не влияла на эффекты гистамина в различных концентрациях как до, так и после лечения

В подгруппе ТБА1 до лечения Н1 блокада приводила к супрессии синтеза ИЛ-4 Гистамин в условиях блокады Н1-рецепторов устранял эффект стимуляции ИЛ-4, и вызывал более глубокую депрессию синтеза данного цитокина по сравнению с изолированной Н1-блокадой без введения гистамина извне После 3-х месячной терапии данная тенденция сохранялась.

В подгруппе ТБА1 блокада Н2-рецепторов усиливала стимулирующее действие гистамина После лечения Н2-блокада не влияла на стимулирующее действие низких концентраций гистамина, но отменяла супрессию синтеза ИЛ-4 высокими концентрациями гистамина

Блокада НЗ/4-рецепторов в подгруппе ТБА1 в обострение приводила к возрастанию уровня ИЛ-4, а при добавлении гистамина в низких и высоких концентрациях в условиях НЗ/4-блокады происходила выраженная стимуляция синтеза ИЛ-4 (более чем в 2 раза) относительно изолированного воздействия гистамина После лечения тенденция влияния НЗ/4-блокады на синтез ИЛ-4 сохранялась Была выявлена отмена супрессирующего влияния высоких концентраций с выраженной стимуляцией более чем в 2 раза относительно исходного уровня

В подгруппе ТБА2 в стадии обострения Н1 блокада приводила к снижению уровня синтеза ИЛ-4 относительно исходного и отменяла стимулирующее влияние гистамина на синтез данного цитокина После трёхмесячной терапии блокада Н1 -рецепторов устраняла стимулирующее влияние низких концентраций гистамина, не влияя на супрессирующее синтез ИЛ-4 воздействие высоких концентраций У подгруппы ТБА2 в обострение были выявлены сходные тенденции с группой ТГБА стадии обострения- блокада Н2- как и НЗ/4-рецепторов не оказывала влияния на уровень синтеза ^Е и не влияла на эффекты гистамина в различных концентрациях.

После трехмесячного лечения и достижения клинического контроля над астмой в подгруппе ТБА2 детей блокада Н2- и НЗ/4-рецепторов приводила к усилению стимуляции синтеза ИЛ-4 низкими концентрациями гистамина и отмене

супрессирующего влияния высоких концентраций гистамина на синтез

У здоровых детей наблюдалась дозозависимая депрессия синтеза ИФНу У больных тяжелей астмой детей обеих групп (ТБА и ТГБА) супрессия синтеза ИФНу гистамином более выражена, чем у здоровых детей, после проведенного лечения во всех подгруппах степень супрессии ИФНу уменьшалась

Блокада Н1-рецепторов гистамина МПК здоровых детей приводила к отмене супрессии синтеза ИФНу гистамином Блокада Н2-рецепторов МПК не устраняла супрессирующего влияния низкой концентрации гистамина, но устраняла супрессирующее влияние высоких концентраций Блокада НЗ/4-рецепторов МПК здоровых детей не только устраняла супрессирующее влияние гистамина на синтез ИФНу, но и вызывала достоверное повышение уровня ИФНу

В группе детей с ТГБА Н1- блокада как до, так и после лечения устраняла супрессирующее влияние гистамина на синтез ИФНу При Н2- и НЗ/4-блокаде в группе ТГБА супрессия синтеза ИФНу гистамином сохранялась

В подгруппе детей ТБА2 как до, так и после лечения Н1 блокада приводила к отмене супрессии синтеза ИФНу гистамином Блокада Н2- и НЗ/4-рецепторов до лечения не влияла на супрессирующее ИФНу воздействие гистамина После 3-х месячной терапии блокада Н2-рецепторов МПК в подгруппе ТБА2 не устраняла супрессирующее влияние низких концентраций гистамина, но устраняла супрессирующее влияние высоких концентраций гистамина При блокаде НЗ/4-рецепторов МПК подгруппы ТБА2 после лечения супрессия синтеза ИФНу гистамином сохранялась

В клеточных культурах подгруппы ТБА1 как до, так и после лечения блокада Н1- рецепторов приводила к отмене гистаминобусловленной супрессии синтеза ИФНу В стадии обострения заболевания у детей подгруппы ТБА1 при блокаде Н2- и НЗ/4-рецепторов супрессирующее влияние гистамина на синтез ИФНу сохранялось В стадии клинической ремиссии блокада Н2-рецепторов приводила к устранению супрессии ИФНу гистамином, а блокада НЗ/4-рецепторов устраняла

супрессирующее влияние высокой концентрации гистамина и не влияла на супрессирующее влияние низкой концентрации

ВЫВОДЫ

1. У детей с ТГБА в стадии обострения гистамин в низкой концентрации, также как и у детей с ТБА без гормонозависимости и у здоровых детей стимулируют синтез 1§Е, у последних менее выражено

1 1 В отличие от здоровых, высокие концентрации гистамина у детей с ТГБА и ТБА стимулируют синтез ^Е, причем при у ТГБА более выражено Показано, что нарушение регуляторного влияния гистамина на синтез МПК детей с ТГБА связано с дисбалансом в секреции ИЛ-4 и ИФНу

2 После 3-х месячной терапии у детей с ТГБА, ТБА уровень спонтанного синтеза ^Е достоверно снижается, причем у детей с ТГБА он отмечается достоверно ниже чем у детей с ТБА без гормонозависимости Вместе с тем у детей с ТБА уровень спонтанного синтеза после лечения не достигает соответствующего уровня здоровых лиц

2 1 У детей с ТГБА после лечения степень стимулирующего влияния гистамина в низкой и высокой концентрации не изменяется, тогда как у детей с ТБА без гормонозависимости в результате лечения изменяются тенденции влияния гистамина на синтез ^Е. в высокой концентрации гистамин супрессирует ^Е-синтез (как и у здоровых лиц), а в низкой концентрации еще более усиливает стимуляцию синтеза ^Е

3 У детей с ТБА и ТГБА в стадии обострения в отличие от здоровых, выявлено нарушение супрессирующего влияния гистамина на синтез ^Е, опосредованного рецепторами Н2- и НЗ/4- типа, дисбалансом секреции ИЛ-4, ИФНу.

4. После 3-х месячной терапии в группе ТБА происходит восстановление роли Н2- и НЗ/4- рецепторов в супрессирующем влиянии гистамина на синтез ^Е, что сопровождается восстановлением соотношения в секреции ИЛ-4, ИФНу В группе ТГБА после лечения нарушение регуляции синтеза ^Е, опосредованное Н2- и НЗ/4- рецепторами сохраняется 5 У детей с ТБА и большим уровнем исходного синтеза ^Е после трехмесячной терапии и достижении клинической ремиссии уровень синтеза оказывается достоверно выше, чем

у детей с ТБА и меньшим исходным уровнем синтеза данного иммуноглобулина, что сопровождается более выраженным дисбалансом синтеза иммунорегуляторных цитокинов (ИЛ-4 и ИФНу) при воздействии гистамина на Н2- и НЗ/4-рецепторы РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Khanferyan R, Milchenko N , Lesik D , Andreyanova A , DuBuske L M IgE synthesis depends on the concentrations of histamine, H3/4 antagonists and pre-existing levels of IgE // American college of allergy, asthma and immunology annual meeting - Boston, 2004 - P 82

2 Лесик Д В , Ханферян P A , Андреянова A H Роль гистамина и гистаминовых рецепторов НЗ/4-типа в регуляции синтеза IgE при атопических заболеваниях // Кубанский научный медицинский вестник - 2006 - №34 (84-85)-С 74-78

3 Андреянова А Н, Лесик Д В , Ханферян Р А Роль гистамина и гистаминовых рецепторов НЗ/4-типа в регуляции синтеза IgE при тяжелой астме у детей// Кубанский научный медицинский вестник - 2006 - № 10 (91) - С 11-14

Подписано в печать 17 08 2007г Гарнитура Тайме Печать ризография Бумага офсетная Заказ № 879 Тираж 100 экз

Отпечатано в типографии ООО «Копи-Принт» Краснодар уд Красная, 176, оф 3 т/ф 279-2-279 ТК «Центр города»

Практически во всех странах мира растет заболеваемость бронхиальной астмой (БА) и аллергией. Известно, что более 20% людей на Земном шаре страдает различными аллергическими заболеваниями, опосредованными, иммуноглобулином Е, - астмой, риноконъюктивитом, экземой и анафилаксией. Частота встречаемости Б А у детей составляет от 5 до 15%; у более чем 50% взрослых пациентов и примерно у 80% больных детей астма имеет аллергическую природу. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), БА выявлена у 150 миллионов людей по всему миру. Именно эта патология наносит наибольший экономический ущерб среди трудоспособного населения и служит основной причиной госпитализации детей с хроническими заболеваниями в западных странах [S.G.O. Johansson, Tari Haahtela (Ред.), 2005]. Для России проблема тяжелых обострений стоит наиболее остро, так как, к сожалению, в нашей стране диагноз БА часто впервые ставит врач скорой помощи, который вынужден оказывать неотложную помощь пациенту [Н.П. Княжеская, 2002]. Отмечается также тенденция к более раннему началу заболевания и сейчас БА часто диагностируют у детей первых месяцев жизни [Н.Д. Новикова, П.Д. Новиков, 2003]. По результатам многих исследований тяжесть течения заболевания в детском возрасте влияет на прогноз БА у взрослых, что несомненно, доказывает важность изучения БА у детей [J. Kokkonen, О. Linna, 1993; М.А. Jenkins, J.L. Hopper, G. Bowes, 1994]. Таким-образом для педиатрической службы вопросы- диагностики, лечения Б А так же актуальны- как и для терапевтического звена здравоохранения. В настоящее время нет четких представлений о механизмах формирования тяжелой БА у детей. Большинство авторов считают, что тяжесть течения заболевания определяется многими факторами (пол, возраст начала БА, отягощенная наследственность, предшествующее лечение, сопутствующие аллергические заболевания), хотя роль некоторых из них оценивается неоднозначно [J. Gerritsen, G.H. Koeter, D.S. Postma, 1989; М.Б. Фрейдин, О.С. Кобякова, JI.M. Огородова, 2000]. Данные литературы свидетельствуют, что тяжесть воспалительной реакции определяется суммарным воздействием множества взаимодействующих между собой факторов: Как известно, межклеточная цитокинопосредованная кооперация при атопическом воспалении может служить примером подобных взаимодействий. Именно дисбаланс между отдельными звеньями этой системы, в числе многих факторов, может приводить к разнообразию клинических проявлений атопии [0.В. Зайцева, А.В. Лаврентьев, Г.А. Самсыгина, 2001]. В настоящее время установлено, что одним из основной причиной тяжелого течения БА является, высокий индекс атопии (сопутствующие аллергические заболевания - атопический дерматит, высокий уровень IgE, ИЛ-4, бронхиальная астма у матери), который во4 многом определяется генетическими факторами [Л.М. Огородова, О.С. Кобякова, В.П. Пузырев, 2000; М.Б. Фрейдин, О.С. Кобякова, Л.М. Огородова, 2000]. Существуют проблемы, связанные с подбором адекватного лечения, так как для достижения контроля«БА детям с тяжелым течением часто назначают высокие дозы стероидных противовоспалительных препаратов, в связи с чем возрастает риск развития побочных эффектов [PJ. Barnes, 1993]. Для оптимизации диагностики, лечения и профилактики БА необходимо понимание механизмов развития реакций гиперчувствительности. Одним из основных медиаторов гиперчувствительности немедленного типа, является гистамин. Этот медиатор синтезируется в тучных клетках из аминокислоты гистидина под действием гистидиндекарбоксилазы. Гистамин депонирован в гранулах тучных клеток и базофилов в виде комплекса с протеогликанами. Концентрация медиатора в клетках достаточно высока и составляет 5 и 1 мг/106 в тучных клетках и базофилах соответственно. Гистамин принимает активное участие в регуляции синтеза IgE. В свою очередь гиперпродукция данного иммуноглобулина лежит в основе реакций гиперчувствительности I типа. Основные эффекты гистамина реализуются через специфические рецепторы (Н-рецепторы). На сегодняшний день известно четыре типа Н-рецепторов: HI-, Н2-, НЗ-, Н4-. Идентичность НЗ- и Н4-рецепторов обсуждается многими исследователями. Одно из наиболее распространенных мнений состоит в том, что существуют общие антагонисты НЗ/4- и поэтому разница между этими рецепторами условна и определяется только локализацией [Н.К. Takahashi, Т. Morichika, Н. Iwagaki, 2003].

Синтез IgE зависит от многих факторов: от концентрации гистамина, чувствительности гистаминовых рецепторов, индивидуальных особенностей самого макроорганизма. Существует прямая зависимость регуляции синтеза IgE от состояния гистаминовых рецепторов НЗ/4- у больных поллинозом [Д.В. Лесик, 2006]. Вместе с тем патогенетические механизмы формирования тяжелой бронхиальной астмы (ТБА) и ее гормонозависимых вариантов, IgE-регуляторная роль гистамина, рецепторов гистамина различного типа при данной патологии в настоящий момент изучены недостаточно.

Цель исследования: изучение роли гистамина, гистаминовых рецепторов в регуляции синтеза IgE при тяжелой гормонозависимой бронхиальной астме у детей. Задачи исследования:

1. Исследовать влияние гистамина на синтез in vitro IgE и IgE-регуляторных цитокинов (интерлейкина 4 и гамма интерферона) при ТГБА у детей 10-16 лет в стадии обострения.

2. Исследовать влияние гистамина на синтез in vitro IgE и IgE-регуляторных цитокинов (интерлейкина 4 и гамма интерферона) при ТГБА у детей 10-16 лет в стадии ремиссии (после 3 месяцев подобранной эффективной базисной терапии).

3. Исследовать роль различных типов гистаминовых рецепторов (HI-, Н2-, НЗ/4-) в регуляции синтеза IgE и основных IgE-регуляторных цитокинов (интерлейкина 4 и гамма интерферона) при ТГБА у детей 10-16 лет в стадии обострения.

4. Исследовать роль различных типов гистаминовых рецепторов (HI-, Н2-, НЗ/4-) в регуляции синтеза^Е и основных IgE-регуляторных цитокинов (интерлейкина 4 и гамма'интерферона) при ТГБА у детей 10-16 лет в, стадии ремиссии (после 3 месяцев подобранной- эффективной базисной терапии).

Научная новизна исследования:

В данной работе впервые:

Проведено, сравнительное исследование влияния гистамина и HI-, Н2-, НЗ/4- блокаторов на синтез in vitro IgE у здоровых детей 10-16 лет и больных ТБА, ТГБА в стадии обострения и по достижении ремиссии (после З'месяцев подобранной эффективной базисной терапии): Проведено сравнительное исследование влияния гистамина и специфической блокады HI-, Н2-, НЗ/4- рецепторов, на секрецию IgE-регуляторных цитокинов (интерлейкина 4 и гамма интерферона) в культурах МПК здоровых детей 10-16 лет и больных ТБА, ТГБА в стадии обострения и по. достижении ремиссии (после 3 месяцев подобранной эффективной' базисной терапии): Теоретическая значимость исследования.

Полученные факты углубляют представления о роли, гистамина, рецепторов гистамина различных типов (HI-, Н2-, НЗ/4-) в регуляции синтеза IgE у здоровых детей и у детей, больных ТГБА и ТБА без гормонозависимости.

Практическая значимость исследования заключается в установлении механизмов регуляции синтеза IgE, опосредованных медиатором нецитокиновой природы (гистамином), у детей, больных ТГБА, ТБА без гормонозависимости, и их отличительные особенности по сравнению со здоровыми лицами позволяют судить о механизмах формирования IgE-зависимых аллергических заболеваний. Полученные данные могут являться основой поиска новых подходов к характеристике эффективности лечения атопических заболеваний, а также основой для более углубленного анализа фармакодинамики уже используемых в терапии данной патологии лекарственных средств (антигистаминных, глюкокортикостероидных препаратов).

Основные положения, выносимые на защиту

1. У детей с ТГБА в стадии обострения выявлено нарушение регуляторного влияния гистамина на баланс IgE-регуляторных цитокинов (ИЛ-4 и ИФНу), заключающееся в изменении синтеза IgE.

2. После лечения у детей с ТГБА в отличие от детей с ТБА без гормонозависимости не происходило восстановления регуляторного влияния гистамина на синтез IgE. Выявлено, что проведенное лечение в подгруппе ТГБА не устраняло нарушения влияния гистамина на баланс IgE-регуляторных цитокинов.

3. У детей с ТГБА в стадии обострения выявлено наличие функциональной неполноценности Н2- и НЗ/4-рецепторов гистамина в отношении регуляторного воздействия на синтез IgE и IgE-регуляторных цитокинов (ИЛ-4 и ИФНу), как и в контрольной группе ТБА (менее выражено).

4. После трёхмесячной терапии функциональная полноценность Н2- и НЗ/4-рецепторов гистамина в контрольной группе ТБА частично восстанавливается, тогда как в группе ТГБА глубокие нарушения функциональной активности рецепторов гистамина даже после достижения стадии медикаментозной ремиссии не устраняются.

ВЫВОДЫ

1. Эффекты гистамина на синтез IgE дозозависимы:

1.1 Гистамин в низкой концентрации у детей с ТГБА в стадии обострения, также как и у детей с ТБА без гормонозависимости и у здоровых детей стимулирует синтез IgE, что менее выражено у здоровых лиц.

1.2 Гистамин в высокой концентрации у детей с ТГБА и ТБА стимулирует синтез IgE, в отличие от здоровых доноров, у ТГБА стимуляция более выражена. Показано также, что нарушение регуляторного влияния гистамина на синтез IgE у детей с ТГБА связано с дисбалансом в секреции ИЛ-4 и ИФНу.

2. Изменение спонтанного уровня синтеза IgE и модуляция синтеза IgE гистамином через 3 месяца после лечения:

2.1 Уровень спонтанного синтеза IgE у детей с ТГБА, ТБА в стадии ремиссии достоверно снижается. У детей с ТГБА он отмечается достоверно ниже, чем у детей с ТБА без гормонозависимости. Вместе с тем у детей с ТБА уровень спонтанного синтеза IgE после лечения не достигает соответствующего уровня здоровых лиц.

2.2 У детей с ТГБА после лечения степень стимулирующего влияния гистамина в низкой и высокой концентрации не изменяется, тогда как у детей с ТБА без гормонозависимости в результате лечения изменяются тенденции влияния гистамина на синтез IgE: в высокой концентрации гистамин супрессирует IgE-синтез (как и у здоровых лиц), а в низкой концентрации еще более усиливает стимуляцию синтеза IgE.

3. У детей с ТБА и ТГБА в стадии обострения в отличие от здоровых, выявлено нарушение супрессирующего влияния гистамина на синтез IgE, опосредованного рецепторами Н2- и НЗ/4- типа, дисбалансом секреции ИЛ-4, ИФНу.

4. Трехмесячная терапия больных ТБА приводит к проявлению супрессирующего влияния гистамина на синтез IgE на фоне блокады Н2-и НЗ/4- рецепторов, что связано с восстановлением секреции ИЛ-4, ИФНу. В то же время, в группе больных с ТГБА нарушение регуляции синтеза IgE, опосредованное Н2- и НЗ/4- рецепторами сохраняется.

5. Уровень синтеза IgE у детей с ТБА с высоким уровнем исходного синтеза IgE в стадии обострения и по достижении клинической ремиссии оказывается достоверно выше, чем у детей с ТБА с низким исходным уровнем синтеза IgE, что сопровождается более выраженным дисбалансом синтеза иммунорегуляторных цитокинов (ИЛ-4 и ИФНу) при воздействии гистамина на Н2- и НЗ/4-рецепторы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Практически во всех странах мира растет заболеваемость бронхиальной астмой (БА) и аллергией. Известно, что более 20% людей на Земном шаре страдает различными аллергическими заболеваниями, опосредованными иммуноглобулином Е, - астмой, риноконъюктивитом, атопическим дерматитом, анафилаксией. Частота встречаемости Б А у детей составляет от 5 до 15%; у более, чем 50% взрослых пациентов и примерно у 80% больных детей астма имеет аллергическую природу. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), БА выявлена у 150 миллионов людей по всему миру. Именно эта патология наносит наибольший экономический ущерб среди трудоспособного населения и служит основной причиной госпитализации детей с хроническими заболеваниями в западных странах [S.G.O. Johansson, Tari Haahtela (Ред.), 2005]. Для России проблема тяжелых обострений стоит наиболее остро, так как, к сожалению, в нашей стране диагноз БА часто впервые ставит врач скорой помощи, который вынужден оказывать неотложную помощь пациенту [Н.П. Княжеская, 2002]. Отмечается также тенденция к более раннему началу заболевания и сейчас БА часто диагностируют у детей первых месяцев жизни [Н.Д. Новикова, П.Д. Новиков, 2003]. По результатам многих исследований тяжесть течения заболевания в детском возрасте влияет на прогноз БА у взрослых, что, несомненно, доказывает важность изучения БА у детей [J. Kokkonen, О. Linna, 1993; М.А. Jenkins, J.L. Hopper, G. Bowes, 1994]. В настоящее время нет четких представлений о механизмах формирования тяжелой БА у детей. Большинство авторов считают, что тяжесть течения заболевания определяется многими факторами (пол, возраст начала БА, отягощенная наследственность, предшествующее лечение, сопутствующие аллергические заболевания), хотя роль некоторых из них оценивается неоднозначно [J. Gerritsen, G.H. Koeter, D.S. Postma, 1989; М.Б. Фрейдин, О.С. Кобякова, Л.М. Огородова, f f

2000]. Данные литературы свидетельствуют, что тяжесть воспалительной реакции определяется суммарным воздействием множества взаимодействующих между собой факторов. Как известно, межклеточная цитокинопосредованная кооперация при атопическом воспалении может служить примером подобных взаимодействий. Именно дисбаланс между отдельными звеньями этой системы, в числе многих факторов, может приводить к разнообразию клинических проявлений атопии [О.В. Зайцева, А.В. Лаврентьев, Г.А. Самсыгина, 2001]. В настоящее время установлено, что одним из основной причиной тяжелого течения БА является высокий индекс атопии (сопутствующие аллергические заболевания - атопический дерматит, высокий уровень IgE, ИЛ-4, бронхиальная астма у матери), который во многом определяется генетическими факторами [Л.М. Огородова, О.С. Кобякова, В.П. Пузырев, 2000; М.Б. Фрейдин, О.С. Кобякова, Л.М. Огородова, 2000]. Для оптимизации диагностики, лечения и профилактики БА необходимо понимание механизмов развития реакций гипер чувствительности. Одним из основных медиаторов гиперчувствительности немедленного типа, является гистамин. Эффекты гистамина реализуются через специфические рецепторы (Н-рецепторы). На сегодняшний день известно четыре типа Н-рецепторов: HI-, Н2-, НЗ-, Н4-. Идентичность НЗ- и Н4- рецепторов обсуждается многими исследователями. Одно из наиболее распространенных мнений состоит в том, что существуют общие антагонисты НЗ/4- и поэтому разница между этими рецепторами условна и определяется только локализацией [Н.К. Takahashi, Т. Morichika, Н. Iwagaki, 2003]. Гистамин принимает активное участие в регуляции синтеза' IgE. Гиперпродукция данного иммуноглобулина лежит в основе реакций гиперчувствительности I типа. Синтез IgE зависит от многих факторов: от концентрации гистамина, чувствительности гистаминовых рецепторов, индивидуальных особенностей самого макроорганизма. Существует прямая зависимость регуляции синтеза IgE от состояния гистаминовых рецепторов НЗ/4- у больных поллинозом [Д.В. Лесин, 2006].

В связи с недостаточной изученностью патогенетических механизмов формирования IgE-зависимых заболеваний, в частности тяжелой бронхиальной астмы (ТБА) и ее гормонозависимых вариантов, IgE-регуляторной роли гистамина, рецепторов гистамина различного типа проведено исследование данных процессов in vitro. Объектом исследования служили 30 больных ТБА, 12 больных ТГБА находившихся на стационарном лечении в Краевой детской клинической больнице г. Краснодара по поводу обострения астмы, а также 12 детей, не страдающих атопическими заболеваниями, возраст детей составил от 10 до 16 лет. Диагноз и степень тяжести при обострении астмы устанавливались согласно международным рекомендациям в соответствии с критериями международного консенсуса GINA (2002, 2006 гг.).

Забор крови производился до начала адекватной терапии, кроме того, все дети были обследованы через 3 месяца на фоне базисной терапии (клиническая ремиссия). Для всех групп критериями исключения служило наличие интеркуррентных заболеваний. Атопическая форма Б А была подтверждена наличием повышенного уровня общего IgE (698,2 + 21 МЕ/мл, наличием диагностического титра специфических IgE к бытовым, грибковым и эпидермальным, пищевым аллергенам (MAST -CLA system, Medland, Голландия), положительными скарификационными пробами со стандартизированными диагностическими аллергенами, данными семейного и личного анамнеза.

В результате применения кластерного анализа уровня синтеза IgE, IgE регуляторных цитокинов МПК группа ТБА разделилась 2 подгруппы, в которых были выявлены различия в ответе МПК на введение гистамина и блокаторов гистаминовых рецепторов.

В 1 подгруппе (ТБА1) исходный уровень синтеза IgE МПК in vitro был достоверно (р<0,01) ниже, чем соответствующий уровень 2-й подгруппы (ТБА2) и составил для 1 и 2 подгруппы соответственно: 7,56 (от 6,13 до 8,56) МЕ/мл и 14,13 (от 12,45 до 14,39) МЕ/мл. Кроме того оказалось, что уровень синтеза сывороточного IgE в подгруппе 1 (18 человек) составил 526,24+ 24,3 МЕ/мл, в подгруппе 2 - 870,16 + 14 МЕ/мл (р<0,01). При ретроспективном анализе данных подгрупп было показано, что в подгруппе 1 дети с ТБА имели более широкий спектр сенсибилизации и наличие более двух сопутствующих аллергических заболеваний (аллергический ринит, аллергический конъюктивит, атопический дерматит, гастроинтестинальная аллергия).

Исследование содержания общего IgE в сыворотках и концентрации IgE в супернатантах проводили иммуноферментным методом с использованием стандартных тест-наборов для определения общего IgE человека (IgE-total, FEIA, «Pharmacia»). Уровень цитокинов в МПК изучался с помощью стандартных тест-систем для иммуноферментного специфического определения уровня человеческого ИЛ-4, ИФН-у («BioSource», США).

Для определения роли гистамина в регуляции синтеза IgE использована модель селективной блокады рецепторов HI-, Н2-, НЗ/4-типа без введения гистамина извне, учитывался предсуществующий уровень гистамина в системе МПК (специфическое связывание, поглощение), а также на фоне с о гистамина в высокой (10") и низкой (10") концентрации (С.А. Котова, О.Б. Белова, Н.М. Бережная, 1995; Н.В. Котова, 2002).

Для блокады HI-рецепторов гистамина был использован селективный Н1-блокатор лоратадин концентрации 10"5М. Для блокады Н2-рецепторов гистамина применялся Н2-блокатор ранитидин в той же концентрации. Для селективной блокады НЗ/4-гистаминовых рецепторов применялся FUB 181 hydrogenmaleate в концентрации 10"5М. Вследствие небольшого объема выборки нормальность распределения признаков не производилась. Анализ различий признаков проводился с помощью непараметрического критерия Вилкоксона [Г.Ф. Лакин, 1994; С. Глянц, 1998].

Подготовку данных для статистической обработки и построение графиков проводили в программе «Excell 2002» (корпорация MS, США). Статистическую обработку проводили в программе «Statistica 6.0» для Windows.

В ходе проведения сравнительной оценки влияния гистамина и блокады гистаминовых рецепторов на синтез IgE у здоровых детей и больных ТГБА и ТБА было выявлено, что в культурах МПК на момент поступления в стационар у детей с тяжелой астмой, как и у здоровых детей гистамин в низких концентрациях вызывал достоверную стимуляцию синтеза IgE. У больных детей выраженность этой стимуляции более высока, чем у здоровых детей.

Вместе с тем после лечения в группе ТГБА кратность стимуляции синтеза IgE относительно соответствующего исходного уровня низкими концентрациями гистамина не изменилась, тогда как подгруппах ТБА1 и ТБА2 возросла с 1,61+0,36 раз до 1,84+0,25 и 1,3+0,06 раз до 1,88+0,53 раз соответственно. Таким образом очевиден эффект повышения чувствительности рецепторов гистамина под влиянием проведенного лечения к низким концентрациям специфического агониста у больных ТБА обеих подгрупп, в отличие от тяжелой гормонозависимой астмы.

В стадии обострения высокая концентрация гистамина у детей, больных ТБА во всех группах стимулировала синтез IgE (ТБА1 в 1,19+0,1 раз; ТБА2 в 1,2+0,04 раз; ТГБА в 1,43+0,11 раз), тогда как у здоровых детей наблюдалась супрессия синтеза IgE. После 3-х месячного лечения в подгруппах ТБА1 и ТБА2 происходило устранение эффекта стимуляции синтеза IgE высокими концентрациями гистамина с достоверной его супрессией (p<0,01), тогда как в культурах МПК больных ТГБА после лечения высокие концентрации гистамина продолжали продукцию IgE (1,41+0,10 раз). Кратность этой стимуляции сопоставима с таковой до лечения. Вероятно это объясняется тем, что в группе ТГБА чувствительность HI-рецепторов (через которые в основном осуществляются стимулирующие IgE синтез эффекты гистамина) сохранялась на относительно постоянном уровне, тогда как полноценного восстановления сенситизации рецепторов Н2- и НЗ/4-типа, ответственных за супрессию IgE синтеза, в данной группе больных детей не происходило.

HI-блокада у здоровых детей не приводила к достоверному изменению синтеза IgE, тогда как во всех изучаемых группах детей с ТБА в данных условиях уровень синтеза IgE достоверно снижался относительно исходного как в стадии обострения, так и после лечения. HI-блокада у здоровых детей отменяла стимулирующее влияние низкой концентрации гистамина на синтез IgE, но не влияла на супрессию синтеза IgE высокой концентрацией гистамина.

В группе ТГБА как до, так и после лечения блокада HI-рецепторов отменяла стимулирующее действие гистамина на IgE-продукцию (р<0,01). Было выявлено, что уровень синтеза IgE в данных условиях достоверно выше, чем при изолированном воздействии Н1-блокатора. Это может свидетельствовать о скрытом стимулирующем эффекте гистамина вводимого извне, возможно в результате конкурентного вытеснения гистамином блокатора.

В подгруппах ТБА1 и ТБА2 как до лечения, так и после, блокада Н1-рецепторов достоверно снижала уровень синтеза IgE относительно исходного (р<0,01). До лечения в подгруппе ТБА1 при блокаде Н1-рецепторов происходила отмена стимулирующего влияния гистамина на синтез IgE. При этом гистамин в данных условиях в обеих концентрациях оказывал достоверное супрессирующее влияние на синтез IgE. В подгруппе ТБА2 в стадии обострения происходила отмена стимулирующего влияния гистамина на синтез IgE при Н1-блокаде. Таким образом, очевидно, что в подгруппе детей ТБА1 регулирующая роль гистамина в ограничении синтеза IgE, опосредована свободными от блокады Н2- и НЗ/4-рецепторами и ближе к понятию нормы, чем в подгруппе ТБА2.

После 3-х месячной терапии в подгруппе ТБА1 блокада Н1-рецепторов гистамина приводила к устранению стимулирующего действия низких концентраций гистамина и усилению супрессирующего влияния высоких концентраций гистамина (р<0,01) на синтез IgE. После лечения блокада HI-рецепторов в подгруппе ТБА2 устраняла стимулирующее влияние низких концентраций гистамина на синтез IgE (р<0,01 по сравнению с уровнем при воздействии данных концентраций гистамина без блокады Н-рецепторов). Супрессирующее влияние высокой концентрации гистамина на синтез IgE сохранялось неизменным. Это свидетельствует о возможном нарушении в данной подгруппе пациентов регулирующей роли Н2- и НЗ/4-рецепторов, что может являться одной из причин более высокой продукции IgE в подгруппе ТБА2 как до, так и после лечения.

При блокаде Н2-рецепторов гистамина МПК здоровых детей достоверного изменения уровня синтеза IgE не происходило. Вместе с тем, при блокаде Н2-рецепторов МПК у здоровых детей происходило устранение супрессирующего влияния высоких концентраций гистамина и сохранение стимулирующего влияния низких концентраций.

В группе ТГБА при Н2-блокаде как до, так и после лечения достоверного изменения синтеза IgE не отмечено. В группе ТГБА в стадии обострения блокада Н2-рецепторов не влияла на стимулирующее влияние гистамина. После лечения в условиях Н2-блокады уровень синтеза IgE при воздействии как низких, так и высоких концентраций гистамина оставался достоверно выше исходного (р<0,01) и отмечался достоверно ниже, чем при воздействии гистамина без блокады Н-рецепторов (р<0,05). В данном случае можно говорить о функциональной неполноценности Н2-рецепторов и отсутствии её восстановления после лечения.

В подгруппе ТБА2 в стадии обострения при блокаде Н2-рецепторов достоверного изменения синтеза IgE МПК не выявлено (р>0,1). Кроме того, блокада Н2-рецепторов МПК данной подгруппы детей не влияла на стимулирующее влияние как низких, так и высоких концентраций гистамина (р>0,05). Однако после 3-х месячного лечения блокада Н2-рецепторов вызывала достоверное увеличение синтеза IgE (р<0,01) относительно соответствующего исходного уровня. Кроме того, Н2-блокатор в данной подгруппе после лечения устранял супрессирующее влияние высоких концентраций гистамина на синтез IgE. Гистамин в данных концентрациях в при Н2-блокаде оказывал стимулирующее влияние на синтез IgE в 1,24+0,31 раза. Это свидетельствует о восстановлении функции Н2-рецепторов в подгруппе ТБА2 после 3-х месячного лечения.

В подгруппе ТБА1 как до, так и после лечения при блокаде Н2-рецепторов было выявлено достоверное повышение уровня синтеза IgE. При добавлении в систему МПК данной подгруппы до лечения как низких, так и высоких концентраций гистамина при Н2-блокаде отмечалась стимуляция синтеза IgE (р<0,01). После лечения при данных условиях низкие концентрации гистамина достоверно повышали уровень синтеза IgE относительно исходного уровня (р<0,01), устранялось супрессирующее влияние на синтез IgE высоких концентраций гистамина (р<0,01), и была выявлена стимуляция синтеза относительно соответствующего исходного уровня (р<0,01). Это говорит о том, что функция Н2-рецепторов сохранна как до, так и после лечения. Восстановление супрессирующих эффектов высоких концентраций гистамина на синтез IgE в данной подгруппе после лечения также может говорить о полноценном восстановлении функции Н2-рецепторов по ограничению синтеза IgE.

У здоровых детей блокада НЗ/4-рецепторов приводила к достоверному (р<0,01) повышению продукции IgE в 1,45+0,16 раз. Блокада НЗ/4-рецепторов у здоровых детей усиливала стимулирующий эффект низких концентраций и устраняла супрессирующее влияние высоких концентраций гистамина (р<0,01). Полученные результаты доказывали то, что у здоровых детей рецепторы гистамина НЗ/4-типа играют более значимую регуляторную роль в ограничении синтеза IgE МПК, чем Н2-рецепторы.

В группе ТГБА при блокаде НЗ/4-рецепторов как до, так и после лечения достоверного изменения синтеза IgE не выявлено. В стадии обострения при добавлении в систему гистамина и блокаде НЗ/4-рецепторов сохранялась тенденция к увеличению синтеза IgE. После лечения при воздействии гистамина в условиях НЗ/4-блокады уровень синтеза IgE оставался достоверно выше исходного (р<0,01) и достоверно ниже, чем при изолированном влиянии гистамина (р<0,05). В данной подгруппе больных детей можно говорить о функциональной неполноценности как Н2-рецепторов, так и о неполноценности НЗ/4-рецепторов и отсутствии её восстановления после проведенного лечения.

Было установлено, что блокада НЗ/4-рецепторов в подгруппе ТБА2, ТГБА до лечения не влияла на синтез IgE. При добавлении гистамина в низкой и высокой концентрации в условиях блокады НЗ/4-рецепторов уровень IgE не имел достоверного отличия от уровня IgE при воздействии соответствующих концентраций гистамина без блокады НЗ/4-рецепторов (р>0,05). После трехмесячной терапии блокада НЗ/4-рецепторов вызывает достоверное (р<0,01) повышение синтеза IgE относительно исходного. Блокада НЗ/4-рецепторов у данного контингента больных после лечения приводила к отмене супрессирующего влияния высоких концентраций гистамина с достоверным повышением уровня синтеза IgE как относительно исходного уровня (р<0,01), так и относительно изолированного влияния НЗ/4-антагониста (р<0,01). В подгруппе ТБА2 после проведенного лечения происходило восстановление функциональной полноценности НЗ/4-рецепторов.

В подгруппе ТБА1 в стадии обострения блокада НЗ/4- приводила к достоверному повышению уровня синтеза IgE относительно исходного уровня (р<0,01), причем степень этого повышения достоверно выше, чем при воздействии Н2-антагониста (р<0,01). Гистамин в высоких концентрациях в условиях блокады НЗ/4-рецепторов повышал уровень синтеза IgE как относительно исходного (р<0,01), так и относительно изолированного воздействия без блокады НЗ/4-рецепторов (р<0,01).

При проведении сравнительной оценки влияния гистамина и блокады рецепторов гистамина Н1-, Н2- и НЗ/4-типа на синтез IgE-регуляторных цитокинов у здоровых детей и больных тяжелой астмой было показано, что у здоровых детей в культурах МПК низкая концентрация гистамина достоверно повышала синтез ИЛ-4 (р<0,05), тогда как высокая супрессировала (р<0,05). В группе ТБА (обеих подгруппах ТБА1 и ТБА2), как и в группе ТГБА гистамин в низкой концентрации стимулировал синтез ИЛ-4, причем значительно более выражено, чем у здоровых лиц в тех же условиях. Гистамин в высоких концентрациях в стадии обострения в отличие от здоровых лиц не снижал синтез ИЛ-4 в подгруппе ТБА1, а в ТБА2 и группе ТГБА стимулировал синтез ИЛ-4, причем у ТБА2 более выражено).

После 3-х месяцев терапии в группе ТГБА гистамин как в низких, так и в высоких концентрациях стимулировал синтез ИЛ-4 относительно соответствующего исходного уровня.

В группе ТБА подгруппах ТБА1 и ТБА2 после 3-х месяцев лечения гистамин в высокой концентрации оказывал супрессирующий синтез ИЛ-4 эффект. Гистамин в низкой концентрации стимулировал синтез ИЛ-4 в группе ТБА, в подгруппе ТБА1 кратность стимуляции относительно исходного уровня выше 1,88±0,13 раз, чем в подгруппе ТБА2 1,35±0,21 раз.

У здоровых детей в культурах МПК гистамин дозозависимо подавлял синтез ИФНу, низкие концентрации менее выражено, чем высокие. В группе детей с ТГБА дозозависимое подавление синтеза ИФНу отмечалось как до, так и после лечения, однако степень подавления синтеза данного цитокина после лечения уменьшалась. В подгруппе ТБА1 до лечения гистамин также дозозависимо подавляла синтез ИФНу, после лечения степень подавления уровня синтеза данного цитокина гистамином уменьшалась, причем наблюдалась потеря дозозависимости данного эффекта. В подгруппе ТБА2 в стадии обострения гистамин как в низкой, так и в высокой концентрациях супрессировал синтез ИФНу в 3 раза относительно исходного уровня, тогда как после трехмесячного лечения степень подавления уровня синтеза данного цитокина гистамином уменьшалась. В подгруппах ТБА1 и ТБА2 после лечения наблюдался эффект инверсии дозозависимого влияния гистамина на синтез ИФНу -низкие концентрации подавляли синтез более выражено, чем высокие.

В культурах МПК здоровых детей HI-блокада устраняла стимулирующее влияние низкой концентрации гистамина на синтез ИЛ-4 и усиливала супрессирующее влияние высокой концентрации гистамина. Блокада Н2-рецепторов МПК здоровых детей не влияла на стимуляцию синтеза ИЛ-4 низкой концентрацией гистамина и не отменяла супрессирующего влияния высокой концентрации гистамина на продукцию данного цитокина. При блокаде НЗ/4- рецепторов гистамина у здоровых детей отмечался достоверный рост синтеза ИЛ-4. Стимулирующее влияние низкой концентрации гистамина на данный цитокин сохранялось, а супресснрующее влияние высокой концентрации гистамина устранялось.

В культурах МПК группы детей с ТГБА как до, так и после лечения блокада рецепторов HI-типа подавляла синтез ИЛ-4 относительно исходного уровня и отменяла стимулирующее влияние гистамина на синтез данного цитокина, не снижая его относительно исходного уровня. Блокада Н2- как и НЗ/4-рецепторов МПК группы ТГБА значимо не изменяла уровень синтеза ИЛ-4 и не влияла на эффекты гистамина в различных концентрациях как до, так и после лечения.

В подгруппе ТБА1 до лечения HI-блокада приводила к супрессии синтеза ИЛ-4. Гистамин в условиях блокады HI-рецепторов устранял эффект стимуляции ИЛ-4, и вызывал более глубокую депрессию синтеза данного цитокина по сравнению с изолированной Hl-блокадой без введения гистамина извне. После 3-х месячной терапии данная тенденция сохранялась.

В подгруппе ТБА1 блокада Н2-рецепторов усиливала стимулирующее действие гистамина. После лечения Н2-блокада не влияла на стимулирующее действие низких концентраций гистамина, но отменяла супрессию синтеза ИЛ-4 высокими концентрациями гистамина.

Блокада НЗ/4-рецепторов в подгруппе ТБА1 в стадии обострения приводила к возрастанию уровня ИЛ-4, а при добавлении гистамина в низких и высоких концентрациях в условиях НЗ/4-блокады происходила выраженная стимуляция синтеза ИЛ-4 (более чем в 2 раза) относительно изолированного воздействия гистамина. После лечения тенденция влияния НЗ/4-блокады на синтез ИЛ-4 сохранялась. Была выявлена отмена супрессирующего влияния высоких концентраций с выраженной стимуляцией более чем в 2 раза относительно исходного уровня.

В подгруппе ТБА2 в стадии обострения HI-блокада приводила к снижению уровня синтеза ИЛ-4 относительно исходного и отменяла стимулирующее влияние гистамина на синтез данного цитокина. После трёхмесячной терапии блокада HI-рецепторов устраняла стимулирующее влияние низких концентраций гистамина, не влияя на супрессирующее синтез ИЛ-4 воздействие высоких концентраций. У подгруппы ТБА2 в стадии обострения были выявлены сходные тенденции с группой ТГБА в стадии обострения: блокада Н2- как и НЗ/4-рецепторов не оказывала влияния на уровень синтеза IgE и не влияла на эффекты гистамина в различных концентрациях.

После трехмесячного лечения и достижения клинического контроля над астмой в подгруппе ТБА2 детей блокада Н2- и НЗ/4-рецепторов приводила к усилению стимуляции синтеза ИЛ-4 низкими концентрациями гистамина и отмене супрессирующего влияния высоких концентраций гистамина на синтез IgE.

У здоровых детей наблюдалась дозозависимая депрессия синтеза ИФНу. У больных тяжелей астмой детей обеих групп (ТБА и ТГБА) супрессия синтеза ИФНу гистамином более выражена, чем у здоровых детей, после проведенного лечения во всех подгруппах степень супрессии ИФНу уменьшалась.

Блокада HI-рецепторов гистамина МПК здоровых детей приводила к отмене супрессии синтеза ИФНу гистамином. Блокада Н2-рецепторов МПК не устраняла супрессирующего влияния низкой концентрации гистамина, но устраняла супрессирующее влияние высоких концентраций. Блокада НЗ/4-рецепторов МПК здоровых детей не только устраняла супрессирующее влияние гистамина на синтез ИФНу, но и вызывала достоверное повышение уровня ИФНу.

В группе детей с ТГБА HI-блокада как до, так и после лечения устраняла супрессирующее влияние гистамина на синтез ИФНу. При Н2- и НЗ/4-блокаде в группе ТГБА супрессия синтеза ИФНу гистамином сохранялась.

В подгруппе детей ТБА2 как до, так и после лечения HI-блокада приводила к отмене супрессии синтеза ИФНу гистамином. Блокада Н2- и НЗ/4-рецепторов до лечения не влияла на супрессирующее ИФНу воздействие гистамина. После 3-х месячной терапии блокада Н2-рецепторов МПК в подгруппе ТБА2 не устраняла супрессирующее влияние низких концентраций гистамина, но устраняла супрессирующее влияние высоких концентраций гистамина. При блокаде НЗ/4-рецепторов МПК подгруппы ТБА2 после лечения супрессия синтеза ИФНу гистамином сохранялась.

В клеточных культурах подгруппы ТБА1 как до, так и после лечения блокада Н1-рецепторов приводила к отмене гистаминобусловленной супрессии синтеза ИФНу. В стадии обострения заболевания у детей подгруппы ТБА1 при блокаде Н2- и НЗ/4-рецепторов супрессирующее влияние гистамина на синтез ИФНу сохранялось. В стадии клинической ремиссии блокада Н2-рецепторов приводила к устранению супрессии ИФНу гистамином, а блокада НЗ/4-рецепторов устраняла супрессирующее влияние высокой концентрации гистамина и не влияла на супрессирующее влияние низкой концентрации.