Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Роль герпесвирусной инфекции в патогенезе атопического дерматита

На правах рукописи

003455950

СКРИПКИНА ПОЛИНА АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В ПАТОГЕНЕЗЕ ЛТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА

14.00.11 - кожные и венерические болезни 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 2008

5 аЕКгада

003455950

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Елена Владиславовна Матушевская

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Елена Викторовна Свирщевская Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Эдуард Алексеевич Баткаев,

Российская медицинская академия последипломного образования

доктор медицинских наук,

профессор Виктор Фадеевич Семенков,

Российский научно-исследовательский институт геронтологии Минздравсоцразвития

РФ

Ведущее научное учреждение: Российский Университет Дружбы Народов.

Зашита диссертации состоится года в 14 часов на

заседании диссертационного совета Д 208.072.10 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан « !% 2оо4

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Хамаганова И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Атопический дерматит (АтД) и в начале XXI века остается актуальной проблемой современной медицины. В последние годы отмечается тенденция к увеличению удельного веса дерматоза в структуре аллергических заболеваний до 50-60%, причем эта цифра неуклонно растет (Бутов Ю.С., 2000; Белоусова Т.А., 2003; Сапунцова С.Г., 2004). Распространенность заболевания достигает 5-20% в детском возрасте, у взрослых - 2-10% (Балаболкин И.И., 2004; Калюжная Л.Д., 2006; Ellis С, Luger Т., 2003). Заболеваемость АтД составляет 7-24/1000 человек в Европе и США, 102,7/100 тысяч населения в России (Хэбиф Т., 2006).

Патогенез АтД до сих пор остается дискуссионным. В настоящее время интерес исследователей в этой области сосредоточен на иммунологических аспектах данного заболевания (Nikol N.H., 2000; Wollenberg А. et al„ 2000; McGirt LY, 2006). Выделено три основных механизма: преимущественно клеточно-опосредованный; преимущественно IgE-опосредованный и связанный с неиммунными механизмами (Antunez С. et al., 2004; Roosje P.J. et al., 2004).

На сегодняшний день доказана первичная роль Т-лимфоцитов в развитии АтД (Spergel JM et all, 1999). Основные звенья патогенеза АтД связывают с генетически детерминированной дисфункцией иммунной системы, прежде всего клеточного иммунитета кожи (Суворова К.Н., 1998), что проявляется аномальной регуляцией цитокинового профиля Т-хелперов на фоне снижения общего числа Т-лимфоцитов (Нестеренко Г.Б. с соав., 1986; Кунгуров Н.В., 1999; Leung D. 1997).

На настоящий момент установлена дихотомия популяции Т-хелперов (CD4+): существует клон Т-хелперов 1-го типа (Txl) и Т-хелперов 2-го типа (Тх2), продуцирующих специфичный для каждого типа клеток спектр цитокинов (Del Prete G., 1998; Romagnani S, 1999).

В многочисленных исследованиях по изучению роли различных цитокинов в патогенезе заболевания показано, что у больных АтД регистрируется продукция как Тх2-ассоциированных цитокинов, так и продуцируемых Txl (Hamid Q et al., 1996; Kondo S et al., 2001; Kaminishi К et al., 2002).

При АтД регистрируется повышение функциональной активности не только Т-, но и B-лимфоцитов, что выражается, в частности, в гиперпродукции IgE (Бережная Н.М., 1997). Патогенная роль повышения уровня общего IgE (выявляют у 50-80% больных

АтД (Матушевская Е.В. Богуш П.Г. и др, 2003; Вулф К. с соавт, 2007; Miraglia del Giudice М., 2006) в развитии дерматоза не вызывает сомнения у большинства авторов. Однако, в настоящее время известно, что этот показатель неспецифичен для данного заболевания, так как обнаруживается у некоторых больных псориазом, Т-клеточной лимфомой, при паразитозах (Суворова К.Н., 1998).

Согласно последним данным, особого внимания в рамках патогенеза АтД заслуживает дефект кожного барьера. Примерно у 10% представителей европейской расы в гене, кодирующем филаггрин, - основной белок, формирующий гранулы в ороговевающих кератиноцитах, - происходит гомозиготная мутация, приводящая к потере экспрессии филаггрина в коже (Irvine AD_et all., 2006; McGrath JA et all., 2007; Stemmler S et all., 2007). Дефект филаггрина, в свою очередь, обуславливает повышение проницаемости кожного барьера для аллергенов при АтД.

Барьерная функция кожи страдает также за счет дисбаланса внеклеточных липидов рогового слоя эпидермиса, что приводит к увеличению потери воды и сухости кожного покрова у больных АтД (Di Nardo A et all., 1998; Choi MJ et all., 2005; De Guzman С et all., 2006; Lee CH et all., 2006). Вследствие пониженного содержания церамидов изменяется проницаемость кожного барьера и снижается бактерицидность эпидермиса, т.к. церамиды и свободные липиды обладают прямым цитотоксическим действием на микроорганизмы, колонизирующие кожу.

Хорошо известно о том, что в этиологии АтД большую роль играют сопутствующие инфекции (бактериальные, грибковые, вирусные). В настоящее время наименее изучена ассоциация АтД с вирусными инфекциями, вызывающими формирование Тх1-ответа. В литературе обсуждаются две противоречащие друг другу гипотезы патогенеза АтД при наличии вирусной инфекции - участие Тх1 (противовирусный тип ответа) и Тх2 (иммортализация Тх2-клеток вирусом).

В предыдущих работах получены данные об ассоциации АтД с инфекциями, вызванными поксвирусами и герпесвирусами (Wollenberg A, et al, 2003; Lubbe J., 2003).

Таким образом, целесообразно продолжить изучение роли вирусной инфекции (ВПГ 1 и 2 типа, ЦМВ, ЭБВ, ГВ 6 и 8 типа) в патогенезе данного заболевания, состояния иммунной системы у больных АтД на основании анализа клеточного и гуморального иммунитета, продукции цитокинов Тх1/Тх2 ряда, синтезируемых лимфоцитами периферической крови (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ФИО а и ИНФ V) и с учетом выявленных изменений разработать соответствующие методы лечения.

В последние годы благодаря широкому спектру действия пристальное внимание многих исследователей привлек препарат панавир. Короткий Н.Г. с соавторами показал высокую эффективность ректальных суппозиториев «Панавир» у детей с атопическим дерматитом, осложненным вторичной, в том числе вирусной, инфекцией (Короткий Н.Г., Шарова Н.М., Сидоренко О.А., 2005 г).

Панавир является растительным препаратом (получен из растения Solatium tuberosum), зарегистрирован (№ 000299/02 от 23.06.2006 г.) и отнесен к фармакологической группе противовирусных и иммуномодулирующих средств. Установлено, что препарат повышает неспецифическую резистентность организма за счет индукции синтеза ИНФ а, обладающего прямым противовирусным действием, и ИНФ у, способствует подавлению синтеза провоспалительных цитокинов и пролиферативной активности некоторых иммунокомпетентных клеток. Также панавир активирует моноцитарно-махрофагальное звено иммунной системы, оказывает антимикробное, антипролиферативное действие.

Учитывая вышесказанное, нам представляется актуальным исследовать эффективность воздействия препарата панавир, который обладает противовирусной активностью в отношении герпесвирусов, иммуномодулирующим и анальгезируюшим свойствами, на клиническое течение АтД.

Цель работы - оптимизация терапии атопического дерматита на основании изучения роли герпесвирусной инфекции и анализа иммунного и цигокинового статуса больных атопическим дерматитом.

Задачи исследования:

1. Оценить уровень антител класса G к герпесвирусам - ВПГ 1 и 2 типа, ЦМВ, ЭБВ, ГВ б и ГВ 8 типов в сыворотке крови больных АтД.

2. Определить влияние панавира на продукцию интерлейкинов (ИЛ) -2, 4, 5, 10, ФНОа и ИНФу лимфоцитами периферической крови больных АтД до и после лечения.

3. Оценить уровень общего сывороточного IgE у больных АтД до и после лечения панавиром.

4. Определить механизмы действия панавира на Т-клетки в условиях in vitro.

5. Изучить клиническую эффективность панавира и разработать метод комплексного лечения больных АтД с использованием этого препарата.

Научная новизна

Проведено клинико-иммунологическое исследование, в рамках которого в комплексной терапии у взрослых пациентов с АтД применен препарат панавир; изучена его терапевтическую эффективность и влияние на различные показатели иммунитета. Выявлена высокая клиническая эффективность, что выразилось в положительной динамике клинических проявлений заболевания, смягчении течения заболевания.

Впервые показана ассоциация АтД с герпесвирусами - ВПГ 1 типа и ЦМВ, но не обнаружено связи с инфекцией, обусловленной ВПГ 2 типа, ЭБВ, ВГ б и 8 типов.

Впервые в России в рамках клинического исследования осуществлен анализ цитокинового статуса больных АтД с помощью нового метода на основе проточной цитометрии (Multiplex assay). Нами также впервые использована поликлональная стимуляция Т-клеток с помощью антител к CD3/CD28-MapKepaM Т-клеток, нанесенных на магнитные бусы, которые обеспечивают полную активацию всех Т-лимфоцитов. Показали, что после терапии панавиром наблюдается достоверное (р<0,05) снижение продукции ФНОа, ИФНуи ИЛ-10.

Впервые показано достоверное (р<0,05) снижение содержания общего сывороточного IgE у больных АтД после лечения панавиром.

Практическая значимость

Проанализирована клиническая эффективность препарата панавир у больных АтД и разработана схема его применения. Определены показания и противопоказания к применению панавира при АтД.

В результате проведенного исследования были получены новые данные о патогенезе АтД.

Внедрение в практику.

Результаты работы внедрены в клиническую практику КВКД № 1 Департамента здравоохранения г. Москвы. Материалы исследования используются в учебном процессе на кафедре дерматовенерологии лечебного факультета ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Обнаружено увеличение частоты выявления антител к герпесвирусам ВПГ 1 типа и ЦМВ у больных АтД по сравнению со здоровыми донорами.

2. Терапия панавиром вызывает достоверное снижение продукции ФНОа, ИФНу и ИЛ-10.

3. У больных АтД повышен уровень общего сывороточного 1;>Е до лечения по сравнению с донорами. Терапия панавиром приводиг к достоверному снижению содержания 1§Е в сыворотке крови пациентов с АтД.

4. Панавир оказывает опосредованное действие на клетки иммунной системы.

5. Выявлена высокая клиническая эффективность панавира при лечении пациентов с АтД при хорошей переносимости препарата и отсутствии побочных эффектов.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

1. Заседаниях кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета РГМУ и совместных научно-практических конференциях кафедры дерматовенерологии лечебного факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и КВКД №1 ДЗ г. Москвы (20062008гг.).

2. 1020-м заседании Московского Научного Общества дерматовенерологов имени А.И. Поспелова (15.11.2007 г.).

3. IV научно-практической конференции, посвященной памяти профессора М.М. Желтакова, «Хронические дерматозы: новые аспекты патогенеза и терапии. Инфекции, передаваемые половым путем» (г. Москва, 7.12.2007 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано б научных работ, из них 3 - в центральной печати.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 107 стр. компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения и выводов; иллюстрирована 12 таблицами, 31 рисунком. Указатель литературы содержит 138 источников (53 отечественных и 85 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Данное клинико-иммунологическое исследование проведено на базе КВКД № 1 ДЗ г. Москвы, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Под нашим наблюдением

находилось 103 пациента с атоплческим дерматитом. Всем больным проводили осмотр, изучение анамнеза, клинико-лабораторные исследования, по показаниям - консультации смежных специалистов.

Панавир и местную индифферентную терапию получали 60 больных, 43 пациентам проводилась общепринятая терапия (антигистаминные препараты, десенсибилизирующие средства, ферментные препараты, топические глюкокортикостероиды).

«Панавир» зарегистрирован (Р N000299/02 от 23.06.2006 г - ампульный раствор; ЛС-001696 от 29.07.08 г. - ректальные суппозитории) как противовирусный и иммуномодулирующий препарат. Активной субстанцией препарата является растительный полисахарид, полученный из побегов Solanum tuberosum, относящийся к классу высокомолекулярных гексозных гликозидов сложного строения: глюкоза (38,5 %), галактоза (14,5 %), рамноза (9 %), манноза (2,5 %), ксилоза (1,5 %), уроновые кислоты (3,5 %). Препарат создан учеными НИИ физико-химической медицины РАМН, выпускается в двух формах: 5 мл 0,004% раствора для внутривенных инъекций, где терапевтическая доза панавира 200 мкг, и в виде ректальных свечей массой 1,2 г каждая, с содержанием основного действующего вещества - 200 мкг. Согласно инструкции по медицинскому применению препарат обладает хорошей переносимостью, серьезные побочные эффекты отсутствуют. Противопоказаниями для назначения является индивидуальная непереносимость компонентов препарата, тяжелая патология почек и селезенки, детский возраст (до 12 лет) и период лактации.

Клиническая характеристика больных атопическим дерматитом

В настоящее исследование включено 103 амбулаторных пациента в возрасте от 16 до 40 лет, страдающих атопическим дерматитом; из них .84 мужчины (81,6%) и 19 женщин (18,4%). Среди мужчин преобладали лица призывного возраста.

У 61% пациентов в анамнезе - указание на младенческую фазу атопического дерматита.

Сезонность в течении заболевания отметили 93 (90,3%) пациента с АтД, обострения заболевания чаще наблюдались в холодное время года.

В структуре сопутствующей патологии у больных АтД преобладали заболевания органов дыхания (53,4%); заболевания, протекающие с аллергическим компонентом (43,7%), в том числе бронхиальная астма 16,5%, поллиноз - 27,2%; болезни органов

пищеварения (52,4%); эндокринные заболевания (7,8%); болезни сердечно-сосудистой системы (6,8%); болезни почек (4,8%).

Среди факторов, провоцирующих очередное обострение, пациенты указали на нарушение гипоаллергенной диеты - 65 человек (63%); стрессовые ситуации - 19 (18,4%) ; контакт с ингаляционными аллергенами - 30 (29,1%); инфекционные заболевания - 12 (11,7%); прием лекарственных средств - 9 (8,7%); воздействие высокой/низкой температуры и влажности воздуха - 37 (35,9%).

Зуд различной интенсивности, как важнейший субъективный признак заболевания, беспокоил 98% пациентов: сильно выраженный зуд (7-10 баллов) отмечали 7%, средней интенсивности (4-6 баллов) - 62%, на слабый зуд жаловались 29%. У 76% больных имелись жалобы на раздражительность, плохое настроение, быструю утомляемость, нарушение сна.

Большинство пациентов, включенных в исследование, состоят на диспансерном учете с диагнозом АтД, неоднократно получали амбулаторное лечение и лечение в условиях стационара в рамках общепринятого (пшосенсибилизирующие, антигистаминные, седативные препараты, ферменты ЖКТ, наружную терапию взбалтываемыми взвесями, аэрозолями, пастами, кремами, мазями, содержащими окись цинка, деготь, нафталан, топическими кортикостероидами). Эффект от назначаемой терапии был положительным, но кратковременным.

Длительность ремиссии 6-8 месяца и 1-3 месяца наблюдалась у большинства больных АтД - в 49% и 42% соответственно. У 9% пациентов заболевание носило торпидный характер без полных клинических ремиссий с кратковременными периодами улучшения 1-2 недели.

Всем пациентам установлен диагноз L.20 по МКБ X пересмотра (атопический дерматит). Кожные проявления дерматоза соответствовали клинике атопического дерматита с типичной морфологией и локализацией высыпаний (лицо,шея,туловище, сгибательные поверхности конечностей). В клинической картине преобладала симметричная эритематозно-папулезная сыпь со склонностью к группировке, с мелко(средне)пластинчатым шелушением; очаги инфильтрации и лихенификации; линейные или точечные экскориации, геморрагические корочки.

Белый разлитой стойкий дермографизм определялся у 44% больных, смешанный -у 59% и розовый - у 15%. Осложненное течение АтД зафиксировано у 64% больных АтД, из них у 54% обнаружен Staphylococcus aureus и 10% - Candida albicans

Ограниченный характер поражения кожного покрова имели большинство пациентов (58,2%), у которых патологический процесс локализовался в основном на лице, в области локтевых, лучезапястных, коленных сгибов. Распространенный процесс в виде множественных очагов поражения, занимающий большую часть лица, туловища и конечностей, характеризовал клиническую картину у 39,8% пациентов, у 1,95% отмечено диффузное поражение кожи, когда патологический процесс распространялся на весь кожный покров.

При оценке степени тяжести заболевания учитывали распространенность и выраженность патологического кожного процесса, частоту и длительность рецидивов, продолжительность ремиссий: с относительно легким течением АтД выявлено 58% больных, со средней тяжестью - 39% и тяжелым течением заболевания - 3%.

Таким образом, под наблюдением находилось 103 пациента с АтД (мужчин -84,женщин - 19), среди мужчин преобладали лица призывного возраста. Раннее начало заболевания зафиксировано у 61% больных. В структуре сопутствующей патологии доминировали заболевания органов дыхания (53,4%); заболевания, протекающие с аллергическим компонентом (43,7%), в том числе бронхиальная астма 16,5%, поллиноз -27,2%; болезни органов пищеварения (52,4%). У большинства больных (58,2%) патологический кожный процесс носил ограниченный характер. Из 103 пациентов 63 имели легкую степень тяжести течения атопического дерматита.

Клинические методы исследования

Критерии отбора пациентов

В исследование включили 103 пациента, страдающих атопическим дерматитом, в возрасте от 16 до 28 лет, наблюдавшихся в консультативно-поликлиническом отделении КВКД №1 ДЗ г. Москвы. К исследованию не допускались беременные и лактирующие женщины; больные с сенсибилизацией к картофелю, с сахарным диабетом в анамнезе либо имеющие нарушенную толерантность к глюкозе; больные с тяжелыми заболеваниями почек и селезенки; пациенты, принимающие кортикостероиды, цитостатики.

Схема приема препарата

В ходе исследования пациенты с АтД были рандомизированы на 2 группы методом случайной выборки.

В I группу вошли 60 больных АтД, которые получали препарат «Панавир» и местную индифферентную терапию. 25 больных (41,7%) получали препарат в инъекционной форме: 5,0 - в/в медленно № 5, с интервалом 48 часов; 35 (58,3%) - в виде ректальных суппозиториев: по 1 свече ежедневно на ночь per rectum, № 10 на курс.

27% пациентов, получавших инъекционную форму препарата, было назначено общепринятое лечение индивидуально в зависимости от тяжести процесса (антигистаминные, десенсибилизирующие, седативные, ферментные препараты, топические ГКС) при развитии обострения заболевания на фоне терапии панавиром.

II группу (группа сравнения) составили 43 пациента с АтД, которым проводилась общепринятая терапия (антигистаминные препараты, десенсибилизирующие средства, ферментные препараты, топические глюкокортикостероиды).

С целью объективизации оценки тяжести заболевания и эффективности терапии мы пользовались международным «золотым» стандартом - индексом SCORAD (Scoring of Atopic Dermatitis), который наиболее полно отражает комплекс объективных и субъективных симптомов АтД. Шкала SCORAD включает б объективных (эритема, отек/папулы, корки/мокнутие, экскориации, лихенификация, сухость кожи) и 2 субъективных (зуд и нарушение сна) критерия. Интенсивность объективных симптомов оценивается по 3-х балльной шкале: 0 - отсутствие, 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 -сильная, а субъективных - по 10-ти балльной. Индекс SCORAD рассчитывается по формуле: SCORAD = А/5+7В/2+С, где А - площадь пораженной кожи (рассчитывается в %, согласно "правилу девяток", где за единицу принята площадь ладонной поверхности кисти, которая соответствует 1% всей поверхности кожи); В - сумма баллов интенсивности проявлений симптомов АтД; С - сумма баллов субъективных симптомов.

Лабораторные методы исследования

Лимфоциты периферической крови (ЛПК) выделяли на градиенте фиколла, отмывали фосфатным буфером (ФБ) и переводили в ФБ с 3% бычьего альбумина (ФБ-А) для анализа фенотипа или в полную питательную среду RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки, 300 мкг/мл L-глютамина, 50 мкг/мл гентамицина, 5х10Е-5 2-меркаптоэтанола для анализа продукции цитокинов. Проточная цитометрия

Анализ фенотипа ЛПК проводили на приборе FACScan. Пятно ЛПК выделяли по прямому и боковому рассеянию. Для анализа фенотипа ЛПК использовали прямо меченые антитела против маркеров лимфоцитов CD3+-PE, CD4+-FITC, CD8+-FITC, CD19+-PE, CD16"-FITC\

CD56+-PE, HLA-DR+-FITC (Сорбент, Москва). ЛПК инкубировали с антителами 1 ч при 4°С.

Анализ цитокинов, продуцируемых ЛПК больных

ЛПК в количестве 1 млн в полной питательной среде вносили в 1 мл в лунки 24-луночного планшета. Для индукции цитокинов клетки стимулировали магнитными бусами, покрытыми антителами к CD3 и CD28, в соотношении 1:2 (клеткшбусы) что обеспечивает полную активацию Т-клеток [18]. Клетки инкубировали 20 часов, супернатанты замораживали при -20°С до использования. Определение цитокинов ИЛ-2, 4, 5, 10, ИФН-у и ФНО-а проводили с помощью набора СВА (BD, USA) методом проточной цитометрии по протоколу производителя. Иммуноферментный анализ

Определение общего IgE проводили по стандартной методике, предложенной производителем (Pharmingen). Вкратце, на 96-луночные плоскодонные планшеты наносили на ночь немеченые антитела против IgE человека в ФБ в концентрации 2 мкг/мл. Планшеты отмывали в 0.05% растворе Tween 20 в ФБ (ТФБ) и блокировали неспецифические места связывания 1% бычьим сывороточным альбумином в ФБ (АФБ) при комнатной температуре. Все дальнейшие инкубации также выполняли в АФБ. Все отмывки проводили в ТФБ. После окончания инкубации планшеты отмывали 2 раза и вносили сыворотки больных в разведении 1:50. Планшеты инкубировали 3 ч, отмывали и вносили биотинилированные антитела к IgE человека, подобранные в пару к первым антителам. После инкубации в течении 1 ч планшеты отмывали и добавляли конъюгат ExtrAvidin-пероксидаза (Sigma Со, USA). Реакцию проявляли ТМВ и оценивали на ридере планшетов Multiscan МСС/340. Данные представлены как оптические плотности. Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием пакета MS Office Excell по t-критерию Стьюдента

Результаты собственных исследований

Среди иммунологических параметров мы определяли влияние на субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови (ЛПК), а также на уровень продукции цитокинов, характерных для Тх1 и Тх2, поскольку, с точки зрения патогенеза АтД, функцией как Txl, так и Тх2 при их попадании в кожу является продукция ими цитокинов.

Анализ фенотипа ЛПК проводили на приборе FACScan методом проточной цитометрии, используя прямо меченые антитела против маркеров лимфоцитов CD3+-PE, CD4+-FITC, CD8+-FITC, CD19+-PE, CD16+-FITC, CD56+-PE, HLA-DR+-FITC («Сорбент», Москва)

Результаты исследований обрабатывали с применением вариационной статистики, оценивали с использованием парного t-тест (критерий Стьюдента) для анализа различий средних показателей в параллельных группах. Для принятия гипотезы применялся уровень достоверности 95% с использованием пакета статистических программ Microsoft Excell

Для оценки эффективности препарата панавир в лечении пациентов с атопическим дерматитом выделяли лимфоциты периферической крови с последующим фенотипированием и анализом продукции цитокинов, исследовали уровень общего сывороточного IgE.

До терапии панавиром все параметры находились в пределах нормы, отмечалась тенденция к увеличению доли В-клеток (CD19+) и повышению соотношения CD4/CD8. После лечения наблюдалось некоторое достоверное снижение общего числа (CD3+) Т-клеток за счет снижения СБ8+-лимфоцитов. Все остальные параметры остались в пределах нормы, причем нормализовалось и содержание В-клеток.

С использованием «multiplex assay» - проточной цитометрии в СВА-модификации -и поликлональной стимуляции ЛПК мы отработали схему анализа продукции.цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ФНОа и ИФНу), характеризующуюся исключительно высокой чувствительностью - уровень продукции всех изучаемых цитокинов удалось оценить во всех образцах (ранее с этой целью применяли метод ПЦР-анализа, с помощью которого выявляли продукцию цитокинов не более чем в 50% образцов). Данный метод впервые использован в рамках клинического исследования для оценки продукции цитокинов, основан на принципах иммуноферментного анализа, где в качестве подложки использованы не планшеты, а бусы, окрашенные флуоресцентным красителем, светящимся в канале FL3 (Рис. 1).

А

ИЛ-2

■ ■ .'•■.ЧзД....'. ИЛ-4

ИЛ-5 ;

ИЛ-10

ФНОа

ИФНу

10° 10' 10z 103 10' FL2

Б

Доноры

АД

й щ

__

■ "• _

ИЛ-2 ИЛ-10 ФНОа ИФН?

ША

ИЛ-5

Рис. 1. Продукция цитокинов ЛПК, определяемая с помощью проточной цитометрии. Репрезентативные точечные изображения бус, используемых для одновременного измерения б цитокинов методом проточной цитометрии (СВА assay, BD, США) в контроле (а) и после инкубации с супернатантом активированных ЛПК (б). Указаны направления сдвига бус при захвате ими цитокинов из супернатантов. В и Г. Сравнение продукции цитокинов (нг/мл) активированными ЛПК, полученных от здоровых лиц (п=6) и больных АД (п=20).

Ранее многие показывали преимущественную активацию Тх2 при АтД. Полученные нами результаты показали, что при использовании поликлональной стимуляции Т-клеток пациентов в стадии обострения заболевания, достоверного различия между больными и здоровыми донорами нет, т.е. у пациентов с АтД не выявлено дефекта

сдвига продукции цитокинов в сторону Тх2. Однако, его отсутствие вовсе не означает отсутствия такого типа ответа в лимфатических узлах, селезенке или коже. Результаты анализа уровня общего сывороточного 1£Е показали его достоверное повышение в сыворотке крови у 71% больных АтД до лечения по сравнению с таковым у здоровых лиц, что. напротив, подтверждает участие Тх2 клеток в патогенезе АтД.

Лечение панавиром пациентов с АтД приводило к достоверному снижению содержания ^Е уже через 1 месяц (Рис. 2), что наблюдается достаточно редко при этом заболевании. При анализе содержания ^Е по группам выявлено, что его достоверное (р<0,05) снижение наблюдается после терапии панавиром. Поскольку панавир напрямую не действует на лимфоциты, то его активность в этом аспекте может быть непрямая. Снижению ^Е может, например, способствовать противозудный эффект панавира.

□ До лечения ■ После лечения

1234 5 6789 10

Рис. 2. Влияние лечения панавиром больных АтД на уровень общего 1§Е в сыворотке крови. Индивидуальные данные по 10 больным. По оси абсцисс приведены данные по оптической плотности поглощения при 450 нм.

Среди выраженных эффектов панавира на иммунные показатели выделяется также достоверное снижение продукции ФНОсс, ИФНу и ИЛ-10. Уровень продукции этих факторов (10-20 нг/мл) в 10 раз превышает продукцию ИЛ-4 и ИЛ-5 (1-2 нг/мл), поэтому его снижение после терапии, несомненно, вносит вклад в разрешение процесса на коже (Рис. 3).

до лечения после лечения

ИЛ-2

Т

1 т

-.л«

ИЛ-10 ФНО-а ИФН-г

5 1 4

5 3

и в 2

1

О

ИЛ-4

ИЛ-5

Рис. 3. Продукшя (нг/мл) цитокинов ЛПК больных АтД до и после лечения панавиром.

На фоне снижения продукции ФНОа, ИФНу и ИЛ-10 и уровня общего сывороточного клинически у пациентов с АтД через 1 месяц от начала терапии панавиром наблюдали разрешение патологического кожного процесса, что выражалось в достоверном снижении индекса БСОКАБ (Рис. 4).

50

40

< 30 а, с

и 20

сл

10 0

до после

Рис. 4. Индекс ЭССЖАВ до и после лечения панавиром.

Одной из основных целей данного исследования является изучение связи АтД с герпесвирусными инфекциями. Мы предположили, что именно герпесвирусная инфекция, как одна из самых распространенных, может усиливать тяжесть течения АтД за счет существования обоих заболеваний в хронической форме. Теоретически, герпесвирусная инфекция может принимать непосредственное участие в патогенезе АтД за счет

активации вирус-специфичных иммунных клеток, мигрирующих затем в кожу. Кроме того, она может оказывать и опосредованное действие на течение АтД за счет переключения иммунного ответа на Txl, поскольку ответ на вирусы всегда опосредуется именно Txl и цитотоксическими CD8 Т-клетками.

Для анализа были выбраны б типов герпесвирусов: вирусы простого герпеса 1 и 2 типов, цитомегало-вирус, вирус Эпштейн-Барр, а также вирусы герпеса б и 8 типов. Анализ инфицированное™ больных и группы сравнения решено было провести по оценке наличия ДНК исследуемых вирусов в сыворотке крови и лимфоцитах больных и доноров методом полимеразной цепной реакции, а также по анализу наличия IgG антител к указанным вирусам. Измерения данных показателей проводили до и после лечения, а также в состоянии ремиссии.

Наличие ДНК герпесвирусов в сыворотке крови и ЛПК больных АтД методом полимеразной цепной реакции выявить не удалось, поэтому основное внимание уделили анализу антител G класса. Присутствие в сыворотке крови циркулирующих IgG к определенным патогенам означает наличие клеток памяти к данным патогенам и свидетельствует о предшествующей инфекции, вызванной ими.

Для анализа использовали ИФА-сиетемы фирмы ЛиТех (Москва). Антитела к ВПГ2 обнаружили только у 1 больного и 2 доноров, а антитела к ВГ8 не выявили ни у кого при удовлетворительном положительном контроле, поставляемом фирмой-производителем. Эти данные, несомненно, являются артефактом, поскольку анализ наличия антител к этим вирусам в целом по миру показывает, что они выявляются у 1245% людей. Мы не считаем, что уровень инфицированное™ населения России данными герпесвирусами значительно отличается от мирового. Так, по данным клинических исследований, антитела к ВПГ2 выявляются у 9-50% населения разных стран (Patnaik Р, 2007), а уровень инфицированности ВГ8 составляет около 20% (Caterino-de-Araujo А, 2007). Далее антитела к ВПГ2 и ВГ 8 типа не определяли.

Среди остальных герпесвирусов самый высокий процент инфицированности (% больных, у которых достоверно выявляются IgG антитела) был вызван ЭБВ и ВГб, в меньшей степени - ВПГ1 и ЦМВ (Рис. 5).

ВПГ1 ВПГ2

ЦМВ

Рис. 5. Наличие антител (в % от общего числа сывороток) к герпесвирусам разных типов в сыворотках крови больных АтД до лечения и в сыворотках здоровых доноров.

По доли больных и доноров, у которых выявляли антитела к ЭБВ и ВГб, различий не было; а доля больных с антителами к ВПГ1 и ЦМВ была на 20% выше по сравнению с группой сравнения. С учетом сказанного мы показали, что среди больных АтД в 1,5 раз чаще встречаются инфекции, вызванные ВПГ1 и ЦМВ. Частота инфицированности ВГ6 и ЭБВ аналогична группе доноров.

Для большей детализации гуморального ответа на вирусы провели сравнение среднего индекса антител в обеих группах по всем изучаемым параметрам (в этом случае не включали в анализ больных, у кого антитела не выявлялись (данные в «серой зоне» или ниже). Показали, что наиболее высокий индекс антител наблюдался для ЭБВ, при этом у больных АтД этот показатель был достоверно (р<0,05) ниже значений, полученных для сывороток сероположительных доноров (Рис. 7). Аналогичная картина наблюдается и для ВПГ1, где индекс для больных АтД был также достоверно ниже значений, полученных для сывороток сероположительных доноров. По индексу антител к ЦМВ и ВГ6 различий между больными АтД и донорами не выявили. Полученные данные показывают, что среди больных АтД значительно выше частота герпетической инфекции, вызванной ВПГ1 и ЦМВ (Рис. 5). Индекс антител к данным вирусам не превышал таковой для группы доноров (Рис. 6).

ЭБВ ЦМВ ВГ б ВПГ 1

Рис. 6. Усредненные значения индексов ^О антител к герпесвирусам разных типов в сыворотках крови больных АтД до лечения и в сыворотках здоровых доноров.

Для выявления связи АтД с герпетическими инфекциями провели подсчет индекса ЗСОЯАО у больных, инфицированных ранее или на настоящий момент 1, 2, 3 или 4 вирусами одновременно. Показали, что имеется тенденция к снижению тяжести АтД при меньшем числе инфекций, однако эта разница не является статистически достоверной (Рис. 7).

60 50 -

О 40 <

§ 30 н Й 20 10 -о

11

2 3

п 1 3 12 13 14

Рис. 7. Ассоциация индекса БСОНАЛ со степенью инфицированности больных АтД герпесвирусами. Инфицированность оценивали по количеству вирусов, к которым выявлялись антитела в сыворотке крови больных: 0 - нет антител ни к одному вирусу; 1 -

есть антитела только к одному вирусу и т.д. В рамке приведено число больных по каждой группе.

В ходе клинико-иммунологического исследования мы рандомизировали пациентов на 2 группы методом случайной выборки: I группа получала панавир, II -общепринятое лечение АтД.

До лечения между I и II группами не наблюдалось статистически значимых различий в степени тяжести АтД, оцениваемой по индексу ЗССЖАО (37,0 ± 14,1 и 34,3 ± 8,9, р > 0,05), после проведенного курса терапии значение индекса ЗССЖАВ достоверно снизилось в I группе, куда входили пациенты, получавшие панавир, р < 0,01 (рис. 8).

34,3

- 28,6

14,7 [~|

ния После лечения

□ Группа I □ Группа II Рис. 8. Динамика индекса ЗССЖАВ по группам в процессе терапии АтД.

При использовании инъекционной формы препарата у 1/3 больных выявлено обострение кожного процесса, чего не отмечалось при применении ректальных свечей. При внутривенных инъекциях чаще регистрировали клиническую ремиссию и значительное улучшение в течении АтД - у 18 (41%) пациентов, при использовании ректальных свечей - у 14 (32%). Интенсивность зуда снижалась со 2-5-й свечи или после 4 инъекции. Следует отметить, что снижение интенсивности зуда предшествовало регрессу высыпаний у пациентов I группы. Уменьшение воспалительных явлений в очагах поражения отмечалось на 14-е сутки от начала терапии. Длительность ремиссии колебалась от 3-4 дней до б мес и более, обострения заболевания после проведенной терапии растительным препаратом протекали менее выражено у 32% больных. В процессе лечения панавиром побочных эффектов выявлено не было, пациенты введение препарата переносили хорошо.

О

< 40

О 30

У 20

2 10

5 о ¡2

До лече

При оценке динамики клинических проявлений АтД в группе сравнения (получавших общепринятое лечение) отмечен менее выраженный терапевтический эффект - на фоне применения панавира наблюдалось более быстрое снижение интенсивности зуда и разрешение патологического кожного процесса.

Клиническая эффективность (клиническое выздоровление + значительное улучшение) в I группе больных (получавших панавир) составила 75%: 45% и 30% соответственно, тогда как в группе сравнения - только 53%: 23% и 30% соответственно.

Таким образом, результаты исследования показали выраженную терапевтическую эффективность, отсутствие побочных эффектов, хорошую переносимость препарата панавир при лечении атопического дерматита различной степени тяжести и форм заболевания.

ВЫВОДЫ

1. У больных АтД показано увеличение частоты выявления AT к герпесвирусам ВПГ 1 типа и ЦМВ по сравнению со здоровыми донорами, частота выявления AT к ВПГ 2 типа, ЭБВ, ВГ 6 и 8 типов не отличалась в среднем от популящш здоровых доноров.

2. Методом Multiplex assay, который позволяет оценить количественно продукцию щггокинов в 100% случаев в супернатантах культур активированных поликлонально ЛПК больных и доноров выявлено, что у больных АтД до лечения достоверно снижена продукция ИЛ-2, а уровень продукции ФНОа, ИФНу и ИЛ-4, 5 и 10 находится в норме. Терапия панавиром приводила к дополнительному достоверному (р<0,05) снижению продукции ФНОа, ИФНу и ИЛ-10.

3. У 72% больных АтД отмечено повышение уровня общего сывороточного IgE до лечения по сравнению с донорами. Терапия панавиром приводила к достоверному (р<0,05) снижению содержания IgE в сыворотке крови пациентов с АтД спустя 3 месяца после лечения.

4. В экспериментах in vitro показано отсутствие митогенного действия панавира, а также влияния препарата на поликлональную пролиферацию ЛПК.

5. Доказана высокая эффективность панавира при лечении больных АтД: клиническая эффективность в группе больных, получавших панавир, составила 75%, что коррелировало с достоверным снижением индекса SCORAD у больных АтД после проведенного курса терапии.

Практические рекомендации.

1. Для определения тактики ведения пациентов с АтД необходимо проведение комплексного иммунологического обследования для определения иммунных показателей, играющих важную роль в реализации Тх1/Тх2 иммунного ответа при данном дерматозе.

2. Среди показателей иммунного статуса, отражающих тяжесть и характер течения заболевания, у больных АтД наиболее достоверен уровень ФНОа, ИФНу, ИЛ-10 и общего сывороточного IgE.

3. Пациентам с легким и среднетяжелым течением АтД (20 < SCORAD < 60), с присоединением вторичной инфекции показано применение противовирусного препарата с иммуномодулирующими свойствами для оптимизации терапии и удлинения сроков ремиссии.

4. Больным атоническим дерматитом рекомендуется терапия панавиром по следующей схеме: в/в вливания 5 мл 0,004% р-ра с интервалом 48 часов № 5 или 10 ректальных суппозиториев (200 мкг) ежедневно на ночь. Свечи предпочтительнее использовать при ярко выраженном зуде.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Скрипкин Ю.К., Дворников A.C., Круглова Л.С., Скрипкина П.А. Современный взгляд на патогенетическую терапию атопического дерматита // Вестник дермат и венеролог., 2006-№4-С. 36-39.

2. Скрипкина П.А., Григорьев B.C., Карпенкова C.B. Определение методом проточной цитофлоуметрии цитокинового статуса больных атопическим дерматитом и дерматомикозом, ассоциированным с аллергодерматозами // Вестник РГМУ Специальный выпуск. Материалы II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, М., 2007. -Ns.2 (55). - С. 311-312.

3. Скрипкина П.А., Григорьев B.C. Опыт применения препарата Панавир у больных атопическим дерматитом //Вестник последипломного медицинского образования, М., 2007,-№2-С. 38-39

4. Скрипкина П.А., Матушевская Е.В., Григорьев B.C., Свирщевская Е.В. Иммуномодулирующий и противовирусный препарат панавир в лечении атопического дерматита //Сборник тезисов научно-практической конференции «Современные

методы диагностики и лечения кожных болезней и инфекций, передаваемых половым путем». Казань, 27-28 марта 2008. - С. 68-69.

5. Скрипкина П.А., Матушевская Е.В., Григорьев B.C., Свирщевская Е.В. Иммуномодулирующая и противовирусная терапия атопического дерматита // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2008. - №2 - С. 30-37.

6. Свирщевская Е.В., Карпенкова C.B., Матушевская Е.В., Лещенко В.М., Скрипкина П.А., Григорьев B.C. Иммунный статус у больных рубромикозом ногтей // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2008. - №2 - С. 43-48.

Заказ № 2б-а/11/2008 Подписано в печать 13.11.2008 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (499) 794-23-19; (495) 778-22-20 •Д ^}: www.cfr.ru; е~таИ:т^)@,cfr.ru

Атопический дерматит (АтД) и в начале XXI века остается актуальной проблемой современной медицины. В последние годы отмечается тенденция к увеличению удельного веса дерматоза в структуре аллергических заболеваний до 50-60%, причем эта цифра все возрастает (Бутов Ю.С., 2000; Белоусова Т.А., 2003; Сапунцова С.Г., 2004). Распространенность заболевания достигает 5-20% в детском возрасте, у взрослых - 2-10% (Балаболкин И.И., 2004; Калюжная Л.Д., 2006; Ellis С, Luger Т., 2003). Заболеваемость АтД составляет 7-24/1000 человек в Европе и США (Хэбиф Т., 2006), 102,7/100 тысяч населения в России.

Патогенез АтД до сих пор остается дискуссионным. В настоящее время интерес исследователей в этой области сосредоточен на иммунологических аспектах данного заболевания (Nikol N.H., 2000; Wollenberg А. et al., 2000; McGirt LY, 2006). Выделено три основных механизма: преимущественно клеточно-опосредованный; преимущественно IgE-опосредованный и связанный с неиммунными механизмами (Antunez С. et al., 2004; Roosje P.J. et al., 2004).

На сегодняшний день доказана первичная роль Т-лимфоцитов в развитии АтД (Spergel JM et all, 1999). Основные звенья патогенеза АтД связывают с генетически детерминированной дисфункцией иммунной системы, прежде всего клеточного иммунитета кожи (Суворова К.Н., 1998), что проявляется аномальной регуляцией цитокинового профиля Т-хелперов на фоне снижения общего числа Т-лимфоцитов (Нестеренко Г.Б. с соав., 1986; Кунгуров Н.В., 1999; Leung D., 1997).

На настоящий момент установлена дихотомия популяции Т-хелперов (CD4+): существует клон Т-хелперов 1-го типа (Txl) и Т-хелперов 2-го типа (Тх2), продуцирующих специфичный для каждого из них спектр цитокинов (Del Prete G., 1998; Romagnani S, 1999).

В многочисленных исследованиях по изучению роли различных цитокинов в патогенезе заболевания показано, что у больных АтД регистрируется продукция как Тх2-ассоциированных цитокинов, так и продуцируемых Txl (Hamid Q et al., 1996; Kondo S et al., 2001; Kaminishi К et al., 2002).

При АтД регистрируется повышение функциональной активности не только Т-, но и В-лимфоцитов, что выражается, в частности, в гиперпродукции IgE (Бережная Н.М., 1997). Патогенная роль повышения уровня общего IgE (выявляют у 50-80% больных АтД (Матушевская Е.В. Богуш П.Г. и др, 2003; Вулф К. с соавт, 2007; Miraglia del Giudice М., 2006) в развитии дерматоза не вызывает сомнения у большинства авторов. Однако, в настоящее время известно, что этот показатель неспецифичен для данного заболевания, так как обнаруживается у некоторых больных псориазом, Т-клеточной лимфомой, при паразитозах (Суворова К.Н., 1998).

Согласно последним данным, особого внимания в рамках патогенеза АтД заслуживает дефект кожного барьера. Примерно у 10% представителей европейской расы в гене, кодирующем филаггрин, - основной белок, формирующий гранулы в ороговевающих кератиноцитах, - происходит гомозиготная мутация, приводящая к потере экспрессии филаггрина в коже (Irvine AD et all., 2006; Stemmler S et all., 2007). Дефект филаггрина, в свою очередь, обуславливает повышение проницаемости кожного барьера для аллергенов при АтД.

Барьерная функция кожи страдает также за счет дисбаланса внеклеточных липидов рогового слоя эпидермиса, что приводит к увеличению потери воды и сухости кожного покрова у больных АтД (Choi MJ et all., 2005; De Guzman С et all., 2006). Вследствие пониженного содержания церамидов изменяется проницаемость кожного барьера и снижается бактерицидность эпидермиса, т.к. церамиды и свободные липиды обладают прямым цитотоксическим действием на микроорганизмы, колонизирующие кожу.

Хорошо известно о том, что в этиологии АтД большую роль играют сопутствующие инфекции (бактериальные, грибковые, вирусные). В настоящее время наименее изучена ассоциация АтД с вирусными инфекциями, вызывающими формирование Тх1-ответа. В литературе обсуждаются две противоречащие друг другу гипотезы патогенеза АтД при наличии вирусной инфекции - участие Тх1 (противовирусный тип ответа) и Тх2 (иммортализация Тх2-клеток вирусом).

Ранее была показана ассоциация АтД с инфекциями, вызванными поксвирусами и герпесвирусами (Wollenberg A, et al, 2003; Lubbe J., 2003).

Таким образом, целесообразно продолжить изучение роли вирусной инфекции (ВПГ 1 и 2 типа, ЦМВ, ЭБВ, ГВ 6 и 8 типа) в патогенезе данного заболевания, состояния иммунной системы у больных АтД на основании анализа клеточного и гуморального иммунитета, продукции цитокинов Тх1/Тх2 ряда, синтезируемых лимфоцитами периферической крови (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ФНО а и ИНФ у), разработать новые методы лечения с учетом выявленных изменений.

Появление нового отечественного препарата «Панавир» позволило нам провести исследование нового метода лечения пациентов с АтД.

Панавир - препарат растительного происхождения (получен из побегов Solanum tuberosum), зарегистрирован (Р N000299/02ot 23.06.2006 г -ампульный раствор; ЛС-001696 от 29.07.2008 г. - ректальные суппозитории) и отнесен к фармакологической группе противовирусных и иммуномодулирующих препаратов. Активной субстанцией панавира является растительный полисахарид, относящийся к классу высокомолекулярных гексозных гликозидов сложного строения: глюкоза (38,5 %), галактоза (14,5 %), рамноза (9 %), манноза (2,5 %), ксилоза (1,5 %), уроновые кислоты (3,5 %). Препарат выпускается в двух формах: 5 мл 0,004% раствора для внутривенных инъекций, где терапевтическая доза панавира 200 мкг, и в виде ректальных свечей массой 1,2 г каждая, с содержанием основного действующего вещества — 200 мкг.

Цель работы: оптимизация терапии атопического дерматита на основании изучения роли герпесвирусной инфекции и анализа иммунного и цитокинового статуса больных атопическим дерматитом.

Для выполнения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Оценить уровень антител класса G к герпесвирусам — ВПГ 1 и 2 типа, ЦМВ, ЭБВ, ГВ 6 и ГВ 8 типов в сыворотке крови больных АтД.

2. Определить влияние панавира на продукцию йнтерлейкинов (ИЛ) -2, 4, 5, 10, ФНОа и ИНФу лимфоцитами периферической крови больных АтД до и после лечения.

3. Оценить уровень общего сывороточного IgE у больных АтД до и после лечения панавиром.

4. Определить механизмы действия панавира на Т-клетки в условиях in vitro.

5. Изучить клиническую эффективность панавира и разработать метод комплексного лечения больных АтД с использованием этого препарата.

Научная новизна

Проведено клинико-иммунологическое исследование, в рамках которого в комплексной терапии у взрослых пациентов с АтД применен препарат панавир; изучена его терапевтическую эффективность и влияние на различные показатели иммунитета. Выявлена высокая клиническая эффективность, что выразилось в положительной динамике клинических проявлений заболевания, смягчении течения заболевания.

Впервые показана ассоциация АтД с герпесвирусами - ВПГ 1 типа и ЦМВ, но не обнаружено связи с инфекцией, обусловленной ВПГ 2 типа, ЭБВ, ГВ 6 и 8 типов.

Впервые в России в рамках клинического исследования осуществлен анализ цитокинового статуса больных АтД' с помощью нового метода на основе проточной цитометрии (Multiplex assay). Нами также впервые использована поликлональыая стимуляция Т-клеток с помощью антител к СВЗ/СБ28-маркерам Т-клеток, нанесенных на магнитные бусы, которые обеспечивают полную активацию всех Т-лимфоцитов. Показали, что после терапии панавиром наблюдается достоверное (р<0,05) снижение продукции ФНОа, ИФНу и ИЛ-10.

Впервые показано достоверное (р<0,05) снижение содержания общего сывороточного у больных АтД после лечения панавиром.

Практическая значимость

Проанализирована клиническая эффективность препарата панавир у больных АтД. Определены показания и противопоказания к применению панавира при АтД.

В результате проведенного исследования были получены новые данные о патогенезе АтД.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях кафедры дерматовенерологии лечебного факультета РГМУ и совместных научно-практических конференциях кафедры дерматовенерологии лечебного факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и КВКД №1 ДЗ г. Москвы (2006-2008гг.); 1020-м заседании Московского Научного Общества дерматовенерологов имени А.И. Поспелова (15.11.2007 г.); IV научно-практической конференции, посвященной памяти профессора М.М. Желтакова, «Хронические дерматозы: новые аспекты патогенеза и терапии. Инфекции, передаваемые половым путем» (г. Москва, 7.12.2007 г.).

Внедрение в практику. Результаты настоящего исследования внедрены в практику кафедры дерматовенерологии лечебного факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и КВКД №1 ДЗ г. Москвы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ: в «Вестнике дерматологии и венерологии», «Вестнике РГМУ», «Российском журнале кожных и венерических болезней», материалах российских научно-практических конференций (РМАПО, апрель 2007; Казань, март 2008).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения и выводов; иллюстрирована 12 таблицами, 31 рисунком. Указатель литературы содержит 138 источников: 53 отечественных и 85 зарубежных.

Выводы:

1. У больных АтД показано увеличение частоты выявления AT к герпесвирусам ВПГ 1 типа и ЦМВ по сравнению со здоровыми донорами, частота выявления AT к ВПГ 2 типа, ЭБВ, ВГ 6 и 8 типов не отличалась от популяции здоровых доноров.

2. Методом Multiplex assay, который позволяет оценить количественно продукцию цитокинов в 100% случаев в супернатантах культур активированных поликлонально ЛПК больных и доноров выявлено, что у больных АтД до лечения достоверно снижена продукция ИЛ-2, а уровень продукции ФНОа, ИФНу и ИЛ-4, 5 и 10 находится в норме. Терапия панавиром приводила к дополнительному достоверному (р<0,05) снижению продукции ФНОа, ИФНу и ИЛ-10.

3. У 72% больных АтД отмечено повышение уровня общего сывороточного IgE до лечения по сравнению с донорами. Терапия панавиром приводила к достоверному (р<0,05) снижению содержания IgE в сыворотке крови пациентов с АтД спустя 3 месяца после лечения.

4. В экспериментах in vitro показано отсутствие митогенного действия панавира, а также влияния препарата на поликлональную пролиферацию ЛПК.

5. Доказана высокая эффективность панавира при лечении больных АтД: клиническая эффективность в группе больных, получавших панавир, составила 75%, что коррелировало с достоверным снижением индекса SCORAD у больных АтД после проведенного курса терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема АтД остается актуальной и в начале XXI века. Согласно Российскому Национальному Согласительному Документу по атопическому дерматиту, на территории Российской Федерации с 2002 г. АтД рассматривается как аллергическое заболевание, возникающее в раннем детском возрасте у лиц с наследственной предрасположенностью к атопическим заболеваниям, обусловленное гиперчувствительностью как к аллергенам, так и к неспецифическим раздражителям. АтД имеет хроническое рецидивирующее течение, возрастные особенности локализации и морфологии очагов воспаления, характеризуется кожным зудом.

Распространенность заболевания варьирует, в среднем составляя 2030% (Скрипкин Ю.К., 1995; Гевондян B.C. с соавт, 2001; Родионов А.Н., 2005). В последние годы отмечается тенденция к увеличению удельного веса АтД в структуре аллергических заболеваний до 50-60% (Бутов Ю.С., 2000; Белоусова Т.А., 2003; Сапунцова С.Г., 2004). У взрослых пациентов атопический дерматит по распространенности, тяжести течения и прогнозу в структуре аллергических заболеваний находится на втором месте после бронхиальной астмы (БА), у детей - занимает лидирующее положение (Репина Т.Ю, Лусс Л.В., 2002).

АтД является этиологически сложным заболеванием, в патогенезе которого играют роль факторы генетической предрасположенности, иммунная система, инфекции, нейрорегуляция. Иммунопатогенез атопического дерматита обусловлен взаимодействием и сочетанием множества факторов, среди которых особого внимания заслуживает неадекватная иммунная реактивность, .проявляющаяся в развитии гиперчувствительности как немедленного, так 'и замедленного типа. Основополагающая роль принадлежит дисфункции Т-клеточного звена иммунитета: снижается общее число СОЗ+-клеток, определяются нарушения продукции цитокинов, клеточно-опосредованных реакций: усилен системный Тх2 ответ, при повреждении кожи отмечена комбинация Тх1/Тх2 ответа (Сидоренко О.А., 2007; Ong PY et all, 2006).

При АтД регистрируется повышение функциональной активности не только Т-, но и В-лимфоцитов, что выражается, в частности, в гиперпродукции IgE (Бережная Н.М., 1997).

При множестве исследований иммунно-генетических механизмов АтД первичности дефекта эпидермального барьера долго не уделяли должного внимания. На сегодняшний день показано, что примерно у 10% представителей европейской расы в гене филаггрина (ключевой протеин, участвующий в терминальной дифференцировке кератиноцитов и формировании кожного барьера) происходит гомозиготная мутация, приводящая к потере экспрессии этого белка в коже (Sandilands A et all., 2007; Vickery BP, 2007). Дефект филаггрина, в свою очередь, обуславливает повышение проницаемости кожного барьера для патогенов. Барьерная функция кожи , при АтД страдает также за счет дисбаланса внеклеточных липидов рогового слоя эпидермиса, что снижает бактерицидность эпидермиса, т.к. церамиды и свободные липиды обладают прямым цитотоксическим действием на микроорганизмы, колонизирующие кожу.

Исходя из вышесказанного, больные АтД более подвержены риску развития инфекционных осложнений различной этиологии (бактериальных, вирусных, грибковых). Наименее изучены в контексте осложненного течения АтД вирусные инфекции. Ранее была показана ассоциация АтД с инфекциями, вызванными поксвирусами и герпесвирусами (Wollenberg A, et al, 2003; Lubbe J., 2003).

Основой для данной работы послужило предположение, что именно наличие герпесвирусной инфекции (ГВИ), как наиболее распространенной в популяции, утяжеляет течение АтД за счет существования обоих заболеваний в хронической форме. Теоретически возможно непосредственное участие ГВИ в патогенезе АтД за счет активации вирус-специфичных иммунных клеток, мигрирующих затем в кожу. Кроме того, герпесвирусная инфекция может оказывать и опосредованное действие на течение АтД за счет переключения иммунного ответа на Txl, поскольку ответ на вирусы всегда опосредуется именно Txl и цитотоксическими CD8 Т-клетками. В литературе обсуждаются две противоречащие друг другу гипотезы патогенеза АтД при наличии вирусной инфекции - участие Txl (противовирусный тип ответа) и Тх2 (иммортализация Тх2-клеток вирусом).

Таким образом, цель нашего исследования - оптимизация терапии атопического дерматита на основании изучения роли герпесвирусной инфекции (ВПГ 1 и 2 типа, ЦМВ, ЭБВ, ГВ 6 и 8 типа) и анализа иммунного и цитокинового статуса больных атопическим дерматитом — является актуальной.

Появление отечественного препарата комбинированного действия «Панавир» позволило нам провести исследование нового метода лечения взрослых пациентов с АтД, поскольку он обладает широким спектром противовирусной активности в отношении герпесвирусов, иммуномодулирующим и анальгезирующим свойствами. Созданный отечественными учеными в НИИ физико-химической медицины РАМН, препарат зарегистрирован Фармакологическим комитетом Минздрава РФ и отнесен к группе иммуномодулирующих и противовирусных средств (Р N000299/02 от 23.06.06 г - ампульный раствор; JIC-001696 от 29.07.08г. -ректальные суппозитории).

Исходя из разнонаправленности действия панавира, его применение при лечении пациентов с осложненным течением АтД оправдано коррекцией имеющихся иммунологических нарушений. Выраженное анальгизирующее действие препарата может снижать уровень зуда, беспокоящего больных АтД (Кукушкин М.Л., Смирнова B.C., 2007). Кроме того, панавир в силу противовирусной активности способен уменьшить вирусную нагрузку на организм, в том числе на иммунную систему, ассоциированную с кожей.

Проведенное в ходе диссертационной работы исследование носило клинико-лабораторный характер: оценивалась терапевтическая эффективность панавира при лечении больных АтД, проводился детальный иммунологический анализ гуморального и клеточного статуса пациентов для выявления герпесвирусной инфекции с помощью лабораторных методов. Для оценки иммунного статуса и наличия инфекции нами использованы такие высокочувствительные методы, как анализ цитокинов с помощью флуоресцентных бус (проточная цитометрия в СВА-модификации «Multiplex assay»); анализ фенотипа субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии, анализ наличия вирусной ДНК методом полимеразной цепной реакции, вирус-специфичный иммуноферментный анализ.

При анализе результатов ИФА в отношении выбранных герпесвирусов (ВПГ 1 и 2 типа, ЦМВ, ЭБВ, ГВ 6 и 8 типа) мы столкнулись с некоторыми проблемами. Так, купленные нами тест-системы для выявления антител к вирусам ВПГ2 и ВГ8 дали практически 100% негативный результат при удовлетворительном положительном контроле, поставляемом фирмой-производителем. Эти данные, несомненно, являются артефактом, поскольку анализ наличия антител к этим вирусам в целом по миру показывает, что они выявляются у 12-45% людей. В целом, мы делаем вывод, что ассоциация АтД выявлена с ВПГ1, ЦМВ: среди больных АтД в 1,5 раз чаще встречаются инфекции, вызванные ВПГ1 и ЦМВ, а частота инфицированности ВГ6 и ЭБВ аналогична группе доноров.

Препарат панавир заявлен как противовирусный препарат с иммуномодулирующими свойствами. Препарат природного происхождения и простого состава, действие которого вызывает выраженный противозудный эффект. Механизм такого противозудного действия панавира не изучен, но, по-видимому, он и является главным в активности панавира. Предпринятая нами попытка оценить действие препарата in vitro на лимфоциты периферической крови не дала желаемого результата. Препарат оказался нетоксичным, немитогенным, не вызывал подавления поликлонально активированной пролиферации Т-клеток, не влиял in vitro на поверхностные маркеры лимфоцитов. Суммируя результаты, следует сказать, что прямого действия на лимфоциты препарат не оказывает. Однако больные отмечали быстрый противозудный эффект, следовательно, у препарата есть активность, действующая через другие механизмы. Мы предположили, что эта активность связана с противовирусным действием панавира. Поэтому после лечения провели повторный анализ IgG и IgM антител к ряду герпесвирусов и показали, что усредненный уровень этих антител держится на одном уровень более 2-3 месяцев. У 20-40% больных с исходно низкими титрами антител наблюдалось снижение их уровня, но были и такие больные, у кого наоборот, уровень антител увеличивался после лечения. Следует отметить, что мы пытались анализировать активный вирус, но анализ методом ПЦР образцов сыворотки и лимфоцитов на наличие вирусной ДНК показал, что вирус находится в латентном состоянии. С другой стороны, анализ IgM антител показывает, что иммунная система где-то встречается с вирусными частицами, и это приводит к формированию гуморального иммунитета. Возможно, что в этом случае препарат не может убить вирус. Суммируя эти данные, следует сделать вывод, что панавир не является препаратом, способным подавлять латентную герпесвирусную инфекцию.

Поскольку в патогенезе АтД наряду с генетическими нарушениями значительную роль играет иммунная система, то для анализа действия панавира были выбраны именно иммунологические параметры. Так, мы определяли влияние на субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови, а также на уровень продукции цитокинов, характерных для Тх1 и Тх2 (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИФНу и ФНОа). Тх2 характеризуются продукцией интерлейкина (ИЛ)-4, ИЛ-5 и ИЛ-10, тогда как характерным цитокином для Тх1 является интерферон у (ИФНу). ФНОа продуцируется в первую очередь такими клетками врожденной системы иммунитета, как макрофаги и нейтрофилы, и, в меньшей степени, лимфоцитами. Поскольку при выделении лимфоцитов из периферической крови на градиенте плотности в полученной суспензии всегда присутствуют 10-15% нейтрофилов и 3-5% макрофагов, то, по-видимому, наблюдаемый ФНОа продуцируется фагоцитами. В норме Тх1 в большей степени выполняют цитотоксическую функцию, элиминируя зараженные вирусами клетки, а Тх2 преимущественно вовлечены во взаимодействие с В-клетками, обеспечивая их оптимальную активацию и продукцию иммунлглобулинов, в том числе IgE. ИЛ-5 вызывает усиленное созревание эозинофилов, которые тоже принимают непосредственное участие в аллергических процессах. ИЛ-10, продуцируемый не только Тх2, но и многими нелимфоидными клетками (например, кератиноцитами кожи), является супрессорным фактором, подавляющим активацию как Txl, так и Тх2.

С точки зрения патогенеза АтД функцией как Txl, так и Тх2 при их попадании в кожу является продукция ими цитокинов. С использованием «multiplex assay» и поликлональной стимуляции мы отработали схему анализа продукции цитокинов, которая позволяет оценить продукцию у 100% больных и доноров.

Ранее многие показывали преимущественную активацию Тх2 при АтД. Общепринято, что Тх2 играют основную роль в патогенезе аллергических заболеваний, в том числе при АтД. Однако все чаще встречаются работы, где регистрируется также активация pi Txl при АтД. Результаты продукции цитокинов Т-клетками после поликлональной стимуляции Т-лимфоцитов показали отсутствие статистической разницы по всем цитокинам между пациентами с АтД до лечения и здоровыми донорами (за исключением ИЛ-2, уровень которого был достоверно ниже у пациентов с АтД). Эти данные подтверждаются результатами недавней работы, опубликованной в Польше, где также не было найдено различия (Machura Е, et all, 2006).

Таким образом, в данной работе у пациентов с АтД не выявлено дефекта сдвига продукции цитокинов в сторону Тх2. Отсутствие сдвига в сторону Тх2 по продукции цитокинов ЛПК больных АтД вовсе не означает отсутствия такого типа ответа в лимфатических узлах, селезенке или коже. При исследовании гуморального иммунитета у 71% больных АтД выявили повышенный уровень общего сывороточного IgE, что, напротив, подтверждает участие Тх2 клеток в патогенезе АтД. Лечение панавиром привело к значительному снижению данного показателя. Поскольку время полужизни иммуноглобулинов в сыворотке крови составляет около 20 дней, то снижение уровня IgE в сыворотке крови у пациентов с АтД после лечения обусловило действие препарата на продукцию IgE В-клетками. Панавир напрямую не действует на лимфоциты, поэтому его активность в этом аспекте может быть объяснена другими механизмами. Снижению IgE может, например, способствовать противозудный эффект панавира.

Действие панавира на иммунные показатели наиболее выражено в отношении продукции ФНОа, ИФНу и ИЛ-10, а также содержания общего IgE в сыворотке крови, которые достоверно снижались после лечения. С учетом того, что уровень продукции этих факторов (10-20 нг/мл) в 10 раз превышает продукцию ИЛ-4 и 5 (1-2 нг/мл), ее снижение после терапии, несомненно, вносит вклад в разрешение процесса на коже. Очевидно, что снижение уровня общего IgE также является положительным результатом лечения. Некоторый парадоксальный стимулирующий эффект препарата в виде свечей на продукцию Тх2 цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-5 наблюдался на границе достоверности, полученной с помощью непараметрических методов.

Через 1 месяц после начала терапии панавиром на фоне имеющихся сдвигов иммунологических параметров клинически у больных АтД наблюдали улучшение, выраженное в снижении суммарного значения ЗССЖАЕ) (до терапии 39±12, после- 11±6 (р<0,01)).

Из 60 больных I группы 25 (41,7%) получали панавир в инъекционной форме, 35 (58,3%) - в виде ректальных суппозиториев.

Снижение интенсивности зуда с 3-5 дня от начала терапии панавиром (со 2-5 свечи или после 2 инъекции) отметили большинство пациентов с АтД,. У 27% пациентов, получавших препарат в виде раствора для в/в вливаний, после 2-3 инъекции выявили повышение интенсивности зуда, что сопровождалось обострением кожного процесса. Однако, при внутривенных инъекциях чаще регистрировали клиническую ремиссию и значительное улучшение в течении АтД — у 18 (41%) пациентов, при использовании ректальных свечей - у 14 (32%). Необходимо отметить, что снижение интенсивности зуда предшествовало регрессу высыпаний. Уменьшение воспалительных явлений в очагах поражения отмечалось на 14-е сутки от начала терапии. Длительность ремиссии колебалась от 3-4 дней до 3 мес, обострения заболевания после проведенной терапии панавиром протекали менее выражено у 32% больных. По сравнению с группой пациентов, получавших традиционное лечение АтД, на фоне применения панавира наблюдалось более быстрое снижение интенсивности зуда и разрешение патологического кожного процесса. Клиническая эффективность панавира при лечении больных АтД составила 74%.

Пациенты хорошо переносили препарат, побочных явлений не выявлено.

Суммируя данные проведенного клинико-иммунологического исследования, выявлена ассоциация АтД с ВПГ1, ЦМВ и, возможно, с ЭБВ. Показано влияние панавира на иммунологические показатели — через 1 месяц от начала терапии выявлено достоверное снижение продукции ФНОа, ИФНу и ИЛ-10, а также содержания общего IgE в сыворотке крови, что коррелировало с разрешением кожного процесса, оцениваемого по индексу SCORAD.

Терапевтическая эффективность панавира при лечении пациентов с АтД оценивается как высокая (74%). Препарат применялся по следующей схеме: в инъекционной форме - 5,0 - в/в медленно № 5, с интервалом 48 часов; в виде ректальных суппозиториев - по 1 свече ежедневно на ночь per rectum, № 10.

Определены противопоказания при его назначении при данном заболевании: беременность и период лактации; сенсибилизация к картофелю, сахарный диабет в анамнезе либо нарушенная толерантность к глюкозе; индивидуальная непереносимость компонентов препарата; тяжелые заболевания почек и селезенки; прием кортикостероидов, цитостатиков.

Таким образом, результаты диссертационного исследования позволяют рекомендовать панавир в инъекционной форме и в виде ректальных свечей в комплексной терапии АтД в качестве эффективного иммуномодулирующего препарата.