Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Роль эпифиза в антистрессорном действии адаптогенных средств

На правах рукописи

СКОРНЯКОВ Антон Александрович

РОЛЬ ЭПИФИЗА В АНТИСТРЕССОРНОМ ДЕЙСТВИИ АДАПТОГЕННЫХ СРЕДСТВ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

6 НОЯ 2014

Москва - 2014

005554269

005554269

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский

университет» Министерства здравоохранения РФ медицинскии

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клинической фармакокинетики ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН

доктор медицинских наук Бейер Эдуард Владимирович

Сейфулла Рошен Джафарович

Доктор биологических наук, руководитель лаборатории эволюции механизмов памяти кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Иноземцев Анатолий Николаевич

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Минздравсоцразвития России

Защита состоится « » 2014 года в

диссертационного совета Д.001.024.01, созданного „а базе ^ГБНУ «НИиГармаГ логии имени В.В. Закусова» по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская д 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», но адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская л 8 и на сайте wvw.academphami.ru '"некая, Д.»

Автореферат разослан« » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последние годы во всём мире наблюдается тенденция к более частому использованию с лечебной целью веществ естественного происхождения (Ansari N., Khodagholi F., 2013; Siegfried NL, Hughes G., 2012) . В первую очередь речь идет о действующих началах самых различных растений (Goonaratna С., 2013). Содержащиеся в них вещества имеют широкий диапазон клинических возможностей, к тому же современные технологии позволяют извлекать и анализировать их с большим успехом, в том числе с привлечением требований доказательной медицины (Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2007). Нельзя игнорировать экономический фактор, поскольку получение биологически активных соединений из доступного и в большинстве случаев дешёвого лекарственного сырья служит хорошей альтернативой искусственно создаваемым медикаментам, производство которых

неуклонно дорожает.

Одной из ключевых особенностей ряда растительных препаратов является способность универсально улучшать адаптационно-приспособительные возможности человека и животных. В связи с этим в 50-е годы минувшего века известным отечественным фармакологом Н В Лазаревым (I960) в обращение было введено понятие «растительные адаптогены». К тому моменту Г. Селье (1936, 1960) уже сформулировал основные положения теории об адаптационным синдроме, а сама проблема адаптации, учитывая её универсальную значимость для деятельности здорового и больного организма, оказалась в фокусе интересов представителей фундаментальной и прикладной медицины. Несколько позже изучение свойств мозговой железы эпифиза позволило обнаружить еще один такого рода натуральный адаптоген - гормон ме-латонин. В настоящее время термин «адаптогены» прочно закрепился в отечественной и зарубежной литературе (Azmathulla S. et а!., 2006; Seely D., Singh R., 2007). Под ними понимают биологически активные вещества, повышающие неспецифическую устойчивость организма к неблагоприятным воздействиям внешней среды (Сейфулла Р.Д. и др., 2010; Сейфулла Р.Д., Кондрашин И.М., 2011). Совершенствуются методы разработки этих препаратов, и расширяются области их применения (Антонов А.К. и др., 2011; Николаева И.Г., 2012; Цымбал М.В. и др., 2012). Между тем анализ современной литературы свидетельствует о том, что механизм их антистрессорного действия изучен неполно, а имеющиеся факты требуют уточнения и систематизации.

В настоящее время эпифиз, как и растительные адаптогены, находится в центре пристального внимания исследователей. Благодаря усилиям специалистов самых различных медицинских дисциплин стало известно, что активные соединения железы обладают широким диапа-

зоном биологической активности, внося вклад в регуляцию ритмических процессов, иммунитета, психической деятельности и работы внутренних органов. Важно, что ограничение функции эпифиза заметно снижает устойчивость человека и животных к любым стрессирующим воздействиям (Арушанян Э.Б., 2012). Подобная универсальная роль эпифиза в адаптационно-приспособительных процессах позволяет предположить его участие в действии адаптогенных средств но эта проблема до сих пор не изучалась. Между тем, подобные исследования позволили бы существенно расширить представления о фармакодина-мике адаптогенных препаратов и, возможно, способствовали оптимизации антистрессорной терапии.

Цель исследования

Изучить роль мозговой железы эпифиза в механизме антистрес-сорного действия препаратов с адаптогенными свойствами.

Задачи исследования

1. Провести сравнительную оценку влияния адаптогенных средств различного происхождения на тревожность и память экспериментальных животных.

2. Изучить влияние препаратов с адаптогенными свойствами на различные по продолжительности ритмические процессы в поведении животных. д

3. Оценить влияние экстракта корней женьшеня, билобила и ме-латонина на психо-эмоциональные, амнезические, дизритмические и морфологические нарушения у стрессированных крыс.

4. Исследовать влияние удаления эпифиза на устойчивость животных к стрессирующим воздействиям.

5. Изучить особенности антистрессорной активности препаратов с адаптогенными свойствами у эпифизэктомированных крыс

6. Оценить влияние адаптогенных средств растительного происхождения на функциональную активность эпифиза (морфометрические и гистохимические показатели состояния пинеалоцитов и уровень ме-латонина в плазме).

Научная новизна исследования

Впервые проведено комплексное изучение влияния естественных адаптогенных препаратов (экстракта корней женьшеня (50 мг/кг) билобила (100 мг/кг) и мелатонина (0,1 мг/кг) на тревожность, память и ритмическую организацию функций у крыс. Обнаружено, что они оказывают противотревожное, антиамнезическое и ритмстабилизирующее

ппеп™П° РЯДУ КрИтеРиев ^внимое с эффектами традиционных препаратов: анксиолитика диазепама (0,1 мг/кг) и ноотропного средства пирацетама (400 мг/кг). Влияние адаптогенных средств „а вариатив! ность сердечного ритма у крыс носит модулирующий характер и

направлено на ослабление крайних отклонений от нормальной организации сердечной деятельности.

Впервые в сравнительном плане изучены антистрессорные возможности естественных адаптогенов. Обнаружено, что отличаясь по своей фармакологической активности, они в целом демонстрируют универсальные антистрессорные свойства. Они заключаются в уменьшении тревожности, амнезических, дизритмических и морфологических нарушений, вызванных стрессом. Мелатонин в сравнении с растительными препаратами демонстрирует наиболее выраженное и сбалансированное действие как у интактных, так и у стрессированных крыс.

В серии экспериментов оценено влияние удаления эпифиза на широкий спектр психо-эмоциональных, поведенческих, ритмологиче-ских и морфологических показателей у интактных и стрессированных крыс. Впервые обнаружено, что у эпифизэктомированных животных все фармакологические эффекты препаратов растительного происхождения в значительной степени нивелируются. Лишь введение мелато-нина восстанавливает стресс-устойчивость крыс почти до исходного уровня.

Впервые обнаружены факты, доказывающие участие эпифиза в действии растительных адаптогенов. Их введение сопровождается усилением функции железы, о чем свидетельствуют гистохимические и морфометрические показатели активности пинеалоцитов, а также рост

уровня мелатонина в плазме.

Научно-практическая значимость исследования

С использованием достаточно обширного количества методических подходов доказана универсальность адаптогенного эффекта естественных препаратов различного происхождения. При этом обнаружены некоторые особенности в спектре фармакологической активности изученных средств, которые следует учитывать в клинической практике. В частности, экстракт корней женьшеня превосходит билобил по противотревожной активности, но уступает по антиамнезическому эффекту.

Показано преимущество мелатонина перед препаратами растительного происхождения, которое заключается в более выраженном и сбалансированном антистрессорном действии. Являясь естественным гормональным хронобиотиком, он способен эффективно ослаблять любые расстройства, вызванные стрессом. В связи с этим можно рекомендовать использование в клинике низких доз мелатонина для коррекции стресс-индуцированных психоэмоциональных, вегетативных и дизритмических нарушений. Обнаружено, что мелатонин заметно усиливает противотревожное действие диазепама и мнемотропный эффект пира-цетама. Эти факты позволяют ставить вопрос о целесообразности использования подобных комбинаций в клинической практике.

Показано, что снижение эпифизарной активности повышает чувствительность к стрессу и во-многом нивелирует адаптогенное действие растительных препаратов. Эти факты можно использовать для экспресс-оценки стресс-устойчивости (по уровню плазменного мелато-нина), а также учитывать при использовании растительных адаптогенов в клинике. Полученные данные существенно расширяют представления о фармакодинамике адаптогенных средств, механизмах их антистрес-сорнои активности, подчеркивают важную роль эпифиза в ее происхождении.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Вещества с адаптогенными свойствами растительного (экстракт корней женьшеня и билобил) и гормонального происхождения (мелатонин) сходным образом снижают тревожность крыс, улучшают память и оказывают стабилизирующее влияние на ритмические процессы Разной длительности. По ряду критериев их действие сопоставимо с эффектами анксиолитика диазепама и ноотропного средства пирацета-

2. Экстракт корней женьшеня, билобил и мелатонин демонстрируют универсальную антистрессорную активность, ограничивая повышение тревожности, ухудшение памяти, дизритмические и морфологические нарушения у крыс. Наиболее выраженное и сбалансированное действие оказывает мелатонин, который к тому же заметно усиливает специфические эффекты диазепама и пирацетама.

3. Удаление мозговой железы эпифиза отчетливо повышает чувствительность экспериментальных животных к стрессу, судя по степени выраженности его анксиогенных, амнезических, дизритмических и морфологических последствий.

_ 4. Эпифиз играет заметную роль в проявлении антистрессорных свойств адаптогенных средств, о чем свидетельствует резкое ослабление их фармакологической активности в случае экстирпации железы Прямым доказательством тому служит усиление функции эпифиза после введения препаратов растительного происхождения (повышение активности пинеалоцитов и уровня мелатонина в плазме крови).

Личный вклад автора Автор работы является основным исполнителем проведенного исследования на всех этапах: анализа данных литературы по теме проведения практической части исследования, анализа полученных результатов, формулирования выводов и рекомендаций. Автор принимал активное участие в подготовке основных публикаций по результатам ра-

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и обсуждены на XVIII и XIX итоговых (межрегиональных) конференциях молодых ученых и студентов (Ставрополь, 2010-2011), X международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009), 5-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), XVIII и XIX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 20112012), IV съезде фармакологов России (Казань, 2012), II Российском съезде по хронобиологии и хрономедицине (Москва, 2012), Всероссийской конференции с международным участием «Физиологические проблемы адаптации» (Ставрополь, 2013), Всероссийской конференции с международным участием «Фармакологическая нейропротекция» (Москва, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 в журналах из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК РФ, 3 статьи в тематических сборниках и 8 тезисов в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 162 страницах и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 33 рисунками. Библиография содержит 178 работ, из них 75 отечественных и 103 зарубежных авторов. и

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ДИЗАИН ИССЛЕДОВАНИЯ Опыты выполнены на 760 белых нелинейных крысах обоего пола. Содержание животных и проведение экспериментов соответствовали правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ № 51000.3-96 и 51000.4-2008) и Приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации № 708н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1986 г).

В открытом поле, представляющем собой круг диаметром I метра с закрепленными у основания лампами (60 Вт) и разделенным на 16 периферических и 8 центральных сегментов, оценивали число пересеченных сегментов, а также вертикальных стоек и умывании. Исследовали поведение животных в приподнятом крестообразном лабиринте, представляющем собой четырехугольную платформу, от которой отхо-

ДЯТ перпендикулярные лучи-дорожки, две из которых открыты (открытые рукава), а две другие имеют затворы (закрытые рукава). Установка располагается на высоте 50 см над уровнем пола. Регистрировали число входов и выходов в открытые и закрытые рукава, время пребывания в них, вертикальные стойки и свешивания.

В качестве экспериментальной установки для оценки условной реакции пассивного избегания (УРГТИ) использовали камеру с электрифицированным решетчатым полом, состоящую из светлого и темного ™пНад светлой частью камеры закреплена лампочка мощностью 100 Вт. Вначале крысу помещали в освещенную камеру спиной к темному отсеку (этап ознакомления). Вскоре животное поворачивалось и находило вход в темный отсек. Процедуру повторяли трижды (этап ооучения). При вступлении в темный отсек при последней попытке ознакомления, подавали удар током (1,5 мА) в течение секунды Через 24 часа крыс вновь помещали в освещенную половину и определяли латентный период входа в темноту (этап воспроизведения).

Принудительное плавание оценивали визуально в течение 18 минут в стеклянном сосуде, заполненном водой (Т - 28°С). Учитывали три разных уровня активности животных в воде: активное (сильные гребко-вые движения и перемещение по периметру резервуара), пассивное (слабые гребки) плавание, а также состояние неподвижности (иммобилизации). Для изучения ритмической структуры локомоции все циклы как активного плавания, так и неподвижности делили на 3 гармоники-короткие (до 6 с), средние (6-18 с), длительные (более 18 с) (Щетинин ь.в. с соавт., 1989). Для оценки кардиоинтервалограммы (КИГ) у предварительно адаптированных к специальному пеналу с контактными электродами для записи ЭКГ животных математическому анализу подвергали сердечный ритм по данным измерения 100 последовательных интервалов (Баевский Р.М., 1979). Суточную динамику подвижности животных оценивали в приборе, состоящем из 18 жилых клеток соединенных с компьютером. По соотношению числа ночных переходов к дневным определяли амплитуду ритма (АР).

Производили количественное определение гликогена и РНК в пинеалоцитах с использованием микроскопа «ЛЮМАН И-2» Показа тели оптической плотности вычисляли на основании фотометрирования 30 клеток. В срезах, окрашенных по Нисслю, оценивали площади ядра и цитоплазмы клеток с расчетом ядерно-цитоплазматического соотношения. Уровень мелатонина в плазме крови определяли методом имму-

ЙяТГтТ аНЗЛтИЗи С ИСГТ°ЛЬ30ВаНИСМ тест-системы МеЫошп-^ (ВиЫтапп Laborator.es АО). Эпифиз удаляли по методике, разработанной в нашей лаборатории (Ованесов К.Б., 1987) Для созда ния стрессовой ситуации животных помещали в резервуар с водой (температура 28°С) на 18 минут однократно или ежедневно в течение 5

суток. В части опытов использовали иммобилизационно-болевой стресс (удары током 90 В, по 2 сек с интервалами 30 сек в течение 5 мин).

На описанных моделях исследовали эффекты препаратов с адап-тогенными свойствами. Использовали средства растительного происхождения - стандартизированный экстракт корней женьшеня (препарат Гербион®Женьшень фирмы K.RKA, Словения, содержащий 21 мг гин-зенозидов в 350 мг экстракта) 50 мг/кг, экстракт Гинкго билоба (препарат «Билобил» той же фирмы, содержащий стандартизированный экстракт EGb 761, включающий 24% флавоноидных гликозидов и 6% тер-пеновых лактонов) 100 мг/кг и эпифизарный гормон мелатонин 0,1 мг/кг (Unipharm). При оценке тревожно-фобического состояния животных эффекты веществ сравнивали с активностью анксиолитика диа-зепама (0,1 мг/кг), а при изучении процессов памяти с действием ноо-тропного средства пирацетама (400 мг/кг). Для оценки острых эффектов вещества вводили за 40 минут до тестирования. Хронически препараты применяли в течение 5 дней. Контролем в каждой серии экспериментов служила группа животных, которым инъецировали физиологический раствор. Результаты, полученные в группе животных с поврежденными структурами мозга, сравнивали с данными ложноопериро-ванных крыс. Статистический анализ и сопоставление вариационных рядов производили при помощи стандартного пакета статистического анализа MS Office и Statistica V.6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Сравнительная оценка психотропного и хронотропного действия веществ с адаптогенными свойствами При исследовании поведения животных в «открытом поле» было обнаружено, что экстракт корней женьшеня статистически значимо увеличивал число пересеченных ими периферических сегментов. Сходное, но менее выраженное действие оказывал билобил. Мелатонин также повышал двигательную активность крыс, и при этом некоторые животные заходили и в центральные сегменты поля, что практически не наблюдалось в других экспериментальных группах. Возрастало также и число вертикальных стоек (таб. 1).

Таблица 1. Влияние препаратов с адаптогенными свойствами на показатели поведения крыс в открытом поле и крестообразном лабиринте

Показатели Группы Открытое поле Крестообразный лабипинт

Периферические сегменты Вертикальные стойки Пребывание в открытых рукавах (с) Свешива-

Интактные 8,0±1,5 3,0±1,2 45,0±7,5 3,5±0,7

Физ. раствор 6,5±2,0 2,75±1,0 35,0±6,0 2,0±0,5

Женьшень 13,4±2,5* 4,2±1,4 72,5±9,5** 5,0±1 0

Билобил 11,3±2,0 3,8±1,2 54,0±6,0 4,5±1,0

Мелатонин 14,8±2,0* 7,0±1,6* 68,5±5,5* 7,0±1,2*

Диазепам 18,5±2,5** 5,2±1,1 ПОДЫ 0,0** 8,5±1,5**

Диазепам+ мелатонин 20,0±3,0** 9,5±2,0** 120,0±15,2** 10,0±1,5**

Примечание: * - статистически значимые отличия (Р<0,05; ** - Р<0 01) при сравнении с контрольной группой (физ. р-р).

Экстракт корней женьшеня и билобил увеличивали время пребывания животных в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта (таб. 1). Мелатонин помимо этого достоверно повышал число вертикальных стоек и свешиваний. Диазепам несколько превосходил адаптогенные средства по силе противотревожного действия однако, наибольший эффект отмечен при комбинированном введении мела-тонина и диазепама. В этом случае высокая горизонтальная активность крыс сочеталась с большим количеством вертикальных стоек и свешиваний (таб. 1).

Таблица 2. Влияние препаратов с адаптогенными свойствами на латентный период перехода при воспроизведении УРПИ и поведение в тесте

экстраполяционного избавления

Метод Групгш\ УРПИ (латентный период перехода) Экстраполяционное избавление

Начало авер-сивных реакций (сек) Число прыжков Период под-ныривания (сек)

Контроль 30,0±5,7 11,0±2,5 7,5±1,5 34,0±6 8

Женьшень Билобил 38,5±6,2 55 5±6 8* 7,5±1,5 11,0±2,0 24,0±5,4

Мелатонин Пирацетам 75,5±5,4** 80 0±6 8** 6,0±1,2* 5,5±1,2 4,2±1,4* 21,5±4,6* 17,2±4,2*

Мелатонин+ пирацетам 100,0±7,2** 5,5±1,0* 7,0±2,2 4,0±1,6* 15,0±3,8** 12,8±4,0**

(?<ад"- Р<0;0,7ТИСТИЧесКИ значимые "PH сравнении с контролем

По данным анализа УРПИ, экстракт корней женьшеня увеличивал латентный период перехода в темный отсек. Более выраженное действие демонстрировал билобил (таб.2). Мелатонин превосходил по своему эффекту растительные препараты. Примерно сходное действие оказывал ноотропный препарат пирацетам. Однако наиболее эффективной оказалась комбинация мелатонина и пирацетама. Сходные результаты получены и при использовании теста экстраполяционного избавления (таб.2).

В ритмической структуре плавания интактных животных доминировали высокочастотные циклы (длительностью до 6 с) независимо от формы активности. Количество же эпизодов средней (6-18 с) и особенно большой (свыше 18 с) продолжительности оказывалось заметно меньше (рис. 1). Экстракт корней женьшеня увеличивал время активного плавания крыс за счет периодов большой длительности (более 18 с), завершавшихся попыткой выбраться из резервуара с водой. Билобил демонстрировал несколько иное действие, заключавшееся в уменьшении числа самых коротких циклов иммобилизации (рис. 1). Близкое по конечному результату, но несколько отличное по качественным показателям действие оказывал мелатонин. Оно сводилось к достоверному ограничению самых коротких циклов как активного плавания, так и неподвижности (рис. 1).

100%

40%

20%

0%

I **

1 2 3 4 5

Рис 1 Соотношение периодов разной длительности в ритмической структуре плавания крыс после введения физ.р-ра (1), женьшеня (2), билобила (3), мелатонина (4) и диазепама (5).

* - статистически значимые различия по сравнению с контролем при Р<0,05 (** -,"и0" □ л □

- циклы менее 6 с;

-6-18 с;

- более 18 с.

Сходное действие оказывал и анксиолитик диазепам. В итоге можно говорить о формировании под влиянием адаптогенных средств более рациональной стратегии плавательного поведения, направленной на избавление от стрессовой ситуации.

Плавательный стресс (помещение крыс в резервуар с водой на 18 минут) заметно угнетал подвижность животных, уменьшая число пере-

сеченных сегментов открытого поля (с 8,0±1,5 до 3,7±0,4; Р<0,05) Экстракт корней женьшеня, судя по полученным данным, ослаблял анксиогенное действие стресса. По сравнению с контрольной группой число пересеченных сегментов (3,5±0,2 и 7,0±0,5; Р<0,05) и вертикальных стоек оказывалось достоверно выше (2,2±0,2 и 4,5±0,4; Р<0,05) Сходное, но менее выраженное действие оказывал биолоб'ил. Мелато-нин также ослаблял повышение тревожности крыс, обусловленное стрессом. Помимо усиления двигательной активности животных (3,2±0,3 и 8,5±0,5 пересеченных сегментов; Р<0,01), гормон достоверно повышал число вертикальных стоек и умываний. Однако наибольшее противотревожное действие оказывала его комбинация с диазепамом В этом случае высокая подвижность крыс (15,0±1,5 пересеченных сегментов) сочеталась с усилением исследовательской активности (7,0±1,0 стоек). Сходные результаты, свидетельствующие об ослаблении анксиогенного влияния стресса адаптогенными препаратами, получены при оценке поведения в крестообразном лабиринте.

Как свидетельствуют полученные нами факты, острый стресс (за 30 минут до воспроизведения УРПИ) резко нарушал память крыс Помещенные в бокс для оценки УРПИ они практически сразу же заходили в темный отсек. В результате латентный период перехода в большинстве случаев оказывался чрезвычайно коротким (9,0±1,2 с). Все изученные адаптогенные средства уменьшали выраженность стрессорной амнезии. Наименьшее действие проявлял экстракт корней женьшеня (латентный период - ] 4,5±2,5 с), а самый выраженный эффект наблюдали после введения мелатонина (35,0±4,0 с). Пирацетам несколько превосходил эпифизарный гормон по силе действия (42,5±4,2 с), но наиболее отчетливый сдвиг отмечался в случае совместного применения мелатонина и традиционного ноотропного препарата (60,0±6,5 с).

Спустя 20 минут после плавательного стресса у животных отмечалось резкое усиление симпатических влияний по сравнению с исходным состоянием. Экстракт корней женьшеня увеличивал значения моды (урежение ритма). В результате индекс напряжения оказывался ниже, чем в контрольной группе (5500±250 и 6600±300, Р<0,05) Билобил также ограничивал усиление симпатических влияний после стресса но не влиял на волновую структуру ритма. При совокупной оценке всех параметров КИГ обнаружилось преимущество эпифизарного гормона перед растительными препаратами. Во-первых, степень ослабления симпатизации была наибольшей, судя по значениям индекса напряжения (4000±180, Р<0,01). Во-вторых, отмечены позитивные изменения на спектрограмме в виде снижения мощности медленных волн и индекса централизации (3,5±0,2 при 6,0±0,5 в контрольной группе, Р<0,01).

Плавательный стресс нарушал нормальную организацию суточного ритма двигательной активности крыс. Резко снижалась ночная подвижность, в ряде случаев

11 40

Рис. 2. Влияние адаптогенных средств на циркадианную подвижность стресси-рованных крыс. Сплошной линией обозначены исходные хронограммы подвижности, пунктирной - после инъекций физ. раствора (I), экстракта корней женьшеня (II), билобила (III), мелатонина (IV). По горизонтальной оси - трехчасовые промежутки времени, по вертикальной - общее число переходов по жилой клетке.

наблюдали расщепление кривой суточной локомоции на ультрадиан-ные составляющие либо инверсию ритмики (рис.2). Вследствие этого падала величина АР ( с 3,4±0,3 у.е. до 1,1+0,15 у.е., Р<0,01). Экстракт корней женьшеня препятствовал угнетающему влиянию стресса на ло-комоцию. Акрофаза ритма приходилась на 21 час, а его амплитуда достоверно повышалась по сравнению с контрольной группой (1,1±0,15 у.е. и 1,6±0,2 у.е. после введения препарата, Р<0,05). Билобил вызывал сопоставимое повышение АР (1,55±0,1 у .е., Р<0,05). Мелатонин превосходил растительные препараты его по своим хронотропным свойствам. Он способствовал формированию контрастного циркадианного ритма (судя по возрастанию АР (до 2,2+0,2 у.е., Р<0,01) и акрофазой в 24 ч.

Хронический стресс вызвал статистически значимую инволюцию тимуса и увеличение массы надпочечников у животных контрольной группы. Выраженность язвенного поражения слизистой желудка была

весьма вариабельной, и в большинстве случаев (80%) отмечались 2-3 язвы общей площадью 6-9 мм2. Экстракт корней женьшеня достоверно снизил степень инволюции тимуса по сравнению с контрольной группой животных. Препарат уменьшал выраженность гипертрофии надпочечников и размеры язв в желудке, но эти сдвиги наблюдались на уровне тенденции. Сходное антистрессорное действие оказывал било-бил. Однако в этом случае статистически значимым оказалось защитное действие на слизистую оболочку желудка. мм2

Рис. 3. Влияние веществ с адаптогенными свойствами на размеры язвенных поражений желудка стрессированных крыс

Столбиками обозначена площадь (мм2) язвенных дефектов у животных, получавших физ. раствор (1), экстракт корней женьшеня (2), билобил (3) и мелатонин (4). *, ** - достоверные отличия при сравнении с контролем (Р<0,05; Р<0,01). Стрелками (А) указана локализация язв у одной из крыс.

Более универсальное стресс-протективное действие демонстрировал мелатонин. Гормон достоверно по сравнению с контролем ограничивал инволюционные изменения в тимусе и гипертрофию надпочечников. Мелатонин также уменьшал повреждающее действие стресса на слизистую желудка (рис. 3).

Обобщая изложенные результаты, можно констатировать, что адаптогенные препараты, принадлежащие к разным фармакологическим группам, обладают сходными свойствами. Они снижают тревожность и улучшают память животных, а также увеличивают число длительных периодов в ритмической структуре плавания и повышают контрастность суточного ритма двигательной активности животных, демонстрируя тем самым хронотропное действие. Однако наиболее заметно адаптогенные свойства препаратов проявляются в условиях стресса. Все изученные вещества ослабляют его анксиогенные и амне-зические последствия, а также дезорганизующее влияние на ритм суточной локомоции. Неодинаково действуя на показатели КИГ интакт-ных крыс, все вещества уменьшают выраженность стресс-

индуцированной симпатикотонии, а также снижают степень морфологических изменений.

2. Роль эпифиза в формировании реакции на стресс

Удаление эпифиза привело к повышению тревожности и ухудшению памяти крыс. Этому сопутствовали учащение колебательного процесса во временной динамике плавания и усиление симпатических влияний на сердце. Наиболее отчетливо эти изменения проявляли себя в условиях стресса. Эпифизэктомированные крысы демонстрировали крайне низкую двигательную и исследовательскую активности в открытом поле. Из центра крестообразного лабиринта они быстро перемещались в один из закрытых рукавов и там находились все оставшееся время. Острый стресс заметно нарушал память экспериментальных животных, судя по достоверному уменьшению латентного периода перехода в темный отсек бокса. Поскольку его значения у ложноопериро-ванных крыс существенно не отличались от данных интактных особей (12,5±1,5 с и 11,7±2,3 с соответственно), можно заключить, что процедура ложной операции не отразилась на состоянии памяти крыс после стресса. Почти все эпифизэктомированные животные сразу же перемешались в темный отсек бокса, не опасаясь электроболевого наказания. В результате латентный период перехода у них сокращался по сравнению с ложнооперированными животными (6,0±1,0 с; Р<0,05).

Согласно полученным данным, у эпифизэктомированных крыс гораздо сильнее, чем у ложнооперированных, после стресса деформировался рисунок циркадианного ритма. В целом по группе можно констатировать его полное отсутствие, о чем свидетельствовала низкая величина АР (1,0±0,2 у.е.), причем в 60% случаев ритм оказался инвертированным. Точно также, судя по данным КИГ, у эпифизэктомированных животных симпатизация после стресса была выражена более резко.

Таблица 3. Влияние эпифизэктомии на выраженность морфологических

изменений, обусловленных стрессом

"~\Параметры Группы Вес тимуса (мг/) Вес надпочечников (мг) Язвенные поражения желудка (мм2)

Интактные 240,0±10,8 25,0±3,0 -

Интактные+стресс 162,5±8,5 38,5±5,4 9,0±1,0

Ложноопериро-роваииые +стресс 158,8±7,6 36,0±4,2 9,7±1,5

Эпифиз-эктоми-рованные + стресс 130,0±8,5' 50,0±5,0* 12,0±2,3

Примечание: * - статистически значимые отличия (Р<0,05) при сравнении с ложнооперированными крысами.

У крыс, перенесших ложную операцию, все морфологические маркеры стресса мало отличались от данных интактных особей (таб. 3). Между тем после удаления эпифиза степень этих изменений была го-

раздо выше. У этих животных отмечены более низкие значения веса тимуса и выраженная гипертрофия надпочечников.

Таким образом, на основании полученных результатов, можно сделать весьма обоснованное заключение о том, что удаление эпифиза повышает чувствительность животных к стрессу. У этих крыс в гораздо большей степени, чем у ложнооперированных, проявляются все нарушения, обусловленные стрессом: повышение тревожности, ухудшение памяти, дизритмия и морфологические сдвиги.

3. Значение эпифиза для проявления фармакологической активности адаптогеииых средств В экспериментах на интактных животных было обнаружено, что удаление эпифиза существенно снижает фармакологическую активность адаптогенных препаратов. В частности, резко ослабевает их влияние на поведение животных в открытом поле и крестообразном лабиринте, а также на способность улучшать память при выработке УРПИ (таб. 4). При этом после экстирпации железы не проявлялось характерное для адаптогенных средств синхронизующее действие, направленное на повышение контрастности суточного ритма подвижности и его амплитуды (таб. 4).

Таблица 4. Влияние препаратов с адаптогенными свойствами на показатели поведения крыс в открытом поле, крестообразном лабиринте, латентный период перехода при воспроизведении УРПИ и амплитуду суточного ритма

Показ ател и (количество) Группы Открытое поле Крестообразный лабиринт УРПИ Амплитуда суточного ритма

Периферические сегменты Вертикальные стойки Пребывание в открытых рукавах (сек.) Свеши-вания Латентный период (сек.)

Ложиооперированные крысы

физ.р-р 7,5±1,5 2,0±0,8 40,5±4,8 5,5±0,7 38,0±5,0 3,0±0,5

женьшень 13,0±1,2* 4,0±1,2 85,0±6,0** 6,0±1,0 45,0±4,5 4,3±0,2 *

билобил 10,5±1,5 3,5±1,0 50,0±5,2 6,0±1,2 55,0±5,5* 3,3±0,4

мелато-нин 15,0±2,0»* 6,0±1,0*» 75,5±9,5** 8,5±1,2* * 60,0±4,0* # 5,1 ±0,2 *

Эпифизэктомироваиные крысы

физ.р-р 4,5±1,0 1,0±0,4 20,0±4,0 2,0±0,2 20,0±5,5 !,9±0,4

женьшень 6,5±0,7 1,8±0,2 30,0±7,5 3,0±1,0 25,0±5,5 2,0±0,6

билобил 6,0±1,0 1,5±0,2 27,0±5,0 3,0±0,8 30,0±6,0 2,1±0,2

мелатонии 8,5±1,5** 2,5±0,2* 32,0±8,5 3,5±1,2 45,0±4,0* 3,4±0,6

* - статистически значимые отличия при сравнении с группой крыс, полу-

чавшей физиологический раствор (* - Р<0,05; ** - Р<0,01).

Однако наиболее отчетливо важная роль эпифиза для реализации фармакологических эффектов адаптогенных средств показана у стрес-сированных крыс. При анализе временной динамики плавательного поведения показано, что экстракт корней женьшеня увеличивал время активности (с 28,5±3,5% до 35,0±4,0%), но за счет преимущественно коротких эпизодов (75,5±5,0%). При этом животные беспорядочно перемешались по периметру резервуара и не предпринимали попыток выбраться из него. Билобил не вызывал каких-либо заметных изменений плавательного поведения. Несколько изменялся и профиль фармакологической активности мелатонина. Гормон уменьшал количество коротких эпизодов неподвижности (с 80,0±7,0% до 65,5±6,5%, Р<0,05), но при этом не влиял на ритмическую структуру активного плавания.

Само по себе удаление железы провоцировало заметное усиление тревожности крыс в тесте «открытого поля», судя по резкому падению числа пересеченных сегментов и вертикальных стоек. В этих условиях экстракт корней женьшеня и билобил недостоверно увеличивали число пересеченных сегментов, не влияя на количество вертикальных стоек. Мелатонин повышал двигательную и исследовательскую активности крыс, но статистически значимым было лишь возрастание числа пересеченных сегментов поля (с 2,5±0,5 до 5,5±1,2; Р<0,05).

После введения экстракта корней женьшеня латентный период перехода в затемненный бокс при оценке УРПИ несколько увеличивался (с 22,0±5,0 с до 27,0±4,5 с), что, вероятно, не было связано с улучшением памяти на электроболевое раздражения, а обусловлено их попытками выбраться из бокса. Крысы совершали хаотичные движения и бились о потолок и стенки бокса. Билобил также мало влиял на длительность латентного периода перехода (29,0±4,0 с). Мелатонин единственный из использованных препаратов увеличивал время пребывания животных в светлом отделе бокса (22,5±5,0 с в контрольной группе и 32,0±6,0 с после введения гормона), но этот сдвиг не носил достоверного характера.

Результаты, свидетельствующие о резком снижении способности изученных препаратов ослаблять стрессорную дизритмию у эпифизэк-томированных крыс, получены при анализе суточной динамики двигательной активности. Обнаружено, что экстракт корней женьшеня повышал подвижность животных сразу после их помещения в клетку. Второй всплеск активности приходился на утренние часы (сразу после включения света). В результате прироста и ночной, и дневной подвижности значения АР мало отличались от результатов контрольной группы (0,95±0,15 у.е. и 1,05±0,1 у.е.), к тому же положение акрофазы ритма было крайне нестабильным. После введения билобила акрофаза ритма также была выражена слабо, а значения АР практически не отличались от данных контрольной группы (1,0±0,2 у.е.). Мелатонин частично вое-

станавливал ночную активность эпифизэктомированных крыс, угнетенную стрессом. Однако, судя по величине АР (1,6±0,2 у.е., Р<0,05), синхронизирующее действие гормона было выражено слабее, чем в группе ложнооперированных животных.

При использовании у ложнооперированных крыс адаптогенные препараты ограничивали инволюционные изменения в тимусе, язвооб-разование в желудке и степень гипертрофии надпочечников, обусловленные стрессом. Иные результаты получены при введении адаптоген-ных средств стрессированным животным с удаленной железой. Экстракт корней женьшеня ограничивал степень инволюции тимуса (135,0±9,2 мг и 145,0±8,5 мг), но этот сдвиг не выходил за рамки тенденции. Также не были обнаружены заметные изменения при сравнении с контрольной группой после введения билобила. Предпочтительнее в данной ситуации выглядел мелатонин. Он уменьшал повреждающее влияние стресса, однако, статистически значимым оказалось лишь снижение площади язвенных дефектов в желудке (с 12,5±2,5 мм2 до 6,2±1,5 мм2; Р<0,05).

Контрольные инъекции физиологического раствора интактным крысам вызывали некоторое уменьшение содержания гликогена в пинеалоцитах, однако, этот сдвиг не выходил за рамки недостоверной тенденции. Введение экстракта корней женьшеня также приводило к истощению запасов гликогена в клеточных элементах эпифиза. Сходные, но еще менее выраженные сдвиги вызывал билобил. После плавательного стресса происходило отчетливое снижение содержания гликогена в пинеалоцитах (с 0,48±0,3 мВ до 0,35±0,2 мВ; Р<0,01). Одновременно наблюдалось повышение уровня РНК и увеличение ядерно-цитоплазмэтического соотношения (с 0,12±0,1 до 0,23±0,15; Р<0,01). Экстракт корней женьшеня, судя по полученным данным, потенцировал усиление функциональной активности пинеалоцитов при стрессе. В первую очередь это проявлялось в еще большем расходовании гликогена, отчего цитоплазма при соответствующей окраске казалась почти прозрачной. Выше, чем в контрольной группе оказывались также уровень РНК и ядерно-цитоплазматическое соотношения. Сходные изменения в клеточных элементах эпифиза наблюдались и после введения билобила. Однако в этом случае достоверно возрастало лишь ядерно-цитоплазматическое соотношение (с 0,23±0,15 до 0,3±0,1).

Содержание мелатонина в плазме крыс, судя по литературным данным, может обнаруживать весьма существенные колебания, причем, как индивидуальные, так и циркадианные .1. е1 а1., 2006). Введе-

ние экстракта корней женьшеня и билобила интактным крысам несколько повышало уровень плазменного мелатонина. Однако этот сдвиг не носил статистически значимого характера при сравнении

А Б

Рис. 5. Влияние растительных адаптогенов на содержание мелатонина в плазме ин-тактных (А) и стрессированных (Б) крыс

По вертикальной оси - уровень мелатонина (пг/мл). 1- исходные данные, 2 - введение физ. раствора, 3 - экстракта корней женьшеня. 4 - билобила. * - статистически значимые отличия при сравнении с контролем (2). + - сопоставление результатов до и после стресса.

контрольной группой животных, получавшей физиологический раствор Это предположение подтвердилось позже в опытах со стрессирован-ными особями. Как оказалось 5-дневный иммобилизационно-болевой стресс приводит к существенному повышению содержания мелатонина в плазме. При этом контрольное введение физиологического раствора заметно не сказывалось на степени прироста уровня гормона. Скорее всего это обусловлено тем, что стрессирующее воздействие инъекций в данном случае «поглощалось» гораздо более мощным электроболевым раздражением. Но самые важные факты обнаружены при введении стрессированным крысам экстракта корней женьшеня и билобила. Оказалось, что оба этих препарата статистически значимо повышают содержание мелатонина в плазме (рис. 5).

Таким образом, согласно полученным данным, растительные адаптогены способствуют более интенсивному увеличению уровня мелатонина в плазме крыс в условиях стресса.

ВЫВОДЫ

1. Адаптогенные препараты растительного (экстракт корней женьшеня (100 мг/кг), билобил (50 мг/кг) и естественного происхождения (мелатонин 0.1 мг/кг) на экспериментальных моделях, традиционно используемых для оценки психо-эмоционального состояния и когнитивных функций, сходным

образом ограничивают тревожность и улучшают память экспериментальных животных. При этом эпифизарный гормон мелатонин заметно потенцирует специфические эффекты эталонного анксиолитика диазепама (0,1 мг/кг) и ноотропного средства пирацетама (200 мг/кг).

2. Экстракт корней женьшеня, билобил и мелатонин демонстрируют отчетливую хронотропную активность, вызывая сходную перестройку ритмических процессов в виде повышения амплитуды суточного ритма подвижности и увеличения длиннопериодных эпизодов в структуре плавания. Неодинаково влияя на вариативность сердечного ритма у отдельных крыс, они в целом способствуют нормализации параметров кардиоинтервалограммы в случае чрезмерного повышения симпатической или вагусной активности.

3. Растительные препараты (экстракт корней женьшеня и билобил) и эпифизарный гормон мелатонин оказывают выраженное антистрессорное действие, ослабляя эмоциональные, когнитивные, хронобиологические и морфологические нарушения (степень гипертрофии надпочечников, инволюции тимуса и размеры язв в желудке). При этом естественный хронобио-тик мелатонин по выраженности и сбалансированности антистрессорных свойств превосходит экстракт корней женьшеня и билобил.

4. Эпифизарный дефицит резко повышает чувствительность животных к стрессирующему воздействию и снижает их адаптивные возможности. У эпифизэктомированных крыс гораздо сильнее проявляются все стресс-индуцированные сдвиги: повышение тревожности, ухудшение памяти, диз-ритмия и морфологические изменения.

5. После удаления эпифиза антистрессорное действие экстракта корней женьшеня и билобила практически нивелируется. В этих условиях лишь введение мелатонина восстанавливает стресс-устойчивость экспериментальных животных.

6. Экстракт корней женьшеня и билобил оказывают прямое стимулирующее влияние на функцию эпифиза, особенно выраженное в условиях стресса. Об этом свидетельствуют данные гистохимических определений (повышенное расходование гликогена и усиление синтеза РНК в пинеало-цитах), морфометрические данные (увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения), а также рост содержания мелатонина в плазме.

Практические рекомендации

Обнаруженные различия в спектре фармакологической активности адаптогенных средств позволяют рекомендовать экстракт корней женьшеня для коррекции стрессорных расстройств, сопровождающихся повышением тревожности, а биолобил для ослабления нарушений памяти. Низкие дозы мелатонина, обладающего универсальным действием, можно использовать для устранения любых стресс-индуцированных нарушений и усиления действия анксиолитических и ноотропных препаратов, а количественное содержание гормона в плазме крови - для экспресс-оценки индивидуальной стресс-устойчивости.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Арушанян, Э.Б. Зависимость колебаний амнезирующего действия атропина от состояния эпифиза [Текст] / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер, A.A. Скорняков // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т. 72, № 4. - С. 3-5.

2. Бейер, Э.В. Антистрессорные возможности эпифгоарного гормона мелатонина в зависимости от экспериментальной модели и выраженности стресса [Текст] / Э.В. Бейер, A.C. Булгакова, A.A. Скорняков, Э.Б. Арушанян // Медицинский вестник Северного Кавказа. -2010. - Т. 18, №2. - С. 59-63.

3. Арушанян, Э.Б. Ритмстабилизирующие свойства усилителей познавательной деятельности мозга [Текст] / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер, A.B. Попов, A.A. Скорняков//Вестник РУДН, серия «Медицина» - 2012. -№ 7. - С. 31-32.

Статьи в сборниках

1. Бейер, Э.В. Влияние мелатонина на амнезический эффект атропина у крыс [Текст] / Э.В. Бейер, A.A. Скорняков // Сб. научных трудов «Фундаментальные исследования в биологии и медицине». - Ставрополь, 2006. - С. 101-102.

2. Арушанян, Э.Б. Ритмстабилизирующие свойства адаптогенных средств / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер, A.B. Попов, A.A. Скорняков // Сб. научных статей по материалам Всесоюзной конференции «Физиологические проблемы адаптации». - Ставрополь, 2013. - С. 19-21.

3. Арушанян, Э.Б. Сравнительная оценка влияния растительных адаптогенов и мелатонина на вариативность сердечного ритма у крыс [Текст] / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер, A.B. Попов, A.A. Скорняков II Сб. научных статей по материалам Всесоюзной конференции «Физиологические проблемы адаптации». -Ставрополь, 2013. - С. 21-23.

Тезисы

1. Бейер, Э.В. Сравнительная оценка психотропной активности мелатонина на различных поведенческих моделях [Текст] / Э.В. Бейер, A.A. Скорняков // Мат. X международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине. - Москва, 2009. - С. 548-549.

2. Скорняков, A.A. Сравнительная оценка поведенческой активности различных ноотропных средств [Текст] / A.A. Скорняков // Тез. докл. XVIII итоговой научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Ставрополь, 2010.-С. 451-452.

3. Бейер, Э.В. Индивидуальные ритмологические особенности животных как предиктор антистрессорного действия диазепама [Текст] / Э.В. Бейер, A.A. Булгакова, A.A. Скорняков, Э.Б. Арушанян, // Эксперим. и клин, фармакол. - 2010, Приложение - С. 25.

4. Арушанян, Э.Б. Эпифизарный гормон мелатонин как универсальный антистрес-сорный агент [Текст] / Э.Б.Арушанян, Э.В.Бейер, A.A. Скорняков, А.С.Булгакова // Тез. докл. XVIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2011. - С. 414-415.

5. Попов, С В. Сравнительная оценка психофармакологической активности женьшеня и мелатонина [Текст] / С.В. Попов, В.В. Минко, A.A. Скорняков // Тез. докл. XIX итоговой научной конференции молодых ученых с международным участием. -Ставрополь, 2011.-С. 103.

6. Бейер, Э.В. Психофармакологические эффекты комбинации экстракта корня женьшеня и мелатонина [Текст] / Э.В. Бейер, A.A. Скорняков // Тез. докл. XIX

Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2012 — С. 469.

7. Бейер, Э.В. Влияние ноотропных средств на вариативность сердечного ритма [Текст] / Э.В. Бейер, A.A. Скорняков // Мат. IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии», г. Казань, 18-21 сентября 2012 г -М.: Фолиум, 2012. - С. 19-20.

8. Арушанян, Э.Б. Сравнительная оценка антистрессорного действия адаптоген-ных средств [Текст] / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер, A.A. Скорняков / Мат. всероссийской научной конференции с международным участием «Фармакологическая нейропротекция» // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2013. - Т. 11, спецвыпуск. - С. 13.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АР - амплитуда ритма

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ИН - индекс напряжения (по данным кардиоинтервапографии)

ИЦ - индекс централизации (по данным кардиоинтервапографии)

КИГ - кардиоинтервалограмма

РНК - рибонуклеиновая кислота

СХЯ - супрахиазматические ядра

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЦНС - центральная нервная система

УРПИ - условная реакция пассивного избегания

у.е. - условные единицы

Подписано в печать 18.09.2014 Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Уч. печ. л. 1,16. Тираж 101 экз. Заказ №167

Отпечатано в типографии ООО "Губерния" 356231, Ставропольский край, с. Татарка, ул. Тельмана д. 1/17 тел.: 956-626, 955-282, 601-905