Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Регуляция иммунитета к внутриклеточным инфекциям генами комплекса Н-2

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУКГСССР

НАУЧНО-ИССПЕДОВАТЕЛЬСШ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИУ. ПОЧЕТНОГО АКАДОЮКА Н.Ф.ГАУАЛЕЛ

На правах рукописи

АПТ Александр Соломонович

РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА К ВНЛРШЕТОЧШЫ ИНФЕКЦИЯМ ГЕНАМИ КОМПЛЕКСА Н-2 (НА ПРИМЕРЕ ТУБЕРКУЛЕЗА)

(14.00.36 - аллергология и технология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Минздрава СССР.

доктор биологических наук, профессор Л.К. Сонталин доктор биологическая наук Е.З. Сидорова доктор медицинских неук Б.Я. Гергер?

Ведущее учреждение"- Московский Ордена Ленина Государственный медицинский институт им. Н.И. Пирогова ( г. Ыосква).

Защита состоится "тУг..

1991 г. в час

на заседании специализированного совета а 001.07.01 по завдте диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Научн исследовательском институте виидемиологии и микробиологии имен почетного академика Н.О. Гамалея АЫН СССР ( 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией исто ознакомиться в библиотеке НИЙЗЫ им. Н.О. Гвкалел АШ СССР.

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан

Учг-щЛ секретарь сдепчализированного совета доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова

r nil

T А?П

:ертаций

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

кт.уальность темы.

Наиболее обиая и, видимо, наиболее важная концепция, диктую-зя необходимость детального исследования роли МНС в Еосприимчк-эсти, развитии и конечном результате инфекционных заболеваний, -го распознавание различными типами Т-клеток любых антигенных мо-зкул только при условии 4->зйческой связи их процессированных родуктов с молекулами МНС (вииз S. et al. , 1987; Poljak R. , 3£f7) ..-^Различия в эффективности связывания антигенных пептидов эзбудителя продуктами разных аллелей МНС, их презентации продук-ши МНС Т-клеткам и зависящем от МНС репертуаре рецепторов Т-кле-ж могут заметно влиять на общий уровень восприимчивости к ин-зкции, поскольку последний зависит как от факторов естественной ззистентности (контролируемых не-МНС генами), так и от реакций зиобретенного иммунитета, контролируемых МНС.

Кроме того, .ярокое распространение получил популяционный семейный анализ ассоциаций широкого спектра злокачественных, /тоиммушьк, инфекционных и других заболеваний с наследованием 1Плотиио5 МНС человека - комплекса HLA . Дяя некоторых заболе-1ний, в том числе инфекционных, установлен достоверный уровень ■социации (сцепления) восприимчивости с конкретными аллеляыи ге->в или гаплотипов НХЛ (Pine Р. , 1981; De Vriea R. et al. , >88). В частности, это касается значительного увеличения часто-I аллеля №2 у больных туберкулезом по сравнению с контрольной >уппой в разных популяциях человека (Khomenko A. et al. » 1990), о указывает на зависимость предрасположенности к этой инфекции ' МНС.

Несмотря на очевидные предпосылки к всестороннему изучению роли комплекса Н-2 в генетическом контроле восприимчивости к инфекциям, в частности - микобахтериальным, у мышей, подобных исследований крайне мало. Изучение контроля иммунного ответа на антигены микобактерий комплексом Н-2 ( Ivanyi J., Sharp К. , 1986; Huygen К. et al, 1988) показали зависимость уровня Ти В-клеточных ответов от генов Н-2, но не позволила с уверенность» судить об их связи с протективным иммунитетом и типом восприимчивости к вкфекту (чувствительный/резистентный). Свой вклад в подобную неопределенность вносит крайне сложная антигенная композиция возбудителя и, по-видимому, дихотомия в типе ответа на разные антигены - индукторные реакции на одни антигены и супрес-сорные на другие ( Oliveira D., líitchiscm N. , 1989). Все se,

сцепление контроля восприимчивости с комплексом Н-2 при мнкобак-Тйриозах было установлено 3 отношении U. lepraemurium ( Curtis j. et al. ,1982), но картирование генов класса I и II, контролирующих инфекцию, проведено не было.

Необходимость получения четких данных о контроле комплексом Н-2, гомологом комплексе тл человека, такой.важной инфекции как туберкулез а отсутствие сколько-нибудь надежной оценки корреляции мевду иммунным ответом и восприимчивостью при большинстве инфекций обусловливает актуальность темы исследования и диктует необходимость комплексного подхода к проблеме: изучение генов класса I и класса II, иммунного ответа in vivo и in vitro , восприимчивости и иммунного ответа, вакцинации и заражения. Цель и ¡здачи исследования.

Целью исследования был всесторонний анализ регуляции взаимодействия паразит-хозяин комплексе«» Н-2 нз модели эксперименте ль-

го туберкулеза. На основании изучения роли генов- комплекса Н-2 формировании противотуберкулезного иммунитета, вкладе этих íob - в зависимости от аллельной композиции у хозяина - в вос-?имчивость к инфекции (определение аллелей "чувствительности" 'резистентности"),влияния комплекса Н-2 на »ффективность вак-шшш, связи мевду уровнем ответа и сопротивляемостью к инфекции га разработана концепция генетической регуляции балансовых отнг-шй между паразитом и хозяином, осуществляемой генами МНС. В [зи с этим были поставлены следующие задачи:

-определить уровень восприимчивости к туберкулезу у кярокой юли линий мышей, конгенных по Н-2;

-картировать на рекомбинантннх по Н-2 линиях предполагаемые 1личия в уровне восприимчивости;

-проверить наличие корреляции мевду степеньи чувствитель-ти к инфекции и уровнем Т-иммунитета in vivo ;

-проанализировать генетическую рестрикции ответов не мико-териальные антигены, в том челе на уровне клонов Т-клеток; -изучить возможную связь супрессии ответа при эксперименталь-туберкулезе с генетической композицией комплекса Н-2; -установить наличие или отсутствие корреляции меяду уровнем t ета Т-клеток и синтезом антишкобактериальных антител у мышей, генных по Н-2. чная новизна.

Впервые установлены достоверные различия по уровню оопро-ляемости к туберкулезной инфекции у мншей в зависимости от зльней структуры комплекса Н-2. Показано, что от генов комп-

Н-2 зависит не только восприимчивость к инфекции, но и фор-звание нротективного действия живой вакцины bcg , поскольку

носители гаплотипа Н-2* вообше не обнаруживают эффекта вакцинами. Доказана корреляция мевду способностью к развитию реакции ГЗТ на антигены ыикобактерий после заражения и сопротивляемостью к инфекции.

Впервые на инфекционной модели удалось показать, что гены класса П комплекса Н-2 не только являются Ir -генами, контролирующими реакции Т-клеток на антигены возбудителя через механизмы презентации, но и представляют собой ir -гены протективного иммунитета in vivo . Показано, что при прочих равных условиях аллель I-Ak выступает в роли "резистентного", а аллель I-Ab -"чувствительного" Ir-гека, хотя это не всегда коррелирует с itx активностыэ в качестве Ir -генов реакций иммунитета. На уровне популяций иммунных лимфоцитов и Т-клонов установлена генетическая рестрикция ответов на антигены ыикобактерий по обоим генам класса П, I-A и 1-Е, и приведены данные и соображения о вероятных физиологических различиях значения этих двух типов рестрикции в формировании противотуберкулезного иммунитета.

С помощью полученных оригинальными методами аллоантисыворо-ток (авт.свидетельство * 1470059) установлено, что супрессия иммунного ответа, чрезвычайно характерная для тяжелой туберкулезной инфекции у мыши и человека, помимо других фактс-ров, обусловлена I-J-положительными клетками. Впервые на vor■ли туберкулеза показана важная роль локуса 1-Е в формировании супрессии ответа. В частности, для снижения синтеза антител к антнгенам микойакте-р-й, являющегося благоприятным фактором для появления относительно резистентных фенотипов, необходима полноценная экспрессия молекул 1-в . Это позволило подтвердить концепцию о необходимости балансовых отношений меж пу индукцией отчета и супрессии npf

утриклеточных инфекциях.

Разработана новая модель для изучения роли цитотоксических еток против инфицированных микобактериями макрофагов в течении фекции. Установлено,что даже при первичной локализации вирулент-х микобактерий искдючительно в аллогенньвс по продуктам класса I крофагах, безусловно разрушаемых а организме хозяина, течение Секции столь же неблагоприятно, как при обычном типе заражения/ л данные позволяют сделать вывод, что действие цитотоксических еток, в том числе рестриктированных по продуктам класса I Т-кил-ров CD8+ на инфицированные клетки-мишени, не участвует (или :ьма малозначимо) в формировании протективного иммунитета при 5еркулезе.

1ктическая значимость.

Хотя работа носит экспериментальный характер, ее практичес-i значимость определяется, во-первых, важностью для здравоохра-шя самой изучаемой инфекции (по данным ВОЗ, туберкулезом пора-ггся не менее 30 миллионов человек в год и до 3-х миллионов че-iük в год умирает от этой болезни), и, во-вторых, высоким уров-I эволюционной, структурной и функциональной гомологии между •• ! человека - комплексом я la - и мыши - комплексом Н-2. Впер- ! i выполненное комплексное исследование участия комплекса Н-2 >азличных аспектах регуляции взаимоотношений организма-хозяина шобактериямн подводит теоретическую базу под интенсивно изу-мую проблему " HLA и туберкулез" и намечает пути дальнейших ледований. Особенно важной может оказаться связь конкретных . лотипов с отсутствием пффекта вакцинации. Кроме.того, заслу-ает внимания особая роль продукта 1-Е в формировании баланса ду супрессией и ответом при туберкулезе, поскольку с аналогом

гена 1-Е у человека - локусом m - сцеплены (ассоциированы) уровень резистентности к туберкулезу и лепре и клинические про явления этих инфекций. Большая часть проведенных исследований финансировалась ВОЗ.

Материалы диссертации вошли э монографии "Иымуногенетика инфекционных заболеваний" (Авербах М.Ы. с соавт., 1985), "Проб лемы наследственности при легочной патологии" (1990) и в "Руко водство по инфекционной иммунологии", готовящееся к печати. Крн ме того, эти материалы используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ЦНИИГ и курсантов ЦПУ. Материалы диссертации неоднократно использовались в разработках ВОЗ. Ряд методов излс жен автором в "Практических рекомендациях по проведению иммунологических исследований при туберкулезе и других заболеваниях легких" (1985), рекомендованных Минздравом СССР к внедрению на всесоюзном уровне. Апробация работы.

Основные положения работы были заложены на Пленумах пробле ной комиссии АМН СССР "Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология" в Саратове (1987) и Ленинграде (1990), на ХУШ Всемирном генетическом конгрессе в Торонто (1989), на международно! конференции по фтизиатрии в Москве (1990). По материалам диссертации делались доклады на научных конференциях и межлабораторньп семинарах в ЦНИИ туберкулеза (1985-1990), Центре по изучению генетики реэистента хозяина Университета Мак Гилла в Монреале (1990) и Исследовательском центре по туберкулезу Хаммерсмитов-ского госпиталя в Лондоне (1989).

По темо диссертации опубликовано 20 статей и одна моногргфи

Объем работы.

Диссертация изложена на 270 страницах машинописи и состоит -13 введения, обзора литературы (2 главы), изложения собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и библиографического указателя, включающего ссылки на 18 отечественных и 478 иностран ■шх работ. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ

Животные. Работа была проведена на 29 независимых инбред-1ых, конгенных, рекомбинантных и мутантной по Н-2 линиях мышей, i также гибридах F1 и потомках возвратных скрещиваний ВС!.

Названия линий, гаплотипы и генотипы Н-2 приведены в табли да при изложении собственных результатов. В экспериментах ис-гальзованы животные в возрасте 2-4 месяцев, которые содержались ! стандартных условиях. Поддержание инбредных линий осуществляюсь братско-сестринскими скрещиваниями с ведением родословных ! племенного журнала, согласно рекомендациям, изложенным в руко-юдствах Н.Н.Медведева (1966) и З.К.Блондовой и соавт. (1983),

Микобактерии. В работе использованы два штамма микобактерий: шрулентный Ы. tuberculoaia H37Rv И вакцинный И. bovis ВСО. )ба они поддерживались и готовились к введению в стандартных ус-говиях. После 3-х недель культивирования на среде Левенштейна-1енсена собранная бактериальная масса подсушивались на фильтре, свешивалась, суспендировалась в физиологическом растворе з кончит рации I мг/мл и хранилась лри -70°С до использования.

Заражение и вакцинация. Культура М. tuberouloeis H37Rv изодилась в латеральную хвостовую вену в дозе 25 мкг/мышь (соот-етствует 2x10° КОЭ на среде Левенштейна-Йенсена) в объеме 0,5 мл

физиологического раствора (Авербах U.M. с соавт., 1980). Регистрация гибели мышей проводилась ежедневно, начиная с 15 дня после заражения.

Культура ы. bovis BCG вводилась подкожно в две точки спины в дозах, указанных при изложении результатов. Оптимальны! интервал для получения вакцинного эффекта между вакцинацией и заражением составил, по результатам предварительных опытов, 4-i недель, поэтому культура BCG вводилась впоследствие за 5 недел до заражения.

Иммунизация микобактериальными антигенами. Для получения иммунных лимфоцитов без предварительной системной вакцинации ил заражении, мышам вводили в подушечки задних лап один из слздуюда препаратов: полный адьювант Фрейнда, содержащий убитые микобакт< рии H37Ra - при исследовании супрессии отаета клетками заражение го легкого; дезинтегрированный ультразвуком растворимый препарат (соникат) H37R* в неполном адыованте Фрейнда - для определения уровня антител и пролиферативного ответа клеток регионарных лимфоузлов; аналогичный препарат BOG - для получения Т-клонов из регионарных лимфоузлов. Концентрация ыикобактериального материала составляла: I мг/пл 11АФ, I мг/мл H37Rv > V мг/мл BOG

Реакция ГЗ'Г, Прямое измерение туберкулиновых проб (реакция ГЗТ в подушечке лапы) проводился по описанному ранее методу (Авербах М.М. с соавт., 1980).

Лекальный перенос ГЗТ проводили путем введения 40 мкл полу-

А

ченной суспензии неприлипающих клеток (2x10 /мышь) в правую заднюю лапу интактных реципиентов, добавляя в среду 10 мкг/мл PPD (Никоненко Б.В. с соавт., 1989). Контрлатерально вводились такие же клетки без антигена.

Антитела к клеточным маркерам и обработка клеток. Гипериммунные" антисыворотки AKR vg СЕЛ, анти-Thyl .2, И ЗН vb 5И> анти- l-Jk , были приготовлен с помощью 6-7-кратных внутрибрю-аинных иммунизации реципиентов, в первом случае клетками селезенки, а во втором случае - КонА-бластами тимоцигов доноров, с

г

качельными интерЕалами, в дозе 10-15x10 клеток на мышь, по ранее описанным методам (Апт А,С. с соавт., 1984; Загретдинова З.М. : соавт., 1990).

В работе были использованы также моноклональные антитела

»

СмДт) против продуктов класса П комплекса Н-2 и маркеров CD4 и. CD8 : I0-2-I6, анти-1-Ак, и 13/4, анти-1-Ек, ( Oi V. et al., [97В); анти-ЬЗТП (?itch J., 1981); H35-I7.2, anrw-Lyt2 (Pierree M. et al. , 1982),* 13V18 , анти- Lyt2.1 ( Cederlane).

Цитотоксическая обработка клеток проводилась в 2 этапа с шкубированием суспензий при 4°С с антителами и при 37°С с комплектом по I часу с последующей отмывкой.

Пролитеративные тесты. Клетки лимфоузлов зараженных или им-|унизированннх мышей культивировали 72-96 часов в лунках 96-лу-гочного плоскодонного планшета в атмосфере Ъ% COg при 98/6 влаж-

с.

¡ости в полной культуральной среде при концентрации 2x10 клеток к

I мл (4x10 клеток на лунку) в объеме 200 мкл. В качестве ис-очника микобактериальных антигенов использовался PPD в конеч-ой концентрации в культуре 10 мкг/мл или (при анализе Т-клоноп) оникат BCG в той же концентрации. Контролем служили культуры ез добавления антигена или с добавлением убитой облучением 2,5 Мрад) культуры s. nureuo , или овальбумина (,0VA ) в той е концентрации. Пролиферация оценивалась по включению радиопк-ивной метки (синтезу ДНК). Интенсивность пролиферации выражали

либо ь абсолютных цифрах (число распадов в минуту) либо в ьиде индекса стимуляции.

Клонирование Т-лимфоцитов. Мыши СВА иммунизировались сони-катом BCG в неполном адьюванте Фрейнда в подушечки обеих задн! лап. Через 9-14 дней регионарные лимфоузлы удалялись, готовила« суспензия клеток в полной кульгуральной среде, и клетки культи;

с.

ровали в концентрации 5-8x10 /мл в 7-10 мл среды во флаконах нг 25 мл в вертикальном положении с антигеном в концентрации 10 ыкг/мл. Через 48 часов часть клеток, обогащенная бластами на градиенте Фиколла 1,077, 20 мин,, 2000 g, титровалась лимитирук щими разведениями до концентрации 5-50 клеток в I мл (1-10 клет на лунку) в полной культуральной среде, содержащей антиген, 2x1 облученных (2 Гр) сингенных клеток селезенки без эритроцитов и 1Ъ% "кондиционированной" полной среды в качестве источника ИЛ2.

Через 14-18 дней клоны с наиболее выраженным ростом рести-мулировали в тех же лунках (с заменой 75%'среды) фидерными клет ками, антигеном и ИЛ2. Через 10-14 дней растущие клоны переноси ли в лунки 24-луночного планшета с одновременной стимуляцией

¿г

(I ыл полной среды с ИЛ2, 1,5x10- клеток фидера, 10 мкг антигена на лунку), и затем повторяли циклы стимулирования с периодическим переносом клеток в новые лунки по мере роста клона кажды 10-16 дней.

Определение уровня антител к микобактериальным антигенам в сыворотке крови. Мышей разных линий иммунизировали в подуиечк. обеих задних лап соникатом H37Rv и на 14 день забирали кровь из ретроорбитального синуса. После отделения сыворотки в ней он ределяли содержание антител к микобактериальным антигенам метод; иммушфе^ментного анализа (USA) ( Engvar В. , Perlrean Р. ,19'

Статистическая обработка проводилась общепринятыми методами вариационной статистики (Плохинский H.A., 1970), используя критерий Стыодента для оценки достоверности различий.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Влияние комплекса Н-2 на восприимчивость к инфекции и эффективность вакцинации_

Д 'S

Заражение мышей умеренной дозой (10 - Ю КОЕ) М. tuberculosis внутривенно вызывает легальнуо инфекцию, развивающуюся в течение 20-70 дней в зависимости от генотипа и сопровождающуюся постоянным нарастанием популяции возбудителя. Это позволяет исследовать генетический контроль заболевания, в том числе со стороны генов Н-2. Естественно, что для оценки участия комплекса Н-2 в контроле восприимчивости могут быть использованы только конгенные по Н-2 линии, поскольку генетическая основа, 5ключающая такие гены, как Bcg , ТЪс-1 и др. (см. выше), влияет ta выживаемость в большей степе!»:, чем Н-2.

В первой с ери» экспериментов было определено среднее время «живания и уровень Г31 на туберкулин у мышей, несущих 8 из 12 звестных независимых лабораторных гаплотипоз Н-2 на генетически основе C57BL ДО (сокращенно BIO). „

Результаты представлены в таблице I. Все линии разбились а две группы: более чувствительные к инфекции со сроком жизни 3-26 дней и более резистентные (32-41 день). Различия между лю-ыми представителями разных групп статистически достоверны, тога как в пределах одной группы линии нб бтличаютсй -(различия межу BI0.BR и ВЮ.М - на границе достоверности) .Поскольку всо эти лнии различаются между собой только по генам комплекса Н-2, по-

лученный результат доказывает участие комплекса Н-2 в ог.ределени общей восприимчивости к инфекции.

Таб: -ца 1

Влияние независимых гаплотипов Н-2 на выживаемость и реакцию ГЗТ при заражении интактных мышей

Линия | Гаплотип \ и х) | ГЗТ±щхх) результатххх^

C57BL /10 b 25,8+1,7 0,14+0,04 s

C57BL/5 b 24,7+1,4 0,16+0,03 s

BI0.WB ü 3 23,7+2,0 0,15+0,03 s

BI0.SM v 23,5+1,8 0,12+0,02 s

ВЮ.Б1 q 26,6+1,5 0,18+0,03 s

BI0.RIII X 25,2+2,1 0,18+0,03 s

B10.D2 d 38,7+2,1 0,24+0,04 r

BI0.BR k 41,2+4,0 0,24+0,05 r

БЮ.М í 32,3+2,0 0,13+0,03 r(i)

х) Среднее время выживглия и ошибка средней хх) 24-часовак реакция на туберкулин - утолщение лапы (мм) ххх) s -чувствительный фенотип; г - резистентный фенотип

Оценка уровня реакции ГЗТ на туберкулин позволила установить, что все высокочувствительные к инфекции линии отличались низким уровнем ГЗТ, тогда как более резистентные линии Б10„В2 и BI0.B8 давали более еысокий уровень реакции. Таким образом, лила ответа in vivo коррелировала с уровнем резистентности. Йскл чением оказались мьпш линии BI0.1.Í (К-2* ), которые, будуш относительно резистентными (хотя и менее резистентными» чем две другие линии, H-2d и ií-2* ), давали ответ в реакции ГО!' на уров-

¡е высокочувствительных линий. Этот факт был затем'проанали-ирован Подробнее.

Для картирования генов комплекса Н-2, определяющих разли-мя в уровне резистентности, эксперимент, аналогичный описан-юму, был проведен на рекомбинантах по Н-2, несущих аллели ло-у -ов всех трех классов, унаследованных от родительских гапло-ипов с разным уровнем резистентности. Результаты, приведенное | таблице 2, позволяют сделать вывод о достаточно сложном влия-1ии аллелей генов комплекса Н-2 на резистентность к инфекции.

Таблица 2

Типирование рекомбинантов по Н-2 по выживаемости и реакции ГЗТ х)

7

1-

! СВВ+

ГЗГ+ а • ! Результат

Линия I

Генотип Н-2

1К1А1Е131Р1

110. А к к к а 38,7+2,9 0,21+0,02 ; . г

Я0.А(2Я) к к к а ь 41,0+3,1 _ хх) г

110,А(4 И) к к - ь ъ 36,1+3,3 0,26*0*04 г

Я0.А(5Н ) Ъ Ь Ъ/к а а 38,1+2,8 т

ИЮ7 Ъ Ь - ъ а 36,3+3,0 г

)10.я (9н ) э а э/к а а 40,845,7 0,23+0,05 г

по.шп Ь к к к ч 35,8+2,4 0,23+0,03 г

ИЮ8 Ъ Ъ - я ч 24,9+1,2 0,13+0,02 э

1 к к к А а 62,8+4,2 С,31+0,05 г

1.ть а к к к (I 65,3+5,1 0,29+0,04 г

1.ТН а э - а а 56,7+4,2 0,25+0,04 г

х) См. примечания к таблице I :х) Не тестировалось

Во-первых, СВВ мышей линии 4н оказалось достоверно выше, чем у мышей BIO. Эти линии отличаются лишь аллелями генов Н-2К и I-A (продукт 1-Еь у BIO и рекомбинантная молекула у 4R не экснрессируются на клетках), Если учесть, что резистентной оказалась также линия ВЮ.ЫШ , у которой ген Н-2К нес« аллель ъ s как и у BIO, а ген 3-А - аллель k , как у 4R , i этот результат указывает на вероятную роль аллелей генов класса I-A в определении восприимчивости к инфекции. Благоприятное влияние аллеля I-Ak подтверждается и тем, что все 7 тестированных линий, несущих аллель I-A* (табл.1 и 2) оказались относительно резистентными к инфекции.

Во-вторых, сравнение линий и вю , отличающихся тол

ко по генам H-2d/l , позволяет сделать вывод о протективном влиянии аллеля(ей) Dd по сравнению с . Протективный эффект аллеля подтверждается относительно высокой резистентностью мышей 5R и 9R . Отметим также, что совместное наследование "протективных" аллелей I-A k и Dd не приводит к кумулятивному эффекту: СВВ линии BIO.А ( AkDd ) не отличается от 2й , 4R ( AkDb) и 9R ( квъй ).

Единственным высокочувствительным рекомбинантом по Н-2 ока залась линия BW8 , которая происходит от двух высокочувствительных гаплотипов Н-2 b и Н-2 4 и не несет аллелей Ак и Dd способствующих пролонгированию жизни после заражения. Этот впол на ожидаемый результат интересен, однако, тем, что позволил убе даться в полной корреляции между СВВ и уровнем развития ГЗТ у зараженных яивотных: единственная высокочувствительная линия НЮ8 среди всех тестированных рекомбинантов оказалась и единственной неотвечающей в реакции ГЭГ на антигены микобактерий.

Предполагаемое участие комплекса Н-2 в определении уровня осприимчивости к туберкулезу через механизмы приобретенного им-унитета к возбудителю подкрепляется в описанных опытах жесткой орреляцией между уровнем ГЗТ и выживаемостью. В этой связи пред-тавлялось необходимым исследовать влияние комплекса Н-2 на эф-ективность вакцинации BCG против летальной инфекции.

В таблице 3 суммированы результаты анализа панели конген-ьгх по Н-2 линий по двум параметрам: протективный эффект двух оптимальных" доз вакцины и уровень ГЗТ у вакцинированных и заем зараженных мышей. Полученные данные показывают, что вакцина-ля всо приводит к достоверному увеличению сроков жизни и уров-ü ГЗТ почти у всех тестированных линий (ср. с табл.1 и 2). На эне вакцинации BCG нивелируются различия между носителями ал-елей 1-Лк - 1~АЪ и 0d- Db . Вместе с тем, имеются весьма

ггересние исключения. У носителей гаплотипов H-2V (BIO.SM ) f

H-2 (ВЮ.М) значительно слабее, чем у .других линий, выраже-5 усиление реакции ГЗТ в результате вакцинации. Более того, если злее низкая доза всо (0,5 мг/мышь) все же оказывает на мышей Ю.SM и ВЮ.М протективный эффект (на последних - весьма сла->»й, достоверно меньший, чем на другие линии), то введение BCG дозе I мг/мышь вообще не обладает защитным действием и даже шжает срок выживания у мышей ВЮ.М. Отметим, что эта парадок-итьная реакция на вакцинацию всо , также как и уровень протек-п! у "обычных" линий не-зависят от фенотипа, определяемого по /ветвителыюсти к первичному заражению, поскольку мыши ВЮ.М фенотип - г ) и BIO.SM (фенотип - а ) при типировании в пря-)м заражении попали в paaiwe классы (табл.1). Полученные дан-je, во-первых, подтверждают наличие корреляции между такими

Таблица 3

Эффективность вакцинации двумя дозами вс с у конгенных по Н-2 линий мышей*^

*................I ■ 1 1 I ...................— I " ......................I ----,—

Линия ¡Гаплотип} Вакцинация О,С мг | Вакцинация I мг. ¡Эффективность

| фенотип | СВВ+ ш | ГЗТ+ т | СВВ+ ш | ГЗТ+ т | доза I | доза 2

BIO ъ (э) 55,3+7,1 0,37+0,08 66,8+6,9 0,45+0,17 + +

BIO. D2 d (D 63,7+5,4 0,40+0,07 69,7+5,3 0,43+0,11 + +

BIO. WB J (e) 52,5+6,9 0,43+0,10 49,6+4,4 0,41+0,09 + +

BIO. br Je (r) 55,8*5,6 0,32+0,05 52,7+5,8 ¿3,36+0,07 + +

BIO.A а (r) 72,4+7,3 0,46+0,09 75,3+9,6 0,48>+0,I4 ' + +

4r h4 (r) 56,8+6,6 0,39+0,07 64,2+7,1 0,36+0,08 + +

BIO.mbr bgl (r) 52,9+5,2 0,34+0.05 63,8+7,2 0,36fO, 06 + +

BIO. sm v (8) 56,1+8,3 0,25+0,04 26,8+1,2 0,22+0,03 + -

BIO.M i (r) 45,7+3,2 0,24+0,05 28,1+5,1 0,24+0,04 + -

х) Мышей вакцинирювали подкожно за 5 недель до заражения H37Rv . Уровень ГЗТ определялся через 15 дней после заражения (7 недель после вакцинации bcg ). Подчеркнуты параметры, достоверно отличающиеся от общего массива данных.

юличественными показателями как уровень ГЗГ и восприимчивость, i во-вторых, позволяют сделать практически важный вывод о зави-:имости между гаплотипом МНС и эффективностью вакцинации разными дозами живой вакцины BCG.

В таблице 4 приводятся результаты сравнения двух линий мы-)ей, несущих гаплотип H-2f на разных генетических основах -¡10, обусловливающей низкий уровень естественной резистентности," I А - высокорезистентной основе А. Будучи достоверно резистенг-iee линии BIO.M (Н-2* ), линия А.CA (Н-2* ), тем не менее, так-;е не только не обнаруживает протективного эффекта вакцинации со в высокой дозе, но и характеризуется снижением СВВ после акцинации и очень низким уровнем ГЗТ. Таким образок, гаплотип действительно обусловливает дефект протективного иммуни-ета, коррелирующий с неспосббностью отвечать усиленным разви-ием ГЗТ на микобактериальные антигены после вакцинации BOG.

Таблица 4

Влияние гаплотипа Н-2* на эффективность вакцинации

BOG в высокой дозе

Т

Линия | Вакцинация

СВВ+

ГЭТ+ га

10. М 10. М 10. М .CA .CA

0,5 мг I мг

I мг

32,3+1,9 45,7+3,2 28,1+2,1 55,7+2,2 45,6+2,5

0,18+0,03 0,24+0,05 0,24+0,04 0,20*0,03 0,19+0,04

'Общий вывод из проведенного анализа должен, по-видимому, 1клю«аться в том, что гены комплекса Н-2 участвуют в регуляции

противотуберкулезного иммунитета, в том числе влияя на протек-тивные реакции. Многообразие этого влияния заключается, во-первых, в том, что уровень резистентности зависит от аллелей генов класса I (область D ) и класса П (локус I-A, а может быть и 1-Е), и во-вторых, в различиях между гашютипаш по развитию резистентности к первичному заражению и к заражению на фоне вакцинации BCG Поскольку Н-2 представляет собой комплекс генов иммунного ответа, дальнейший анализ был связан с изучением влияния генов Н-2 на реакции иммунитета к антигенам микобактерий.

В таблице 5 приводятся данные, характеризующие пролифератив-ный ответ иммунных к соникату H37Rv лимфоцитов регионарных иммунных лимфоузлов мышей различных линий на специфическук ( ppd , H37Rv ) и поликлональнув (Кон А) активацию. Следует отметить, что, несмотря на существенный разброс в спонтанной (в отсутствии стимула) и стимулированной антигенами и Кон А пролиферативной способности лимфоцитов мышей разных линий все они, за исключением BI0.M, характеризовались выраженной способностью к ответу на оба использованных микобактериальных антигенных препарата. Ответ на антиген, использованный для иммунизации, во всех случаях был выше ответа на ppd , однако и последний стимулировал заметный уровень пролиферации. Напротив, лимфоциты мышей BI0.M вообще не стимулировались ppd и очень слабо отвечали на соникат B37Rv . Этот дефект был специфичен и не объяснялся ни низким уровнем общей пролиферативной активности без стимуляции (такой же отмечался у многих линий), ни нарушениями жизнеспособности клеток или невосприимчивостью к активирующим сигналам (клетки BI0.M отвечают на Кон А не хуже клеток других линий мьгаей).

Таблица 5

Пролиферативный ответ in vitro иммунных лимфоцитов мышей ионгенных по Н-2 линии х)

! Линия ! Имп/мин при стимуляции

1 j - j PPD I H37RV j Кон А

BIO 320+108 3049+593 II255+I429 107919+7692

BIO. D2 187+49 781+63 6227+802 85140+8455

BIO. WB 3298+1007 20995+2340 29965+4195 I08I78[+20II7

BIO. SM 197+60 834+89 4884+638 71579+5346

BIO.M 263+91 330+108 1092+493 72845+3092

4R 37I+II9 2074+399 6630+1005 48775+2666

BIO. MSR 566+127 5715+1018 14329+3692 61106+6505

BIO.fflT 972+244 5I98+I38I I089I+I080 71652+4545

l 3I0I+III8 22724+3197 45377+3359 8I02I+I03I0

I.Tb 1239+383 8085+946 28420+4050 164854+20586

\.TH 1572+305 15671+2300 36037+5703 163474+26909

с) Мышей иммунизировали в подушечки лап 40 мкл сониката H37Rv (I мг/мл) в неполном адыованте Фрейнда в объеме 40 мкл. Через 18 дней суспензии регионарных лимфоузлов стимулировали PPD (Юмкг/мл), соникагом H37Rv (10 мкгумл) в течение 72 ч, или Кон А (3 мкг/мл) в течение 48 часов с добавлением 3Н-тимидина на лунку на последние 8 ч инкубации.

На рис Л данные, характеризующие ответ иммунных лимфоцитов, :редставлены в виде индексов стимуляции (отношений включения Н-тимидина в опыте и контроле). Наряду с линиями, дающими высо-ий ответ на оба препарата микобактериальных антигенов (BIO, I0.MBR ) или характеризующимися средним уровнем ответа на оба нтигена ( 4Н , А, A.Tl), отмечается значительная разница в за-

рис. 1 "!ролпфератив1Шй ответ на микобактериалыше антиген) РИ) (засггр: ховашше столбцу) и соникат н37Иу (н< заштрихованные столбцы лммунизнроьакта соникатоы мшей, конгешшх по Н-2. ИС = индекс стимуляции.

юимости от стимула у других конгенных линий, которая не может лъ исследована подробнее в подобных экспериментах ввиду слож-эсти антигенного состава PPD и грубого соникага H37Rv . Тем э менее, линия BI0.M - единственная, у которой ответ на мико-1ктериальные антигены снижен до очень незначительного.

Этот эксперимент дает все основания полагать, что отсутст-íe протективного эффекта вакоинации BCG у мышей BI0.M имеет им-/нологические причины и связано с нарушением ответа Т-клеток гих мышей на антигены ыикобактерий. Безусловно, необходимы до-злнительные исследования, чтобы установить природу обнаружение дефекта гаплотипа H-2f , поскольку он может быть связан с аруаениями презентации, распознавания и активной супрессией гвета. Исследование этого вопроса может иметь большое практи-зское значение, так как известны популяции человека (например, Южной Индии - ВОЗ, 1983), где вакцинация BCG оказалась неэф-зктивной. Есть основания полагать, что это связано с генетически причинами, и наши результаты наводят на мысль о необходимос-1 поиска гаплотипов Н1Л , "дефектных" по отношению к ответу на ^кобактериальные антигены в условиях вакцинации и/или иммуниза-1И. Важно подчеркнуть, что популлционный или семейный анализ но-г отелей заболевания по системе ньл при данной постановке вопро-i вряд ли эффективенгмыши BI0.M не отличаются от других чувстпи-елъных к туберкулезу линий по восприимчивости к заражению, но езко отличаются по эффективности вакцинации ВСG и ответу Иймун-ых Т-клеток на антигены микобактерий.

П. Генетическая рестрикция ответа на мико-бактериальные антигены_

Высокочувствительные к туберкулезу конгенные линчи на генетической основе BIO (фенотип s ) характеризуются, как было показано в предыдущей главе,чрезвычайно низким уровнем реакции ГЗТ после первичного заражения. У более резистентных линий с фенотипом г Т-клеточный иммунный ответ достоверно выше, хотя и не достигает величин, характерных для ответа на "неинфекционные" антигены. Гранулематозные и воспалительные реакции при инфекциях обнаруживают двоякое влияние"на конечный результат заболевания, поскольку не только способствуют элиминации возбудителя к блокированию диссеминации, но и приводят к деструктивным изменениям в тканях. Все же почти полное отсутствие ответа у линий а вряд ли обеспечивает оптимальный баланс между возбудителем и хозяином, vio подтверждается быстрой гибелью этих животных.

В связи с этим представлялось разумным исследовать возможную связь между уровнем Т-клеточного иммунитета и сроком гибели у зараженных мышей. Учитывая, что линии BIO и 4R , отличающиеся по СВВ, несут разные аллели только двух локусов, Н-2К и I-A, а участие в контроле резистентности гена Н-2К не установлено, было проведено сравнение динамики пролиферативного ответа in vitro в присутствии ppd лимфоцитов зараженных мышей 4r и BIO (рис.2). У высокочувствительных мышей BIO ответ на ppd остается очень низким даже на пике (15 день). Напротив, ответ лимфоцитов 4R рр вивается до эначимчх величин на пике (15-20 дни) и лишь затем падает. Таким образом, большая резистентность мышей 4R к инфекции коррелирует с более высоким уровнем и медленнее наступающей супрессией пролиферации Т-клеток а присутствии fpd in vitro

ис

5

10

го 25 30 35 (срок послэ яара.?г>1шя - Д'-пт)

Рис. 2. НоолисьеретпвтЯ ответ in vttr<ra fpö клет-ч

лимфоузлов ».'vrrgil 4Я (кривая I) и BIO (уху.rar. 2), заражениях туберкулером. Стрелки Ä п Б гт/е-шл СВВ нксей BIO и 4R , соответствен. . НО - и"г«кс стимуля.^и = лмп/мкн m : ^п/'мяя^,.^

I

(рис.2) и более сильной реакцией ГЗГ in vivo (табл.1 и 2).

Пролиферация Т-клоток in vitro при культивировании с антигеном в течение 2-4 суток отражает фазу распознавания в иммунном ответе и основана на презентации антигена АПК Т-клеткам, рестрик-тироваиксй молекулами Н-2 класса Я. В нашем случае есть основания полагать, что презентация и последующий ответ Т-клеток более эффективны в контексте молекулы I-A мышей 4R , чем в контексте I-Ab мышей BIO. Для того чтобы убедиться, что реакция на PPD рестриктирована именно продуктами локуса I-A было использовано два подхода. Во-первых, в тесте локального переноса ГЗГ с лимфоцитами вакцинированных доноров интактным реципиентам, отличающиеся по разным генам Н-2, была исследована рестрикция ответа in vivo. Во-вторых, с помощью мАт к продуктам Н-2 класса II был блокирован ответ Г-лимфоцитоэ на PPD in vitro.

В таблице б представлены результаты локального переноса ГЗГ в подушечку лапы интактных реципиентов от вакцинированных вое доноров (подробно методику см. в разделе Материалы и Методы). При использовании переносимых меток, очищенных от АПК, ответ зависит от АПК реципиента и генетически рестриктирован. Перенос успешен в сингенной системе, но не в аллогенной (строки 1,2), что зависит от генов комплекса Н-2, но не от генетической основы (строка 3) и полностью определяется совпадением между донорам и реципиентом по аллели локуса I-A (строки 4, б, 7), но не 1-Е (строка 5). Интересно, что мутация гена A.|jeta, изменившая 3 аминокислоты в- продукте 1-А,нс влияет на презентацию ppd в данной системе (строка 8).

Определение фенотипа клеток, осуществляющих перенос реакции (табл.7), было проведено с помощью цитотоксичеокой обработки ан-

Таблица 6

Локальный перенос ГЗТ на микобактериальныо антигены рестриктирован локусом I-A

I' -1 —|

Реци- ; Генотип ¿ гг/гхх) j Резуль-пиент j Н-2 х) ¿ j тат

№! Донор ! ! !

Генотип Н-2

! ! i i ! К! ! 1 A ! г \ ! ь ! d ! ir! ! ! kí A! eí » j ! !

I BAL В/с d d d d BALB/c d d d d 0,23 +

2 BAL В/с d d d d B5 b b b b 0,02 -

3 СБА k k k k AKr k k k к 0,24 +

4 СВА k k k k 4R k k - b 0,21 +

5 СВА k k к k BIO.HTT a s к d 0,01 -

6 СВА k k k k A.TL з k k d 0,26

7 Вб b b - b 4R k k - b 0,03 -

8 В6 b _ - ■ b B6-H-2- Ь bral2 - b 0,21 +

х) Подчеркнуты аллели Н-2, совпадающие у донора и реципиента. хх) Ошибка средней не превышала 15$.

тителами к маркерам, отличающимся у Т-индукторов и Т-эффекторов, Полученные данные позволяют сделать вчвод, что реакция ГЗТ в системе локального переноса обусловлена Т-хлетками с фенотипом CD4+ CD8" , т.е. Т-уелперами/индукторами. Кроме того, введение антител к молекуле I-A без комплемента непосредственно е и>гсто развития ответа полностью блокирует последний, что пэдьетрждает участие продукта I-A в презентации микобактериальних антигенов. Учитывая, что различия в выживаемости между мышами 4R и ЗГО коррелирует с различиями в уроьне ГЗТ, а таку.е сам тин реакции и то, wo перенос осукесталяется Т-индукторами, мскно предполагать, что протективный ответ при заражении вирулентным Етаммом ч.. t^bor-

culoais связан с активацией популяции ТнХ. Для этого типа клеток аллель I-A51 играет роль Ir-гена, контролирующего высокий, а I-Ab - низкий уровень ответа.

Таблица 7

Перенос ГЗТ осуществляется Т-клетками фенотипа CD4+CD3"

Обработка переносимых клеток антителами*^ J ГЗТ+ m |

Thy 1,2 + с (антисыворстка) 0,01+0,01

byt 2.1 + с (M35-I7.2) 0,19+0,03 +

L3'í4 + с (СК1.5) 0,00+0,01

I-Ak (I0-2-I6) 0,01+0,02

х) В скобках - источник антител. Асцит гибридомы H-35-I7.2 использовался в разведении 1:500, культургльная жидкость гибридомы GKI.5 - 1:100, гибридомы IU-2-I6 - 1:50.

В принципе, полную зависимость ответа от молекулы I-A у

этих линий следовало ожидать, поскольку ни мыши BIO, ни мыши 4R

не якспрессируют второй продукт класса П, молекулу 1-Е. Более

интересный результат был получен при анализе мышей линии СБА

(Н-2к ), у которых на АПК ?кспрессируются обе молекулы класса II

(табл.8). Лимфоциты зараженных мышей С13А пролифернруют in vitro

в присутствии PFD (строка 6). Введение в культуру антител к т «Ь

I-A достоверно снижает ответ, но не отменяет пролиферацию пол-

i.

ностыо (строка 7). Можно полагать, что остаточная пролиферация связала о распознаванием антигонов в контексте молекул 1-Е, однако, введение в культуру антител анти-.Т-Е но меняет достоверно индекс -пролиферации по сравнении с K-Oirvрольной группой (без антител) и дал»j несколько усиливает как спонтанную, так и си'?цифи-

Ааолица о

Рестрикция пролиферативного ответа на РГР лимфоцитов зараженных мышей антигенами класса П

»1 Линия мышей J Генотип области I j Обработка [ Пролиферация**' | Индекс

! ( 7 « | Т? ? 1 »ijrjiuj.jffriui Vi ;(jalphjbei;s антителами*' j PFD | контроль i ции XXX)

I 310 Ъ b (Ъ) - - 3,14+0,49 1,37+0,21 2,29

2 BIO ъ b (Ь) - 14 V 18 2,90+0,37 1,15+0,24 2,53

3 BIO. А (4Н) к к (к/Ъ) - - 4,75+0,60 1,53+0,22 3,10

4 BIO.А (4R) к к (к/Ъ) - 14 V 18 1,34+0,29 1,00+0,11 1,33-

5 BIO.А (4R) к к (к/Ъ) - I0-2-16 1,42+0,37 1,12+0,19 1,27

6 СБА к к к к - 4,94+0,71 1,49+0,22 3,31

7 СБА к к к к 10—2—16 1,99+0,34 1,05+0,12 1,91

а СЕ\ к к к к 13/4 6,03+0,94 2,04+0,51 2,96

9 СБА к к к к I0-2-I6 и 13/4 1,0-3+0,12 0,66+0,09 1,28

X/ I4VI8, анти-Т-А'к , асцит гибридомы в конечном разведении 1:200; I0-2-I6, анти^-А* , культуральмая жидкость гибридомы в конечном разведении 1:30; 13/4, анти-1-Е* , куль-туральндя жидкость гибридомы в конечном разведении 1:30.

хх) ilwn/мин X Ю"?.

ухх) Имп/мик с PPD : Имл/мин в контроле.

■о

ческую пролиферацию (строка 8). Вместе с тем, введение смеси антител анти-1-A + анти-I-E полностью блокирует ответ (строка 9). Последний результат позволяет сделать вывод о том, wo обе молекулу класса Л, I-A и 1-Е, участвуют в презентации антигенов ми-кобактерий иммунным Т-лимфоцитам. Отсутствие снижения ответа при блокировании продукта 1-Е может объясняться особыми свойствами рестриктированных по 1-Е Т-клонов, в частности, тесной связью супрессии разных типов ответа с молекулой 1-Е. Это же соображение может объяснять некоторое несовпадение результатов при исследовании рестрикции переноса ГЗТ (исключительно по I-A) и рестрикции пролифератиэного ответа (в основном по I-A, но с участием 1-Е), поскольку в реакциях, вероятно, участвуют разные типы клеток: Тн1 в первой и все Т-клетки CD4+ во второй.

При клонировании Т-лимфоцитов мыши, специфичных к микобак-териальным антигенам, разными авторами использовались мыши с гап-лотитми Н-2Ь и Н-2 4 (Kaufmann S. , 1989; Sano У. et al., 1986), т.е. I-E-отрицательные, и, естественно, все Т-клоны с фенотипом с'04+ быии рестриктированы по I-A. Нами были получены Т-клоны от мышей СВА, гн-.спрессирующих молекулу 1-Е, и проведено исследование специфичности и рестрикции их ответа на микобакте-риалтые антигены.

Всего методом лимитирующих разведений было получено 8 клонов, имеющих ш данным цитотоксического теста фенотип CD4+ . На рис.3 приводятся данные, характеризующие специфичность одного из клоков (IC3) и зависимость интенсивности ответа от дозы клеток. В опыте использованы клетки, взятые всего через 96 одеон после предыдущей стимуляции, пог>т:>му И'с спонтанная (остаточная) пролиферация довольно высока Г.''"' имп/мин). Тем не менее, клон

U Iird).

Рис. J.

(¿lUTHrQH мхг/мл)

.м

4,3 8,7 17,5 35

(клеток на лунку х 10')

Антигокиая специфичность (А) и зависимость пролл^!аиыи от дозы клеток (Б) клона IC3. А: о - соншат 3CG, а - облучэшмй s. aureus , д- овальбумин. Б: в - 15 мкг/мл аиигака, и - Ооз антигена. 4 х IСVлунку облученных клеток селезенки СЧА в качестве АПК.

1СЗ отвечает синтезом ДК на стимуляцию даже низкой (1-2,5 мкг/мл] дезой антигенного препарата РРС , но не дает ответа ни на посторонний бактериальный ( Б. аигсия), ни на белковый (овальбумин) антигены. Ответ наблюдается даже при использовании очень низкой цозн клеток (8,7х10^/лунку) и характеризуется четкой дозовой зависимостью от ангиге>(а и отвечающих клеток. Как показано в таблице? 9, разные клонк отвечают на специфический антиген с различной интенсивностью, *гго, вероятно, зависит от аффинности их тек и от распознавания пептидов (число последних может быть велико, поскольку в качестве антигена использовался грубый препарат мико-бактерий). Увеличение интервала между последней стимуляцией и тестом, как и следовало ожидать, сильно снижает спонтанную пролиферацию.

Таблица 9

Различия в интенсивности отпета Т-клонов, » специфичных к микобактериальным антигенам^'

Клон 1 Пролиферация (имп/мин х 10 3)

10 мкг/мл сониката

103

11)3 2Н9

гы58+139<-; 66274*432 93«2+07Ь

контроль

862+938 720+84 3033+695

Иццекс стимуляции

30,35 92,04 3,09

х) 70х1р" клеток наглого клонл культивировались- в присутствии 4x10^ облученных ран) клрток селезенки СМ и течение

7?. г^сов (последние б часам с °П-тимидином). Клетки юпты. в тост через 9 дне!) после последней стимуляции ,чнгигеном

Вес полученные клону бчпи промерены на рестрикцию их отпета и'л антиген продуктами комплекс» II-2. }[лп отоги л качестве АПК Ис-пользпрчлш'.ь облуч<-кчи'.>. кл'-тчи селедочки рчкиг^ии'лнтон по Н-2,

совпадающих с линией СБА - источником клонированных Т-клеток -по одним, но отличающихся по другим аллелям комплекса Н-2.

Отметим, что из 8 клонов лишь один давал реакцию в СКЛ н отсутствии антигена с гаплотипом H-2d , и еще один - с Н-2Ь В таблице 10 приведены результаты анализа рестрикционной специфичности трех клонов. Все они не давали реакции на аллогечные АПК и не пролиферировали в отсутствии антигена. Сопоставляя результаты теста с различными по генотипу Н-2 АШ, можно сделать вывод, что клоны IC3 и 2Р7 распознают антиген в контексте молекулы I-Ak , тогда как клон 2НЭ рестриктирован по I-Ek (отвечает с АПК от мышей ВЮ.НТТ, но не 4Н ; при наличии аллеля k обеих молекул класса П ответ положительный). Еще 4 клона характеризовались такой же рестрикцией по I-A^ , чак и клоны IC3 и 2F7. Таким образом, у 1-Е-полокительных мышей СЛЛ при иммунизации антигенами микобактерий действительно активируются Т-клоны, рест-риктированные по обеим молекулам класса П, причем число 1-А-рест-риктированных клонов выше, чем 1-Е-рестриктированных-

Ш. Супрессия иммунного ответа на микобактериальные антигены и ее зависимость от структуры комплекса _Н-2__

Многочисленные данные, полученные в разнообразных экспериментальных тест-системах и в клинике, свидетельствуют с том, что течение хронических инфекций сопровождается активацией меха^-з-мов иммуносупрессии (обзор данных Авербах М.М. с соавт.г 1985). В полной мере это относится к микобактериальным инфекциям, при которых у мышей (Апт A.C. с соавт., 1983, 1984; Turcotte J. , Legault D. , 1980, 1981) и y человека ( Ellner J. , 1989) наблюдается подавление реакций иммунитета. Многие типы каскадных

'1аблица 10

Рестрикция пролиферативного ответа Т-клонов генами класса П комплекса Н-2 х)

----г

Клон !

Антиген-Презентирушие клетк*' и ответ20^

Г

СБА

k k k к

А.ТЬ IBIO.MBR I BIO.A(4lO { BIO.HTT | ( IQx

f { j BIO. Sf.) PI

Bkkdjbkkq

к к

s в к d;

b/v

IC3

2F7

2119

Г 4932 6108

3054 690

2794 326

223II 7034

3800 1017

3665 494

17558 5499

2306 752

2173 705

27826 5162

1746 491

1112

698*

1378 1030

174 210

3889 411

1016 1277

150 102'

1218

1397

х) 50x10 клеток каждого клопа культивировались в присутствии 4x10° облученных клеток селезенки соответствующей линии в течение 48 часов (последние 6 часов с Н-тимидином). Клетки взяты в тест через 6 дней после последней стимуляции антигеном.

хх) Числитель - 10 мкг/мл сокиката B'JG без антигена.

знаменатель - контроль

взаимодействий между разными популяциями иммунокомнетентных кле-ток-суиресеоров зависят от антигенной детерминанты I-J (рестрик-гированы по этой детерминанте), являющейся, по-видимому, маркером неизвестного рецептора Т-суггрессороп к антигенам класса П. В этой связи нами были проведены эксперименты по изучению возможности участия í-j -иологитрлышх kjirtoic р супрессии иммунп то ответа при туберкулезе. В качестве критериев ответа были вяяты реакция Г.'ЗТ на туберкулин (специфический ответ tn vivo ) и пролифератив-нне отпеты на PFO (июцифпчеекпп otdpt rn vitro ) и ФГА (неспе-цифическмП ответ In vjtio).

Результаты, представленные на рисунке 4, свидетельствуют о том, что воздействие на I- J-положительные клетки специфическими антителами в начальной фазе инфекции приводит к усиление ответа во всех трех исследованных реакциях. Два обстоятельства позволяют утверждать, что подобное усиление отлета связано именно с воздействием на 1-J4-клетки-супрсссс-ры. Бо-первью, к 21 дню инфекции поликлональный кеспсцифический ответ Т-члеток на патоген ФГА снижается в 2,5 раса по сравнению с незараяеннач контролем и это подавление частично отменяется антисывороткой. Во-вторых, ранее нами было показано, что развитие инфекции сопрсводда-ется прогрессирующей супрессией иммунного ответа, которая может быть перенесена интактным реципиентам с I- j-положительными Т~ ¡слетками. Таким образом, эти эксперименты указывают на важную роль I- J-положительных клеток в регуляции иммунного ответа к микобактериальным антигенам.

Участие I- J-положительных Г-клеток о супрессии ответа .той туберкулезе было подтверждено в еде одной тест-системе, которая позволила установить ОЭ -фенотип супрессорев. 3 совмас/нкх экспериментах с И.Б.К'рзмником чами было установлено (Крамник И.Б. с соавт.» Í990a,6)f что иктерстициальные макрофаги легочной ткани зараженных мыяей обладают сильнейиим супрессоркым действием на ответ иммунных к микобактериальным антигенов Т-лимф^ц,:тоЕ. Эффекторными клетками суггозссчи в пдре.гхю/ял'озней ткани заражан-ного легкого являются i/акро^зга, которь-м чгл подарта-чя пролиферации ишупиых лкмфецигоъ лки.*А,гк*е«;:«х. уз лоз кл^чизирен? «wx ШЮ рецйпиентсь не требуйся взалуопеи"'::;^:? с или CJJ8*

лимфо(;и'*'ами легкого (да:-:кне не г^иводчтед). Однако, ка?с показал? в таблице II, регуляция прелифератьчного ответа -"легок лкуфвузлоь

лс

г\ д

i

Рис. 4.

ИС 8

3

f

va".

0,4

0,3

о,:

0,1

I £ i

Введение in vivo аллоантисыворотки апти-l-j милам СБА усиливает ствет на ФГА (А) и PPD (Б)in vitro и реакцию ГЗТ на туберкулин (В)in vivo . Антисыворотка вводилась вместе с вирулентными микобактерияш и через 48 ч. после заражения (2 х 20 мкл),

I - анти—I-J^t 2 - aHTH-i-jk , 3 - интактные мшш СВА.

Таблица II зависит

от наличия 1-а+С08- клеток в отвечавшей популяции

Супрессия, обусловленная клетками легкого, зависит ч

__ ---------- - ------- ------- ------— -------- - ;

~ " ■ 1 | 1 " I ' —|-г~

Обработка ; Доза клеток-; РР1) } имп/мин } клеток лимфо-| супрессоров : | (утг,-3ч ; узлов | | , ' )

ИС

Комплемент

анти- Ьухг

% супрессии для групчм

25x10"

50x10

100x10'

Я

45.2 7,0

41.3

8,3

26.4 ¡3,9

о, и

6,5 -

5,0 9

4,5 42

о О к., С 75

25Х103

50x10^

ЮОхЮ3

47,4

7.1

22,3 4,9

11,6 3,9

9.2

4,0

6,7 -

5,0 53

3,0 76

2,3 61

4,5 -

4,8 -2

4,2 6

3,7 4

анти

-

25x10-

50x10"

100x10^

И,2

2,5

12,0 2,5

10,5 2,5

10,7 2,9

х) 4x10 члетсГк л'.'!-тоузлов :шмунизированшх ¡1АФ мпаей СБА после обрабетк» культивировали с клеткачи-супрессоргми или без них 9*5 ч,1ме. ИС - индекс стимуляции.

в присутствий клеток-супреесоров из легочной ткани, в большой степени зависит от наличия в отвечающей популяции I- j-положи-тельных клеток с фенотипом СЬ8~ . Б то время как удаление клеток byt2+ ( CD3+ ) из популяции не рнияет на супрессию ответ легочными клетками, элиминация I--J -положительных клеток приво дит к снижению общей пролиферативной потенции клеток лимфоузло (в опыте и в контроле), но полностью отменяет супрессию клетка ми .егкого оставшегося иммунного ответа на PFD . Таким образо; для развития супрессии ответа, вызываемой макрофагами-супрессо рами, необходимо присутствие l~J+CD8~ -клеток в отвечающей популяции.

. Множество данных свидетельствуют и пользу того, что I-j -i сущие рецепторше молекулы самем тесным образом ассоциированы с экспрессией молею'л 1-Е класса Ii (Waltojibaugb с. efc al, 1986; Murphy D. , 1987). В связи с этим нами был изучен иммунный от вет на микобактериалышо антигены (соникат H37fiv ) у ряда кон-генпнх 1-Е-пололснтельных и I-E-отрицательных линий мышей.

Наиболее информативными оказались эксперименты по определению уровня антител класса Iß*) , специфичных к использованному для иммунизации пнтигену. Простое сопоставление уровня it иикобактериаль.ччм антигенам в сыворотке kjo'sh после иммунизации в по,душечки лпи соникатом H'^Tiiv у панели конгенных по Н-2 линий мы^ей (рис.5) дает лишь основания утверждать, чго данный тип отпета xnpiKiериоуетсп существенными меглинейными различиями. Однако попарное сравнение линий, наиболее близких по аллель-коП структуре комплекса Н--2, имущих одинаковую генетическую сс-ног'у, но огли'>ч»11'ИХ':-ч пу чкепрссеип продукта 1-Ь на клетках по-'•"иоляст ,>•<• nvH'U'ei !-. общую 9а*ну» аак^чомерчеегь. Тнкое сравнение

о

со о

43

о*

о

сч

о

«-с

I—г

«-с

i—г

1 С

ь-Г

I

Ш

ь-Г

•з,

Ц CD

Ш -3

ь Я

к s ь

S 3

S Я M

a

a

ь к

о ¡C

s:

п ; :

ь

ж

о

д m

а

'Уг «

>гу

Л ш

О «

« Е*

£

£Р о

щ S

s о

а «

Ф

«

о >

о

«а t-

r\

о

§ t»> H

а- a}

Й X

о S

о о

о

H

о к

со о*

ю о

ь~с

о

сз

о

о

с

сделано и* рисунке 6, из которого видно, что уровень igG у линий A.TL и BIO. MB R, экспрессирующих продукт 1-Еk , достоверно ниже, чем, соответственно, у А.ТН и 4R , не экспрессирующих прс дукты локуса 1-Е. Безусловно, в паре А.ТЪ - А.ТН различия могут быть связа(ш с разными аллелями I-A, а в паре 4к - мвн - с разными аллелями генов класса I, однако ситуация является "взаи-монерекриваемой" (в первой паре одинаковы аллели локусоь Кис, а во второй - локуса I-A), что дает основания для вывода о регуляции синтеза антител в зависимости от экспрессии продукта 1-Е, В обоих случаях экспрессия продукта 1-Е связана с понижением (супрессией) ответа на микобактериальные антигены. В третьей из сравниваемых пар ( 9R - ВЮЛГГТ) обнаруживаются небольшие, но достоверные, различия в зависимости от аллеля I-j (все остальные покусы идентичны). Таким образом, по крайней мере некоторые типы ответа на микобактериальные антигены, по-видимому, регулируются взаимодействиями клеток, связанными с продуктами локусов 1-Е и I-J , что соответствует данным, полученным для других инфекций : дейшианиоза (Б1всЬ»е11 J. , 1985 ^ и гельмиктозов ( víassora D. et el., I9Ö7). Учитывая неблагоприятное влияние на развитие бактериальных внутриклеточных инфекций высокого уровня специфических антител, можно предполагать, что полученные данные об избирательном отсутствии супрессии синтеза антител к ми-кобактериям у Iогрицагельных линий (реакция ГЗТ и пролиферация Т-клеток у птих мышей остается нормальной, за исключением линии BlO.to - см.выые) свидетельствуют о некоторой селективной ценности нормальной экспрессии продукта I-K, необходимой для т-давленип "понратдптих" типов иммунного ответ;!.

Группа Линия Генотип Н-2

Уровень антител i^g 0,2 0,4 0,6 .0,8 1,0

А..И1 К^А3Е"0а

A.XL

kWD4

I--1

(-

i

и to

4Й К*АкЕ~0Ь

B10.UBR K^E^D4

I--1

BIO.HíT KaAeElcDd

за

e-knd U£)

KAED

i'ac. 6 . Сависимость уровня антител xga от аллелей локуса 1-Е и-детерминанты i-j.

ВЫВОДЫ

1. Урозень резистентности к экспериментальному туберкулезу у мышей зависит от аллелей генов комплекса Н-2. Гаплотипы Н-2 d и Н-211 при прочих равных условиях детерминируют более высокий уровень резистентности к инфекции по сравнению с другими гапло-тииами.

2, Усиление резистентности к туберкулезу у носителей гапло-типа Н-2^ связано с экспрессией гена класса П 1-Ак , а у носителей гаплотипа Н-^ - гена класса I H-2Dd.

3. Уровень резистентности к туберкулезу коррелирует с уровнем реакции ГЗТ к м и к о б а кт ериал ы ш м антигенам. Последний контролируется генами комплекса Н-2,, но зависит также от аллелей генов естественной резистентности.

4, Протективный эффект вакцинации живой вакциной BOG к последующему заражению обнаружен у всех исследованных нами линий мьтей при использовании низких доз вакцины. Высокая доза вакцины nec^CKTHBHa для носителей гагшотинов Н-2* и H-2V.

с

о. Дефект вакцинного действия вся у мышей Н-2 зависит только от нэеительства этого гаплотипа Н-2 и не связан с действием геиоп естественной резистентности. Отсутствие протективчого

дойетния вакцины обусловлено резким снижением способности Т-кле-

£

тон носителей тглотипч !!-2 отвечать на кикобяктериальные антигена in vivo и in vitro.

г,

С. Генетический контроль генами MIKJ уровня восприимчивости к периичному эара*'?ннм и эффективности накцпч-лции ÜCG осущест-ьл'Н-тгя ипяависим'-». "Влагонриитчое" глияни« на организм хозяина лр;| aim из о этих лмр: молнией яогиент от разных гишотппов 11-2.

-417. Ответ Т-клеток CD4+ на мииобактериельные антигены естриктирован но обоим генам класся П - и fp Е~и . причем ольюая часть клонов Т-индукторов распознает микобактериалыше нтигены в контексте молекулы Др .

8. Аллель i-a11 детерминирует высокий, а аллель 1-Аъ~ изкий уровень ответа Т-клеток при туберкулезной инфекци", о не соответствующие уровни синтеза антител. Аллели локуса -А играют роль -генов не только для реакции Т-клеток п vitro на антигены микобактерий, но и в определении уровня ззистентности.

9. Нормальная экспрессия продукта I-B свьвана со снижением крови уровня антител ige к микобактеривльннм антигенам но г влияет на уровень реакции ГЗТ.

10. Супрессия по крайней мере некоторых типов иммунного гвета на микобактерии обусловлена активностью I-J -пс.южи-■льных взаимодействутеих иммуиокомпетентннх клеток.

Список работ, опубликованных по тепе диссертация

Veflemtkosr A.A., Apt A.S., Erttov I.K. 'Jn i -i f.reiM onnl ein graft Jneonritlbillty between 15 nnñ i7 я"ггп» H-2 Ьчр}"-/рра. Í4immog«n?tio4, 1977, V.5, Г. 54с-с;уИ.

2. Авербах М.М., Мороз A.M., Апт A.C., Торонджадзе В., Ильина И.Н. Межлинейные различия чувствительности мышей к туберкулезу. Иммунология, 1980, № 2, с.42-43.

3. Апт A.C., Никоненко Б.В., Мороз A.M., Авербах М.М. Генетический анализ факторов, детерминирующих чувствительность к туберкулезу. Бюлл.экеп.биол., 1982, № 12, с.83-85.

4. Апт A.C., Мороз A.M., Никоненко Б.В., Абрамова З.П., Авербах М.М. Воздействие специфической аллоантисыворотки против Т-супрессоров на показатели клеточного иммунитета при экспериментальном туберкулезе у мншей. Иммунология, 1984, № 5, с.26-28.

5. Бландова З.К., Чапкова Я., Поспелов Л.Е., Никоненко Б.В., Апт A.C. Изучение рекомбинантного гаплотипа Н-2 мышей конген-hq-рези ст cht ной линии BIG.Di { йЮ8)Л . Генетика, 1984, № 9,

с.1484-1488.

6. Airr A.C., Никоненко Б.В., Авербах М.М. Два типа экспрессии продукта аплеля I- Jk на лимфоидных клетках мышей. Иммунология, 1984, * I, с.2Г;-40.

7. Авербах М.М., Мороз A.M., Апт A.C., Никоненко Б.В. Им-муногенетика инфекционных заболеваний. М., Медицина, 1985, 253 с.

Q. Nickoneriko B.V., Apt А.о., Moroz A.M., Ayerbakh М.Ы. Cenetio analysis of sunceptibility of mice to H37Rv tuberculcmio infentton: eoneitivity versue relative resistance. Progr. Leuk. Biol., 1985, V. 3, P. 291-299.

9. Никонрнко E.B., Arrr A.C., Мороз A.M., Авербах М.М. Генетические аспекты экспериментального туберкулеза у мншей. Генетика. 1906, »5, с.051-85-1.

10, Мороз A.M., Airr A.C., Никоненко Б.В. Иммуногенетичаские механизмы резистентности к туберкулезу у мыший. Пробл. туберку-

iesa, 1983, № 9, с.49-52.

11. Am* A.C. Экспрессия генов класса П в регуляторных попу-1яциях Т-лимфоцитов мыши и возможный механизм генетической рест-шкции по области I комплекса Н-2. Генетика, 1967, № 12,

:.2098-2103.

12. Никоненко В.В., Межлумова М.Б., Мороз A.M., Апт A.C. 'енетическая рестрикция гиперчувствительности замедленного типа : туберкулину у мышей. Генетика, 1988, № 9, с.1707-1709.

13. Apt A.S., liickonenko B.V., Hezhlutaova М.В., Moroa A.M., verbakh M.M. Immune response to tuberculosis and its restriction у the H-2 genea. XVIth Intern. Congress Geneticfl, Toronto, 19в8, . 824.

14. Buachma E., Apt A.S Uickonenko B.V., Moroa A.M., verbakh M.M., Skaraene E. Genetic a3pecta of innate resistance nd acquired immunity to mycoüacteria in inbred mice. Sp-inger emin. Inmmopathol., -1938, V. ,0, P. 315-336.

15. Апт A.C., Никоненко Б.В., Мороз A.M., Авербах 1«.М. Ре-уляцкя противотуберкулезного иммунитета у мышей еками комплек-а Н-2. Бюлл. эксп. биол., 1988, №7, с.73-75.

16. Мороз A.M., Апт A.C., Крамник И.Б. и др. Генетический энтроль противотуберкулезного иммунитета у мышей. Доклада I Все-эюэного съезда иммунологов. Сочи, 1939, т.I, с.78.

17. liickonenko B.V., Uezhlumova М.В., Apt A.S., Moroz Л.м. ocal adoptive transfer of delayed-type hypersensiyivity to uberculin frora M. bovig (BCG) infected mice. Polia Biol., 1°8?, . 35, P. 255-259.

16. Крамник И.Б., Мороз Л.И., Апт А.С., Клеточные механизмы супрессии пролиферации Т-лимфоцитов клетками легкого при экспериментальном туберкулезе, Билл. эксп. о'иол., 1990, № 8, е.172-176.

19. Apt A.S. t?HC heterozygosity and enhanced disease resistance - an example. Immunol.Today, 1950, V. 11, P. 387.

"JO. Крямник И.Б., Апт А.С., Мороз A.M. Супрессия иммунного ответа клетками легкого при экспериментальном туберкулезе. Балл.

эксп. биол., 1990, №7, с.77-80.

21. Apt a.s., Kramriik I.В., Moron A.M. Regulation of T-ceil proliferative responses by cells from solid lung tissue of M. tuberculoaia-infected mice. Immunology, т991, V. 73, P. 923-930.

v>