Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка лекарственных средств из растительного сырья, обладающих фригопротекторным действием

На правах рукописи

Шацких Аймеседо Абдулаевна

Разработка лекарственных средств из растительного сырья, обладающих фригопротекгорным действием

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 ! НОЯ ¿013

Москва - 2013 г

005538563

005538563

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук,

профессор Киселева Татьяна Леонидовна

доктор медицинских наук Назаренко Наталья Анатольевна

Официальные оппоненты:

Лякина Марина Николаевна - доктор фармацевтических наук (15.00.02), заместитель начальника управления экспертизы лекарственных средств № 3 Центра экспертизы и контроля готовых лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России

Терешина Наталья Сергеевна - доктор фармацевтических наук (15.00.02), заведующая лабораторией фармакогнозии НИИ фармации Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М.Сеченова.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Защита диссертации состоится 13 г. в [у на заседании

Диссертационного совета Д 070.01 / во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИ-ЛАР) РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина,7) по адресу: 123056, ул. Красина, Д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, д. 7

Автореферат разослан: 13 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук л Громакова Алла Ивановна

к>

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Россия является одной из самых холодных стран мира: около 70 % ее территории представлено зоной вечной мерзлоты, в ряде регионов температура воздуха в зимний период опускается до минус 60 °С. Более 7 миллионов человек проживают в чрезвычайно холодных регионах, классифицируемых законодательством РФ как «Крайний Север и приравненные к нему местности». Из общего числа больных с холодовой травмой на Северные регионы приходится 85 %, а в районах Крайнего Севера ежегодно регистрируется более 11000 случаев оказания медицинской помощи пострадавшим от общего переохлаждения организма. (Чащин В.Н. 1998; Рыбдылов Д.Д., 2005; Чадаев А.П.и др., 2005; Михайличенко М.И., 2009; Таранова Е.В., 2009; Гостищев В.К, 2010; Patel N.N., Patel D.N., 2008; Moussa M.et al., 2008).

Удельный вес холодовой травмы в общей структуре травматических поражений в зоне с умеренным климатом составляет до 1 %, а в Сибири и на Севере до 10 % (Рыбдылов Д.Д., 2005; Брегадзе A.A., 2006; Сизоненко В.А., 2007). По данным различных авторов инвалидами становятся 20-94 % пострадавших от холодовой травмы (Савкин А.Н., Кузнецова Н.Л., 2006; Сизоненко В.А., 2007; Bruen K.J. et al., 2007; Day M.W., 2008). Чрезвычайно высокий уровень инвалидизации пациентов говорит об актуальности решения проблемы лечения холодовой травмы и общего охлаждения организма (Котельников В.П., 1988; Томина Е.А., 2008; Михайличенко М.И., 2009; Маракуца Е.В., 2010; ArfordS., 2008).

Современные лекарственные препараты, в том числе гормональные, используемые в стандартных схемах лечения холодовой травмы обладают выраженными побочными эффектами и имеют целый ряд противопоказаний к применению (Са-тыбалдыев В.М., Глянцев С.П., 2002; Алхазова, Р.Т. и др., 2004; Машковский М.Д., 2012). Стоимость их гораздо выше препаратов растительного происхождения. В ассортименте отечественных лекарственных средств (JIC) доля растительных препаратов составляет 25-30 %, из них около 40 сборов, разрешенных к медицинскому применению в РФ.

В традиционной медицине (ТМ) многих стран сборы лекарственных растений (JIP) исторически используются для лечения симптомов холодовой травмы. В России в арсенале фригопротекторов отсутствуют JIC растительного происхождения, поэтому поиск и разработка новых эффективных и безопасных многокомпо-

нентных сборов, обеспечивающих комплексное фармакологическое воздействие на все звенья патологического процесса при холодовой травме, является важной задачей фармацевтических исследований. В связи с этим является актуальной разработка сборов на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) обладающих противовоспалительным, обезболивающим, ранозаживляющим, антиок-сидантным, иммуностимулирующим и детоксицирующим действием.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является разработка и стандартизация эффективных и безопасных сборов фригопротекторного действия для профилактики и комплексного лечения холодовой травмы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать рациональный состав и оптимальные соотношения компонентов сборов на основании их предварительного фитохимического изучения и фармакологического скрининга.

2. Провести фармакогностическое изучение предложенных сборов и установить их диагностически значимые внешние и анатомические признаки.

3. Провести фитохимическое исследование сборов на содержание основных групп биологически активных веществ (БАВ) и предложить показатели их подлинности.

4. Разработать методики качественного и количественного анализа для определения норм содержания БАВ в сборах с использованием современных физико-химических методов, определить числовые показатели.

5. Провести сравнительное изучение эффективности разработанных сборов с препаратом контроля.

6. Разработать проекты Фармакопейных статей предприятия (ФСП) на сборы.

Научная новизна работы

Впервые на основе анализа опыта традиционной медицины России и результатов собственных исследований (фармакологического скрининга и фитохимического изучения) разработаны оптимальные составы двух сборов (№ 1 и № 2) рекомендуемых для профилактики и комплексного лечения холодовой травмы. Обоснована целесообразность и актуальность разработки сборов как растительных фригопротекторов.

Разработаны показатели подлинности двух предложенных сборов (внешние признаки, микроскопия): на основании проведенных исследований подтверждены диагностически значимые признаки для трактовки анатомо-морфологического строения компонентов сборов.

Изучен химический состав сборов № 1 и № 2. Идентифицированы флаво-ноиды (ликуразид, рутин, гиперозид, лютеолин-7-гликозид, кемпферол, кверцетин), фенокарбоновые кислоты (хлорогеновая, неохлорогеновая, кофейная, цико-риевая кислоты), дубильные вещества (галловая кислота, танин, катехин, эпикате-хингаллат), а также сахара, терпеноиды, органические кислоты, гиперицин, гер-ниарин, глицирризиновая кислота, ß-каротин. Разработаны показатели подлинности сборов с помощью общепринятых качественных реакций и ТСХ.

Подобраны оптимальные условия и разработаны методики качественного и количественного анализа БАВ в исследуемых объектах (ТСХ, ВЭЖХ). Подтверждено наличие в них основных групп БАВ - флавоноидов, сапонинов, эфирных масел, дубильных веществ, полисахаридов, Сахаров.

Проведена валидация методик количественного спектрофотометрического определения флавоноидов и полисахаридов по показателям линейности, воспроизводимости, правильности и повторяемости.

На основании проведенных экспериментальных исследований (иммунологических, биохимических, гематологических) на фоне применения сборов выявлены достоверные положительные изменения восстановления всех лабораторных показателей у экспериментальных животных при криотравме в сравнении с контролем. Приоритет проведенных исследований подтвержден 2 Патентами РФ и 1 международным (Германия):

1) «Средство из растительного сырья для профилактики и лечения отморожений» № 2326684 (20.06. 2008 г.);

2) «Сбор лекарственных растений «Фитоморозко», обладающий фригопро-текторным действием» № 2336896 (27.10.2008 г.);

3) Bundesrepublik Deutschland Urkunde über die Eintragung des Gebrauhsmus-ters Nr. 20 2008 017 925.4 (2008).

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны и оформлены:

- два новых сбора, достоверно повышающих эффективность восстановления лабораторных животных при криотравме.

- два проекта фармакопейных статей предприятия (ФСП) на сборы:

- «Сбор для профилактики и комплексного лечения холодовой травмы»;

- «Фитоморозко»

Приоритет результатов проведенных исследований подтверждены 3 Патентами, международным ФРГ и двумя патентами РФ.

Результаты исследований внедрены в учебный и научно-методический процессы на кафедре фармакологии ГБОУ ВПО Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск) (акт внедрения № 1 от 08.02.2013 г.) и на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акт внедрения № 3 от 24.10.13 г)

Личный вклад автора.

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке цели и задач, выборе объектов исследования, проведении экспериментальных исследований, обобщению полученных данных и их статистической обработке. С участием автора разработано 2 новых сбора, защищенных 2 патентами РФ и 1 международным ФРГ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.04.02 — «фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенных исследований соответствуют пунктам 2 и 3 паспорта специальности.

Связь задач и исследования с проблемным планом фармацевтической науки

Диссертационная работа выполнена в рамках Региональной научно-технической программы «Здоровье населения Европейского Севера» (2002-2007 г.) и планом научных исследований «ГБОУ ВПО СГМУ (г. Архангельск) Минздрава России» (Договор с МЗ РФ № 01200300253 от 11.12. 2002 г.)

Апробация работы

Основные положения работы доложены на Всероссийских научно-практических конференциях: «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006 г.); «Традиционная медицина - 2007» (М., 2007 г.); I и II Российских фитотерапевтических съездах (М., 2008 г.; М., 2010 г.); Международной научно-практической конференции «Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы» (Махачкала, 2006 г.); II Междуна-

родной медицинской конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2008 г.); VII Международном конгрессе «Традиционная медицина» (М., 2009 г.); I и II Международных конгрессах «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (М., 2011 г.; М., 2012 г.); IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012 г.). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ, которые отражают основное содержание диссертационной работы, из них 14 в ведущих изданиях, входящих в перечень ВАК РФ, 3 патента. Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 121 рисунок. Работа состоит из введения, обзора литературы, трех экспериментальных глав, общих выводов, списка литературы из 308 наименований, из них 84 на иностранных языках, и приложения. Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты разработки двух оригинальных научно обоснованных рецептур сборов (№ 1 и № 2) фригопротекторного действия на основе опыта ТМ России;

- результаты фармакогностического изучения сборов (№ 1 и № 2), использованные для разработки показателей подлинности и критериев качества;

- результаты разработки методик качественного анализа и количественного определения различных групп действующих веществ в сборах, и результаты их вали-дации;

- показатели подлинности сборов № 1 и № 2, критерии оценки их качества и нормы числовых показателей (с проектами ФСП);

- результаты экспериментальных исследований, подтверждающих рациональность составов рецептур, эффективность и безопасность сборов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служило лекарственное растительное сырье, отвечающее требованиям НД, и сборы из него (№ 1 и № 2), разработанные на основе фармакологического скрининга и результатов информационно-аналитических и фотохимических исследований.

Фармакологические исследования проводили на базе кафедры фармакологии ГБОУ ВПО СГМУ (г. Архангельск), иммуноферментный анализ в НИИ Биомедицинской химии, фармакогностические в ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии (г. Москва).

Изучение внешних признаков и анатомического строения сборов и исходного сырья проводили по ГФ XI; микроскоп «Olympus СХ 41» с окуляром х19, и объективами х4, х10, х20, х40 и хЮО; фотокамера «Olympus Digital Camera С — 3000 Zoom» (Япония).

Настои сборов готовили в соответствии ГФ XI издания. Водно-спиртовые извлечения для качественного и количественного определения БАВ получали с использованием спирта этилового 40 %, 50 %, 70 % в соотношении 1:20.

Фитохимические исследования проводили современными физико-химическими методами: УФ-спектрофотометрия, ТСХ, ВЭЖХ.

Метод ТСХ: Идентификацию фенольных соединений в сборах № 1 и № 2 проводили на пластинках «Kieselgel 40 F254; Е. Merck, Darmstadt» в системе растворителей: этилацетат - уксусная кислота - вода (25:5:5); вещества сравнения - 1 % спиртовые растворы РСО рутина, кемпферола, лютеолин-7-гликозида, кверце-тина, ликуразида; детекция зон адсорбции - в УФ-свете при 360 нм.

Идентификацию глицирризиновой кислоты (к. солодки) проводили на пластинках «Kieselgel 60 F254», в смеси растворителей - изопропанол - муравьиная кислота - вода (70:6:24); детекция зон адсорбции в УФ-свете при 254 нм.

Для идентификации гиперицина (тр. зверобоя) использовали пластины «Si-lufol» 7,5x15 см, смесь растворителей: хлороформ - спирт метиловый (40:10); визуализация зон адсорбции — 2 % спиртовым раствором алюминия хлорида в УФ-свете при 360 нм.

Идентификацию герниарина (цв. ромашки аптечной) в сборе № 2 проводили на пластинках «Kieselgel 40 F254» восходящим способом в хлороформе; длина пробега растворителя 10 см; детектирование при 365 нм.

Идентификацию свободных Сахаров проводили на пластинках «TLC Silica-gel 60, Е. Мегк», в системе пиридин - этилацетат - вода (20:60:40); длина пробега 7,5 см; визуализация зон адсорбции после обработки смесью: тимол - серная кислота конц.- спирт этиловый 95 % (0,5:5:95); нагревание 10 мин. в сушильном шкафу при 100-105° С; свидетели: растворы Сахаров в спирте этиловом 50 % глюкозы, фруктозы, арабинозы, галактозы, рамнозы, мальтозы.

ТСХ каротиноидов проводили на пластинках «Sorbfil» ПТСХ-П-А» размером 10x8 см, с подвижной фазой бензол - этиловый спирт 95 % ( 80:20); растворы сравнения - 0,01 % растворы лютеина и ß-каротина в спирте этиловом 95 %, длина пробега 10 см; визуализация зон адсорбции 1 % раствором фосфорномолибдено-вой кислоты в 95 % этаноле (после нагревания при 80° С).

Для идентификации каротиноидов методом спектрофотометрии измеряли поглощение гексановых извлечений на спектрофотометре «Gelios», (США), в кювете с толщиной слоя 10 мм, в интервале от 350 до 600 нм.

Метод ВЭЖХ: Изучение качественного состава фенольных соединений проводили на приборе «Gilston» (Франция) с металлической колонкой 4,6x250 мм Kromasil С 18, с размером частиц 5 микрон; ручным инжектором Rheodyne 7125 USA с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Мультихром для «Windows»; при комнатной температуре; подвижная фаза: метанол - вода - фосфорная кислота конц. (400:600:5); скорость подачи элюента 0,8 мл/мин; УФ-детектор «Gilston» UV/VIS модель 151 (при 254 нм).

Количественное определение глицирризиновой кислоты в сборах проводили методом ВЭЖХ («Gilston», Франция) на колонке металлической ALLTIMA С-8 размером 4,6x250 мм; неподвижная фаза Silicagel С-8; подвижная фаза метанол-вода-фосфорная кислота конц. (40:60:0,5); скорость подачи элюента 1 мл/мин, при комнатной температуре; детектор УФ при длине волны 254 нм; объём вводимой пробы 20 мкл.

Содержание дубильных (окисляемых) веществ и эфирного масла (метод 1) определяли по ГФ XI; суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту - титритометрически. Количественное определение флавоноидов, полисахаридов, каротиноидов - спектрофотометрическим методом. Спектры поглощений снимали на саморегистрирующем спектрофотометре «Gelios» (США), при 370-600 нм, в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Валидацию аналитических методик проводили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений», ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность)», ОФС 42-0113-09 «Вапидация аналитических методик». Статистическую обработку результатов фармакологических исследований проводили с помощью статистических пакетов Statistica 6.0, SPSS 11,5 и Sigma Plot 8.0., (Berry D.M, Lindgren B.W., 1996; Гланц.С., 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор оптимальных составов и соотношения ингредиентов в сборах

По данным литературы, выявлены лекарственные растения, используемые в традиционной медицине для коррекции основных проявлений холодовой травмы. При выборе компонентов сборов (№ 1 и № 2) в качестве теоретического обоснования принимали во внимание официнальность каждого вида сырья, химический состав, состояние сырьевой базы, технологичность, биологическое действие (с учетом всех звеньев патологического процесса и клинических проявлений холодовой травмы): противовоспалительное, анальгетическое, антибактериальное, дезинток-сикационное, противоотёчное, ранозаживляющее, антикоагулянтное, антиокси-дантное, общеукрепляющее, улучшающее местное кровообращение, спазмолитическое, седативное, иммуномодулирующее, диуретическое, поливитаминное.

Предложены рецептуры 5 сборов по 7-9 компонентов. Проведен их фармакологический скрининг и предварительные фотохимические исследования, показано отсутствие острой токсичности.

На основании фармакологического и фотохимического скрининга выбраны оптимальные рецептуры, условно обозначенные как:

Сбор № 1 : трава зверобоя (Herba Hyperici) ГФ XI изд., вып. 2, ст. 52; листья берёзы (Folia Betulae) (ВФС 42-2487-95); трава горца птичьего (Herba Polygoni avi-cularis) - ГФ XI, вып. 2, ст. 56; трава душицы (Herba Orygani vulgaris) - ГФ XI, вып. 2, ст. 55; корень солодки (Radices Glycyrrhizei) - ГФ X., ст. 573; плоды шиповника (Fructus Rozae)- ГФ XI, вып. 2, ст. 38; цветки календулы (Flores Calendulae) - ГФ XI, вып. 2, ст. 5;

Сбор №2: трава тысячелистника (Herba Achilleae millefolii) ГФ XI, вып. 2, ст. 53; цветки ромашки (Flores marticariae, chamomillae) ГФ XI, вып. 2, ст. 7. трава зверобоя (Herba Hyperici) ГФ XI изд., вып. 2, ст. 52; листья берёзы (Folia Betulae) (ВФС 42-2487-95); трава горца птичьего (Herba Polygoni avicularis) - ГФ XI, вып. 2, ст. 56; корень солодки (Radices Glycyrrhizei) - ГФ X., ст. 573; плоды шиповника (Fructus Rozae) - ГФ XI, вып. 2, ст. 38; Составы сборов и количественное соотношение ингредиентов защищены патентами РФ и Германии.

2. Фармакогностическая характеристика, определение критериев подлинности

Проведенные исследования подтвердили подлинность каждого вида ЛРС в составе сборов, как соответствущую описаниям в частных ФС на сырьё и в специальной литературе. Всего в обоих сборах выявлено по морфологическим признакам 9 видов ЛРС, из них по 5 видов включено в состав обоих сборов.

Внешние признаки

Сбор № 1: Смесь неоднородных частиц измельченного растительного сырья, проходящих сквозь сито по ТУ 36-18-001-39436682-98 с отверстиями диаметром 5 мм. Цвет зеленый (от светло - до темно-зеленого) с желто-оранжевыми, белыми и бурыми включениями. Запах ароматный, вкус водного извлечения горьковато-сладкий.

Сбор №2: Смесь неоднородных частиц измельченного растительного сырья, проходящих сквозь сито по ТУ 36-18-001-39436682-98 с отверстиями диаметром 5 мм. Цвет серовато-зеленый с белыми и желтыми вкраплениями. Запах сильный, ароматный, вкус водного извлечения горьковато-сладкий.

Микроскопический анализ

Микроскопическая диагностика сборов № 1 и № 2 проведена в полном объеме, диагностические анатомические признаки, присущие отдельным компонентам, определены в сборах и установлено их соответствие описаниям в частных ФС на соответствующие виды ЛРС и в специальной литературе. Микроскопическое исследование сборов выявило ряд признаков, которые определяют присутствие каждого из его компонентов (диагностически значимые признаки) (рис. 1). Проведенные исследования подтвердили подлинность исходных компонентов сборов по входящим в их состав видам ЛРС. Описание и фотографии микроскопических диагностических признаков включены в проекты ФСП на сборы № 1 и № 2.

3. Фитохимическое изучение сборов № 1 и № 2

С помощью общепринятых качественных реакций установлено наличие в сборах основных групп БАВ - флавоноидов, сапонинов, эфирных масел, дубильных веществ, полисахаридов, Сахаров.

Рисунок 1. Микроскопические диагностические признаки сборов № 1 и № 2: (1) пигментированное вместилище листьев зверобоя; (2) бесцветное вместилище листьев зверобоя (ув. 200х); (3) друзы оксапата кальция, (За)- эфиромасличные железки, (36) - вытянутые клетки эпидермиса вдоль жилки листьев березы (ув. 200х); (4) фрагмент верхнего эпидермиса с бурым содержимым травы горца птичьего (ув. ЮОх); листочек обвертки (5)- секреторные ходы цветков ромашки (ув. 40х); эпидермис язычкового цветка (6) - эфиромасличная железка эпидермиса язычкового цветка ромашки (ув. 250х); давленые микропрепараты: фрагмент пробки корни солодки (ув. 40х), (8) - каменистые клетки околоплодника орешка плодов шиповника (ув. ЗООх), (9)- эпидермис плода с длинными волосками плодов шиповника (ув. 200х); жилка листа (¡0) - секреторные ходы травы тысячелистника (ув. 250х); (11)-эфиромасличная железка эпидермиса нижней стороны листа травы душицы (ув. 400х); (12) -верхней стороны трубчатого цветка ноготков с вытянутыми сосочками (ув. 200х); фрагмент листовой пластинки горца птичьего (13а) - клетки с бурым содержимым, (136) - устьица (ув. 200х).

Фенольные соединения присутствуют во всех видах ЛРС, из них флавонои-ды составляют доминирующую группу БАВ в обоих сборах, во многом обусловливая их терапевтический эффект. Соединения флавоноидной природы доминируют в следующих компонентах сбора № 1: траве зверобоя, листьях березы, корнях солодки, цветках календулы и сбора № 2: траве тысячелистника, зверобоя, листьях березы, корнях солодки. На хроматограммах спиртовых извлечений из сборов методом ТСХ на пластинках Кіеве^еі 40Р254 обнаружено:

Сбор № 1: 11 зон адсорбции, из них 6 отнесено к флавоноидам: с Яґ » 0,25 (ликуразид); с Яґ « 0,30 (рутин); с Яґ « 0,35 (гиперазид); с Яґ « 0,48 (лютеолин -7-глюкозид); с Яґ « 0,96 (кемпферол); с Яґ ~ 0,98 (кверцетин); неидентифицировано 5 зон: с Яґ « 0,10; 0,22; 0,38; 0,44; 0,65 (рис. 2).

Сбор № 2: 13 зон адсорбции, из них 6 отнесено к флавоноидам: с Яґ » 0,25 (ликуразид); с Яґ » 0,30 (рутин); с Яґ » 0,35 (гиперазид); с Яґ » 0,48 (лютеолин -7-глюкозид); с Яґ ~ 0,96 (кемпферол); с Яґ » 0,98 (кверцетин); неидентифицировано 7 зон с Яґ« 0,10; 0,15; 0,22; 0,38; 0,44; 0,65; 0,68 (рис. 3).

Рисунок 2. Схема хроматограммы извлече- Рисунок 3. Схема хроматограммы извлечения из сбора № 1 (1) и растворов: ликурази- ния из сбора № 2 (1) и растворов: ликурази-да (2), рутина (3), гиперазида (4), лютео- да (2), рутина (3), гиперозида (4), лютеолин-лин-7-гликозида (5), кемпферола (6), квер- 7-гликозида (5), кемпферола (6), кверцетина цетина; в системе: этилацетат - уксусная (7); в системе: этилацетат - уксусная кислота кислота -вода (25:5:5) (обнаружение при -вода (25:5:5) (обнаружение при 360 нм). 365 нм).

Результаты ВЭЖХ исследования фенольных соединений представлены на рисунках 4-7. Идентифицировано в водном извлечении из сбора № 1: таннин, эпи-катехингаллат, глициризиновая кислота; флавоноиды свободные и гликозидиро-

ванные - ликуразид, лютеолин-7-гликозид, рутин, гиперозид; фенолкарбоновые кислоты - хлорогеновая, неохлорогеновая, кофейная. Преобладают по содержанию лютеолин-7-гликозид - 17,6 % и рутин - 27,6 %. Суммарное содержание фла-воноидов, определенное методом нормализации площадей пиков, составляет более 69 %, танина - 16,1 % от суммы полифенольных соединений (рис.4).

ту

&

і і і і і і і і і і і і—і і і і і і і—і і і і і і і і і і і і і і і

4 5 6 7 8 9 101 II21314151617181 «СЕ 122232£52бП282<8(В І323М53Є73839104 14213+45»

Рисунок 4. ВЭЖХ водного извлечения сбора № 1 при X =254 нм.

Идентифицировано в водном извлечении из сбора № 2: галловая, цикорие-вая, кофейная кислоты; флавоноиды свободные и гликозидированные - ликуразид, лютеолин-7-гликозид, рутин. Преобладают по содержанию галловая кислота 24,5% и рутин 36,5 %, суммарное содержание флавоноидов, определенное методом нормализации площадей пиков, составляет более 48 % от суммы фенольных соединений (рис. 5).

I I I I I I I і—і—і—і—і—і—і—і—і—г—і—1-і—і—і—і—і—і—1-і—і—п-

0 Г 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223242526272829303132

Рисунок 5. ВЭЖХ водного извлечения сбора № 2 при X =254 нм.

Идентифицировано в водно-спиртовом извлечении из сбора № 1: таннин, катехин, цикориевая кислота и рутин. Содержание флавоноидов, определенное методом нормализации площадей пиков, составляет: рутина более 30 %, катехина более 23 % от суммы полифенольных соединений. Идентифицировано в водно-спиртовом извлечении из сбора № 2: таннин, цикориевая кислота, ликуразид и рутин; преобладают по содержанию танин - 23,2 % и флавоноиды - 51,4 % от суммы полифенольных соединений.

При идентификации глицирризиновой кислоты (из к. солодки) в сборах № 1 и № 2 на хроматограмме обнаружена зона, флуоресцирующая синим цветом (с Rf около 0,6) на уровне зоны PCO глицирризиновой кислоты. При идентификации гиперицина (из тр. зверобоя) на хроматограмме спиртового извлечения из сборов обнаружены зоны адсорбции, желто-зеленого цвета: 1 - около линии старта на уровне PCO рутина (Rs =1,0); 2 - гиперозид (Rs =2,0).

При идентификации герниарина БАВ (из цв. ромашки) на уровне зон свидетеля герниарина наблюдали яркую синюю зону. При идентификации свободных Сахаров на хроматограммах исследуемых извлечений из сборов обнаружено по 8 красно-фиолетовых зон с Rf около 0,26 (галактоза); 0,32 (мальтоза); 0,38 (глюкоза); 0,40 (фруктоза); 0,74 (рамноза); 4 зоны с Rf около 0,14; 0,18; 0,67; 0,92 (не-идентифицированы).

При идентификации каротиноидов методом избирательной экстракции с последующим рехроматографированием на колонке с оксидом алюминия с измерением максимума поглощения, установлено присутствие ß-каротина, что согласуется с данными литературы (рис. 6).

9<-яп Or*ph

<иа о о зге

' 1 4 7'J 5: О 322

J ' ^\

\

/ I

/ \ \

\ | i

V I

«ОС 4?S »VC 4?* WO 54Э «30

bVavocarg№(nm]

Рисунок 6. Спектр поглощения ß- каротина, в видимой области (водно-спиртовое извлечение): 1- сбор № 1; 2- сбор № 2

03

02

I

5 01

При ТСХ исследованиях каротиноидов на хроматограмме спиртового извлечения из сборов № 1 и № 2 обнаружена 1 зона адсорбции синего цвета (КГ около 0,53), соответствующая (3-каротину.

4. Разработка методик количественного определения БАВ в сборах

Спектрофотометрия-определение рутина. Для оценки содержания фе-нольных веществ в сборах предложена адаптированная методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом спектрофотомет-рии, с раствором алюминия хлорида. Определены оптимальные условия экстракции суммы флавоноидов из сборов № 1 и № 2: степень измельчения сырья 1 и 3 мм соответственно, экстрагент - этиловый спирт 40 %, двукратная экстракция по 30 мин каждая при нагревании на кипящей водяной бане; соотношение сы-рье:экстрагент 1:20. Подобраны концентрация (3 %) и объем (2мл) алюминия хлорида. Устойчивое окрашивание извлечений с хлоридом алюминия наступает через 30 мин, максимум поглощения спектров извлечения - 410 нм совпадают (рис. 7,8).

Рисунок 7. Спектры спиртовых извлечений - сбор № 1:

1 - из сбора № 1; 2 - из сбора № 1с добавлением 2 % р-ра АІСІз ;3 - спектр комплексов рутина АІСІз в спиртовых извлечениях сбора № 1; 4 - спектр спиртового раствора СО рутина; 5 - спектр спиртового раствора СО рутина с добавлением АІСІз.

Рисунок 8. Спектры спиртовых извлечений - сбор № 2:

1 - из сбора №2; 2 - сбора № 2 с добавлением 2% р-ра А1С1з;3 - спектр комплексов рутина с АІСІз в спиртовых извлечениях из сбора № 2; 4 - спектр спиртового раствора СО рутина; 5 - спектр спиртового раствора СО рутина с добавлением АІСІз.

Ошибка единичного определения с 95% вероятностью для сбора № 1 и № 2 не превышает 1,15 % и 1,24 % соответственно. Содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин, для сбора № 1 колеблется от 2,83 до 3,21 %; для сбора № 2- от 2,53 до 2,66 %. В проект ФСП предлагаем установить норму содержания суммы флавоноидов для сбора № 1 - не менее 2,70 %, для сбора № 2- не менее 2,40 %.

Методика валидирована - подтверждена линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность.

Определение полисахаридов. Количественная оценка суммы полисахаридов основана на спектрофотометрии продуктов кислотного гидролиза сборов с пикриновой кислотой в щелочной среде и использования в качестве стандартного образца PCO глюкозы. Согласно полученным данным, комплексы взаимодействия извлечений из сборов № 1 и № 2 с пикриновой кислотой имеют спектральную кривую, идентичную спектральной кривой комплекса глюкозы с пикриновой кислотой при длине волны 460 нм. Достоверность предлагаемой методики определения содержания полисахаридов в сборах проверялась опытами с добавками глюкозы.

Количественное содержание полисахаридов в пересчете на глюкозу составило в сборе № 1, № 2 - 3,4 % и 3,3 % соответственно. Норма содержания полисахаридов в сборе № 1 и № 2 установлена не менее 3,0 %.

Методика валидирована - подтверждена специфичность, прецизионность и правильность. Относительная ошибка методики количественного определения суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу с 95% вероятностью составляет для сбора № 1 - 3,1 %, для сбора № 2 - 5,1 %. Отсутствие систематической ошибки подтверждено опытами с добавками.

Определение ß-каротина Количественное определение ß-каротина в сборах осуществляли методом спектрофотометрии после предварительной экстракции гексаном и разделения от сопутствующих веществ на колонке с оксидом алюминия. Полученные результаты исследования подтверждают содержание ß-каротина в сборах № 1- 0,2%, № 2 - 0,5 %. Относительная ошибка методики количественного определения содержания ß-каротина с 95 % вероятностью составляет для сбора № 1 - ±3,1 %, для сбора № 2 - ±1,45 %.

Определение глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ. Показано, что содержание глицирризиновой кислоты в опытных сериях сборов № 1 и № 2 колеблется от 0,696 до 0,700 %. Ошибка единичного определения с 95 % вероятностью не превышает для сбора № 1 - ±2,4 %, для сбора № 2 - ±2,3 %. Предложено установить норму содержания глицирризиновой кислоты для сборов № 1 и № 2 - не менее 0,6 %.

Определение эфирного масла. Содержание эфирного масла в образцах опытных серий сбора № 1 составило не менее 0,14 %, в образцах сбора № 2 - не менее 0,11%; суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту для сбора №

1 не менее 1,27 %, для сбора № 2 - не менее 1,15 %; дубильных веществ - не менее 2,83 % и 2,95 % соответственно.

Проведен товароведческий анализ шести опытно-производственных серий каждого сбора. Установлены следующие числовые показатели (%):

Сбор № 1 - содержание золы общей - не более 8,5 %; золы, нерастворимой в 10 % кислоте хлористоводородной - не более 1 %; массовая доля влаги - не более 13 %; степень измельчения: частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 5 мм - не более 10 %; проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм - не более 10 %; органической примеси - не более 3 %, минеральной примеси -не более 2 %; зараженность амбарными вредителями, плесень, затхлость, посторонние запахи и привкусы не допускаются.

Сбор № 2 - содержание золы общей - не более 8,0 %; золы, нерастворимой в 10 % кислоте хлористоводородной - не более 1 %; массовая доля влаги - не более 13 %; степень измельчения: частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 5 мм - не более 3 %; проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм - не более 2 %; органической примеси - не более 3 %, минеральной примеси -не более 2 %; зараженность амбарными вредителями, плесень, затхлость, посторонние запахи и привкусы не допускаются.

Таким образом, полученные результаты включены в проекты ФСП: сбор №1

- «Сбор для профилактики и комплексного лечения холодовой травмы»; сбор № 2

- «Фитоморозко».

Экспериментальные исследования проведенные на биологических моделях с криовоздействием, показали, что сборы достоверно обладают противовоспалительным, жаропонижающим, обезболивающим, антианемическим, детоксици-рующим, регенерирующим действием.

Таким образом, разработаны составы сборов (№ 1 и № 2) с фригопротектор-ным действием и методы их стандартизации. Эффективность и безопасность разработанных сборов подтверждена статистически достоверными результами полученными в ходе экспериментальных исследований на биологических моделях с криовоздействием, доказавшими положительную динамику восстановления всех лабораторных показателей (интерлейкины, гемоглобин, СОЭ, мочевина, креати-нин и др.).

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны, научно обоснованы и защищены патентами составы (рецептуры) новых сборов фригопротекторного действия из официнального ЛРС: № 1 -«Сбор для профилактики и комплексного лечения холодовой травмы» и № 2 -«Фитоморозко».

2. Проведено фитохимическое исследование сборов № 1 и № 2. С помощью качественных реакций, методов ТСХ и ВЭЖХ в них идентифицированы флаво-ноиды (ликуразид, рутин, гиперозид, лютеолин-7-гликозид, кемпферол, кверцетин), фенокарбоновые кислоты (хлорогеновая, неохлорогеновая, кофейная, цико-риевая кислоты), дубильные вещества (галловая кислота, танин, катехин, эпикате-хингаллат), а также сахара, терпеноиды, органические кислоты, гиперицин, гер-ниарин, глицирризиновая кислота, Р-каротин.

3. С использованием фармакопейных методик установлены диагностически значимые внешние и микроскопические признаки исследуемых сборов; с помощью общепринятых качественных реакций и ТСХ разработаны показатели их подлинности.

4. Разработаны и валидированы методики (спектрофотометрические) количественной оценки БАВ - суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу, методики (титриметрические) количественного определения суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту, дубильных (окисляемых) веществ, а также - эфирного масла, бетакаротина, глици-ризиновой кислоты. С помощью разработанных методик проведено количественное определение основных групп БАВ в сборах и предложены нормы их содержания: для флавоноидов - не менее 2,7 % (сбор № ]) и 2,4 % (сбор № 2), полисахаридов - не менее 3,0 % для обоих сборов.

5. С помощью общепринятых методов (на основании анализа серийных образцов) нормированы товароведческие характеристики сборов № 1 и № 2; разработаны проекты ФСП на сборы: № 1 - «Сбор для профилактики и комплексного лечения холодовой травмы»; № 2 - сбор «Фитоморозко» фригопротекторного действия.

6. Экспериментально доказано противовоспалительное, жаропонижающее, обезболивающее, антианемическое, детоксицирующее и регенерирующее действие сборов, их безопасность и эффективность при холодовой травме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алиева A.A. Фригопротекторы растительного происхождения // Бюл. СГМУ. - 2005.-№ 1. - С. 9-10.

2. Алиева A.A., Назаренко М.Ю., Киселева Т.Л., Назаренко H.A. Влияние лекарственных растительных сборов на биохимические показатели крови крыс при острой холодовой травме // Экология человека,- 2006.- № 8- С. 39-43.

3. Алиева A.A., Назаренко М.Ю., Киселева Т.Л., Назаренко H.A. Изучение влияния растительных лекарственных средств на уровень мочевины крови крыс при острой холодовой травме // Традиционная медицина.- 2006.- № 1 (6). - С. 53-57.

4. Алиева A.A., Назаренко М.Ю., Киселева Т.Л., Назаренко H.A. Изучение влияния двух новых сборов на уровень креатинина в крови крыс при острой холодовой травме // Сборник научных трудов - Сиб. ГМУ, г. Томск, 2006 г.- С. 58-60.

5. Алиева A.A., Назаренко М.Ю., Киселева Т.Л., Назаренко H.A. Поиск эффективных фригопротекторов растительного происхождения // Сборник научных трудов междунар. научн. конф. «Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы», г. Махачкала, 9 сентября 2006 г.- Махачкала: ИПЦ ДГМА, 2006.-С. 168.

6. Алиева A.A., Назаренко М.Ю., Киселева Т.Л., Назаренко H.A. Эффективность сборов на основе листьев березы бородавчатой, травы душицы обыкновенной, тысячелистника обыкновенного и зверобоя продырявленного при острой холодовой травме у крыс // Сборник научных трудов междунар. научн. конф. «Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы», г. Махачкала, 9 сентября 2006 г.- Махачкала: ИПЦ ДГМА, 2006.- С.169-170.

7. Алиева A.A. Назаренко М.Ю., Киселева Т.Л., Назаренко H.A. Сравнительное изучение дексаметазона и сбора на уровень мочевины крови крыс при холодовой травме // Сборник научных трудов конгресса «Традиционная медицина - 2007», г. Москва, 1-3 марта 2007 г. - М.: изд-во ФГУ ФНКЭЦ ТМДЛ, 2007. - С.26-29.

8. Алиева A.A., Назаренко М.Ю., Киселева Т.Л., Назаренко H.A. Сравнительное изучение дексаметазона и лекарственного сбора на уровень мочевины крови крыс при холодовой травме H.A. // Экология человека.- 2007,- №5-С.43-46.

9. Алиева A.A. Назаренко H.A., Киселева Т.Л., Назаренко М.Ю. Сравнительное изучение влияния дексаметазона и фитосборов на гематологические показатели крови крыс при острой холодовой травме // Сб. науч. тр. 1-го Российского фитотерапевтического съезда, Москва, 14-16 марта 2008 г., М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2008. - С. 164-169.

Ю.Алиева A.A., Пащенко В.П., Назаренко H.A., Киселева Т.Л. Изучение влияния фитосборов на рост клеточной культуры почек мыши // Сборник научных трудов 1-го Российского фитотерапевтического съезда, Москва, 14-16 марта 2008 г., М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2008. - С.162-164.

П.Алиева A.A., Пащенко В.П., Киселева T.JI., Назаренко H.A. Влияние декса-метазона и фитосборов на маркеры пролиферации клеточной культуры почек мыши // Цитология. - СПб.- «Наука» РАН, - 2008. - Т. 50. - № 9,- С.794.

12.Алиева A.A., Назаренко H.A., Киселева Т.Л., Назаренко М.Ю. Изучение влияния дексаметазона и растительных сборов на кинетику уровня цитоки-нов il-1 ß и il- 6 в сыворотке крови крыс при острой холодовой травме в эксперименте // Пятигорск, ГФА, 2009,- Вып. 64,- С.383-384.

13.Алиева A.A., Назаренко H.A., Киселева Т.Л., Назаренко М.Ю. Мониторинг уровня цитокинов сыворотки крови крыс при криоповреждении и введении дексаметазона и фитосборов // Сборник научных трудов Международного форума «Интегративная медицина-2009», г. Москва, 5-7 июня 2009 г.- М.: Издательство ФГУ ФНКЭЦ ТМДЛ, 2009 г. - Вып.4. - С.209-211.

14.Алиева A.A., Чаузова A.B., КиселеваТ.Л., Пинчук Е.О., Л.А. Устынюк Л.А. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в сборе, применяемом для профилактики и лечения отморожений // I Съезд натуротерапевтов России: Сборник научных трудов (г. Москва, 25 октября 2009 г.)/ Приложение к специальному выпуску журнала «Традиционная медицина» № 3 (18).- 2009.-М.: Издательство Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2009. - С.156-161.

15.Алиева A.A., Чаузова A.B., Киселева Т.Л., Пинчук Е.О., Устынюк Л.А. Разработка характеристик подлинности сбора, применяемого для профилактики и лечения отморожений (качественные реакции и тонкослойная хроматография //1 Съезд натуротерапевтов России: Сборник научных трудов, г. Москва, 25 октября 2009 г./ Приложение к специальному выпуску журнала «Традиционная медицина» № 3 (18) 2009. - М.: Изд-во Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2009.- С.161-164.

16.Алиева A.A., Фролова Л.Н., Киселева Т.Л., Мельникова H.H., Цветаева Е.В., Пинчук Е.О. Изучение анатомо - диагностических признаков сбора №1, применяемого для профилактики и лечения отморожений // Традиционная медицина. - 2009. - № 2 (17).- С.60-64.

17. Алиева А А., Киселева Т. Л., Фролова Л.Н., Мельникова H.H., Цветаева Е.В., Смирнова М.М. Микроскопическое изучение сбора № 2 «Фитоморозко» для профилактики и лечения отморожений // VII Международный конгресс «Традиционная медицина»: Сборник научных трудов, г. Москва, 23-25 октября 2009 г. / Приложение к специальному выпуску журнала «Традиционная медицина» № 3 (18) 2009. - М.: Изд-во Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2009. - С.326-328.

18.Алиева A.A., Фролова Л.Н., Киселева Т.Л., Мельникова H.H., Цветаева Е.В., Пинчук Е.О. Изучение анатомических диагностических признаков сбора №1, применяемого для профилактики и лечения отморожений // VII Международный конгресс «Традиционная медицина»: Сборник научных трудов, г. Москва, 23-25 октября 2009 г. / Приложение к специальному выпуску журнала «Традиционная медицина» № 3 (18) 2009,- М.: Изд-во Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2009. - С.335-336.

19.Алиева A.A., Чаузова A.B., Киселева Т.Л., Смирнова М.М., Устынюк Л.А. Разработка характеристик подлинности сбора «Фитоморозко» (качествен-

ные реакции и тонкослойная хроматография) // VII Международный конгресс «Традиционная медицина»: Сборник научных трудов, г. Москва, 23-25 октября 2009 г./ Приложение к специальному выпуску журнала «Традиционная медицина» № 3 (18), 2009,- М.: Изд-во Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2009.- С. 340-344.

20.Алиева A.A., Назаренко H.A. Фармакогностическое изучение сборов для профилактики и лечения отморожений // Бюллетень СГМУ,- 2009.- № 2. -Вып. 23,- С. 5-6.

21.Алиева A.A., Малетина Е.А., Назаренко H.A. Информационно-аналитическое исследование фригопротекторов растительного происхождения // Бюллетень СГМУ.- 2009,- № 2.- Вып. 23.- С. 6-7.

22.Алиева A.A. Назаренко H.A., Киселёва Т.Н., Назаренко М.Ю., Малявский И.Ю., Пащенко A.B. Морфологическое изучение почек крыс при отморожении и при введении дексаметазона и фитосборов // II Российский Фитотера-певтический съезд: Сборник научных трудов, г. Москва, 22-23 октября 2010 г./ Приложение к специальному выпуску журнала «Традиционная медицина» №3(22).- 2010,-С. 4-5.

23.Шацких A.A. Назаренко H.A., Киселева Т.Л., Назаренко М.Ю., Малявский И.Ю., Пащенко A.B. Нефропротекторные свойства двух сборов при экспериментальной острой холодовой травме // Растительные ресурсы.- 2011.Т. 47.-Вып. 3.- С. 123-129.

24.Шацких A.A., Назаренко H.A., Киселева Т.Л., Назаренко М.Ю., В.П. Пащенко В.П. Сравнительное изучение влияния свежеприготовленных и длитель-нохранящихся настоев сборов с фригопротекторной активностью на рост культуры почек мыши // Традиционная медицина,- 2011.- № 5.- С.395-398.

25.Шацких A.A., Назаренко H.A., Киселева Т.Л., Назаренко М.Ю., Малявский И.Ю., Пащенко A.B. Морфологическое изучение влияния сборов и дексаметазона на кожу крыс при криоповреждении // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии», г. Казань, 18-21 сентября 2012 г. - М.: Фолиум, 2012. - С. 199.

26.Шацких A.A., Назаренко H.A., Киселева Т.Л., Назаренко М.Ю., Малявский И.Ю., Пащенко A.B. Сравнительное изучение влияния двух новых сборов и дексаметазона на цитоархитектонику кожи крыс при острой холодовой травме //Традиционная медицина».- 2012.- № 5 - С.159-162.

27.Шацких A.A., Киселева Т.Л. Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов и валидация в сборах (№1 и №2) применяемые для профилактики и лечения отморожений // Научные ведомости БелГУ: Медицина. Фармация.-2013.-№ 11 (154).-Вып. 22/2. - С. 84-91.

28.Сбор лекарственных растений «Фитоморозко», обладающий фригопротек-торным действием: пат. A.c. 2336896 Рос. Федерация: заявители и патентообладатели Назаренко H.A., Киселёва Т.Л., Алиева A.A., Назаренко М.Ю., A.A. Карпеев A.A. заявл. 30.11.06.; опубл. 27.10.08.

29. Средство из растительного сырья для профилактики и лечения отморожений: пат. A.c. 2326684 Рос. Федерация: заявители H.A. Назаренко H.A., Киселёва Т.Л., Алиева A.A., Назаренко М.Ю; патентообладатели СГМУ (г. Архангельск), заявл. 26.10.06.; опубл. 20.06.08.

30.Arzneimittel aus Pflanzenrohstoffe zur Kongelationspravention und Kongela-tionsbehandiung: Pat. Alieva Ajmcsedo, Archangelsk, RU; Kiseleva Tatjana, Moskau, RU; Nazarenko Mikhail, Archangelsk, RU; Nazarenko Natalja A., Archangelsk, RU/Nr. 20 2008 017 925.4; 17.12.2008 aus 10 2008 062 426.8 Bundesrepublik Deutschland Urkunde über die Eintragung des Gcbrauhsmusters.

Используемые сокращения:

БАВ - Биологически активные вещества

ВЭЖХ - Высокоэффективная жидкостная хроматография

ГФ - Государственная фармакопея

лс - Лекарственные средства

ЛР - Лекарственные растения

ЛРС - Лекарственное растительное сырье

нд - Нормативный документ

reo - Государственный стандартный образец

тех - Тонкослойная хроматография

тм - Традиционная медицина

ФС - Фармакопейная статья

Подписано в печать:

30.10.2013

Заказ № 9010 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ra