Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Прокоагулянтная активность плазменных фосфолипидных мембран при тромбофилиях

На правах рукописи

МАМАЕВ Андрей Николаевич

Прокоагудянтная активность плазменных фосфолипидных мембран при тромбофилиях

14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Барнаул - 1997

Работа выполнена в Алтайском государственном медицинском университете.

Научные руководители: Член-корреспондент РАМН,

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор З.С. Баркаган; Кандидат медицинских наук,

A.П.Момот.

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук,

профессор A.B. Федоров; Кандидат медицинских наук,

B.А. Ечыкомов.

Ведущее учреждение: Новосибирский государственные медицинский институт

Защита состоится «_»_1997 г.

в__часов на заседании диссертационного совета Д 084.25.01

при Алтайском государственном медицинском университете по адресу: 656099, г. Барнаул, пр. Ленина, 40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Алтайского государственного медицинского университета: Адрес библиотеки: 656017, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 144.

Автореферат разослан « »_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Е.И. Буевич

Актуальность проблемы. Гематогенные тромбофилии (ГТ) широко распространены в клинической практике, осложняют течение многих заболеваний, приводят к ранней инвалидизации и гибели больных. Основными клиническими проявлениями тромбофилий являются рецидивирующие тромбозы вен и/или артерий, тромбоэмболии, ишемии и инфаркты органов, нарушения мозгового кровообращения, другие нарушения кровотока в магистральных сосудах и в зонах микротшркуляшш (З.С.Баркаган, 19831996; З.С.Баркаган и соавт., 1991 - 1997; Б.Л.Балуда и соает., 1992; Я.Ь.В1ск е1 а1, 1992,1995; М.Батато, 1993; В.ОаЫЬаск, 1995; ЬМ.Бе.фаШап еТ а1. 1996 и др.). Они могут быть первичными, генетически обусловленными, а также вторичными, связанные с другими заболеваниями. Нарушения гемостаза, лежащие в основе многих тромбофилий, пока недостаточно известны широкому кругу' врачей и часто не диагностируются.

Распознавание и дифференциация различных патогенетических форм ГТ - важная задача, поскольку многие из них имеют сходную симптоматику, но нуждаются в различных профилактических и лечебных воздействиях. Не менее важное значение имеет выявление наиболее тромбогенных тромбофилий, определение степени выраженности нарушений гемостаза, контроль по количественным показателям эффективности применяемого лечения. Между тем, даже при наиболее распространенных приобретенных и наследственных тромбофилиях - антифосфолипидном синдроме (АФС), резистентности фактора V к активированному протеину С (АПС), недостаточно четко определены ведущие механизмы тромбогенности и плохо разработаны критерии количественной оценки выявляемых нарушений, влияние на эти нарушения применяемых методов лечения. Известно также, что АФС. при одинаковых показателях титра антифосфолипидных антител протекает в одних случаях с частыми тяжелыми тромбозами и тромбоэмбо-лиями, а в других. - без тромботических нарушений (З.С.Баркаган, 1990,1993; З.С.Баркаган и соает., 1991 - 1995; А.Е.Дорохов, 1995; Е.Л.Насонов и соавт., 1995; М.ВЛжШп, 1994; ТЖМеаёе, 1994; ЯАЛч/гсппп е( а!.,1996; MJ.Seghatc.hian е1 а!., 1996).

Роль плазменных фосфолипидных мембран (ПФМ), как матриц на которых активируются и взаимодействуют факторы свертывания крови и антикоагулянты, в настоящее время общеизвестна (Д.М. Зубаиров, 1978; Д.М. Зубаиров и соавт., 1987-1993; А.Ш.Бышевский и соавт., 1985-1993; О.А.Терсенов и соавт. 1988; О.А.Терсенов, 1989; Р.Ф.Байкеев, 1994). В исследованиях последних лет установлено, что блокада этих мембран анти-фосфолипидными антителами и, в еще большей степени, антителами к фосфолипицам и некоторым белкам (Д-гликопротешгу-Г, аннексину V, протромбину и др.), является одним из ведущих механизмов нарушения взаимодействия физиологических антикоагулянтов с активированными факторами свертывания крови и тромбообразования (E.Marciniak et al., 1989; L.Amer et al, 1990; S.C.Lo et al, 1990; M.Borrell et al., 1992; Kitchen S. et al., 1989; J.T.Brandt et al., 1993; R.L.Bick, 1994; M.I.Bokarewa et al., 1994,1995; P.G.Groot et al., 1994).

В литературе мы не нашли данных о том, как изменяется лрокоагу-лянтная активность ПФМ при разных тромбофилиях, в том числе при АФС, а также данных о влиянии лечебных воздействий на прокоагулянт-ную активность ПФМ при этих заболеваниях. Наша работа посвящена определению степени участия плазменных фосфолипидных мембран в патогенезе гематогенных тромбофилий. Второй важной задачей, имеющей большое практическое значение, стала разработка простых и доступных методов диагностики ГТ, в частности способа определения активности волчаночного антикоагулянта (ВА) и совершенствование методов феноти-пической диагностики резистентности к АПС.

Цель работы. Определить степень участия плазменных фосфолипидных мембран в патогенезе разных гематогенных тромбофилий, уточнить специфичность этих нарушений, и на этой основе разработать новые диагностические тесты и методы контроля эффективности лечения.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние прокоагулянтной активности ПФМ у больных с разными видами тромбофилий и при геморрагическом микротромбоваскулите.

2. На основании полученных результатов уточнить критерии диагностики антифосфолипидного синдрома и выявления эффектов ВА.

3. Изучить возможность количественной оценки ингибиторной активности ВА в традиционных единицах Бетесда.

4. Оценить воздействие терапии на прокоагулянтную активность ПФМ при антифосфолилидном синдроме.

5. Разработать новый, доступный для большинства лабораторий вариант методики фенотипической диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью к АПС, используя в качестве реагента плазму лишенную фактора V, но содержащую актированный протеин С и нормальное количество К-витаминозависимых факторов свертывания.

6. Определить частоту выявления тромбофилии, обусловленной резистентностью к АПС, среди больных с ранними тромбозами в регионе Сибири.

Научная новизна:

1. Полученные результаты уточняют ранее неизученные стороны патогенеза некоторых гематогенных тромбофилий, связь нарушений гемостаза с изменением прокоагулянтной активности ПФМ.

2. Показано участие ПФМ в патогенезе нарушений гемостаза при АФС и геморрагическом микротромбоваскулите.

3. На основании применения новых методических подходов установлены разные механизмы' иншбирующего действия ВА на фосфолипидные матрицы.

4. Представлены первые данные о значительной частоте тромбофилии, обусловленной резистентностью к АПС среди больных с ранними рецидивирующими тромбозами в регионе Сибири.

Практическая значимость: 1. Уточнена диагностическая значимость метода определения прокоагулянтной активности ПФМ для выявления эффектов ВА.

2. Уточнены критерии эффективности лечения больных с АФС и геморрагическим микротромбоваскулитом, по сдвигам прокоагулянтной активности ПФМ.

3. Показана возможность количественной оценки активности ВА в традиционных единицах Бетесда.

4. Разработан новый доступный вариант методики распознавания тромбо-филии, обусловленной резистентностью к АПС.

5. Установлена высокая частота тромбофилии, обусловленной резистентностью к АПС, среди больных с ранними тромбозами и тромбоэмболиями в регионе Сибири.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практику работы Алтайского гематологического центра и городской больницы №11, в отделениях ревматологии и сосудистой хирургии Алтайской краевой больницы, в краевом перинатальном центре, в родильных домах и гинекологических отделениях города Барнаула. Основные положения работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции "Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 1995); Ш Всероссийской конференции "Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения" (Москва,'1997); XI Международном конгрессе токси-нологов (Тель-Авив, 1994); XII Международном конгрессе гематологов (Стамбул, 1995); XIV Международном конфессе по тромбозам (Монпелье, 1996), IIa XVI Международном конгрессе ISTH (Флоренция, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 6 в центральной и 5 в зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописи, иллюстрирована 22 таблицами и 9 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, и списка литературы (310 источников).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При АФС прокоагулянтная активность ПФМ снижена.

2. Способ определения ирокоагулянтной активности ПФМ может быть использован для выявления эффектов ВА.

3. Предложенный способ определения активности ВА позволяет оценивать эффект ингибиторов "волчаночного типа" в стандартных единицах Бетесда.

4. Прокоагулянтная активность ПФМ снижается в острой фазе геморрагического микротромбоваскулита и повышается до нормы при успешном лечении.

5. Разработанный способ диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью к АПС, , высоко специфичен, отличается хорошей воспроизводимостью, не чувствителен к эффектам антикоагулянтов непрямого действия, доступен для большинства клинических лабораторий.

6. Резистентность к АПС - частый вид тромбофилии в регионе Сибири.

Работа выполнена в лаборатории гемостаза при кафедре пропедевтики внутренних болезней Алтайского медицинского университета и Алтайском гематологическом центре (научный руководитель - член-корр. РАМН, заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., проф. З.С.Баркаган, зав. лаб. - к.м.н. АП.Момот).

Выражаю благодарность моему научному руководителю и учителю профессору З.С. Баркагану за предложенную тему, постоянный интерес к работе, ценные советы и замечания и заведующему лабораторией гемостаза Алтайского гематологического центра к.м.н. А.П.Момоту.

Выражаю глубокую признательность за товарищескую помощь и совместные исследования доцентам кафедры пропедевтики внутренних болезней Л.П. Цывкиной, Е.И. Буевичу, ассистентам к.м.н. K.M. Бишевскому и к.м.н. В.И.Белых, врачам к.м.н. Г.В.Сердюк, к.м.н. А.Е.Дорохову, аспиранту И.Я. Цеймах, лаборантам кафедры Т.А.Лапшиной и Т.Г.Усовой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Развернутое исследование системы гемостаза выполнено у 120 больных и у 100 здоровых людей контрольной группы. Антифосфолипидный синдром диагностирован у 29 больных, из числа которых вторичный антифосфолипидный синдром выявлен у 17 больных. Резистентность к АПС выявлена у 10, из 50 больных с рецидивирующими тромбозами и тромбоэмболиями, дефицит протеина С - у 6, дефицит антитромбина III - у одного. У 33-х больных с повторными тромбозами и тромбоэмболиями в молодом возрасте указанные выше тромбо-фшши выявлены не были (первая группа сравнения).

Геморрагический микротромбоваскулит (болезнь Шенлейна-Геноха) диагностирован у 22-х больных. Системные заболевания соединительной ткани, не осложненные АФС, были диагностированы у 19 больных (вторая группа, сравнения), из них у 10- СКВ, у 5 - ревматоидный артрит, у 2-х -узелковый периартериит, у одного - болезнь Бехчета, у одного - ревматизм.

При исследовании системы гемостаза определяли следующие параметры:

1. Тесты, характеризующие сосудисто-тромбоцитарный гемостаз: подсчет количества тромбоцитов в камере Горяева с использованием фазового контраста по Brecher et al.(1953) или на счетчике клеток крови "Cell-Dyn 3500" (Abbott), АДФ-,коллаген-, адреналин-агрегацию тромбоцитов на агрегометре "Инфра", определение фактора Вилдебранда по Evans (1977).

2. Тесты, характеризующие коагуляционный гемостаз и фибринолиз: активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) с реагентами фирм "Технология-Стандарт" или "Organon Teknika", протромбиновое время с тромбопластинами фирм "Технология-Стандарт" и/или "Organon Teknika", стандартизированными по международному индексу чувствительности (IS1), время свертывания в тесте с ядом порзы (Vípera lebetina tura-nica) по З.С.Баркагану (1975), время свертывания в тесте с ядом эфы (Echis multisquamatus) по Л.П.Цывкиной и соавт. (1977), тромбиновое время,

концентрация фибриногена в плазме по Р.А.Ругберг (1961), ХИа-зависимый лизис эуглобулинов по Г.Ф.Еремину и А.Г.Архипову (1982).

3. Тесты, выявляющие тромбинемию по наличию в плазме РФМК: этаноловый тест по Godai (1971), фенантролиновый (ФТ) по В.А.Елыко-мову и А.П.Момогу (1987).

4. Прокоагуляитную активность плазменных фосфолипидных мембран определяли по разработанному А.П.Момотом и К.М.Бишевским методу (патент РФ № 2058031, 1996; А.П.Момот, 1997).

5. Выявление волчаночных антикоагулянтов выполняли в соответствии с методическими рекомендациями нашего центра (З.С.Баркаган и соавт., 1993). Оно включало: каолиновое время свертывания БТП, АПТВ с эталонным реагентом "Platelin LS" фирмы "Organon Teknika", время свертывания с разведенным тромбопластином (1:50) по Schleider (1976), тест коррекции нормальной плазмой (в соотношении 1:1), тест коррекции разрушенными тромбоцитами по Tripiett (1983).

Активность ингибиторов волчанопного типа определяли в единицах Бетесда разработанным нами способом по ингибированию плазмой больных с волчаночным антикоагулянтом ПФМ, полученных из нормальной плазмы.

6. Способы определения антитромбина III: а) коагуляционный способ определения прогрессивной активности антитромбина III по Abildgaard et al. (1970) в модификации К.М.Бишевского (1979), б) способ определения гепарин-кофакторной активности антитромбина III (кинетический метод с использованием диагностического набора "Berichrom Antithrombin III"), в) иммунологический способ с помощью диагностического набора "NOR-Partigen-Antithrombin III" (Behringwerke AG).

7. Способы определения активности протеина С: а) коагуляционный способ по Martinolli (1986), б) способ определения протеина С кинетическим методом (на хромогенном субстрате) с использованием диагностического набора "Berichrom Protein С " (Behringwerke AG).

8. Резистентность к АПС определяли разработанным нами способом фенотипической диагностики с вычислением индексов R и NR.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование прокоагулянтной активности ПФМ у больных с ВА

У 29 больных с АФС с тромбозами, тромбоэмболиями, нарушениями мозгового кровообращения, невынашиванием беременности, другими проявлениями тромбофилического статуса нами был диагностирован АФС по наличию в плазме ВА. У больных этой группы обнаружено значительное снижение, в среднем 42.1±5.2%, прокоагулянтной активности ПФМ в сравнении с контрольными значениями (99.8±1.8%, Р<0.001 ). Для уточнения механизма угнетения прокоагулянтной активности ПФМ, нами выполнялись тесты обмена ПФМ. Исследовали показания каолинового времени (КВ) до и после внесения ПФМ больного в плазму донора, а также до и после внесения ПФМ донора в плазму больного. Результаты определения КВ при обмене ПФМ представлены на рис.1. Из него видно, что при возврате в профильтрованную нормальную БТП собственных ПФМ наблюдается полное восстановление исходного КБ, среднее значение 88.1+3.1 с (столбец 3). В отличие от этого, при добавлении ПФМ, полученных из плазмы больных, в нормальную профильтрованную плазму - КВ не подвергалось нормализации, а оставалось удлиненным в среднем до 120.6 ± 16.1 с (столбец 4). С другой стороны, при добавлении ПФМ, полученных из нормальной БТП, в профильтрованную плазму больных с ВА каолиновое время укоротилось незначительно, в среднем всего в 1.4 раза, до 138.6±16.3 с (столбец 8), тогда как при возврате этих же ПФМ в профильтрованную нормальную плазму КВ укоротилось в 1.8 раза. Эти данные свидетельствуют об ингибировании ПФМ, полученных из нормальной плазмы, антифосфо-липидными антителами, содержащимися в плазме больных.

Таким образом, нами выявлено закономерное и значительное снижение прокоагулянтной активности ПФМ у больных АФС. При этом подавление активности ПФМ менее 72% нами обнаружено у 24 из 29 больных. Эти данные позволяют считать методический подход для выявления эффектов ВА, основанный на определении ингибироваиия ангифосфолипид-

ными антителами прокоагулянтной активности ПФМ, эффективным способом диагностики АФС.

Каолиновое время, с 250 -I

200-

150

100 •

50

7 и5- до фильтрации

2 и 6 - после фильтрации

Зи 7- после возврата

собственных ПФМ

4 на- при обмене ПФМ

Контроль

Больные АФС

Рис. 1. Каолиновое время свертывания в разных образцах БТП у больных с АФС и в контроле.

Р1.2<0.001; Риз>0.5; Ри4<0,05; Р23<0.001;Р?.,,<0.001; Ри<0.05; Р$.¿<0.001; Рг}.7>0.5; Р5-8>0.5; Р6.7<0.001; Р6-8<0.001; Р7.8>0.5; Р1.5<0.001; Р2.6<0.001; Р3_7<0.001; Р4.8>0.5

Для оценки степени специфичности этого те ста мы провели сравнений его показаний у больных с системными заболеваниями соединительной ткани, осложненными АФС и без клинико-лабораторных признаков АФС. Установлено, что значительное снижение прокоагулянтной активности ПФМ наблюдалось только у больных с АФС, но было нормальным у больных коллагенозами без АФС.

Результаты определения активности ВА по ингибированию нормальных ПФМ

; " Нами разработан новый способ количественной оценки ВА, который позволяет определять активность ВА в единицах ингибитора Бетесда (ЕБ). Установлено, что в среднем активность ингибитора волчаночного типа, у обследованных 15 больных с АФС, равна 0.91 ± 0.07 ЕБ. Наибольшая активность выявлена -у больной АФС, протекавшим с тромбозами, невы-нашЯ'ва'нием-' беременности и ложноположительной реакцией Вассермана. При изучении ингибирующего действия ВА на показания прокоагулянт-ной активности ПФМ донора при помещении их в плазму больного уста-н$щендА^_дто.,.^щетение этой прокоагулянтной активности достигает максимума через 15-30 мин.

Коагуляционная активность ПФМ, %

Рис,2. Угнетение прокоагулянтной активности ПФМ донора при внесении их в плазму больных с ВА и инкубации.

При этом у 4 из 5 больных прокоагулянтная активность снизилась более чем на 30% в течение первых трех минут инкубации, а у одного больного с вторичным АФС обнаружено медленное (прогрессивное) угнетение активности ПФМ. В контрольных исследованиях угнетения, про-коагулянтной активности ПФМ с течением времени в нормальной рлазме не выявлялось (рис.2).

Изменения прокоагулянтной активности ПФМ и активности ВА

у больных с АФС в процессе лечения

При обследовании 14 больных с АФС после курса комплексного лечения по разработанной в нашем центре методике (З.С.Баркаган, 1989,1990; З.С.Баркоган и соавт., '1989-1993; Г.В.Сердюк, 1993; Л.Е.Дорохов, 1995; Z.S.Barkagan еГ а1, 1993), включавшей в себя этапный плазмаферез, подкожные инъекции гепарина или фраксипарина, применение дезагрегантов (аспирин, трентал или др.) установлено, что исходно сниженный показатель прокоагулянтной активности ПФМ достоверно повысился с 42.1 ± 5.2% до 73.2±5.6% (Р<0.001). Восстановление прокоагулянтной активности ПФМ у больных с АФС, после проведенного лечения, мы связываем с удалением из их крови антифосфолипидных антител и их комплексов с ПФМ ( рис.3). Интибиторная активность ВА после лечения достоверно снизилась у этих больных с 0.91 ± 0.07 ЕБ до 0.43 ± 0.21 ЕБ (рис.4.).

В целом, полученные нами данные свидетельствуют о закономерном нарушении прокоагулянтной активности ПФМ у больных с наличием ВА в крови. Способ определения прокоагулянтной активности ПФМ по А.П.Мо-моту и К.М.Бипгевскому и способ количественного определения активности ВА в единицах Бетесда могут быть использованы в качестве тестов для выявления эффектов ВА и оценки эффективности лечения больных АФС.

Активность ПФМ,%

120

90

Р,.2 <0.001 Риз <0.001

Р2-3 <0.001

Рис. 3. Прокоагулянтная активность ПФМ у больных АФС (1 - контроль; 2 - до лечения; 3 - после лечения).

Активность ВА, БЕ 1,2

0,8-

0,4-

1 - до лечения

2 - после лечения

Р].2 <0.05

Рис. 4. Активность ВА у больных АФС в процессе лечения.

Прокоагулянтная активность ПФМ у больных с резистентностью к протеину С, дефицитом протеина С и дефицитом антитромбина Ш

Прокоагулянтную активность ПФМ мы определили у 10 больных с резистентностью к /\ПС, у 6 больных с дефицитом протеина Сиу одного больного с дефицитом антитромбина III. Полученные результаты представлены на рисунке 5.

Прокоагулянтная активность ПФМ, %

120 ■

80

40

Р,-2 >0.5 Риз >0.5 Р2-з >0.5

Рис. 5. Показатели прокоагулянтной активности ПФМ у больных с разными видами тромбофилий (1 - контроль; 2 - больные с резистентностью к А ПС; 3 - больные с дефицитом протеина С; 4- больной с дефицитом АТ-Ш).

Из рисунка 5 видно, что у обследованных больных с различными наследственными тромбофилиями прокоахулянтная активность ПФМ не отличается от контрольных значений. Эти данные свидетельствуют о том, что снижение прокоагулянтной активности ПФМ является специфическим нарушением, свойственным иммунной тромбофилии - АФС.

Прокоагулянтная активность ПФМ у больных геморрагическим микротромбоваскулитом (ГМВ)

Мы обследовали 22 больных ГМВ. Из числа этих больных кожно-сустав-ная форма заболевания диагностирована у 17, кожно-почечная - у 2-х, кожно-абдоминальная - у 2-х, смешанная форма - у одной. Установлено, что в острой фазе ГМВ происходит временное снижение прокоагулянтной активности ПФМ (64.6+8.7%), и это снижение наблюдается при всех клинических формах ГМВ. После комплексного лечения происходит нормализация прокоагулянтной активности ПФМ (109.2+8.6%), что очевидно связано с уменьшением их потребления в процессе внутрисосудистого свертывания крови (рис.6).

Прокоагулянтная

активность ПФМ,% 1 - контроль

2 -до лечения

т 3 - после лечения

X 1

- т Р¡.2 <0.001 Р/.з <0.3 Р2-з <0.001

-Ь X

1 ; •»" * г: ' 2 : 3

Рис. 6. Прокоагулянтная активность у больных ГМВ до и после лечения.

Установлено, что у отдельных больных с ГМВ прокоагулянтная активность ПФМ повышалась до высокого уровня, что соответствует обнаруженной А.П.Момотом (1997) гипермембранемии во второй фазе ДВС синдрома. В отличие от этого при неэффективном лечении этот показатель оставался сниженным.

Диагностика тромбофилии, обусловленной резистентностью к АПС.

Разработка нового варианта теста

Для фенотипической диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью к АПС, используют функциональные способы, регистрирующие в плазме больных недостаточное удлинение коагуляционных тестов (часто АПТВ) после внесения в тестируемую смесь активированного протеина С. Но для выполнения таких исследований необходимы дорогостоящие и достаточно дефицитные реагенты, в том числе плазма, лишенная фактора V. Это делает подобные определения малодоступными для большинства клинических лабораторий. В связи с этим нами, совместно с З.С.Баркаганом и Л.П.Цывкиной, был разработан вариант этого теста, более доступный для большинства клинических лабораторий.

Этот способ отличается от известных тем, что в тест-системе используется нормальная оксалатная плазма, лишенная фактора V, с активированным протаком протеином С. Приготовить такую плазму легко в любой лаборатории. Она содержит достаточное количество факторов протромбино-вого комплекса, протеина С и протеина Б, но в ней отсутствует фактор V. Это существенно повышает чувствительность теста к дефекту фактора V в исследуемой плазме, и исключает влияние на результаты теста дефицита физиологических антикоагулянтов (протеинов С и Б) и эффектов лечения непрямыми антикоагулянтами, поскольку в плазме, лишенной фактора V, содержание К-витамшгзависимых факторов свертывания и антикоагулянтов остается нормальным. Способ имеет хорошую воспроизводимость, пригоден для обследования больных, получающих непрямые антикоагулянты и доступен для большинства клинических лабораторий.

Принцип способа: Для активации протеина С к нормальной плазме, лишенной фактора V, добавляли "Рго1ас", после чего смешивали исследуемую плазму, разведенную в пропорции 1:3 буфером Михаэлиса и каолин-кефалиновый реагент, инкубировали эту смесь, добавляли СаС12. Под влиянием АПС происходит удлинение АПТВ более чем в 2.2 раза,

тогда как при резистентности фактора Уа к активированному протеину С это удлинение АПТВ выражено значительно слабее.

Оценивали результаты теста на основании вычисления индексов 11б (в исследуемой плазме), К^ (в контрольной нормальной плазме) и N11.

АПТВ исследуемого образца БТП после добавления плазмы без фактора V с активированным протеином С

КБ =-

АПТВ исследуемого образца БТП после добавления плазмы без фактора V и буфера

АПТВ контрольного образца БТП после добавления плазмы без фактора V с активированным протеином С

Кк==---

АПТВ контрольного образца БТП после добавления плазмы без фактора V и буфера

Активность протака была нами подобрана так, что при исследовании плазмы здоровых людей индекс Як был в пределах 2.2-3.0. N11 вычисляли по формуле:

Кб

N11 = -

%

В норме N11 колеблется в пределах от 0.78 до 1.26. Снижение индекса N11 в пределах от 0.78 до 0.7 говорит об умеренной резистентности фактора Уа к активированному протеину С, от 0.7 до 0.5 - о значительной резистентности, менее 0.5 - о тяжелой (чаще всего гомозиготной) форме этого нарушения.

Рисунок 7 демонстрирует результаты вычисления индексов Я и N11 в группах больных с тромбозами и в контрольной группе. Из рисунка видно, что у 10 из 50 больных с ранними рецидивирующими тромбозами мы выявили стабильную резистентность к протеину С. При этом, у двух больных по индексу ЫИ обнаружена умеренная резистентность к протеину С

к

3.5

® ® 00 ' 1

®

о о

® ® ей) ООО

1

ш

1.5

1,0

0.5

0.0

®®<9

р.

& ООО

оооо оооооо 000000

да

90 90

"V"

1

1

Рис. 7.

Индексы К и N1^ подученные при определении резистентности к АПС в разных группах больных и в контроле. Обозначения: 1 - контроль, 2 - больные с тромбозами без резистентности к АПС, 3 - больные с резистентностью к АПС.

(ЫЯ 0.70-0.78), у пяти - значительная резистентность (КЯ 0.50-0.70) и у трех - очень глубокая, характерная для тяжелой формы этой патологии (N11

0.4.0.5). У одного больного обнаружено сочетание значительной резистентности к АПС со снижением содержания протеина 5 (т.е. мультигенная тромбофилия).

ВЫВОДЫ

1. При антифосфолипидном синдроме прокоагулянтная активность ПФМ закономерно снижена, что документируется методом микрофильтрации.

2. Для количественной оценки ингибирующего действия волчацочного антакоагулянта в традиционных единицах активности Бетесда может быть использован способ, основанный на определении угнетения нормальных ПФМ ингибиторами из плазмы больного.

3. Прокоагулянтная активность ПФМ повышается, а ингибиторная активность ВА снижается у больных с антифосфолипидным синдромом при комплексном лечении с применением этапного плазмафереза.

4. При тромбофилиях, обусловленных дефицитом протеина С и резистентностью к протеину С, средние значения прокоагулянтной активности ПФМ остаются нормальными, но в отдельных случаях подвергаются сдвигам вследствие активации процесса внутрисосудистой коагуляции.

5. Разработанный вариант методики диагностики тромбофшши, обусловленной резистентностью к протеину С, высоко специфичен, имеет хорошую воспроизводимость и может применяться при .лечении непрямыми антикоагулянтами.

6. Резистентность к активированному протеину С является часто встречающимся видом тромбофилии в регионе Западной Сибири.

7. В острой фазе геморрагического микротромбоваскулита происходит снижение прокоагулянтной активности ПФМ. При эффективном комплексном лечении с применением этапного плазмафереза происходит нормализация прокоагулянтной активности ПФМ.

Практические рекомендации:

1. Метод определения прокоагулянтной активности ПФМ может быть использован для диагностики и контроля эффективности лечения больных АФС.

2. Для определения иншбиторной активности ВА в единицах Бетесда может применяться способ, основанный на определении угнетения нормальных ПФМ.

3. Предложенный вариант способа фенотипической диагностики тромбо-филии, обусловленной резистентностью к АПС, является доступным и высокоспецифичным тестом, может применяться в клинических лабораториях для выявления этого вида тромбофилии.

4. Исследование прокоагулянтной активности ПФМ облегчает контроль за эффективностью лечения геморрагического микротромбоваскулита.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. The influence of plasma phospholipid membranes and lupus "anticoagulants" (LA) on snake venoms clotting action. // In: 11th World Congress on Animal, Plant and Microbial Toxins. Tel Aviv. - October 2-7. - 1994. - P.80. (With Z.S.Barkagan, LP.Tsyvkina).

2. Определение и оценка участия фрагментов клеточных мембран в процессе свертывания крови. // В кн: Сборник научных трудов Росийской конференции "Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии". -С-Петербург, 1995. - С.126-127. (соавт. З.С.Баркаган, А.П.Момот, К.М.Бишевский).

3. Анализ участия микромембран в гемокоагулирующих эффектах змеиных ядов. // В кн: Сборник научных трудов Нижегородского медицинского университета. - 1995. - С.15-18. (соавт. З.С.Баркаган, Л.П.Цывкина, А.П.Момот, И.Я.Цеймах, Т.А.Соломина).

4. A new simple test for determination of the changes of plasma phospholipid procoagulant activity in patients with the antiphospholipid syndrome (APS). // In: XHIth Meeting of the International Society of Haematology. Istambul, 3-8 September 1995. - P.945. (With Z.S.Barkagan, A.P.Momot, I.Ceimah).

5. Coagulation activity of plasma phospholipid membranes (PhM) in patients with lupus anticoagulant (LA). // In: 14 th International Congress on Thrombosis. Montpellier, France, 14-19 October 1996. - Abstr. 51. - P.342. (With Z.S.Barkagan, A.P.Momot).

6. The influence of different heparins on haemocoagulant action of central-asian snake venoms. // In: 14 th International Congress on Thrombosis. Montpellier, France, 14-19 October 1996. - Abstr. 51. - P.342. (With Z.S.Barkagan, L.P.Tsyvkina, I.Ya.Tseimakh).

7. Первый опыт диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью к активированному протеину С.//Тер. архив.- 1997,- №2. - С.35-37. (соавт. З.С.Баркаган, В.Б.Гервазиев, Л.П.Цывкина, АЛ.Карпенко, И.Я.Цеймах).

8. Предварительные данные о частоте тромбофилии, обусловленной резистентностью к активированному протеину С в российской популяции региона Сибири. // В кн: Тезисы докладов на III Всероссийской конференции "Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения". - Москва, 1997. - С.16-17. (соавт. З.С.Баркаган, Л.П.Цывкина, И.Я.Цеймах).

9. К методике фенотипической диагностики резистентности к протеину С. // В кн: Тезисы докладов на III Всероссийской конференции "Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения". - Москва, 1997. - С.18-20. (соавт. З.С.Баркаган, Л.П.Цывкина, И.Я.Цеймах).

10. Связь илеокавальных тромбозов в области имплантации кава-фильтров с гематогенными тромбофилиями. // В кн: Тезисы докладов на III Всероссийской конференции '¿Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения". - Москва, 1997. - С.45-46.^ (соавт. В.Б.Гервазиев, З.С.Баркаган, А.А.Карпенко; Л.П.Цывкина).

11. Prevalence of APC-resistance (APC-R) amoung the patients with early thrombosis in the sibirian region of Russia In: XVI Congress of the International Soc. on Thrombosis and Haemostasis. Florence, 1997 - Abstr.32. (With Z.S.Barkagan, L.P.Tsyvkina, I.Ya.Tseimakh).