Пути оптимизации диагностики и антибактериальной терапии гонококковой инфекции

Максимова, Анна Александровна

Диссертации по медицине → Кожные и венерические болезни

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Пути оптимизации диагностики и антибактериальной терапии гонококковой инфекции

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Максимова, Анна Александровна Санкт-Петербург 2009 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.11

Автореферат диссертации по медицине на тему Пути оптимизации диагностики и антибактериальной терапии гонококковой инфекции

На правах рукописи

МАКСИМОВА Анна Александровна

ПУТИ ОПТИМИЗАЦИИ ДИАГНОСТИКИ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ ГОНОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

14.00.11 - кожные и венерические болезни 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2009

003477949

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова»

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор

Соколовский Евгений Владиславович

доктор медицинских наук профессор Савичева Алевтина Михайловна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор

Данилов Сергей Иванович

доктор медицинских наук профессор Сбойчаков Виктор Борисович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия»

Защита диссертации состоится « оХ» м _ 2009 года в (С часов на заседании совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 215.002.01 при ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «Ь» 09 2009 года

Учёный секретарь совета

доктор медицинских наук профессор Пономаренко Геннадий-Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Во всем мире гонококковая инфекция относится к числу наиболее значимых инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). Для контроля и профилактики распространения заболевания необходима эффективная диагностика, лечение и эпидемиологический надзор (мониторинг резистентности к противомикробным препаратам, определение фенотипов и генотипов Neisseria gonorrhoeae).

Гонококковая инфекция по частоте встречаемости стоит на втором месте среди ИППП после хламидийной инфекции. Ежегодно во всем мире регистрируется около 60 миллионов новых случаев (Gerbase А.С. et al., 1998). В 2008 году в России уровень заболеваемости гонококковой инфекцией, по данным ВОЗ, составил 56,23 случая на 100 000 населения, а в Санкт-Петербурге, по оценкам специалистов проекта сотрудничества по надзору за инфекцнонными болезнями в Северной Европе, - 35,4 случая на 100 000 населения. Однако реальный уровень заболеваемости остается неизвестным из-за самолечения, недостаточной диагностики и проблем при получении эпидемиологических данных (Unemo М. et al., 2006; Unemo М. et al., 2007; Vorobieva V. et al., 2007).

Лабораторная диагностика инфекции, вызванной N. gonorrhoeae, в Санкт-Петербурге не соответствует международным стандартам, основанным на принципах доказательной медицины, что отражает ситуацию в целом по стране (Van Dyck Е. et al., 1999; Tapsail J., 2001; Bignell C.J., 2001; Savicheva A. et al., 2007a; Savicheva A. et al., 2007b). Диагностика гонококковой инфекции в большинстве случаев основана на данных микроскопического метода, являющегося наиболее дешевым. Те немногие лаборатории, которые используют в диагностике гонококковой инфекции культуральный метод, работают с отечественными песелективными питательными средами, часто не проводят видовую идентификацию и тестирование на антибиотикочувствительность N. gonorrhoeae (Unemo М. et al., 2006).

В последнее время в некоторых муниципальных, федеральных и частных лабораториях нашей страны стали использовать методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), наиболее известным из которых является метод на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Помимо ПЦР была разработана первая тест-система на основе реакции транскрипционной амплификации NASBA в реальном времени (NASBA Real-Time).

В связи с высокой стоимостью международных тестов для диагностики гонококковой инфекции в нашей стране используются тесты на основе методов амплификации нуклеиновых кислот, разработанные и произведенные в России. Однако до настоящего времени они не прошли оценку и сравнение с международно признанными тест-системами. Разработка и внедрение методов амплификации нуклеиновых кислот, а также валидация существующих тест-систем, на наш взгляд, приведет к улучшению качества диагностики гонококковой инфекции. ~

Для лечения гонококковой инфекции до сих пор в нашей стране используются ¡пенициллины, тетрациклины и фторхинолоны (в основном ципрофлоксацин). Однако в большинстве стран, в том числе и в России, наблюдается высокий уровень резистентности к этим антибактериальным препаратам (АБП) (Tapsall J.W., 2005; AGSP, 2006; Wang В. et at., 2006; Martin l.M. et al., 2006; Vorobieva V. et al., 2007; Kubanova A. et at., 2008). Сейчас препаратами первой линии для лечения гонококковой инфекции являются цефалоспорины третьего поколения (цефтриаксон) и спектиномицин (Рахматуллина М.Р. и др., 2007). Однако в последнее время все чаще появляются сообщения о снижении чувствительности и к этим препаратам (Tapsall J.W., 2005; AGSP, 2006; Martin l.M. et al., 2006; Кубанова A.A. и др., 2006). Несмотря на то, что резистентность гонококков к спектиномицину все еще редко встречается, наблюдается распространение резистентных штаммов (Boslego J.W. et al., 1987). Также в литературе описываются мультирезистентные штаммы N. gonorrhoeae (Wang S.A. et al., 2003).

Несмотря на наблюдающуюся во всем мире тенденцию к неуклонному росту антибиотикорезистентности гонококков, в России проводились лить единичные исследования чувствительности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам.

Существует тесная корреляция между чувствительностью гонококков in vitro и клинической эффективностью лечения гонококковой инфекции. В связи с этим необходим мониторинг устойчивости клинических изолятов N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам на национальном, региональном и местном уровнях. Исследования по эффективности лечения и обновление рекомендаций по лечению гонококковой инфекции являются важнейшими элементами эпидемиологического контроля над этим заболеванием.

Учитывая большую медицинскую и социальную значимость гонококковой инфекции, актуальными являются проблемы профилактики, эффективной диагностики и терапии данного заболевания.

Цель работы. Оценить диагностические характеристики методов лабораторной диагностики гонококковой инфекции и исследовать чувствительность штаммов N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам.

Задачи исследования

1. Оценить распространенность гонококковой инфекции у пациентов в зависимости от пола и возраста.

2. Установить связь воспалительного процесса в уретре и цервикальном канале с гонококковой инфекцией.

3. Оценить диагностические характеристики (чувствительность, специфичность, прогностическую значимость положительных и отрицательных результатов) микроскопического, культурального и молекулярно-биологических методов при диагностике инфекции, вызванной N. gonorrhoeae.

4. Определить чувствительность штаммов N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам при помощи Е-теста и диско-диффузионного метода и сравнить эти методы.

5. Определить оптимальный спектр антибактериальных препаратов для лечения гонококковой инфекции.

Научная новизна. Установлено, что распространенность гонококковой инфекции у пациентов молодежных клиник ниже, чем у посетителей кожно-венерологических диспансеров и выше среди мужчин, чем среди женщин.

При наличии уретрита или цервицита у пациентов частота выявления N. gonorrhoeae составляет от 6% до 15%. Гонококковая инфекция у всех мужчин протекает на фоне уретрита, у всех женщин - на фоне цервицита, у 56 % - на фоне уретрита.

Диагностическая чувствительность микроскопического и культурального методов диагностики гонококковой инфекции ниже, чем у методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и NASBA). Специфичность всех методов составляет 100%.

Все оцениваемые тест-системы на основе методов амплификации нуклеиновых кислот показали высокий уровень совпадения результатов друг с другом и с референсным методом (99,4%—100).

Большинство исследованных штаммов N. gonorrhoeae имеют высокий уровень чувствительности (97,6-100%) к цефиксиму, цефтриаксону и спектиномицину. Значимое согласие Е-теста и диско-диффузионного метода при определении чувствительности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам показано лишь в отношении ципрофлоксацина, цефуроксима и цефтриаксона.

Практическая значимость. Высокая чувствительность и специфичность методов амплификации нуклеиновых кислот для выявления N. gonorrhoeae при исследовании как урогенитальных, так и экстрагенитальных проб, а также высокий уровень совпадения результатов друг с другом и с референсным методом, позволяют рекомендовать эти методы для диагностики инфекции, вызванной N. gonorrhoeae.

Клинические материалы, полученные от женщин и мужчин неинвазивным путем (первая порция свободно выпущенной мочи), являются информативным материалом при исследовании методами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот, что позволяет использовать эти образцы при диагностике гонококковой инфекции.

Высокий уровень чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к цефиксиму, цефтриаксону и спектиномицину позволяет использовать эти препараты для лечения гонококковой инфекции.

Показано значительное расхождение в результатах исследования чувствительности N. gonorrhoeae по большинству антибактериальных препаратов с использованием метода Е-тестов и диско-диффузионного метода, поэтому рекомендуется использовать диски с антибиотиками других производителей и применять диско-диффузионный метод только после его оценки по отношению к более стандартизованному методу.

Личное участие автора в получении результатов. Диссертант лично проводила весь объем клинических, инструментальных и микробиологических

исследований, сформировала базу данных, провела обработку полученных результатов, выполнила их статистический анализ и обобщение. Основные положения, выносимые на защиту

1. Частота выявления гонококковой инфекции у мужчин с уретритом, у женщин с уретритом и цервицитом составляет 14,8%, 7,9% и 6,3%, соответственно. Воспалительный процесс в уретре при гонококковой инфекции выявлен у всех мужчин и 55,6% женщин, в цервикальном канале - у всех женщин.

2. Диагностическая чувствительность микроскопического метода диагностики инфекции, вызванной N. gonorrhoeae, составляет (31,8-75%), культуралыюго - (31,8-50%), методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и NASBA) - (66,7%—100%). Специфичность всех методов составляет 100%.

3. Препаратами выбора для лечения гонококковой инфекции вляются цефиксим, цефтриаксон и спектиномицин, так как от 97,6% до 100% исследованных штаммов N. gonorrhoeae имеют высокий уровень чувствительности к этим препаратам.

Реализация и внедрение полученных результатов работы. Результаты настоящего исследования внедрены в учебную, научно-исследовательскую, клинико-диагностическую и лечебную работу кафедры дерматовенерологии с клиникой ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» и НИИ акушерства и гинекологии имени Д.О. Отга СЗО РАМН.

Апробация и публикация материалов исследования. Основные положения диссертации доложены на 22-ой конференции Европейского отделения International Union against Sexually Transmitted Infections (IUSTI), посвященная ИПГ1П (г. Версаль, Франция, 2006), 10-ом Всемирном конгрессе International Union against Sexually Transmitted Infections (IUSTI) (г. Сиэтл, США, 2007), 23-ей конференции Европейского отделения International Union against Sexually Transmitted Infections (IUSTI), посвященная ИППП и ВИЧ/СПИД (г. Дубровник, Хорватия, 2007), конференции молодых ученых Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2009 год), на заседаниях кафедры дерматовенерологии с клиникой ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова».

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 1 статья в журналах по перечню ВАК Минобразования России.

Объем и структура работы. Диссертация объемом 155 страниц состоит из введения и пяти глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Текст диссертации содержит 18 таблиц, 13 рисунков. Список литературы включает 185 источников, в том числе 18 отечественных авторов и 167 - иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Данное исследование осуществлялось в три этапа. На первом этапе проводилась сравнительная оценка микроскопического, культурапьного методов и двух методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и NASBA), для диагностики инфекции, вызванной N. gonorrhoeae.

На первом этапе участвовали 334 пациента (286 женщин и 48 мужчин), обратившихся в кожно-венерологические диспансеры (КВД) № 3 и № 11 г. Санкт-Петербурга с апреля по июль 2006 года с жалобами на зуд, выделения из половых органов, дизурию.

Для оценки методов лабораторной диагностики гонококковой инфекции было исследовано 620 образцов: 286 соскобов из цервикального канала, 286 соскобов из уретры у женщин, 48 соскобов из уретры у мужчин.

Для микроскопического исследования использовали препараты, окрашенные по Граму; для культурапьного - две питательные среды -неселективную среду российского производства "Комилегон" (Институт вакцин и сывороток, Санкт-Петербург, Россия) и селективную среду VCA3 (bioMerieux, Франция); для молекулярно-биологических методов - ПЦР с электрофорезной детекцией, разработанную в ЦНИИ эпидемиологии, Москва (ПЦР-эф-ИЭ), и тест, основанный на технологии NASBA в реальном времени (bioMerieux, Нидерланды) с мишень-специфическими олигонуклеотидами, разработанными в ЦНИИ эпидемиологии, Москва.

На втором этапе проводилась оценка методов амплификации нуклеиновых кислот для выявления N. gonorrhoeae. Для участия были приглашены пациенты трех молодежных консультативно-диагностических центров Санкт-Петербурга, имевшие симптомы урогенитапьной инфекции (выделения из мочеполовых органов, дизурию и т.п.) и не принимавшие антибиотики в течение четырех недель до участия в исследовании. С ноября 2006 г. по январь 2007 г. в исследование было включено 446 пациентов (319 женщин и 127 мужчин). Кроме того, от дополнительной группы, состоящей из 50 женщин с подозрением на гонококковую инфекцию (наличие клинических симптомов и/или обнаружение грамотрицательных диплококков при микроскопическом исследовании препаратов, окрашенных по Граму, и/или установленная гонококковая инфекция у полового партнера), были получены клинические материалы из ротоглотки и прямой кишки.

Для сравнительной оценки МАНК для диагностики гонококковой инфекции было исследовано 990 проб (319 соскобов из цервикального канала, 317 проб мочи от женщин, 127 соскобов из уретры от мужчин, 127 проб мочи от мужчин, 50 ректальных проб и 50 проб из ротоглотки).

Оценивались следующие МАНК: ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в компании ДНК-технология, Москва (ПЦР-эф-Дт и ПЦР-рв-Дт), ПЦР с электрофорезной детекцией компании Литех, Москва (ПЦР-эф-Л), ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в ЦНИИ эпидемиологии, Москва (ПЦР-эф-ИЭ и ПЦР-

рв-ИЭ), и тест, основанный на технологии NASBA в реальном времени (bioMerieux, Бокстел, Нидерланды), с мишень-специфическими олигонуклеотидами, разработанный в ЦНИИ эпидемиологии. В качестве референсного метода использовали ПЦР в реальном времени, мишенью в которой является псевдоген N. gonorrhoeae рогА.

На третьем этапе проводилась оценка антибиотикочувствительности штаммов N. gonorrhoeae, циркулировавших в Санкт-Петербурге в 2007-2008 годах, к антибактериальным препаратам, наиболее часто применяемым для лечения гонококковой инфекции, диско-диффузионным методом и методом Е-тестов, а также сравнение этих методов между собой.

На этапе исследования антибиотикочувствительности клинических изолятов N. gonorrhoeae клинический материал (соскобы эпителия цервикалыюго канала у женщин и уретры у мужчин) был получен от 48 пациентов городского кожно-венерологического диспансера - 12 женщин и 36 мужчин. Из них 3 изолята погибли при культивировании. Еще 3 изолята были оксидазоотрицательными и окрашивались по Граму положительно, поэтому дальше не идентифицировались. Таким образом, были выделены, размножены и идентифицированы как N. gonorrhoeae 42 изолята - от 11 женщин и 31 мужчины.

Выделенные клинические изоляты N. gonorrhoeae тестировали на чувствительность к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, цефуроксиму, цефиксиму, цефтриаксону и спектиномицину методом Е-тестов и диско-диффузионным методом.

Статистическая обработка материала выполнялась на ЭВМ с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v. 6.0).

Результаты исследований и их обсуждение.

На первом этапе в исследовании приняли участие пациенты КВД, где средний возраст женщин составил 25,7±0,5 года (диапазон от 18 до 39 лет), средний возраст мужчин - 29,8+1,6 года (диапазон от 20 до 44 лет). Обследовано 334 пациента, среди них 286 женщин и 48 мужчин. Гонококки обнаружены у 13 женщин и 4 мужчин. В этой группе распространенность гонококковой инфекции составила 4,5% среди женщин (цервикальный канал и уретра) и 8,3% (уретра) среди мужчин (х2=0,56; р>0,10). В целом частота выявления гонококков среди пациентов, посещающих

дерматовенерологические клиники, была равна 5,1%.

На втором этапе в исследовании участвовали посетители молодежных консультативно-диагностических центров, средний возраст женщин составил 20,7+0,4 года (диапазон от 15 до 30 лет) и средний возраст мужчин - 20,8±1,3 года (диапазон от 15 до 27 лет). Обследовано 446 пациентов, среди них 369 женщин и 127 мужчин. Гонококки обнаружены у 7 женщин и 5 мужчин. В этой группе пациентов распространенность гонококковой инфекции составила 5,1% и 2,2% среди мужчин и женщин, соответственно (х~0,47; р>0,10). Среди всех

обследованных нами посетителей молодежных центров частота выявления гонококков составила 2,7%.

При сравнении двух групп пациентов нами установлено, что гонококки реже выявлялись у пациентов молодежных клиник (2,7%), чем у посетителей кожно-венерологических диспансеров (5,1%; х2=0,62; р>0,10)

Таким образом, нами установлено, что распространенность гонококковой инфекции ниже в молодежной популяции. В обеих группах распространенность гонококковой инфекции среди мужчин выше, чем среди женщин (х2=0,56; р>0,10; х2=0,47; р>0,10).

При микроскопическом исследовании клинических материалов, полученных из цервикального канала у женщин и из уретры у мужчин и окрашенных по Граму, выявляли и оценивали наличие или отсутствие воспалительной реакции, а также наличие или отсутствие микроорганизмов, в том числе грамотрицатедьных диплококков. Воспалительная реакция оценивалась по наличию и количеству полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) в препарате.

При исследовании клинических материалов из уретры у мужчин (п=48), обратившихся в КВД с жалобами на зуд, выделения из половых органов, дизурию, в 21 (43,8%) случае отсутствовали микроскопические признаки воспаления, то есть количество ПМЯЛ было менее 5, а в 27 (56,2%) случаях количество ПМЯЛ было больше 5, что свидетельствует о наличии воспалительного процесса в уретре.

При исследовании клинических материалов из цервикального канала у женщин (п=286) в 205 (71,7%) случаях имелись микроскопические признаки воспаления, то есть количество ПМЯЛ было более 10, а в 81 (28,3%) случае количество ПМЯЛ было менее 10.

При исследовании клинических материалов из уретры у женщин (п=286) в 63 (22%) случаях имелись микроскопические признаки воспаления, то есть количество ПМЯЛ было более 10, а в 223 (78%) случаях количество ПМЯЛ было менее 10.

При оценке образцов, полученных от пациентов с гонококковой инфекцией, выявлено, что у всех мужчин гонококковая инфекция в уретре протекает на фоне воспалительного процесса. Гонококковая инфекция в цервикальном канале протекает на фоне воспалительного процесса у всех женщин, а в уретре - у 55,6%.

Результаты нашего исследования показали, что частота выявления N. gonorrhoeae при наличии воспалительного процесса в уретре мужчин составила 14,8%, в уретре женщин - 7,9%, в цервикальном канале - 6,3%.

При сравнительной оценке методов микробиологической диагностики инфекции, вызванной /V. gonorrhoeae, получены следующие данные. При микроскопическом исследовании препаратов, окрашенных по Граму, грамотрицательные внутриклеточные диплококки были обнаружены у 4 женщин и 3 мужчин. Положительный результат культурального исследования по выделению N. gonorrhoeae был получен у 4 женщин и 2 мужчин.

При сравнении результатов культивирования с использованием неселективной питательной среды российского производства Комплегон и селективной питательной среды VCA3 было получено два дискордантных результата, но в итоге обе питательные среды для культурапьного исследования с целью выделения N. gonorrhoeae показали одинаковую чувствительность. Тем не менее, на среде Комплегон чаще выделялись другие микроорганизмы, такие как стафилококки, стрептококки, бактерии кишечной группы, что затрудняло обнаружение и идентификацию гонококков.

Анализ результатов исследования с помощью МАНК показал, что нуклеиновые кислоты N. gonorrhoeae были обнаружены в образцах отделяемого урогенитального тракта 13 женщин и 4 мужчин. Сравнение между собой результатов двух амплификационных методов показало, что все положительные результаты метода NASBA совпали с положительными результатами метода ПЦР. Однако еще в двух случаях положительные результаты были получены только методом ПЦР.

Все положительные результаты ПЦР были подтверждены методом определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК с амплификацией и секвенированием продуктов амплификации (табл. 1).

Таблица 1.

Количество положительных образцов, выявленных с использованием разных

методов диагностики гонококковой инфекции

Источник получения клинического материала Культуральная диагностика Микроскопия ПЦР NASBA

Комплегон VCA3

Цервикальный канал (женщины, п=286) 4 (1,4%) 4 (1,4%) 4 (1,4%) 13 (4,5%) 12 (4,2%)

Уретра (женщины, п=286) 3 (1,0%) 2 (0,7%) 3 (1,0%) 9 (3,1%) 8 (2,8%)

Уретра (мужчины, п=48) 1 (2,1%) 2 (4,2%) 3 (6,3%) 4 (8,3%) 4 (8,3%)

1 X' 0,01 1,76 3,70 1,42 2,21

Р >0,10 >0,10 =0,054 >0,10 >0,10

При обобщении результатов, полученных при анализе всех трех вариантов клинического материала (уретра мужчин и женщин, цервикальный канал), методы ПЦР и NASBA давали достоверно более высокую частоту выявления N. gonorrhoeae, чем культуральное исследование с использованием питательных сред Комплегон и VCA3 (р<0,003 и р<0,007, соответственно). Молекулярно-биологические методы продемонстрировали более высокую чувствительность и по сравнению с микроскопическим методом диагностики (р=0,011 и р=0,024, соответственно).

На основании результатов, полученных с помощью ПЦР, распространенность N. gonorrhoeae составила 4,5% среди женщин (цервикальный канал и уретра) и 8,3% (уретра) среди мужчин ()f=0,56; р>0,10).

В результате диагностическая чувствительность микроскопического метода составила 31,8% у женщин и 75,0% у мужчин, культурального метода -31,8% и 50,0% у женщин и мужчин, соответственно, метода NASBA - 90,9% и 100% у женщин и мужчин, соответственно. Прогностическая значимость отрицательных результатов микроскопического, культурального методов и метода NASBA составила 97,3%, 97,3% и 99,6% у женщин, и 97,8%, 95,7% и 100% у мужчин, соответственно.

Диагностическая специфичность и прогностическая значимость положительных результатов всех методов, используемых для выявления N. gonorrhoeae, составили 100%

На этапе сравнительной оценки МАНК для диагностики инфекции, вызванной N. gonorrhoeae, при анализе урогенитапьных образцов ДНК/РНК N. gonorrhoeae была обнаружена у семи женщин (2,2%) и у пятерых мужчин (3,9%; х2=0>47; р>0,10). Среди экстрагенитальных образцов, полученных от группы женщин с подозрением на гонококковую инфекцию (п=50), у восьми (16,0%) из них были обнаружены гонококки.

Все оцениваемые МАНК показали высокий уровень совпадения результатов друг с другом и с референсным методом. У мужчин совпадение результатов всех тестов составило 100%. Более лого, среди экстрагенитальных образцов, полученных от группы женщин с подозрением на гонококковую инфекцию (п=50), также наблюдалось 100%-ное совпадение результатов МАНК российского производства и референсного метода. У женщин совпадение результатов для цервикальных проб и проб мочи составило 99,7% и 99,4%, соответственно (табл. 2).

Таблица 2.

Совпадение результатов исследования по выявлению N. gonorrhoeae с использованием тест-систем на основе МАНК российского производства, выбранных для сравнителыюго исследоиaiшя, и референсного метода

Пациенты Образцы Количество образцов Конкор- дант-11 ость, %

всего положительные всеми методами отрицательные всеми методами

женщины цервик. канал 319 5 313 99,7

моча 317 4 311 99,4

прямая кишка 50 7 43 100

ротоглотка 50 4 46 100

мужчины уретра 127 4 123 100

моча 127 5 122 100

При использовании МАНК отечественного производства были получены пять ложноотрицательных результатов (три разные пробы); один положительный цервикальный образец и один положительный образец мочи не были выявлены при исследовании ПЦР-эф-Ли, и еще один положительный образец мочи - при исследовании ПЦР-эф-Ли, ПЦР-эф-ДТ и ПЦР-рв-ДТ.

У женщин самую высокую чувствительность показали ПЦР-эф-Эп, ПЦР-рв-Эп и NASBA (100% для цервикальных проб и проб мочи). Чувствительность ПЦР-эф-ДТ, ПЦР-рв-ДТ и ПЦР-эф-Ли составила 100%, 83,3%, 100% и 83,3%, 83,3%, 66,7% для цервикальных образцов и мочи, соответственно. Прогностическая значимость отрицательных результатов варьировала от 99,4% до 100%.

У мужчин все МАНК российского производства показали 100% чувствительность для всех образцов. Специфичность и прогностическая значимость положительных результатов всех отечественных тестов равнялась 100%.

Ингибирование амплификации наблюдалось при исследовании 18 урогенитальных проб, полученных от восьми женщин и семерых мужчин. Ингибирование амплификации при исследовании экстрагенитальных образцов не было отмечено ни в одной из реакций МАНК. .

Пределы детекции ПЦР-эф-ДТ, ПЦР-рв-ДТ, ПЦР-эф-Ли, ПЦР-эф-ИЭ и ПЦР-рв-ИЭ составили 1-3, 1-3, 3-6, 1-3 и 1 геномную копию на реакцию, соответственно.

Результаты тестирования чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, цефуроксиму, цефиксиму, цефтриаксону и спектиномицину суммированы в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты определения чувствительности штаммов N. gonorrhoeae с

использованием Е-тестов и диско-диффузионного метода (п=42)

Количество Количество Количество

чувствительных штаммов с резистентных

штаммов (%) промежуточной штаммов (%)

АБП чувствительностью

(%)

Е-тест ДДМ Е-тест ДДМ Е-тест ДДМ

Пенициллин 30,9 0 64,3 57,1 4,8 42,9

Тетрациклин 42,9 0 45,2 26,2 11,9 73,8

Ципрофлоксацин 45,2 28,6 0 16,6 54,8 54,8

Цефуроксим 88,1 73,8 2,4 14,3 9,5 11,9

Цефиксим 100* 97,6 0 2,4 0 12,4

Цефтриаксон 97,6 92,9 2,4 7,1 0 0

Спектиномицин 100 - 0 - 0 -

* на чувствительность к цефиксиму с использованием Е-тестов было протестировано 25 штаммов N. gonorrhoeae

Для спектиномицииа использовался только метод Е-тестов по причине отсутствия дисков, содержащих этот антибиотик, у данного производителя. Для характеристики чувствительности к АБП N. gonorrhoeae использовали только результаты Е-тестов (ДДМ использовался с целью его оценки по отношению к стандартизованным, коммерческим Е-тестам).

Цефиксим и спектиномицин показали 100% активность в отношении гонококковой инфекции. Один из 42 штаммов (2,4%) проявил промежуточную чувствительность к цефтриаксону, остальные штаммы были к нему чувствительны. Более половины всех штаммов продемонстрировали резистентность или промежуточную чувствительность к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину. Количество штаммов, чувствительных к цефуроксиму, значительно превышает таковое для пенициллина, тетрациклина и ципрофлоксацина, однако, это число ниже 95%, поэтому цефуроксим не должен использоваться для лечения гонореи.

При сравнении Е-теста и диско-диффузионного метода определено значительное расхождение по большинству препаратов. Наибольшее расхождение между методами было отмечено при исследовании чувствительности N. gonorrhoeae к тетрациклину (1 8 случаев), далее в порядке убывания - к пенициллину (13 случаев), цефуроксиму (8 случаев), ципрофлоксацину (7 случаев), цефтриаксону (4 случая) и цефиксиму (1 случай). Ни по одному из изучаемых АБП не наблюдалось полного совпадения результатов метода Е-тестов и ДДМ.

Проведенное исследование по сравнительной оценке микроскопического, культурального методов и двух МЛНК (ПЦР и NASBA) для диагностики инфекции, вызванной N. gonorrhoeae, показало, что лабораторная диагностика гонококковой инфекции в Санкт-Петербурге неоптимальна и требует значительных улучшений.

Микроскопический и культуральный метод, являющиеся

регламентированными методами диагностики гонореи, показали низкую чувствительность, особенно при диагностике гонореи у женщин. Из этого следует необходимость разработки и внедрения эффективной и качественной культуральной диагностики гонококковой инфекции на территории Санкт-Петербурга и других регионов России, с использованием селективных сред, видовой идентификации и исследования антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae.

В последние годы за рубежом в рамках протоколов диагностики гонококковой инфекции стали использовать МАНК, которые обладают высокой чувствительностью и специфичностью.

В последнее время в некоторых муниципальных, федеральных и частных лабораториях России для диагностики инфекции, вызванной N. gonorrhoeae, стали использоваться коммерческие тест-системы отечественного производства на основе метода ПЦР.

Данное исследование стало первым исследованием по всесторонней оценке МАНК, разработанных и применяемых в России для выявления N. gonorrhoeae. В целом, все шесть МАНК Российского производства показали

высокий уровень совпадения результатов друг с другом и с референсным методом (99,4-100%), относительно высокую чувствительность (66,7-100%), идеальную специфичность (100%) при использовании как урогенительных (полученных инвазивным и неинвазивным путем), так и экстрагенитальных образцов, а также низкие пределы детекции (1 -6 копий на реакцию).

В своем исследовании мы показали, что образцы мочи как от женщин, так и от мужчин, являются, по меньшей мере, не менее информативным материалом, чем цервикальные образцы у женщин и пробы из уретры у мужчин.

Разработка и внедрение МАНК, а также валидация существующих тест-систем, на наш взгляд, создаст объективные условия для включения их в современные алгоритмы диагностики гонококковой инфекции.

Недавно в нашей стране была разработана новая тест-система на основе технологии NASBA, где в качестве мишени используется рибосомальные РНК (рРНК) возбудителя. Практическое использование метода NASBA хорошо продемонстрировано в проведенном исследовании.

В данном исследовании было показано, что уровень промежуточной чувствительности и резистентности N. gonorrhoeae к традиционным антибиотикам, используемым для лечения гонореи в Санкт-Петербурге, достаточно высок. Тем не менее, все изоляты N. gonorrhoeae были чувствительны к цефиксиму и спектиномицину. Был также выявлен лишь один изолят N. gonorrhoeae, проявляющий промежуточную чувствительность к цефтриаксону. Таким образом, для лечения гонореи в Санкт-Петербурге могут быть использованы: цефиксим, цефтриаксон и спектиномицин.

При сравнении Е-тсстов и диско-диффузионного метода было показано значимое согласие лишь в отношении ципрофлоксацина, цефуроксима и цефтриаксона. В отношении пенициллина и тетрациклина были получены значительные расхождения в результатах. Поэтому для дальнейших исследований рекомендуется использовать, возможно, более качественные диски с антибиотиками других производителей и применять диско-диффузионный метод для тестирования чувствительности гонококков к антибактериальным препаратам только после оценки по отношению к более стандартизованному методу.

ВЫВОДЫ

1. Распространенность гонококковой инфекции среди посетителей молодежных центров составила 5,1% и 2,2% среди мужчин и женщин, соответственно, а среди посетителей КВД - 8,3% среди мужчин и 4,5% среди женщин.

2. Гонококковая инфекция у всех мужчин протекает на фоне выраженного воспалительного процесса в уретре. У женщин гонококковая инфекция у 100% пациентов протекает с явлениями цервицита и у 55,6% пациентов - с явлениями уретрита. Частота выявления N. gonorrhoeae при наличии уретрита у мужчин составляет 14,8.%, уретрита женщин - 7,9%, цервицита -6,3%.

а) чувствительность микроскопического метода при оценке урогенитальных образцов составила 31,8% у женщин и 75% у мужчин, специфичность - 100%;

б) чувствительность культурального метода составила 31,8% при исследовании клинического материала, полученного от женщин, и 50%-от мужчин, специфичность - 100%;

в) тест-системы на основе методов амплификации нуклеиновых кислот показали высокий уровень совпадения результатов друг с другом и с референсным методом (99,4-100%), относительно высокую диагностическую чувствительность (66,7-100%) и специфичность (100%) при использовании как урогенитальных (полученных инвазивным и неинвазивным путем), так и экстрагенитальных образцов, и низкие пределы детекции (1-6 копий на реакцию).

4. Диагностическая чувствительность тестов на основе методов амплификации нуклеиновых кислот при исследовании образцов мочи как от женщин (66,7100%), так и от мужчин (100%) сопоставима у большинства методов с диагностической чувствительностью при исследовании цсрвикальных образцов у женщин (83,3-100%) и проб из уретры у мужчин (100%).

5. Метод Е-теста и диско-диффузионный метод определения антибиотикочувствительности имеют значительные расхождения результатов по чувствительности N. gonorrhoeae к большинству исследованных антибактериальных препаратов.

6. При исследовании методом Е-теста чувствительными к цефикеиму являются ¡00% исследованных штаммов N. gonorrhoeae, к цефтриаксону - 97,6%, к спектиномицину - 100%, что позволяет рассматривать данные антибактериальные средства как препараты выбора при лечении гонококковой инфекции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Микроскопические методы исследования с окрашиванием препаратов по Граму необходимо использовать не только для выявления грамотрицательных диплококков, но и для оценки степени выраженности воспалительной реакции в уретре или цервнкапьном канале. При наличии признаков воспаления (количестве полиморфноядерных лейкоцитов более 5 для мужской уретры и более 10 для женской уретры и цервикального канала) необходимо обязательное обследование на наличие N. gonorrhoeae.

2. Использование микроскопического метода исследования препаратов, окрашенных по Граму, для диагностики гонококковой инфекции целесообразно только для тестирования клинических материалов, полученных из уретры у мужчин с наличием жалоб и микроскопических симптомов уретрита.

3. 'Гест-системы на основе методов амплификации нуклеиновых кислот российского производства для диагностики гонококковой инфекции

целесообразно использовать для исследования как урогенитальных (полученных инвазивным и неинвазивным путем), так и экстрагенитальиых образцов. При этом образцы мочи как от женщин, так и от мужчин являются наиболее приемлемым для пациента и не менее информативным для врача материалом для исследования с целью выявления N. gonorrhoeae, по сравнению с цервикальными образцами и пробами из уретры.

4. При отсутствии возможности определения антибиотикочувствительности клинического изолята N. gonorrhoeae препаратами выбора для лечения гонококковой инфекции на территории Санкт-Петербурга являются цефиксим, цефтриаксон и спектиномицин.

5. Диско-диффузионный метод для тестирования чувствительности гонококков к антибактериальным препаратам рекомендуется использовать после оценки его по отношению к более стандартизованному методу (Е-тесту, методу серийных разведений в агаре).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Максимова А.А. Качество лабораторной диагностики гонококковой инфекции / Е.В. Шипицына, А.А. Максимова, А.Е. Гущин, З.М. Мартикайнен, П.Г. Рыжих, A.M. Савичева, Е.В. Соколовский, Г.А. Шипулин, М. Домсйка, М. Унемо // Журн. акуш. жен. болези. - 2008. - Т. 57, Вып. 3,-С. 60-66.

2. Мартикайнен З.М. Сравнительная оценка питательных сред для выделения Neisseria gonorrhoeae / З.М. Мартикайнен, С.С. Сахарцева, Р.Ч. Соколовская, И.Е. Афонина, А.А. Максимова, М! Унемо // Журн. акуш. жен. болезн. -2006. - Т. 55, специальный выпуск. - С. 34-35.

3. Кирпичева А.А. Оценка микроскопического, культурального методов и метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики Neisseria gonorrhoeae / А.А. Кирпичева, Е.В. Шипицына, З.М. Мартикайнен, A.M. Савичева, С.С. Сахарцева, И.Е. Афонина, Е.В. Соколовский, М. Унемо, М. Домсйка // Журн. акуш. жен. болезн. - 2006. - Т. 55, специальный выпуск. -С. 75-76.

4. Kirpicheva A. Comparison of microscopy, culture and polymerase chain reaction used for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in St. Petersburg, Russia / E. Shipitsyna, Z. Martikainen, A. Kirpicheva, M. Unemo, A. Savicheva, S. Saharceva, 1. Afonona, E. Sokolovsky, M. Domeika // Int. J. STD/AIDS. - 2006. -Vol.17, Suppl. l.-P. 35.

5. Maximova A.A. Evaluation of nucleic acid amplification tests (NAATS) for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia / E.V. Shipitsyna, M. Unemo, A.E. Guschin, A.A. Maximova, P. Ryzhikh, A.M. Savicheva, E.V. Sokolovsky, G.A. Shipulin, M. Domeika // 17th ISSTDR (International society for STD research); 10th IUSTI World congress (International Union against STIs), Seattle, Washington, USA, 2007. - P. 184-185.

6. Maximova A. Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) assays for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia / A. Maximova, E. Shipitsyna, A. Savicheva, A. Benkovich, E. Zolotoverkhaya, A. Krysanova, M. Domeika, M. Unemo //

Abstr. 23rd 1USTI-EUR0PE Conf. on STI's and HIV/AIDS, Cavtat/Dubrovnik, Croatia, 2007. - P. 97-98. 7. Maximova A. Comparison of microscopy, culture and in-liouse PCR and NASBA assays for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia / E. Shipitsyna, A. Guschin, A. Maximova, M. Tseslyuk, A. Savicheva, E. Sokolovsky, G. Shipulin, M. Domeika, M. Unemo // APM1S, 2008. - Vol. 116, № 2. - P. 133-138.

Подписано в печать 08.09.09 Формат 60x84/16

Объем 1 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 660

Типография BMA им. С.М. Кирова 194044, СПб., уд. Академика Лебедева, 6

Оглавление диссертации Максимова, Анна Александровна :: 2009 :: Санкт-Петербург

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. СОВРЕМЕННАЯ ДИАГНОСТИКА И ТЕРАПИЯ ГОНОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Таксономия нейссерий.

1.2 Клеточная и молекулярная структура Neisseria gonorrhoeae.

1.3 Патогенез гонококковой инфекции.

1.4 Клинические проявления гонококковой инфекции.

1.5 Диагностика инфекций, вызываемых Neisseria gonorrhoeae.

1.5.1 Микроскопические методы исследования.

1.5.2 Культуральная диагностика гонококковой инфекции.

1.5.3 Иммунологические методы.

1.5.4 Молекулярно-биологические методы диагностики.

1.5.5 Проблемы диагностики гонококковой инфекции.

1.6 Лечение гонококковой инфекции и антибиотикорезистентность Neisseria gonorrhoeae.

1.6.1 Тенденции распространения резистентности N. gonorrhoeae.

1.6.2 Механизмы устойчивости N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам.

1.6.3 Методы выявления устойчивости N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Схема исследования.

2.2 Пациенты и клинические образцы.

2.3 Взятие образцов и пробоподготовка.

2.4 Микроскопическое исследование.

2.5 Культуральное исследование на этапе сравнения методов.

2.6 Культуральное исследование и идентификация N. gonorrhoeae на этапе определении антибиотикочувствительности.

2.7 Определение чувствительности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам с помощью Е-тестов.

2.8 Определение чувствительности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам с помощью диско-диффузионного метода.

2.9 Методы амплификации нуклеиновых кислот.

2.9.1 Выделение нуклеиновых кислот для ПЦР методом ДНК* экспресс.

2.9.2 Выделение нуклеиновых кислот для ПЦР методом ДНК-сорбА

2.9.3 Выделение нуклеиновых кислот для NASBA.

2.9.4 Выделение ДНК для референсного ПЦР.

2.9.5 ПЦР с электрофорезной детекцией.

2.9.6 ПЦР в реальном времени.

2.9.7 Референсная ПЦР в реальном времени с праймерами к псевдогену N. gonorrhoeae рогА.

2.9.8 NASBA в реальном времени.

2.9.9- Определение пределов детекции ПЦР российского производства.

2.9.10 Определение нуклеотидной последовательности ДНК для видовой идентификации N. gonorrhoeae.

2.10 Оценка диагностических характеристик методов.

2.11 Статистические методы.

Глава 3. ОЦЕНКА МЕТОДОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ГОНОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ.

3.1 Сравнение методов лабораторной диагностики гонококковой инфекции.

3.2 Сравнительная оценка МАНК для выявления N. gonorrhoeae.

Глава 4. АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ N. GONORRHOEAE.

4.1 Определение антибиотикочувствительности клинических изолятов N. gonorrhoeae, циркулировавших в Санкт-Петербурге.

4.2 Сравнение методов определения чувствительности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам.

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Кожные и венерические болезни", Максимова, Анна Александровна, автореферат

Гонококковая инфекция по частоте встречаемости стоит на втором месте среди ИППП после хламидийной инфекции. Ежегодно во всем мире регистрируется около 60 миллионов новых случаев (Gerbase А.С. et al., 1998). В 2008 году в России уровень заболеваемости гонококковой инфекцией по данным ВОЗ составил 56,23 случаев на 100 000 населения, а в Санкт-Петербурге по оценкам специалистов проекта сотрудничества по надзору за инфекционными болезнями в Северной Европе - 35,4 случаев на 100 000 населения. Однако реальный уровень, заболеваемости остается неизвестным из-за самолечения, недостаточной диагностики и проблем при» получении эпидемиологических данных (Unemo М. et al., 2006; Unemo М. et al., 2007; Vorobieva V. et al., 2007).

Лабораторная диагностика инфекции, вызванной N. gonorrhoeae, в Санкт-Петербурге не соответствует международным стандартам, основанным на принципах доказательной медицины, что отражает ситуацию в целом по стране (Van Dyck Е. et al., 1999; Tapsall J., 2001; Bignell С J., 2001; Savicheva A. et al., 2007a; Savicheva A. et al., 2007b). Диагностика гонококковой инфекции в большинстве случаев основана на данных микроскопического метода, являющегося наиболее дешевым. Те немногие лаборатории, которые используют в диагностике гонококковой инфекции культуральный метод, работают с отечественными неселективными питательными средами, часто не проводят видовую идентификацию и тестирование на антибиотикочувствительность N. gonorrhoeae (Unemo М. et al., 2006).

В связи с высокой стоимостью международных тестов для диагностики гонококковой инфекции в нашей стране используются тесты на основе методов амплификации нуклеиновых кислот, разработанные и произведенные в России. Однако, до настоящего времени они- не прошли оценку и сравнение с международно признанными тест-системами. Разработка и внедрение методов амплификации нуклеиновых кислот, а также валидация существующих тест-систем, на наш взгляд, приведет к улучшению г качества диагностики гонококковой инфекции.

Для лечения гонококковой инфекции до сих пор в нашей стране' используются пенициллины, тетрациклины и фторхинолоны (в основном ципрофлоксацин). Однако в большинстве стран, в том числе и в России, наблюдается высокий уровень резистентности к этим антибактериальным препаратам (АБП) (Tapsall J.W., 2005; AGSP, 2006; Wang В. et al., 2006; Martin I.M. et al., 2006; Vorobieva V. et ah, 2007; Kubanova A. et al., 2008). Сейчас препаратами первой линии для лечения гонококковой инфекции являются цефалоспорины третьего поколения (цефтриаксон) и спектиномицин (Рахматуллина М.Р. и др., 2007). Однако в последнее время все чаще появляются сообщения о снижении чувствительности и к этим препаратам (Tapsall J.W., 2005; AGSP, 2006; Martin I.M. et al., 2006; Кубанова A.A. и др., 2006). Несмотря на то, что резистентность гонококков к спектиномицину все еще редко встречается, наблюдается распространение резистентных штаммов (Boslego J.W. et al., 1987). Также в литературе описываются мультирезистентные штаммы N. gonorrhoeae (Wang S.A. et al., 2003).

Несмотря на наблюдающуюся во всем мире тенденцию к неуклонному росту антибиотикорезистентности гонококков, в России проводились лишь единичные исследования чувствительности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам.

Задачи исследования

1. Оценить распространенность гонококковой инфекции у пациентов в зависимости от пола и возраста.

2. Установить связь воспалительного процесса в уретре и цервикальном канале с гонококковой инфекцией.

5. Определить оптимальный спектр антибактериальных препаратов для лечения гонококковой инфекции.

Гонококковая инфекция протекает на фоне уретрита у всех мужчин и на фоне цервицита у всех женщин, у 56 % женщин - на фоне уретрита. При наличии уретрита или цервицита частота выявления N. gonorrhoeae составляет от 6% до 15%

Диагностическая чувствительность микроскопического и культурального методов> диагностики гонококковой инфекции ниже, чем у методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот (ПНР и NASBA). Специфичность всех методов составляет 100%.

Большинство исследованных штаммов N. gonorrhoeae имеют высокий уровень чувствительности (97,6-100%) к цефиксиму, цефтриаксону и спектиномицину. Значимое согласие Е-теста и диско-диффузионного метода определение чувствительности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам показано лишь в отношении ципрофлоксацина, цефуроксима и цефтриаксона.

Неинвазивные образцы (моча), полученные от женщин и мужчин, являются информативным материалом при исследовании методами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот, что позволяет использовать эти образцы при диагностике гонококковой инфекции.

Показано значительное расхождение в результатах исследования чувствительности N. gonorrhoeae по большинству антибактериальных препаратов с использованием метода Е-тестов и диско-диффузионного метода, поэтому рекомендуется использовать, диски других производителей и применять диско-диффузионный метод только после оценки по отношению к более стандартизованному методу.

Личное участие автора в получении результатов. Диссертант лично проводил весь объем клинических и инструментальных исследований, сформировал базу данных, провел обработку полученных результатов, выполнил их статистический анализ и обобщение. Основные положения, выносимые на защиту 1. Частота выявления гонококковой инфекции у мужчин с уретритом, у женщин с уретритом и цервицитом составляет 14,8%, 7,9% и 6,3%, соответственно. Воспалительный процесс в уретре при гонококковой инфекции выявлен у всех мужчин и 55,6% женщин, в цервикальном канале - у всех женщин.

2. Диагностическая чувствительность микроскопического метода диагностики N. gonorrhoeae составляет (31,8-75%), культурального -(31,8-50%), методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и NASBA) - (66,7%-100%). Специфичность всех методов составляет 100%.

Реализация и внедрение полученных результатов работы. Результаты настоящего исследования внедрены в учебную, научную и лечебную работу кафедры дерматовенерологии с клиникой ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова», и диагностику в лаборатории микробиологии ГУ «НИИ Акушерства и гинекологии имени-Д.О. Отта РАМН».

Апробация и публикация материалов исследования. Основные положения диссертации доложены на 22-ой конференции Европейского отделения International Union against Sexually Transmitted Infections (IUSTI), посвященная ИППП (г. Версаль, Франция, 2006), 10-ом Всемирном конгрессе International Union against Sexually Transmitted Infections (IUSTI) (г. Сиэтл, США, 2007), 23-ей конференции Европейского отделения International Union against Sexually Transmitted Infections (IUSTI), посвященная ИППП и ВИЧ/СПИД (г. Дубровник, Хорватия, 2007), конференции молодых ученых Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2009 год), на заседаниях кафедры дерматовенерологии с клиникой ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова».

Заключение диссертационного исследования на тему "Пути оптимизации диагностики и антибактериальной терапии гонококковой инфекции"

выводы

1. Распространенность гонококковой инфекции среди посетителей молодежных центров составила 5,1% и 2,2% среди мужчин и женщин соответственно, а среди посетителей КВД - 8,3% среди мужчин и 4,5% среди женщин.

2. Гонококковая инфекция у всех мужчин протекает на фоне выраженного воспалительного процесса в уретре. У женщин гонококковая инфекция у 100% пациентов протекает с явлениями цервицита и у 55,6% пациентов — с явлениями уретрита. Частота выявления N. gonorrhoeae при наличии уретрита у мужчин составляет 14,8%, уретрита женщин — 7,9%, цервицита - 6,3%.

3. При сравнении микроскопического, культурального методов и методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и NASBA) для диагностики инфекции, вызванной N. gonorrhoeae: а) чувствительность микроскопического метода при оценке урогенитальных образцов составила 31,8% у женщин и 75% у мужчин, специфичность - 100%; б) чувствительность культурального метода составила 31,8% при исследовании клинического материала, полученного от женщин, и 50% — от мужчин, специфичность - 100%; в) тест-системы на основе методов амплификации нуклеиновых кислот показали высокий уровень совпадения результатов друг с другом и с референсным методом (99,4-100%), относительно высокую диагностическую чувствительность (66,7-100%) и специфичность (100%) при использовании как урогенитальных (полученных инвазивным и неинвазивным путем), так и экстрагенитальных образцов, и низкие пределы детекции (1-6 копий на реакцию).

4. Диагностическая чувствительность тестов на основе методов амплификации нуклеиновых кислот при исследовании образцов мочи как от женщин (66,7—100%), так и от мужчин (100%) сопоставима у

I ( I большинства методов с диагностической чувствительностью при исследовании цервикальных образцов у женщин (83,3-100%) и проб из уретры у мужчин (100%).

6. При исследовании методом Е-теста чувствительными к цефиксиму являются 100% исследованных штаммов N. gonorrhoeae, к цефтриаксону -97,6%, к спектиномицину - 100%, что позволяет рассматривать данные антибактериальные средства как препараты выбора при лечении гонококковой инфекции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Микроскопические методы исследования с окрашиванием препаратов по Граму необходимо использовать не только для выявления грамотрицательных диплококков, но и для оценки степени выраженности воспалительной реакции в уретре или цервикальном канале. При наличии признаков воспаления (количестве полиморфноядерных лейкоцитов более 5 для мужской уретры и более 10 для, женской уретры и цервикального канала) необходимо обязательное обследование на наличие N. gonorrhoeae.

2. Использование микроскопического метода исследования препаратов, окрашенных по Граму, для диагностики гонококковой инфекции целесообразно только для1 тестирования клинических материалов, полученных из уретры у мужчин с наличием жалоб и микроскопических симптомов уретрита.

3. Тест-системы на основе методов амплификации нуклеиновых кислот российского производства для диагностики гонококковой инфекции целесообразно использовать для исследования как урогенитальных (полученных инвазивным и неинвазивным путем), так и экстрагенитальных образцов. При этом образцы мочи как от женщин, так и от мужчин являются наиболее приемлемым для пациента и не менее информативным для врача материалом для исследования с целью выявления N. gonorrhoeae, по сравнению с цервикальными образцами и пробами из уретры.

134

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Максимова, Анна Александровна

1. Верещагин, В.А. Устойчивость к фторхинолонам среди российских изолятов Neisseria gonorroeae / В.А. Верещагин, Е.Н. Ильина, М.В. Малахова и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2005. -№ 1.-С. 23-27.

2. Кобенко, Э.Г. Чувствительность клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae, циркулирующих в Екатеринбурге и Свердловской области / Э.Г. Кобенко, Н.М. Герасимова, А.Г. Сергеев и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. - № 4. - С. 41-42.

3. Кубанова, А.А. Антибиотикорезистентность in vitro штаммов N. gonorrhoeae, выделенных от больных с неосложненной гонококковой инфекцией / А.А. Кубанова, М.М. Васильев, Т.В. Припутневич и др. // Вестн. дерматол. венерол. 2005. — № 2. - С. 40-44.

4. Кубанова, А.А. Мониторинг антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae и молекулярные механизмы ее развития в Российской Федерации / А.А. Кубанова, В.М. Говорун, Н.В. Фриго и др. // Вестн. дерматол. венерол. -2006.-№5.-С. 17-24.

5. Сехин, С.В. Определение чувствительности гонококков к антибактериальным препаратам / С.В. Сехин, Д.Л. Вознесенский, М.М. Васильев и др. // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2003. - Т. 5, №2.-С. 175-182.

6. Соколовский, Е.В. Дерматовенерология: Учебник для студ. высш. мед. учеб. заведений / Е.В. Соколовский, Е.Р. Аравийская, К.Н. Монахов и др. / Под ред. Е.В. Соколовского. М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 528 с.

7. Соколовский, Е.В. Инфекции, передаваемые половым путем: Руководство для врачей / Е.В. Соколовский, A.M. Савичева, М. Домейка и др. М.: МЕДпресс-информ, 2006. - 256 с.

8. Соколовский, Е.В. Гонококковая инфекция. Ведение больных. Рекомендации для врачей / Е.В. Соколовский, A.M. Савичева, В.И. Кисина и др. (ред.). СПб.: ООО «Издательство Фолиант», 2008. - 120 с.

9. Ю.Страчунский, JI.C. Чувствительность гонококков к антибиотикам и выбор антибактериальных препаратов при гонококковой инфекции / JI.C. Страчунский, С.В. Сехин, К.К. Борисенко и др. // Инфекции, передаваемые половым путем. — 1999. — № 2. С. 26-29.

10. AGSP. Australian Gonococcal Surveillance Programme. Annual report of the Australian Gonococcal Surveillance Programme // Commun. Dis. Intel!. -2006. Vol. 30, № 2. - P. 205-210.

11. Anderson, J.E. Opposing selective forces for expression of the gonococcal lactoferrin1 receptor / J.E. Anderson, M.M. Hobbs, G.D. Biswas et al. // Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 48, № 5.- P. 1325-1337.

12. Apicella, M.A. Phenotypic variation in epitope expression of the Neisseria gonorrhoeae lipooligosaccharide / M.A. Apicella, M. Shero, G.A. Jarvis et al. // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55, № 8. - P. 1755-1761.i

13. Ashford; W.A. Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae / W.A. Ashford,s

14. R.G. Golash, V.G. Hemming // Lancet. 1976. - Vol. 2, № 7987. - P: 657658.

15. Backman, A. Complete sequence of a beta-lactamase-encoding plasmid in Neisseria meningitidis / A. Backman, P. Orvelid, J.A. Vazquez et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44, № 1. - P. 210-212.

16. Bala, M. Comparison of disc diffusion' results with minimum inhibitory concentration (MIC) values for antimicrobial susceptibility testing of Neisseria gonorrhoeae / M. Bala, K. Ray, S.M. Gupta // Indian J. Med. Res. 2005. -Vol. 122, № l.-P. 48-5к

17. Bessen, D. Interactions of gonococci with HeLa cells: attachment, detachment, replication, penetration, and the role of protein II / D. Bessen, E.C. Gotschlich // Infect. Immun. 1986. - Vol. 54, №1. - P. 154460.

18. Bhat, K.S. The opacity proteins of Neisseria gonorrhoeae strain MS 11 are encoded by a family of 11 complete genes / K.S. Bhat, C.P. Gibbs, O. Barrera et al. // Mol. Microbiol. 1991. - Vol. 5, № 8. - P. 1889-1901.

19. Bignell, C.J. European Branch of the International Union against Sexually Transmitted Infection and the European Office of the World Health

20. Organization. European guideline for the management of gonorrhoea / C.J. Bignell // Int. J. STD. AIDS. 2001. - Vol. 12, Suppl. 3. - P. 27-29.

21. Birch, L. A comparison of nucleic acid amplification techniques for the assessment of bacterial viability / L. Birch, C.E. Dawson, J.H. Cornett, J.T. Keer // Lett. Appl. Microbiol. 2001. - Vol. 33, № 4. - P. 296-301.

22. Birkenmeyer, L. Preliminary evaluation of the ligase chain reaction for specific detection of Neisseria gonorrhoeae / L. Birkenmeyer, A.S. Armstrong // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30, № 12. - P. 3089-3094.

23. Boslego, J.W. Effect of spectinomycin use on the prevalence of spectinomycin-resistant and of penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae / J.W. Boslego,-E.G. Tramont; E.T. Takafuji et al. // N. Engl. J. Med. 1987. - Vol. 317, № 5. - P. 272-278.

24. Caldwell, J.G. Sensitivity and reproducibility of Thayer-Martin culture medium in diagnosing gonorrhea in women / J.G. Caldwell, E.V. Price, G.J. Pazin et al. // Am. J. Obstet. Gynecol. 1971. - Vol. 109, № 3. - P. 463-468:

25. Carroll, K.C. Evaluation of the Abbott LCx ligase chain reaction assay for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in urine and genital swab specimens from a sexually transmitted'disease clinic population /

26. K.C. Carroll, W.E. Aldeen, M. Morrison // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol.36, №6.-P. 1630-1633.

27. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Recall of LCx Neisseria gonorrhoeae assay and implications for laboratory testing for N. gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2002. -Vol. 51, №32.-P. 709.

28. Chaudhry, U. Detection of Neisseria gonorrhoeae by PCR using orfl gene as target / U. Chaudhry, D. Saluja // Sex. Transm. Infect. 2002. - Vol. 78, № 1. -P. 72.

29. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification / J. Compton // Nature. 1991.-Vol. 350, №6313.-P. 91-92.

30. Cook, R.L. Systematic review: noninvasive testing for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae / R.L. Cook, S.L. Hutchison, L. 0stergaard et al. // Ann. Intern. Med. 2005. - Vol. 142, № 11. - P. 914-925.

31. Cornelissen, C.N. The transferrin receptor expressed by gonococcal strain FA1090 is required for experimental infection of human male volunteers / C.N. Cornelissen, M. Kelley, M.M. Hobbs et al. // Mol. Microbiol. 1998. - Vol.27, №3.-P.611-616.

32. Danaher, R.J. Genetic basis of Neisseria gonorrhoeae lipooligosaccharide antigenic variation / R.J. Danaher, J.C. Levin, D. Arking et al. // J. Bacteriol. -1995. Vol. 177, № 24. - P. 7275-7279.

33. Danielsson, D. Biology of Neisseria gonorrhoeae / D. Danielsson // Recent Advances in Sexually Transmitted Diseases / Ed. by J.D. Oriel, J.R.W. Harris.- Edinburgh: Churchill Livingstone, 1986. 122 p.

34. Danielsson, D. Diagnosis of Neisseria infections by defined immufluorescence. Methodologic aspects and applications / D. Danielsson, U. Forsum // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1975. - Vol. 254. - P. 334-349.

35. Deguchi, T. DNA gyrase mutations in quinolone-resistant clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae / T. Deguchi, M. Yasuda, M. Asano et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 1995. - Vol. 39, № 2. - P. 561-563.

36. Delauche, M.C. Gonococcal arthritis. / M.C. Delauche, M.F. Kahn, A. Ryckewaert // Rev. Rhum. Mai. Osteoartic. 1981. - Vol. 48, № 2. - P. 127132. [франц.]

37. Dempsey, J.A. Physical map of the chromosome of Neisseria gonorrhoeae FA1090 with locations of genetic markers, including opa and pil genes / J.A. Dempsey, W. Litaker, A. Madhure et al. // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173, № 17.-P. 5476-5486.

38. Dillon, J.R. Relationship between plasmid content and auxotype in Neisseria gonorrhoeae isolates / J.R. Dillon, M. Pauze // Infect. Immun. 1981. - Vol.33, № 2. - P. 625-628.

39. Donders, G. Microbiological diagnosis of gonorrhoea / G. Donders // Sex. Transm. Infect. 1998. - Vol. 74, № 1. - P. 78.

40. Dougherty, T.J. Involvement of a change in penicillin target and peptidoglycan structure in low-level resistance to (3-lactam antibiotics in Neisseria gonorrhoeae / T.J. Dougherty // Antimicrob. Agents Chemother. 1985. -Vol.28, № 1. - P. 90-95.

41. Edwards, J.L. The molecular mechanisms used by Neisseria gonorrhoeae to initiate infection differ between men and women / J.L. Edwards, M.A. Apicella // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - Vol. 17, № 4. - P. 965-981.

42. Elkins, C. Antibodies to N-terminal peptides of gonococcal porin are bactericidal when gonococcal lipopolysaccharide is not sialylated / C. Elkins, N.H. Carbonetti, V.A. Varela et al. // Mol. Microbiol. 1992. - Vol. 6, № 18. -P. 2617-2628.

43. Elwell, L.P. Plasmids of the genus Neisseria / L.P. Elwell, S. Falkow // The Gonococcus / Ed. by R.B. Roberts. New York: John Wiley and Sons, Inc., 1975.-P. 137-154.

44. Engelkirk, P.G. Physical evidence of a plasmid in Neisseria gonorrhoeae / P.G. Engelkirk, D.E. Schoenhard // J. Infect. Dis. 1973. - Vol. 127, № 2. - P. 197200.

45. Farrell, D.J. Evaluation of AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae PCR using cppB nested PCR and 16S rRNA PCR / D.J. Farrell // J. Clin. Microbiol. 1999. -Vol.37, № 2. - P. 386-390.

46. Feavers, I.M. A gonococcal porA pseudogene: implications for understanding the evolution and pathogenicity of Neisseria-gonorrhoeae / I.M. Feavers, M.C.J. Maiden // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 30, № 3. - P. 647-656.

47. Gerbase, A.C. Global prevalence and incidence estimates of selected curable STDs / A.C. Gerbase, J.T. Rowley, D.H.L. Heymann et al. // Sex. Transm. Infect. 1998. - Vol. 74, Suppl. 1. - P. S12-S16.

48. Gibbs, C.P. Genome plasticity in Neisseria gonorrhoeae / C.P. Gibbs, T.F. Meyer // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - Vol. 145, № 2. - P. 173-179:

49. Gill, M.J. Gonococcal resistance to p-lactams and tetracycline involves mutation in loop 3 of the porin encoded at the penB locus / M.J. Gill, S. Simjee, K. Al-Hattawi et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - Vol. 42, №11. -P. 2799-2803.

50. Hagblom, P. Intragenic variation by site-specific recombination in the cryptic plasmid of Neisseria gonorrhoeae / P. Hagblom^ C. Korch, A.B. Jonsson et al. // J. Bacteriol. 1986. - Vol. 167, № 1. - P. 231-237.

51. Handsfield, H.H. Neisseria gonorrhoeae / H.H. Handsfield // Principles and Practice of Infectious Disease, 3rd ed. / Ed. by G.L. Mandell, R.G. Douglas, Jr., J.E. Bennett. New York: Churchill Livingstone, 1990. - P. 1613-1631.

52. Hjelmevoll, S.O. A fast real-time polymerase chain reaction method for sensitive and specific detection of the Neisseria gonorrhoeae porA pseudogene /

53. S.O. Hjelmevoll, M.E. Olsen, J.U. Sollid et al. // J. Mol. Diagn. 2006. - Vol.8, №5.-P. 574-581.

54. Holmes, K.K. Disseminated gonococcal infection / K.K. Holmes, G.W. Counts, H.N. Beaty // Ann. Intern. Med. 1971. - Vol. 74, №>6. - P: 979-993.

55. Holmes, K. Sexually Transmitted Diseases, 4th ed. / K. Holmes, P. Sparling, W. Stamm et al. -New York: McGraw-Hill, 2007. -2192 p.

56. Ison, С. A. Antimicrobial agents and gonorrhoea: therapeutic choice, resistance and susceptibility testing / C.A. Ison // Genitourin. Med. 1996. - Vol. 72, №4. -P. 253-257.

57. Janda, W.M. Neisseria and Moraxella catarrhalis / W.M. Janda, J.S. Knapp // Manual of Clinical Microbiology, 8th ed, vol. 1 / / Ed. by P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen et al. Washington: ASM Press, 2003. - P. 585-608.

58. Jephcott, A.E. Microbiological diagnosis of gonorrhoea / A.E. Jephcott // Genitourin. Med. 1997. - Vol. 73, № 4. - P. 245-252.

59. Johnson, R.E. Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infections 2002 / R.E. Johnson, W.J. Newhall, J.R. Papp et al. // MMWR Recomm. Rep. - 2002. - Vol. 51 (RR-15). - P. 1-38.

60. Kasper, D.L. Harrison's Principles of Internal Medicine. 16th ed. / D.L. Kasper, E. Braunwald, S. Hauser (eds.) /. N.Y.: McGraw-Hill Co, 2006. - 556 p.

61. Keer, J.T. Molecular methods for the assessment of bacterial viability / J.T. Keer, L. Birch // J. Microbiol. Methods. 2003. - Vol. 53, № 2. - P. 175-183.

62. Kilian, M. Biological significance of IgAl proteases in bacterial colonization and pathogenesis: critical evaluation of experimental evidence / M. Kilian, J. Reinholdt, H. Lomholt et al. // APMIS. 1996. - Vol. 104, № 5. - P. 321-338.

63. King, A. Gonorrhoeae: diagnosis / A. King, C. Nicol // Venereal Diseases. -London: Bailliere Tindall, 1975. 186 p.

64. Kline, K.A. Recombination, repair and replication in the pathogenic Neisseria: the 3 R's of molecular genetics of two human-specific bacterial pathogens / K.A. Kline, E.V. Sechman, E.P. Skaar et al. // Mol. Microbiol. 2003. -Vol.50, № l.-P. 3-13.

65. Knapp, J.S. Historical perspectives and identification of Neisseria and related species /J.S. Knapp // Clin. Microbiol. Rev. 1988. - Vol. 1, № 4. - P. 415431.

66. Knapp, J.S. Neisseria and Branhamella / J.S. Knapp, E.H. Koumans // Manual of Clinical Microbiology, 7th ed. / Ed. by P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, R.H. Yolken. Washington: ASM, 1999. - P. 586-603.

67. Knapp, J.S. Neisseria and Branhamella / J.S. Knapp, R.J. Rice // Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. / Ed. by P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, R.H. Yolken. Washington: ASM Press, 1995. - P. 324-340.

68. Linz, B. Frequent interspecific genetic exchange between commensal Neisseriae and Neisseria meningitidis / B. Linz, M. Schenker, P. Zhu et al. // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 36, № 5. - P. 1049-1058.

69. Lister, N.A. Screening for Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in men who have sex with men at male-only saunas / N.A. Lister, A. Smith, S. Tabrizi et al. // Sex. Transmm. Dis. 2003. - Vol. 30, № 12. - P. 886-889.

70. Little, M.C. Strand displacement amplification and homogeneous real-time detection incorporated in a second-generation DNA probe system, BDProbeTecET / M.C. Little, J. Andrews, R. Moore et al. // Clin. Chem. -1999. Vol. 45, № 6, Pt. 1. - P. 777-784.

71. Luna, V.A. Identification of the conjugative mef gene in clinical Acinetobacter junii and Neisseria gonorrhoeae isolates / V.A. Luna, S: Cousin, W.L.H. Whittington et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44, № 9. -P. 2503-2506.

72. Mahony, J.B. Multiplex PCR for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genitourinaiy specimens / J.B. Mahony, K.E. Luinstra, M. Tyndall et al. // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33, № 11'. -P.3 049-3 053.

73. Manavi, K. Sensitivity of microscopy for the rapid diagnosis of gonorrhoea in men and women and the role of gonorrhoea serovars / K. Manavi, H. Young, D. Clutterbuck // Int. J. STD AIDS. 2003. - Vol. 14, № 6. - P. 390-394.

74. Martin, J.E. New system for cultivation of Neisseria gonorrhoeae / J.E. Martin, J.H. Armstrong, P.B. Smith // Appl. Microbiol. 1974. - Vol. 27, № 4. -P. 802-805.

75. Martin, P.M. Resistance to killing by serum, auxotypes, and disseminated gonococcal infections / P.M. Martin, M. Guibourdenche, J.Y. Riou // N. Engl. J. Med. 1982. - Vol. 307, № 19. - P. 1214.

76. Mayer, L.W. Characterization of plasmid deoxyribonucleic acid' from Neisseria gonorrhoeae / L.W. Mayer, K.K. Holmes, S. Falkow // Infect. Immun. 1974. - Vol.10, № 4. - P. 712-717.

77. Mehaffey, P.C. Evaluation of in vitro activity of azithromycin, clarithromycin, and erythromycin tested against strains of Neisseria gonorrhoeae by reference agar dilution, disk diffusion, and E-test methods /

78. P.C. Mehaffey, S.D. Putnam, M.S. Barret et al. // J. Clin. Microbiol. 1996. -Vol. 34, №2.-P. 479-481.

79. Mistry, D. IgAl protease / D. Mistry, R.A. Stockley // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2006. - Vol. 38, № 8. - P. 1244-1248.

80. Miyada, C.G. A DNA sequence for the discrimination of Neisseria gonorrhoeae from other Neisseria species / C.G. Miyada, T.L. Born // Mol. Cell. Probes. 1991. - Vol. 5, № 5. - P. 327-335.

81. Morse S.A. Neisseria, Moraxella, Kingella and Eikenella / S.A. Morse // Baron S. Medical Microbiology, 4th ed. Galveston: The University of Texas Medical Branch at Galveston, 1996. - P. 217-231.

82. Morse, S.A. High-level tetracycline resistance in Neisseria gonorrhoeae is result of acquisition of streptococcal tetM determinant / S.A. Morse, S.R.

83. Johnson, J.W. Biddle et al.// Antimicrob. Agents Chemother. 1986. - Vol. 30, №5.-P. 664-670.

84. Mullis, K.B. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction / K.B. Mullis, F.A. Faloona // Methods Enzymol. 1987. - Vol. 155.-P. 335-350.

85. Nassif, X. Interactions of pathogenic Neisseria with host cells. Is it possible to assemble the puzzle? / X. Nassif, C. Pujol, P. Morand et al. // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 32, № 6. - P. 1124-1132.

86. O'Rourke, M. Opa-typing: a high-resolution tool for studying the epidemiology of gonorrhoea / M. O'Rourke, C.A. Ison, A.M. Renton et al. // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 17, № 5. - P. 865-875.

87. O'Rourke, M. Genetic structure of Neisseria gonorrhoeae populations: a non-clonal pathogen / M. O'Rourke, E. Stevens // J. Gen. Microbiol. — 1993. -Vol. 139, № 11.-P. 2603-2611.

88. Palmer, H.M. A multiplex polymerase chain reaction to differentiate P-lactamase plasmids of Neisseria gonorrhoeae / H.M. Palmer, J.P. Leeming, A. Turner // J. Antimicrob. Chemother. 2000. - Vol. 45, № 6. - P. 777-782.

89. Palmer, H.M. Evaluation of the specificities of five DNA amplification methods for the detection of Neisseria gonorrhoeae / H.M. Palmer, H. Mallinson, R.L. Wood et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, № 2. -P.835-837.

90. Panke, E.S. Comparison of Gen-Probe DNA probe test and culture for the detection of Neisseria gonorrhoeae in endocervical specimens / E.S. Panke, L.I. Yang, P.A. Leist et al. // J. Clin. Microbiol. 1991. -Vol. 29, № 5. - P. 883888.

91. Peter-Getzlaff, S. Diagnostic value of molecular confirmation assays for Neisseria gonorrhoeae / S. Peter-Getzlaff, J. Luethy, B. Springer // J. Clin. Microbiol. -2007. Vol. 45, № 5. - P. 3856-3858.

92. Phillips, I. Beta-lactamase-producing, penicillin-resistant gonococcus / I. Phillips // Lancet. 1976. - Vol. 2, № 7987. - P. 656-657.

93. Pohlner, J. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease / J. Pohlner, R. Halter, K. Beyreuther et al. // Nature. 1987. - Vol. 325, № 6103. - P. 458-462.

94. Poole, K. Efflux-mediated antimicrobial resistance / K. Poole // J. Antimicrob. Chemother. 2005. - Vol. 56, № 1. - P. 20-51.

95. Radcliffe, K.W. Introduction. European STD guidelines / K.W. Radcliffe // Int. J. STD AIDS. 2001. - Vol. 12, Suppl. 3. - P. 2-3.

96. Ram, S. The contrasting mechanisms of serum resistance of Neisseria gonorrhoeae and group В Neisseria meningitidis / S. Ram, F.G. Mackinnon, S. Gulati et al. // Mol. Immunol. 1999. - Vol. 36, № 13-14. - P. 915-928.

97. Ripa, Т. A variant of Chlamydia trachomatis with deletion in cryptic plasmid: implications for use of PCR diagnostic tests / T. Ripa, P. Nilsson // Euro Surveill. 2006. - Vol. 11, № 11. - E061109.2.

98. Roberts, M.C. Plasmids of Neisseria gonorrhoeae and other Neisseria species / M.C. Roberts // Clin. Microbiol. Rev. 1989. - Vol. 2, Suppl. -P.S18-S23.

99. Roberts, M.C. Erythromycin resistant Neisseria gonorrhoeae and oral commensal Neisseria spp. carry known rRNA methylase genes / M.C. Roberts, W.O. Chung, D. Roe et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol.43, №6.-P. 1367-1372.

100. Roongpisuthipong, A. Gonococcal urethritis diagnosed from enzyme immunoassay of urine sediment / A. Roongpisuthipong, J.S. Lewis, S.J. Kraus et al. // Sex. Transm. Dis. 1988. - Vol. 15, №4.-P. 192-195.

101. Saiki, R.K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / R.K. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel et al. // Science. 1988. - Vol. 239, № 4839. - P. 487-491.

102. Sandstrom, E.G. A survey of gonococcal serology / E.G. Sandstrom, D. Danielsson // Genital Infections and Their Complications: Symposium Proceedings / Ed. by D. Danielsson. Stockholm: Almqvist and Wikseli International, 1975. - 326 p.

103. Schachter, J. Enzyme immunoassay for diagnosis of gonorrhea / J. Schachter, W.M. McCormack, R.F. Smith et al. // J. Clin. Microbiol. 1984. -Vol. 19, № l.-P. 57-59.

104. Schmale, J.D. Observations on the culture diagnosis of gonorrhea in women / J.D. Schmale, J.E., Jr Martin, G. Domescik // JAMA. 1969. - Vol. 210, №2. -P. 312-314.

105. Simons, M.P. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes / M.P. Simons, W.M. Nauseef, M.A. Apicella // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, № 4. - P. 1971-1977.

106. Smith, N.H. Networks and groups within the genus Neisseria: analysis of argF, recA, rho, and 16S rRNA sequences from human Neisseria species / N.H. Smith, E.C. Holmes, G.M. Donovan et al. // Mol. Biol. Evol. 1999. - Vol. 16, №6.-P. 773-783.

107. Sox, Т.Е. Conjugative plasmids in Neisseria gonorrhoeae / Т.Е. Sox, W. Mohammed, E. Blackman et al. // J. Bacteriol. 1978. - Vol. 134, № 1. -P.278-286.

108. Sparling, P.F. Biology of Neisseria gonorrhoeae / P.F. Sparling // Sexually Transmitted Diseases, 3rd ed. / Ed. by K.K. Holmes, P.-A. Mardh, P.F. Sparling et al. New York: McGraw Hill, 1999. - P. 433-449.

109. Sparling, P.F. Vaccines for bacterial sexually transmitted infections: a realistic goal? / P.F. Sparling, C. Elkins, P.B. Wyrick et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91, № 7. - P. 2456-2463.

110. Sparling, P.F. Inheritance of low-level resistance to penicillin, tetracycline and chloramphenicol in Neisseria gonorrhoeae / P.F. Sparling, F.A. Sarubbi, E. Blackman // J. Bacteriol. 1975. - Vol. 124, № 2. - P. 740-749.

111. Swanson, J. Studies on gonococcus infection. IV. Pili: their role in attachment of gonococci to tissue culture cells / J. Swanson // J. Exp. Med. -1973.-Vol. 137, №3.-P. 571-589.

112. Tabrizi, S.N. Evaluation of opa-based real-time PCR for detection of Neisseria gonorrhoeae / S.N. Tabrizi, S. Chen, J. Tapsall et al. // Sex. Transm. Dis. 2005. - Vol. 32, № 3. - P. 199-202.

113. Tabrizi, S.N. A self-administered technique for the detection of sexually transmitted diseases in remote communities / S.N. Tabrizi, B. Paterson, C.K. Fairley et al. // J. Infect. Dis. 1997. - Vol. 176, № 1. - P. 289-292.

114. Tapsall, J. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae. World Health Organization (WHO) report 2001. WHO/CDS/CSR/DSR/2001.3 / J. Tapsall / -Geneva: WHO, 2001. 58 p.

115. Tapsall, J.W. Antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae / J.W. Tapsall // Clin. Infect. Dis. 2005. - Vol. 41, Suppl. 4. - P. S263-S268.

116. Thompson, J. Disseminated gonococcal infection due to a beta-lactamase-producing strain of Neisseria gonorrhoeae. A case report / J. Thompson, J.M, Dunbar, A. van Gent et al. // Br. J. Vener. Dis. 1981. - Vol. 57, № 5. - P.325-326.

117. Unemo, M. Genotypic and phenotypic characterisation of Neisseria gonorrhoeae / M. Unemo /. Linkoping: Univ., 2003. - 104 p.

118. Unemo, M. The porA pseudogene of Neisseria gonorrhoeae low level of genetic polymorphism and a few, mainly identical, inactivating mutations / M. Unemo, ,0. Norlen, H. Fredlund // APMIS. - 2005. - Vol. 113, № 6. - P. 410419.

119. Unemo, M. Neisseria gonorrhoeae- population in Arkhangelsk, Russia: phenotypic and genotypic heterogeneity / M. Unemo, V. Vorobieva, N. Firsova et al. // Clin. Microbiol. Infect. 2007. - Vol. 13, № 9. - P. 873-878.

120. Van Dyck, E. Gonorrhoea // Laboratory Diagnosis of Sexually Transmitted Diseases / E. Van Dyck, A.Z. Meheus, P. Piot (eds) /. Geneva: World Health Organization. - 1999. - P. 1-21.

121. Vazquez, J.A. Ecological separation and genetic isolation of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis / J.A. Vazquez, L. de la Fuente, S. Berron et al. // Curr. Biol. 1993. - Vol. 3, № 9. - P. 567-572.

122. Virji, M. The role of common and type-specific pilus antigenic domains in adhesion and virulence of gonococci for human epithelial cells / M. Virji, J.E. Heckels // J. Gen. Microbiol. 1984.-Vol. 130, №5.-P. 1089-1095.

123. Vorobieva, V. Antibiotic susceptibility of Neisseria gonorrhoeae in Arkhangelsk, Russia / V. Vorobieva, N. Firsova, T. Ababcova et al. // Sex. Transm. Infect. 2007. - Vol. 83, № 2. - P. 133-135.

124. Wang, S.A. Multidrug-resistant Neisseria gonorrhoeae with decreased susceptibility to cefixime Hawaii, 2001 / S.A. Wang, M.V. Lee, N. O'Connor et al. // Clin. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 37, № 6. - P. 849-852.

125. Wang, B. Antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeae isolated in Jiangsu-province, China, with a focus on fluoroquinolone resistance / B. Wang, J'.S. Xu, C.X. Wang et al. // J. Med. Microbiol'. 2006. - Vol. 55, Pt. 9. -P.1251-1255.

126. Wetzler, L.M. Gonococcal lipooligosaccharide sialylation prevents complement-dependent killing by immune sera / L.M. Wetzler, K. Barry, M.S. Blake et al. // Infect. Immun. 1992. - Vol: 60, № 1. - P. 39-43.

127. Whiley, D.M. A new confirmatory Neisseria gonorrhoeae real-time PCR assay targeting the porA pseudogene / D.M. Whiley, P.J. Buda, J. Bayliss et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2004. - Vol. 23, № 9. - P. 705-710. •

128. Whiley, D.M. Exploring «best practice» for nucleic acid detection of Neisseria gonorrhoeae / D.M.1 Whiley, S.M. Garland, G. Harnett et al. // Sex. Health.-2008.-Vol. 5, № l.-P. 17-23.

129. Whiley, D.M. Nucleic acid amplification testing for Neisseria gonorrhoeae: an ongoing challenge / D.M. Whiley, J.W. Tapsall, T.P. Sloots // J. Mol. Diagn.- 2006. Vol. 8, № 1. - P. 3-15.

130. Wiesner, P.J. Clinical spectrum of pharyngeal gonococcal infection / P.J. Wiesner, E. Tronca, P. Bonin et al. // N. Engl. J. Med. 1973. - Vol. 288, № 4.- P.181-185.

131. World Health Organization. STD Treatment Strategies. WHO/VDT/89.447. -1989.-30 p.

132. World Health Organization. Management of Sexually Transmitted Diseases.- World Health Organization. WHO/UNAIDS. 1997. - WHO/GPA/94.1 Rev. 1.

133. Young, H. Cultural diagnosis of gonorrhoea with modified New York City (MNYC) medium / H. Young // Br. J. Vener. Dis. 1978. - Vol. 54, № 1. -P.36-^0.

134. Young, H. Evaluation of ligase chain reaction for the non-cultural detection of rectal and pharyngeal gonorrhoea in men who have sex with men / H. Young, K. Manavi, A. McMillan // Sex. Transm. Infect. 2003. - Vol. 79, № 6. p. 484^186.

135. Zoubkov, M. Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae, and emerging fluoroquinolone resistance in Russia / M. Zoubkov, A. Kubanova, T. Vahnina et al. // Clin. Microbiol. Infect. 2004. - Vol. 10, Suppl. 3. - P. 1592.