Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Применение siRNA для подавления репродукции респираторного синцитиального вируса, одного из этиологических агентов вирус-индуцированной бронхиальной астмы

На правах рукописи

Акимов Виталий Сергеевич

ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ РЕСПИРАТОРНОГО СИНЦИТИАЛЬНОГО ВИРУСА,

ОДНОГО ИЗ ЭТИОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ ВИРУС-ИНДУЦИРОВАННОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003167540

Москва, 2008

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук М.Р. Хаитов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Э.В. Карамов доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилин

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Росздрава

дании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» по адресу: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2. Тел/Факс: (495) 617-10-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России».

Защита диссертации состоится «

Ж ¿ш

2008 г. в

часов на засе-

Автореферат разослан « » 2008 г.

Ученый секретарь

Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Респираторный синцитиальный вирус (PCB) является одним из главных этиологических факторов вирус-индуцированной бронхиальной астмы [Johnston S L , 1995, Хаитов М Р , 2003] Доказано, что перенесенная в детском возрасте РСВ-инфекция, приводит к развитию гиперчувствительности дыхательных путей у детей и к развитию бронхиальной астмы в дальнейшей жизни [McBnde J Т, 1999] РСВ-инфекция - одна из главных причин тяжелых заболеваний верхних и нижних дыхательных путей у новорожденных и детей раннего возраста. Инфекция PCB у новорожденных сопряжена с высокой смертностью, что, отчасти, связано с недостатком эффективных лекарственных средств Ежегодно в мире в результате заболеваний нижних дыхательных путей, связанных с PCB, умирает несколько миллионов детей младше 5 лет PCB вызывает инфекцию нижних дыхательных путей примерно в 40% случаев первичного инфицирования [Venkatesh М Р, 2006] Показано, что PCB является основной причиной заболеваемости и смертности у пожилых и людей с ослабленным иммунитетом [Englund JA, 1997, Falsey A R, 2000]

Хорошо известно, что вирусные инфекции являются важными факторами возникновения дыхательной обструкции у больных бронхиальной астмой Это в первую очередь связано с колонизацией вирусами эпителия дыхательных путей, клетки которого продуцируют большое количество провоспалительных цитоки-нов и медиаторов, усиливающих воспалительный процесс [Gern J Е , 1995] Установлено, что у больных атопической бронхиальной астмой респираторная вирусная инфекция усиливает гиперреактивность бронхов [Empey D W, 1976, Einarsson О , 1996] По различным данным от 60% до 85% обострений бронхиальной астмы у детей и до 50% обострений бронхиальной астмы у взрослых связаны с респираторными вирусами [Johnston S L , 1998, Хаитов М Р , 2003] В связи с этим появилось основание для характеристики обострений бронхиальной астмы, ассоциированных с ОРВИ, термином вирус-индуцированная бронхиальная астма

Подходы к терапии вирус-индуцированных обострений заболеваний респираторного тракта недостаточно эффективны [Black CP, 2003, Venkatesh MP,

2006] На сегодняшний день не существует эффективной вакцины против PCB В клинической практике для лечения РСВ-инфекции, в том числе тяжелых состояний, таких как бронхиолит и пневмония, обычно используется только симптоматическая терапия Эффективность рибавирина по результатам последних исследований поставлена под сомнение Противовирусные средства на основе монокло-нальных антител обладают очень высокой стоимостью и не доступны для повсеместного клинического применения Таким образом, во всем мире существует острая потребность в создании нового эффективного средства против РСВ-инфекции

В 2006 году лауреатами Нобелевской премии в области физиологии и медицины за открытие интерференции РНК стали американские ученые Эндрю Файр и Крег Мелло [Fire А, 1998] Интерференция РНК - это РНК-зависимый механизм регуляции экспрессии генов, в котором введение в клетку двухцепочечной РНК ингибирует экспрессию генов с комплементарной нуклеотидной последовательностью Среди прочих важных функций этот механизм позволяет клетке защищаться от чужеродного генетического материала, прежде всего от вирусов. При попадании в клетку двухцепочечной РНК она разрезается РНКазаШ-подобным ферментом, который называется Dicer, на короткие двухцепочечные РНК длиной 21-23 пары нуклеотидов - siRNA (от англ small interfering RNA) [Zamore PD, 2000] Эти siRNA включаются в состав сложного эффекторного белкового комплекса RISC (RNAi-mduced silencing complex), обнаруживающего и разрушающую мРНК-мишень, соответствующую данной siRNA [Martinez J, 2002] Это значит, что введение в клетку siRNA против конкретной мРНК-мишени приводит к сайленсингу соответствующего белка, в том числе и вирусного белка. В связи с этим, возможность разработки нового антивирусного средства специфического действия против PCB на основе механизма интерференции РНК является весьма перспективной

Цель работы: разработка подхода, основанного на использовании механизма интерференции РНК, для подавления репликации PCB - основного этиологического фактора возникновения бронхиолита у детей, а также причинозначимо-4

го фактора, предраспологающего к развитию бронхообструктивного синдрома и бронхиальной астмы, и одной из основных причин вирус-индуцированных обострений бронхиальной астмы у детей и взрослых

Задачи исследования. 1. Проанализировать геном PCB

2 Произвести дизайн siRNA против мРНК кандидатного белка-мишени PCB

3 Оценить антивирусную активность siRNA против мРНК белка-мишени PCB in vitro в культуре клеток

4 Оценить антивирусную активность siRNA против мРНК белка-мишени PCB m vivo на мышах

5 Выявить наиболее эффективные siRNA против мРНК белка-мишени PCB

Научная новизна. Впервые в Российской Федерации экспериментально изучена возможность использования средств на основе siRNA против вирусов на клеточной модели и на экспериментальных животных

Проведена оценка противовирусного действия на модели РСВ-инфекции в культуре клеток МА104 экспериментальных образцов siRNA при помощи микроскопического наблюдения за состоянием монослоя клеток, методом титрования вируса и определением количества вирусной РНК в культуральной жидкости методом ПЦР в реальном времени Подобранные специфические siRNA эффективно подавляли репродукцию PCB в культуре клеток

Отработана экспериментальная модель РСВ-инфекции на мышах BALB/C Действие экспериментальных образцов siRNA испытали на мышиной модели РСВ-инфекции путем определения количества вирусной РНК PCB в гомогенатах легких мышей методом ПЦР в реальном времени, а также патологоанатомической оценкой состояния легких мышей и при помощи титрования вируса из легочных смывов

Исследования, проведенные in vitro и in vivo, продемонстрировали противовирусную активность испытанных экспериментальных образцов посредством подавления репликации PCB, что предоставляет возможность для создания специфических противовирусных средств на основе механизма интерференции РНК

Практическая значимость. Данная работа открыла возможность примене ния механизма интерференции РНК для создания новых лекарственных средств против PCB, обладающих сиквенс-специфическим действием Данные лекарственные препараты могут быть использованы для профилактики и лечения состояний, ассоциированных с РСВ-инфекцией, в том числе таких тяжелых как бронхиолит у детей Более того, применение данных средств поможет сократить заболеваемость бронхиальной астмой, связанной с перенесенной в раннем детстве РСВ-инфекцией, а также позволит уменьшить число вирус-индуцированных обострений бронхиальной астмы у детей и взрослых Продемонстрирована возможность создания сравнительно недорогой, простой, но эффективной методики для контроля РСВ-инфекции в экспериментальных моделях Данный подход может быть использован в дальнейшем для разработки новых средств профилактики и лечения других социально значимых вирусных инфекций

Показана эффективность эндотрахеального введения мышам препаратов, содержащих siRNA, что подразумевает возможность применения ингаляционных средств данного механизма действия против PCB, например, в виде простого ручного дозированного ингалятора

Полученные данные могут быть использованы в образовательном процессе для студентов ВУЗов и в учебных программах повышения квалификации специалистов по аллергологии и иммунологии Результаты работы могут стать показательным учебным материалом для демонстрации возможностей механизма интерференции РНК по угнетению репродукции вирусов

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на ежегодном съезде Американской Академии Аллергологии, Астмы и Иммунологии (Сан Диего, США, 23-27 февраля 2007г ), на XXVI конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии (Готеборг, Швеция, 9-13 июня 2007г), на VIII конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, Россия, 27-29 июня 2007г), на 2-м Международном конгрессе «Иммунитет и болезни От теории к терапии» (Москва, Россия, 10-14 сентября 2007 г), на ежегодном съезде Американского Коллед-6

жа Аллергологии, Астмы и Иммунологии (Даллас, США, 8-14 ноября 2007 г) Основные результаты диссертационной работы отражены в 9 публикациях, в том числе 8 в центральной научной печати, 1 публикация в материалах международных конгрессов

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа В С Акимова построена по традиционному плану, изложена на 113 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, разделов, описывающих материалы и методы исследований, результаты, обсуждения полученных результатов и выводов Диссертация иллюстрирована 1 таблицей, 20 рисунками, включая фотографии. Список использованной литературы включает 164 источника, из них 12 отечественных и 152 зарубежных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использован респираторно-синцитиальный вирус штамм Long Вирус культивировали на перевиваемой культуре эмбриональных эпителиальных клеток почки обезьяны МА104 Вирус и культура клеток любезно предоставлены Сомининой А А, ГУ НИИ гриппа РАМН, г Санкт-Петербург Для получения модели инфекции использовали мышей линии BALB/c обоих полов весом 18-20 грамм Животные поступали из питомника ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН, Москва Вся работа с животными проводилась в соответствии с «Положением об этическом отношении к лабораторным животным», согласно приказу директора ГНЦ Институт иммунологии от 07 07 2003 и приказа МЗ РФ от 19 06 2003 №267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации» 1.1. Культивирование клеток и вируса

PCB размножали в культуре клеток МА104, которые культивировали на питательной среде, состоящей из двух частей MEM и одной части DMEM с добавлением 4% фетальной сыворотки коров, L-глутамина (300 мкг/мл) и гентамицина (50 мкг/мл) в инкубаторе с 5% С02 при 37°С За 24 часа до заражения вирусом клетки пересевали на культуральные флаконы 162 см2, чтобы к моменту заражения они образовали монослой с 50% конфлюентностью Клетки дважды промыва-

ли средой без сыворотки и заражали 1 мл вируса, содержащего 2*104 ТЦД50/мл После 2 часов адсорбции вируса при 37°С, при периодическом покачивании флаконов, добавляли 60 мл поддерживающей среды Поддерживающая среда отличается от питательной отсутствием фетальной сыворотки и повышенным содержанием L-глутамина (600 мкг/мл) Через 48 часов после заражения, наблюдали характерное для PCB ЦПД в виде образования множества синцитиев, при этом основная часть монослоя оставалась прикрепленной 1.2. Трансфекция клеток МА104 siRNA и заражение PCB

За 24 часа до трансфекции клетки МА104 пересевали на 12-ти луночные планшеты с такой плотностью, чтобы к моменту трансфекции они образовали монослой с 50% конфлюентностью Перед трансфекцией производили смену среды на бессывороточную Opti-MEM I Трансфекцию siRNA производили с использованием реагента для трансфекции Lipofectamme2000 по рекомендованной производителем методике Спустя 4 часа после трансфекции клетки заражали PCB в дозе 103 ТЦД50/лунку Через 4 часа после заражения проводили вторую трансфекцию siRNA Через 48, 72 и 96 часов после инфицирования из лунок отбирали культуральную жидкость для титрования по ЦПД и анализа методом количественной ПЦР Из лунок с клетками, зараженными PCB и обработанными специфическими и неспецифическими siRNA, через 48, 72 и 92 ч после инфицирования переносили по 200 мкл культуральной жидкости в пробирки и осветляли низкоскоростным центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 мин Осветление культуральной жидкости при подготовке материала для ПЦР делали для того, чтобы оценить количество РНК «отпочковавшихся» вирионов, т е полностью завершивших цикл репродукции Часть надосадочной жидкости сразу использовали для титрования вируса, другую часть хранили при -70°С до исследования методом ПЦР Таким образом, наряду с титрованием вируса по ЦПД, ПЦР выступает в роли метода дополнительного контроля уровня вирусной репродукции Контроль трансфекции производили использованием флюоресцентно-меченной siRNA к мРНК структурного клеточного белка ламина- siGLO Lamm А/С

1.3. Титрование вируса в культуральной жидкости по ЦПД определением конечной точки

Титрование вируса производили путем пятикратных разведений вирусного материала в 96-луночных планшетах с подготовленным монослоем клеток МА104 Титр PCB определяли на 8 день по последнему разведению, в котором наблюдалось развитие ЦПД с образованием специфических синцитиев Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в ТЦЦ5о/мл, т е в количестве 50% тканевых цитопатических доз вируса, содержащихся в 1 мл

1.4. Определение количества вирусной РНК в культуральной жидкости методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green-1

В работе были использованы праймеры, направленные к F-гену, подобранные на основании анализа нуклеотидной последовательности генома PCB штамм Long Прямой праймер - GTGTTGGATCTGCAATCG Обратный праймер -CTGTTGTTCTTTTGTTGGAACTC Размер ампликона - 258 пар оснований Суммарную нуклеиновую кислоту выделяли из 100 мкл образца, используя коммерческий набор реагентов «ИзоГен» кДНК получали в 30 мкл реакционной смеси, содержащей буфер для ОТ, 0,5 мМ каждого дНТФ, 12,5 пкмоль прямого прай-мера, 5 ед ингибитора рибонуклеаз, 50 ед ревертазы вируса лейкоза Молони, 8 мкл РНК, при 37°С в течение 30 минут Фермент инактивировали прогреванием при 95°С в течение 5 минут Далее, образцы анализировали методом ПЦР с флюоресцентной детекцией в режиме реального времени (РВ) в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green-1 Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, состоящей из реактивов набора для проведения ПЦР РВ "Синтол", и 12,5 пмоль каждого праймера в термоциклере АНК-16 Программа ПЦР 95°С -120 сек -1 цикл, 55°С - 50 сек, 95°С - 20 сек - 45 циклов Для построения калибровочной кривой был использован калибратор - ПЦР-продукт, вырезанный из геля, очищенный, с известной концентрацией Расчет пороговых циклов, построение калибровочных кривых, расчет числа копий кДНК проводили при помощи программного обеспечения к амплификатору АНК-16 Специфичность

ПЦР контролировали при помощи процедуры "плавления" продуктов реакции методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий Ре зультаты выявляли и документировали в ультрафиолетовом свете (312 нм) пр помощи гель-документирующей системы «Gel Imager»

1.5. Экспериментальная модель инфекции PCB на мышах

Перед началом эксперимента вирус концентрировали преципитацией поли этиленгликолем Полученный вирусный материал использовали для заражени мышей Животных распределили по группам и взвесили В каждую группу входи ло 6 мышей - 4 самки и 2 самца Всего было сформировано 6 групп 1 группе вво дили смесь PCB и siOl, 2 группе - PCB и si03, 3 группе - PCB и si05, 4 - PCB siHRV, 5 - смесь PCB и фосфатно-солевого буфера, 6 - фосфатный солевой бу фер При учете результатов опыта 4 группа считалась контрольной Животные 1 2, 3, 4 групп получили 60 мкл siRNA (1 мкг/мкл) и 40 мкл вируса с титро 2*106ТЦД5о/мл, 5 группе вводили вирус, смешанный с фосфатно-солевым буфе ром в тех же пропорциях Введение PCB и siRNA осуществляли эндотрахеальн при помощи катетера Действия, связанные с эндотрахеальным введением вирус и препаратов siRNA, а также вынужденный убой мышей, сопровождались внут рибрюшинной инъекцией наркотизирующего средства диазепам в дозе 15 мг/кг Спустя 6 дней после заражения животных забивали и извлекали легкие вместе трахеей Перед убоем мышей взвешивали

1.6. Титрование вируса в смывах из легких мышей

Легкие мышей помещали на стерильную чашку Петри и при помощи инсу-линового шприца многократно промывали 1 мл поддерживающей среды Полученный смыв осветляли центрифугированием (5 минут, 5000 об/мин) при4°С Титрование вируса в полученных смывах проводили путем последовательных трехкратных разведений вирусного материала в 96-луночных планшетах с подготовленным монослоем клеток Титр PCB учитывали на 10 день после заражения по последнему разведению, в котором наблюдалось характерное ЦПД

1.7. Определение количества вирусной РНК в гомогенатах легких мышей методом ОТ и ПЦР-РВ с использованием флуоресцентно-меченного зонда TaqMan

С целью определения количества вирусной РНК легкие гомогенизировали в фосфатно-солевом буфере (200 мкл на 100 мкг легочной ткани) Экстракт осветляли центрифугированием (5 минут, 5000 об/мин) при 4°С Гомогенаты хранили при -80°С до момента исследования методом обратной транскрипции (ОТ) и ПНР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) Для выделения вирусной РНК использовали коммерческий набор Qiagen В реакции ОТ кДНК получали в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 3 мкл буфера для ОТ, 0,5 мМ дНТФ, 25 пмоль прай-мера для ОТ, 5 ед ингибитора рибонуклеаз, 40 ед ревертазы вируса лейкоза Молони, 10 мкл РНК, при 42°С в течение 30 минут Фермент инактивировали нагреванием при 95 °С в течение 5 минут Далее образцы анализировали методом ПЦР-РВ с использованием флуоресцентно-меченного зонда TaqMan Амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси, которая содержала 5 мкл 10-кратного буфера для Hot Start Taq ДНК полимеразы, 30 мМ дНТФ, 2мМ MgC12, 12,5 пмоль каждого праймера, 5 пмоль флуоресцентно-меченного зонда, 2,5 ед Hot Start Taq ДНК полимеразы и 5 мкл кДНК в термоциклере АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН) Программа ПЦР 95°С - 120 с -1 цикл, 58°С - 40 с, 95°С - 20 с - 45 циклов Зонд для ПЦР-РВ ROX-AGAGGATGGTACTGTGACAATGCAGGATCA-BHQ2 Перед началом исследования образцов была построена калибровочная кривая для определения количества копий кДНК PCB Для построения калибровочной кривой был использован калибратор - ПЦР-продукт, вырезанный из геля, очищенный при помощи набора фирмы Promega с известной концентрацией Готовили его 10-кратные разведения - 300 000, 30 000, 3 000 и 300 копий на реакционную смесь в трех повторно-стях и проводили ПЦР в реальном времени 1.8. Статистический анализ

Полученные данные представляли в виде среднего значения± стандартная ошибка среднего значения Оценивали достоверность отличия титра вируса и ко-

личества вирусной РНК в культуральной жидкости в лунках, обработанных ис следуемыми siRNA, по сравнению с обработанными контрольной siRNA (siHRV по t-критерию Стьюдента, считая различие достоверным при Р<0,001 Статисти ческую значимость различий в количестве вирусной РНК в разных группах мы шей оценивали в соответствии с критерием t Стьюдента, различие считали досто верным при Р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение генома PCB. Дизайн siRNA против мРНК белка Р PCB. В ка

честве мишени в геноме PCB был выбран фосфопротеин Р, являющийся меньше' субъединицей РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP) и эссенциальным транс крипционным фактором для белка L [Bitko V, 2001], поэтому ингибирование син теза субъединицы Р вирусной RdRP должно приводить к угнетению основног объема вирусной транскрипции и репликации и, следовательно, трансляции ви русных белков

Структура мРНК белка Р PCB была изучена на основании анализа 21 нук-леотидных последовательностей, доступных в банке данных NCBI (Национальный центр биотехнологической информации, США) Выбранные молекулы siRNA были нацелены на консервативные участки мРНК белка Р в пределах открытой рамки считывания и соответствовали формулам AAN19TT, NAN19NN, NARN17YNN, NANN17YNN (где N - любое нуклеиновое основание, R - пурино-вое нуклеиновое основание, Y - пиримидиновое нуклеиновое основание) В соответствии с критериями, рекомендованными Elbashir с соавторами [Elbashir S М , 2001] были синтезированы шесть уникальных потенциально наиболее эффективных последовательностей siRNA к мРНК белка Р

1) siOl. мРНК мишень CGAUAAUAUAACUGCAAGAUU (401-419)

siRNA CGAUAAUAUAACUGCAAGAdTdT

dTdTGCUAUUAUAUUGACGUUCU

2) si03. мРНК мишень UGAUCUAUCACUUGAAGAUUU (719-737)

siRNA UGAUCUAUCACUUGAAGAUdTdT

3' dTdTACUAGAUAGUGAACUUCUA

3) si05. мРНК мишень GUAGUAGCAAGUGCAGGACCU (474-492)

siRNA GUAGUAGCAAGUGCAGGACdCdT

3' dTdCCAUCAUCGUUCACGUCCUG

4) si07. мРНК мишень GCAAGUGCAGGACCUACAUCU (480-498)

siKNA GCAAGUGCAGGACCUACAUdCdT

3' dTdCCGUUCACGUCCUGGAUGUA

5) si09. мРНК мишень UACUAGGAAUGCUUCACACAUU (451 -470)

siRNA UACUAGGAAUGCUUCACACAdTdT

3' dAdCCACAGAGAGUUAGGUUGUAG

6) sill. мРНК мишень UUGAUAACAAUGAAGAAGAAU (343-361)

siRNA UUGAUAACAAUGAAGAAGAdAdT

3' dTdAAACUAUUGUUACUUCUUCU

Ha 3'-концах всех siRNA были помещены дезоксирибонуклеиновые остатки, что увеличивает их устойчивость к РНКазам [Elbashir S М, 2001]

7) siMix. В качестве седьмой опытной siRNA использовали смесь этих шести специфических siRNA, смешанных в равных пропорциях

Специфичность действия siRNA контролировали использованием siRNA к

мРНК белка VP4 риновируса 16 серотипа, показавшей высокую противоринови-

русную активность в культуре клеток [Krista М Ph, 2004]

siHRV мРНК мишень GAUGCAGCUUCCAGUGGUGUU (728-746)

siRNA GAUGCAGCUUCCAGUGGUGdTdT

3' dTdTCUACGUCGAAGGUCACCAC

Оценка антивирусной активности siRNA против мРНК белка Р PCB в культуре клеток.

Микроскопическая оценка состояния зараженных вирусом клеток Изменение структуры монослоя клеток МА104 под действием вируса наблюдали в динамике при помощи микроскопа В клетках обработанных неспецифическими siRNA (siHRV и siGLO) и необработанных siRNA через 24 часа после заражения при микроскопическом исследовании монослоя наблюдали единичные синцитии Через 48 часов после заражения наблюдали выраженное ЦПД, которое проявлялось в формировании характерных крупных синцитиев в монослое Через 72-96

13

часов после инфицирования в этих лунках оставалось около 50% прикрепленных клеток, из них примерно половина в составе обширных синцитиев, остальные клетки находились в составе всплывших синцигиев Через 120 часов после заражения под действием вируса монослой полностью разрушается

Напротив, через 48, 72 и 96 часов после заражения в лунках, обработанных специфическими siRNA визуально синцитии не определялись, монослой выглядел интактным Более того, состояние клеток к 3-4 суткам даже улучшилось, что было отмечено по интенсивной клеточной пролиферации В клетках, обработанных специфическими siRNA, признаков ЦПД не наблюдали до 7-10 суток, в зависимости от использованной siRNA

В отдельном эксперименте было показано, что даже однократная обработка клеток специфическими siRNA через 4 часа после инфицирования обеспечивает длительное угнетение образования синцитиев по сравнению с неспецифическими siRNA В этих лунках через 48-72 часа после заражения синцитии также визуально не определялись Через 96 часов в лунках с одной трансфекцией визуально определялись единичные маленькие синцитии с 2-3 ядрами Активное образование синцитиев наблюдали на 5-7 сутки после заражения в зависимости от использованной siRNA

Оценка противовирусной активности siRNA методом титрования Титр вируса в клетках, обработанных различными специфическими siRNA против PCB, при оценке титра по ЦПД через 48, 72 и 96 часов после заражения был значительно ниже, чем в обработанных контрольной неспецифической siRNA Наиболее эффективные варианты siRNA снижали титр вируса в 200-300 раз по сравнению с контрольными siRNA Ниже в виде гистограмм (рисунок 1) представлены результаты определения титра вируса через 48, 72 и 96 часов после инфицирования По оси абсцисс расположены варианты siRNA - опытные и контрольная (siHRV) По оси ординат титр вируса в 1о§юТЦД5о в мл культуральной жидкости *** -Р<0,001

10'-10'-10'-

10"-10'-

ю3-

1 о3-1 о5-

ю'-

1 о3-

ю2-

Рисунок 1. Титрование вируса через 48, 72 и 96 часов после инфицирования и обработки

Оценка противовирусной активности яЖЫА путем определения в культу-ральной жидкости количества вирусной РНК методом ПЦР в реальном времени. При проведении ПЦР в реальном времени зафиксировано значительное снижение количества копий вирусной РНК - до 40 раз по сравнению с контрольными з1КНА. На гистограммах (рисунки 2) представлены результаты определения количества вирусной РНК методом ПЦР в реальном времени через 48, 72 и 96 часов. По оси абсцисс расположены варианты 31Ю\[А - опытные и контрольная (бЩЮ/). По оси ординат 1о§ 10 количества вирусной РНК в мл культуральной жидкости соответственно. ** - Р<0,01, *** - Р<0,001

♦ * - V ■

* Л. - - -

"г1! * * *[

¿¡ГЧЛ¡х" Э|б1 ' 5|6З ¿¡ЙБ 5Й7 ' в|б9 з^ к н'яу'

"ПТГП

3|М|Х эЮ1 эЮЗ

:

¡05 эЮ7 ¡Ю9 бИ 1 s¡HRV

И

'¡¡¡¿¡х з¡Ь1 ' зШ ' згЬг ' $¡1)7 ' з||)9 ' эт 8 1

ix' si6l Si63 ' si&5 ' sii)7 ' sii)9 ' sii 1 SiHRV

10'

***T

SiMix si01 Si03 Si05 si07 si09 Si11 siHRV

i

SiMix si01 si03 Si05 Si07 si09 si 11 SiHRV

Рисунок 2. Результаты определения количества вирусной РНК в вируссодержащей кулы туральной жидкости, 48, 72 и 96 часов после заражения и обработки siRNA.

В диссертационной работе показано, что siRNA посредством сайленсинга вирусных генов эффективно угнетает вирусную репликацию. Применение наномо-, лярных концентраций siRNA приводит к достоверному снижению титра вируса, до 200-300 раз в культуре клеток. Известно, что вещество обычно считается потенциально успешным в качестве фармакологического терапевтического средства, если, оно эффективно в культуре клеток в субмикромолярных концентрациях.

При определении количества вирусной РНК при помощи ОТ-ПЦР степень уменьшения количества вирусной РНК в культуральной жидкости при обработке

siRNA достигла 30-40 раз Более эффективное снижение титра вируса (в 200-300 раз) при оценке действия siRNA по ЦПД по сравнению с количественным определением вирусной РНК объясняется нарушениями в сборке вирионов под воздействием siRNA siRNA к мРНК белка Р PCB вызывает сайленсинг гена ключевого белка, что, возможно, ведет к сборке дефектных вирионов, содержащих недостаточное количество белка Р, но содержащих РНК Образуется меньшее количество инфекционных полноценных вирионов, что проявляется снижением вирусных титров в культуральной жидкости

Комплексный анализ данных, полученный в экспериментах на культуре клеток при микроскопическом исследовании, титровании вируса и ПЦР позволяет сделать заключение о том, что мРНК белка Р является удачной мРНК-мишенью для создания антивирусного средства против PCB на основе siRNA

Важным моментом в подборе участка мРНК мишени является проблема «ускользающих мутаций» вирусов и необходимость подбора siRNA к консервативным участкам генома В настоящей работе показано, что эффективность смеси siRNA (siMix) в культуре клеток не уступает самым удачным siRNA, входящим в ее состав Таким образом, смесь нескольких siRNA может быть использована как универсальный препарат против PCB, обладающий противовирусной активностью в отношении большого разнообразия генетических вариантов вируса В принципе препарат siMix может содержать siRNA не только к одной, а сразу к нескольким разным мРНК-мишеням, кодирующим ключевые вирусные белки Таким образом, можно одновременно воздействовать на различные звенья патогенной активности вируса и добиваться более эффективного снижения активности вирусной репликации

Оценка антивирусной активности siRNA против мРНК белка Р PCB в экспериментальной модели инфекции на мышах. Для оценки активности siRNA в мышиной модели РСВ-инфекции использовали образцы siRNA, показавшие наибольшую эффективность в модели m vitro Этими образцами стали опытные siOl, si03, si07 и контрольная siHRV

По данным большинства исследователей экспериментальную модель PCB получают при использовании мышей линии BALB/c и PCB штамм А2, к которому мыши более восприимчивы [Taylor G , 1984, Van Schalk S M , 1998, Sudo К, 1999,

Kong X, 2005, Bitko V, 2007] Но в литературе также встречаются данные об удачном проведении экспериментов in vivo с применением PCB штамм Long [Bitko V, 2005, Cianci С , 2004]

PCB вводили мышам в смеси с siRNA без применения специальных средств доставки siRNA В перспективе применение siRNA без носителей является экономически более эффективным, а также снижает риск побочных эффектов С другой стороны, с помощью средств для доставки siRNA с клетку можно добиться более эффективного сайленсинга вирусных генов

В данной работе препарат siRNA вводился эндотрахеально, что позволяло доставлять siRNA непосредственно на эпителий респираторного тракта - основной, первичный очаг репликации респираторных вирусов Для использования siRNA против вирусов, поражающих другие органы и ткани потребуются специальные средства доставки, которые обеспечат транспортную функцию через различные гистологические барьеры, защитную функцию от разрушения и сохранение функциональных свойств siRNA

Титрование вируса в бронхоалъвеолярных смывах их легких мышей и пато-логоанатомическая оценка состояния легких При титровании вируса из легочных смывов не удалось получить результаты, которые характеризовали бы разницу в титре между опытными и контрольной группой Вероятно, это связано с недостаточной чувствительностью применяемого метода титрования вируса по ЦПД Однако было замечено, что в группах обработанных опытными специфическими siRNA удалось выделить вирус в культуре клеток из легких только у 1 мыши из 18, те у 5% мышей Тогда как из легких 12 мышей контрольной 4 группы (siHRV) и 5 группы (не обработанной siRNA) удалось выделить вирус у 42% мышей Это указывает на снижение репродукции вируса в легких мышей, обработанных специфическими siRNA

Снижение репродукции вируса в легких мышей, обработанных специфическими siRNA, подтверждаются видимыми поражениями в легких, которые мы наблюдали при вскрытии грудной клетки мышей Легкие мышей из группы зараженных респираторным синцитиальным вирусом без введения siRNA и мышей из контрольной группы (siHRV) выглядели отечными, цианотичными, неравномерной окраски с участками уплотнений и очагами кровоизлиянияний, по консистен-

ции они были неэластичными, рыхлыми, что соответствовало патологоанатоми-ческой картине массивной двухсторонней полисегментарной очагово-сливной геморрагической пневмонии. Напротив, в легких мышей из групп зараженных мышей, которые получили опытные специфические siRNA, видимых патологических изменений ткани легких не определялось - они были равномерной «здоровой» светлорозовой окраски, эластичной, упругой консистенции.

Определение количества вирусной РНК в гомогенатах легких методом ПЦР в реальном времени. В гомогенатах легких мышей на 6 сутки после эндотрахеаль-ного введения респираторного синцитиального вируса и siOl при проведении ПЦР-РВ обнаружено статистически достоверное снижение количества копий специфической вирусной РНК в 14 раз по сравнению с контролем (siHRV). В гомогенатах легких мышей получивших эндотрахеально респираторный синцитиальный вирус и si03 зафиксировано снижение количества копий специфической вирусной РНК в 7 раз. При проведении ПЦР-РВ в гомогенатах легких мышей, которым вводились PCB и si07, зарегистрировано статистически недостоверное снижение количества копий специфической вирусной РНК по сравнению с контролем. Результаты определения количества вирусной РНК методом ПЦР-РВ представлены в виде гистограммы (рисунок 3).

1

101 *

юб-Ц—,—и—г—и—,—и—,—и—т—I

ЯЭУ+вЮ! ИЗУ+эЮЗ Р!5У+5Ю7 РЗУ+бНЯУ Я!5У

Рисунок 3. Результаты определения количества вирусной РНК в гомогенатах легких методом ПЦР-РВ, копий/1 грамм легочной ткани. По оси абсцисс расположены варианты з1ЯКА - опытных (зЮ1, бЮЗ, зЮ7) и контрольных групп (вйЖУ, ЯБУ); по оси ординат -количество копий вирусной РЫК в 1 грамме легочной ткани. * - Р<0,05.

Выявление наиболее эффективных siRNA против PCB. Эксперимен тальные образцы siOl и si03 наиболее эффективно подавляли репликацию вирус в культуре клеток по сравнению с другими экспериментальными образцами. Эт же образцы показали лучшие результаты по снижению вирусной репликации модели инфекции на мышах Указанные siRNA соответствуют формуле AAN19T и обладают высокой устойчивостью к эндонуклеазам [Bank S, 2004] А также, возможно, более эффективным взаимодействием с комплексом RISC

Специфичность siRNA очень убедительна несовпадение на одну пару оснований между siRNA и мРНК-мишенью делает невозможным сайленсинг [Elbashir S М, 2001] Трансфекция клетки siRNA против одной вирусной мРНК не влияет на транскрипцию других мРНК Так использование siRNA к мРНК белка VP4 ри-новируса 16 серотипа не влияло на титр PCB Кроме того, применение реагента для контроля трансфекции siGLO (siRNA к мРНК белка ядерной мембраны клетки ламина) также не виляло на титр PCB Напротив, использование siRNA к мРНК белка Р PCB продемонстрировало четкое вирусспецифическое действие - исследуемые siRNA эффективно снижали титр PCB Применение siRNA приводит к сайленсингу ключевого вирусного белка, никак не влияя на нормально протекающие процессы в клетке

Специфичность siRNA в клетках млекопитающих также обусловлена их неспособностью активировать интерфероновый ответ Отсутствие влияния контрольных siRNA на титр PCB подтверждает данные о том, что двухцепочечные олигорибонуклеотиды длиной менее 30 пар оснований не индуцируют синтеза интерферона в клетках млекопитающих Этот факт является несомненным преимуществом технологий на основе siRNA, по сравнению с противовирусными средствами, влияющими на систему интерферона, потому что интерфероновый ответ, индуцируемый длинными молекулами РНК, вызывает общее неспецифическое угнетение всей трансляции в клетке [Bennett С F , 1999, Bitko V, 2001]

Возможно применение лекарственного средства на основе siRNA против PCB и с профилактической, и с лечебной целью Использование siRNA до инфицирования или на начальных этапах инфекции позволяет наиболее эффективно подавлять вирусную репликацию Тем не менее, применение siRNA на более поздних стадиях инфекции также оправдано - использование специфических

siRNA должно ограничивать активность инфекции, уменьшать выраженность симптомов и сокращать длительность течения заболевания

Респираторные вирусы, и особенно РСВ, обладают высокой тропностью к эпителию респираторного тракта Поэтому ингаляционное введение препарата обеспечивает прицельную доставку siRNA к очагу инфекции, что является идеальным условием для решения проблемы способа введения лекарственного средства в фармакологии Ингаляционное введение siRNA является сравнительно не-инвазивным и безболезненным. В настоящей работе эндотрахеальное введение мышам «голой» siRNA без средств доставки эффективно оказывало противовирусных эффект, что согласуется с данными других исследователей с ингаляционным или интраназальным введением мышам «голой» siRNA [Bitko V, 2005, Tompkins S M, 2004] Ингаляционное введение «голой» siRNA исключает потенциальный риск возможного побочного действия средства доставки Высокую эффективность «голой» siRNA без носителей еще предстоит объяснить Возможно, это связано с тем, что ткани респираторного тракта, в частности легкие, более восприимчивы к диффузии малых молекул или становятся таковыми во время инфекции

Важным с практической точки зрения является то, что эту методику сравнительно легко использовать Для использования siRNA в качестве противовирусного средства необходим правильный подбор ключевого для репродукции вируса белка-мишени, участка соответствующей мРНК и решение проблемы пути доставки В случае с респираторной инфекцией правильно спроектированая siRNA при ингаляционном/интраназальном введении может предотвращать развитие инфекции, а также оказывать лечебное действие при применении после инфицирования Применение «голой» специфической siRNA, доставляемой при помощи мелкодисперсного аэрозоля на основе простого ручного ингалятора, может предотвращать или лечить РСВ-инфекцию у людей

Безусловно, очень привлекательной является сравнительная дешевизна методики на основе siRNA Синтез олигонуклеотидов в настоящее время относительно доступен и прост Кроме того, в России недавно появились компании, которые синтезируют siRNA Этот факт дает siRNA большое преимущество, например, по сравнению со средствами на основе моноклональных антител

Несмотря на то что, молекулярная биология и эпидемиология PCB хорошо изучены, средств для эффективного лечения и профилактики РСВ-инфекции до сих пор не разработано В данном исследовании получены убедительные данные

0 том, что siRNA против мРНК белка Р PCB эффективно подавляют репродукцию вируса, поэтому терапевтическое использование siRNA кажется весьма перспективным Следует рассматривать синтетические молекулы siRNA в качестве средства высоко эффективного и специфического подавления экспрессии генов цито-плазматической вирусной РНК На сегодняшний день существует потребность в создании эффективной противовирусной терапии для предотвращения и лечения состояний и заболеваний, связанных с респираторными вирусами, в частности ви-рус-индуцированной бронхиальной астмы Возможность использования siRNA в качестве эффективного специфического противовирусного средства, безусловно, должна реализоваться в разработке надежной, безопасной и недорогой противовирусной терапевтической методики

ВЫВОДЫ

1 Белок Р является успешной мишенью для эффективного подавления PCB при помощи siRNA

2 siRNA к мРНК белка Р PCB эффективно снижает репликацию PCB in vitro в культуре клеток

3 siRNA к мРНК белка Р PCB эффективно снижает репликацию PCB m vivo на мышах

4 Выявлены наиболее эффективные siRNA против мРНК белка Р PCB

5 siRNA обладает специфическим действием, не оказывает влияния на уровень транскрипции других белков

6 siRNA может использоваться в качестве специфического противовирусного средства, не влияющего на нормально протекающие процессы в клетке

7 siRNA может применяться в качестве противовирусного средства без специальных средств доставки в чистом виде при эндотрахеальном/ингаляционном введении, что может использовано при создании средств против респираторных вирусов

8 Использование siRNA в качестве противовирусного средства представляется сравнительно простой и недорогой методикой, требующей лишь выбора белка-

мишени вируса, знания методики дизайна siRNA и синтеза олигонуклеотидов, который в настоящее время стал доступен

9 Показана возможность создания эффективного лекарственного средства против РСВ, одного из основных этиологических факторов вирус-индуцированной бронхиальной астмы, с использованием механизма интерференции РНК

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Хаитов М Р., Акимов В С. Возможности применения технологий RNAi для подавления репликации респираторно-синцитиального вируса, одного из основных этиологических агентов приступов бронхиальной астмы Физиология и патология иммунной системы, №5,2005, стр 3-6

2 Хаитов М Р , Акимов В С Технология RNAi Возможности применения siRNA для подавления репликации респираторных вирусов, основных этиологических агентов приступов бронхиальной астмы Иммунология, №4, 2005, стр 249-255

3 Хаитов М Р, Акимов В С Интерференция РНК Успехи современной биологии Том 126, №3, 2006 С 242-249

4 Акимов В С, Хаитов М Р, Файзулоев Е Б, Никонова А А, Трофимов Д Ю, Алексеев J1П, Соминина А А, Зверев В.В Подавление репродукции респираторно-синцитиального вируса методом siRNA Вопросы вирусологии №2, 2007 С 8-12

5 Хаитов М Р, Акимов В С , Файзулоев Е Б , Никонова А А, Трофимов Д Ю , Алексеев Л.П, Соминина А А, Зверев В В Разработка новых подходов к созданию антивирусных препаратов Сообщение №1 Подавление репродукции респираторно-синцитиального вируса методом siRNA Физиология и патология иммунной системы, 2007, №9, с 8-13

6 Хаитов М Р, Акимов В С Файзулоев Е Б, Никонова А А, Трофимов Д Ю , Алексеев Л П, Соминина А А, Зверев В В Молекулярно-генетические подходы к подавлению репродукции респираторных вирусов Российский аллергологиче-ский журнал, 2007, №3 приложение 1, с 80

7 Khaitov М R , Akimov V S , Faizuloev Е В , Nikonova А А , Alexeev L Р , Zverev V V and DuBuske L M Inhibition of Respiratory Syncytial Virus (RSV)

Replication m Cell Culture by Small Interfering RNA (siRNA) Journal of Allergy and Clinical Immunology, Volume 119, Issue 1, Supplement 1, January 2007, p S233-S234

8 Khaitov M R, Akimov V S , Faizuloev E B , Nikonova A A, Trofimov D U , Alekseev L P , Sommina A A , Zverev V V , DuBuske L M siRNA mediated inhibition of RSV replication J Allergy, 2007, v 62 (s 83), p 127 9. Khaitov M R, Akimov V S , Faizuloev E B., Nikonova A A, Trofimov D U, Alekseev L.P, Sommina A A, Zverev VV, DuBuske LM Inhibition of RSV infection m vitro by small interfering RNAs 2007 Annual Meeting ACAAI November 8-14 p 33

Подписано в печать 27 03 08 Формат 60x84/16 Бумага офсетная

_Тираж 100 экз Заказ № 269_

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш , 24

Актуальность проблемы.

Респираторно-синцитиальный вирус является одним из главных этиологических факторов вирус-индуцированной бронхиальной астмы [10,86]. Доказано, что перенесенная в детском возрасте РСВ-инфекция, приводит к развитию гиперчувствительности дыхательных путей у детей и к развитию бронхиальной астмы в дальнейшей жизни [108]. РСВ-инфекция - одна из главных причин тяжелых заболеваний верхних и нижних дыхательных путей у новорожденных и детей раннего возраста. Инфекция PCB у новорожденных сопряжена с высокой смертностью, что отчасти связано с недостатком эффективных лекарственных средств. Ежегодно в мире в результате заболеваний нижних дыхательных путей, связанных с PCB, умирает несколько миллионов детей младше 5 лет. PCB вызывает инфекцию нижних дыхательных путей в примерно 40% случаев первичного инфицирования [149]. Показано, что PCB является основной причиной заболеваемости и смертности у пожилых людей, взрослых и детей с ослабленным иммунитетом [47,49].

Хорошо известно, что вирусные инфекции являются важными факторами возникновения дыхательной обструкции у больных бронхиальной астмой. Это в первую очередь связано с колонизацией вирусами эпителия дыхательных путей, клетки которого продуцируют большое количество провоспалительных цитокинов и медиаторов, усиливающих воспалительный процесс [56]. Установлено, что у больных атопической бронхиальной астмой респираторная вирусная инфекция усиливает гиперреактивность бронхов [42,46]. По различным данным от 60% до 85% обострений бронхиальной астмы у детей и до 50% обострений бронхиальной астмы у взрослых связаны с респираторными вирусами [58,86,118]. В связи с этим появилось основание для характеристики обострений бронхиальной астмы, ассоциированных с ОРВИ, термином вирус-индуцированная бронхиальная астма.

Подходы к терапии вирус-индуцированных обострений заболеваний респираторного тракта недостаточно эффективны [24,149]. На сегодняшний день не существует эффективной вакцины против PCB. В клинической практике для лечения РСВ-инфекции, в том числе тяжелых состояний, таких как бронхиолит и пневмония, обычно используется только симптоматическая терапия. Эффективность рибавирина по результатам последних исследований поставлена под сомнение. Противовирусные средства на основе моноклональных антител обладают очень высокой стоимостью и не доступны для повсеместного клинического применения. Таким образом, во всем мире существует острая потребность в создании нового эффективного средства против респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.

В 2006 году лауреатами Нобелевской премии в области физиологии и медицины за открытие интерференции РНК стали американские ученые Эндрю Файр и Крег Мелло [52,53,111]. Интерференция РНК - это РНК-зависимый механизм регуляции экспрессии генов, в котором двухцепочечная рибонуклеиновая кислота ингибирует экспрессию генов с комплементарной нуклеотидной последовательностью. Среди прочих важных функций этот механизм позволяет клетке защищаться от чужеродного генетического материала, прежде всего от вирусов. При попадании в клетку двухцепочечной РНК она разрезается РНКазаШ-подобным ферментом, который называется Dicer, на короткие двухцепочечные РНК длиной 21-23 пары нуклеотидов - siRNA (от англ. small interfering RNA) [20,163]. Эти siRNA включаются в состав сложного эффекторного белкового комплекса RISC (RNAi-induced silencing complex), обнаруживающего и разрушающую мРНК-мишень, соответствующую данной siRNA [106]. Это значит, что введение в клетку siRNA против конкретной мРНК-мишени приводит к сайленсингу соответствующего белка, в том числе и вирусного белка. В связи с этим, возможность разработки нового антивирусного средства специфического действия против PCB на основе механизма интерференции РНК является весьма перспективной.

Цель работы: разработка подхода, основанного на использовании механизма интерференции РНК, для подавления репликации PCB - основного этиологического фактора возникновения бронхиолита у детей, а также причинозначимого фактора, предраспологающего к развитию бронхообструктивного синдрома и бронхиальной астмы, и одной из основных причин вирус-индуцированных обострений бронхиальной астмы у детей и взрослых.

Задачи:

1. Проанализировать геном PCB.

2. Произвести дизайн siRNA против мРНК кандидатного белка-мишени PCB.

3. Оценить антивирусную активность siRNA против мРНК белка-мишени PCB in vitro в культуре клеток.

4. Оценить антивирусную активность siRNA против мРНК белка-мишени PCB in vivo на мышах.

5. Выявить наиболее эффективные siRNA против мРНК белка-мишени PCB.

Научная новизна.

Впервые в Российской Федерации экспериментально изучена возможность использования средств на основе siRNA против вирусов на клеточной модели и на экспериментальных животных.

Проведен дизайн siRNA против мРНК белка Р PCB, спроектированы 6 уникальных экспериментальных образцов siRNA, получивших рабочие названия siOl, si03, si05, si07, si09 и sill, нацеленных к различным участкам мРНК белка Р PCB в пределах открытой рамки считывания.

На модели РСВ-инфекции в культуре клеток МА104 проведена оценка противовирусного действия 6 экспериментальных образцов и препарата смеси этих образцов, названного siMix, при помощи микроскопического наблюдения за состоянием монослоя клеток, методом титрования вируса и определением количества вирусной РНК в культуральной жидкости методом ПЦР в реальном времени по сравнению с неспецифической siRNA к мРНК белка VP4 риновируса 16 серотипа. Подобранные специфические siRNA эффективно подавляют репродукцию PCB в культуре клеток.

Получена экспериментальная модель РСВ-инфекции на мышах BALB/C. На основании полученных данных о противовирусной активности siRNA в культуре клеток, выбраны 3 наиболее эффективные последовательности siRNA (siOl, si03, si07), действие которых испытаны на мышиной модели инфекции PCB. Специфичность действия siRNA контролировали посредством использования siRNA к мРНК белка VP4 риновируса 16 серотипа. Оценку противовирусной активности проводили путем определения количества вирусной РНК PCB в гомогенатах легких мышей методом ПЦР в реальном времени, а также патологоанатомической оценкой состояния легких мышей и при помощи титрования вируса из легочных смывов. Полученные во второй части работы данные согласуются с эффективностью siRNA, полученными нами в культуре клеток.

Проведенные исследования in vitro и in vivo продемонстрировали противовирусную активность испытанных экспериментальных образцов посредством подавления репликации PCB, что дает возможность для создания специфических противовирусных средств на основе механизма интерефернции РНК.

Практическая значимость.

На сегодняшний день в мире не существует эффективных лекарственных средств для лечения РСВ-инфекции, являющейся основной причиной таких тяжелых состояний как бронхиолит у детей, пневмония у детей и взрослых, а также одной из главных причин вирус-индуцированной бронхиальной астмы. Для решения этой актуальной проблемы в данной работе показана возможность применения механизма интерференции РНК для создания эффективных лекарственных средств сиквенс-специфического действия против PCB.

выводы

1. Белок Р является успешной мишенью для эффективного подавления PCB при помощи siRNA.

2. siRNA к мРНК белка Р PCB эффективно снижает репликацию PCB in vitro в культуре клеток.

3. siRNA к мРНК белка Р PCB эффективно снижает репликацию PCB in vivo на мышах.

4. Выявлены наиболее эффективные siRNA против мРНК белка Р PCB.

5. siRNA обладает специфическим действием, не оказывает влияния на уровень транскрипции других белков

6. siRNA может использоваться в качестве специфического противовирусного средства, не влияющего на нормально протекающие процессы в клетке.

7. siRNA может применяться в качестве противовирусного средства без специальных средств доставки в чистом виде при эндотрахеальном/ингаляционном введении, что может использовано при создании средств против респираторных вирусов

8. Использование siRNA в качестве противовирусного средства представляется сравнительно простой и недорогой методикой, требующей лишь выбора белка-мишени вируса, знания методики дизайна siRNA и синтеза олигонуклеотидов, который в настоящее время стал доступен.

9. Показана возможность создания эффективного лекарственного средства против PCB, одного из основных этиологических факторов вирус-индуцированной бронхиальной астмы, с использованием механизма интерференции РНК.