Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Морфофункциональный статус эритроцитов при экспериментальных метгемоглобинемиях

рГБ ОД

1 1 7ПТ)

1 / |Нчо> /и 11

На правах рукописи

ШПЕРЛИНГ ИГОРЬ АЛЕКСЕЕВИЧ

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СТАТУС ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТГЕМОГЛОБИНЕМИЯХ

14.00.16 - патологическая физиология

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2002

Работа выполнена в Томском военно-медицинском институте МО РФ, в НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, в Сибирском государственном медицинском университете МЗ РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН,

заслуженный деятель науки РФ Новицкий В.В.

кандидат медицинских наук, доцент Жаткин O.A.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Жданов В.В.

доктор медицинских наук, профессор Логвинов C.B.

Ведущая организация: Новосибирская государственная медицинская академия МЗ РФ

Защита состоится "_"_2002 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии ТНЦ

СО РАМН.

i

Автореферат разослан ftü^&U 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Амосова E.H.

pi///. ov,. о ^ г)

1 < I

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Расширяющееся с каждым годом внедрение химиче-:ких соединений в различные виды промышленности, быта, науки создает условия пя повышенного образования метгемоглобина (metHb) в крови при действии окис-штелей, амидо- и нитропроизводных бензола, анилина, гидразина и его производных, жислов азота (Кушаковский М.С.,1968; Дервиз Г.В.,1977; Токарев Ю.Н.,1979; Pach J. :t al.,1996; Струков M.A.,1999; Жаткин O.A., 1998,1999; Башарин В.А.,2001), употреб-1СНИИ в пищу воды, продуктов растительного и животного происхождения с повы-менным содержанием нитритов и нитратов (Fan A.M. et al., 1996; Lutynski R. et il.,1996; Benini D. et al., 1998).

Отравления медицинского лабораторного персонала метгемоглобинобразую-цими ксенобиотиками по частоте случаев стоят на пятом месте после интоксикаций Зарбитуратами, угарным газом, цианистым калием, азидами (Binder L. et al.,1991).

Метгемоглобинобразующими свойствами обладает ряд лекарственных препаратов: фенацетин, нитроглицерин, викасол, некоторые сульфаниламиды и противома-тярийные средства, анестетики (Могош Г.,1984; Curry S.C. et al.,1991; Rudlof В. et il., 1995; Khan N.A. et al.,1999; Тино Г. и соавт.,2001), бензилпенициллин (Сальникова П.А. и соавт.,1989), альмагель (Самсыгина Г.А. и соавт.,1989), тетрациклины (Пет-ienKO Ю.М. и соавт.,1993).

В результате воздействия на организм перечисленных факторов снижается ки-;лородная емкость крови и создаются предпосылки для развития гипоксического со-:тояния (Середенко М.М. и соавт.,1987).

При многих заболеваниях внутренних органов (панкреатит, осложненный холецистит, злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта, варикоз-юе расширение вен нижних конечностей, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки) под влиянием патологических процессов концентрация metHb увеличивается в 4-6 раз по сравнению с нормой, что может явиться причиной развития емической гипоксии и требует соответствующей корригирующей терапии (Зеньков II.11.,1984; Юпатов С.И. и соавт.,1984).

Гемоглобин (НЬ) составляет основную часть (до 95,5%) содержимого эритроцитов (Рябов С.И.,1971; Шиффман Ф.Дж,2000), и его качественное изменение не может не повлиять на структурную и функциональную стабильность других эритроци-гарных компонентов, например, мембраны, цитоскелета, ферментных систем. От их :остояния во многом зависят деформируемость, агрегация и форма эритроцитов, определяющие способность зрелых красных клеток крови продвигаться по микроцирку-пяторному руслу, что обусловливает нормальный газообмен на этом уровне (Борисюк MB. и соавт.,1989; Сторожок С.А. соавт.,1997). В то же время известно, что изменение состояния органов и систем организма даже при отсутствии выраженных проявлений гипоксии сопровождается изменением метаболизма, структуры и функциональных свойств эритроцитов (Нагаева Т.А., 1997; Доровских Я.А., 1998; Грациано-ва Н.Д.,1999; Колосова М.В.,1999; Новицкий В.В. и соавт.,1997,1998,1999; Степовая Е.А.,1999; Рязанцева Н.В., 1997,2001). В условиях гемической гипоксии отмечается выраженная перестройка в деятельности всех систем организма (Лановенко И.И. и соавт., 1986; Середенко М.М. и соавт., 1987; Сиваченко В.Н.,1995,1999), что не может не отразиться на морфофункциональном статусе эритроцитов.

С позиции одних авторов повышенное метгемоглобинобразование определяется как исчерпание антиоксидантной защиты эритроцитов и универсальный этап не-

иммунного гемолиза (Рубина Х.М.,1979). Другие исследователи обозначают процесс метгемоглобинобразования как фактор, характеризующий уровень метаболической активности эритроцитов (Рябов С.И.,1971; Рябов С.И. и соавт.,1973; Бойтлер Э.,1981; Кайракбаева Г.М. и соавт.,1990). Большой объем исследований проведен в направлении изучения особенностей процессов в тканях и средах организма в ответ на геми-ческую гипоксию, вызванную повышенным содержанием metHb в крови (Дударе i: В.П., 1986; Середенко М.М. и соавт.,1987; Волжская A.M. и соавт.,1993; Кисляков Ю.Я. и соавт.,1993; Сиваченко В.Н.,1995; Гоженко А.И. и соавт.,1997). Однако вс всех этих исследованиях модели развития гемической гипоксии рассматриваются на уровне отдельных свойств или характеристик эритроцитов.

Метгемоглобинемии нередко сопровождаются анемией (Колла В.Э. и со-авт., 1976; Токарев Ю.Н.,1979; Бойтлер Э.,1981; Лановенко И.И. и соавт., 1986; Каю-мова А.Ф.,1990; McMillan D.C. et al., 1991; Волжская A.M. и соавт., 1993; Кисляков Ю.Я. и соавт.,1993; Магакян Ю.А. и. соавт.,1993,1997). Однако на данное время не! единого представления о механизмах развития анемии при метгемоглобинемиях. Известно, что под влиянием одних метгемоглобинобразователей в клинической картине ярко выражен гипоксический компонент и менее - гемолитический (нитрит натрия), з под влиянием других - проявляется гипоксия смешанного генеза: в результате блокады дыхательного пигмента и повышенного гемолиза эритроцитов (фенилгидразин) Есть предположение, что существует обратная связь между гемолитическими свойствами препаратов и их способностью к образованию мет-формы гемоглобина (Бойтлер Э.,1981).

Для изучения патогенеза метгемоглобинемии широко используются экспериментальные модели на лабораторных животных (собаки, крысы, мыши) с применением нитрита натрия (Костенко JI.X. и соавт.,1985; Лановенко И.И. и соавт.,1986; Середенко М.М. и соавт., 1987; Волжская A.M. и соавт., 1993; Кисляков Ю.Я. и соавт.,1993; Сиваченко В.Н.,1995,1999) и фенилгидразина (Костенко Л.Х. соавт.,1985: Магакян Ю.А. и соавт, 1993,1997; Башарин В.А.,2001). Кроме того, фенилгидразин широко используется для моделирования гемолитической анемии (Гольдберг Д.И. н соавт.,1980; Гольдберг Е.Д.,1989; Каюмова А.Ф.,1990; Магакян Ю.А. и соавт., 1993,1997). В то же время отравления людей в быту и на производстве нитритам! и нитратами, гидразином и его производными занимают одно из ведущих мест (Benini D. et al.,1998; Дерябина В.Г. и соавт., 1999; Башарин В.А.,2001).

В литературе отсутствуют данные по комплексному изучению морфофунк-ционального состояния эритроцитов и механизмах нарушения периферического звен; эритрона в динамике метгемглобинемии и, в частности, после воздействия нитрит; натрия и фенилгидразина.

Вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования:

Установить особенности морфофункционального статуса эритроцитов и меха низмы нарушения периферического звена эритрона в динамике экспериментальны} метгемоглобинемии.

Задачи исследования:

1.Изучить в опыте на животных структурно-метаболические и функциональ ные изменения циркулирующих эритроцитов в динамике метгемоглобинемий посл< острого воздействия нитрита натрия и фенилгидразина (LD50).

2.Выявить особенности и механизмы нарушения периферического звена эри-трона, развития анемии у крыс в динамике острых экспериментальных метгемогло-бинемий после однократного введения нитрита натрия и фенилгидразина (LD50).

3.Провести сравнительную оценку изменений морфофункционального статуса циркулирующих эритроцитов в динамике метгемоглобинемий после однократного воздействия нитрита натрия и фенилгидразина.

Научная новизна

Впервые с использованием комплекса современных методов исследования морфофункционального статуса эритроцитов периферической крови дана развернутая характеристика качественного состояния периферического звена эритрона при экспериментальных метгемоглобинемиях. Установлено, что однократное введение крысам метгемоглобинобразователей - нитрита натрия в дозе 90 мг/кг (LD50) и солянокислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг (LD50) при относительно коротких периодах метге-моглобинемии приводит к выраженным нарушениям структурно-метаболического и функционального состояния эритроцитов периферической крови в период повышенного содержания metHb и в отдаленные сроки с развитием анемии различной степени тяжести.

Впервые показано, что в патогенезе гемической гипоксии, наряду с повышенным содержанием в эритроцитах metHb, нарушение морфофункционального статуса эритроцитов следует рассматривать как одно из ведущих звеньев, участвующих в формировании механизмов нарушения газотранспортной функции крови.

Впервые установлено, что однократное введение крысам нитрита натрия в половинной летальной дозе не приводит к анемии глубокой степени, но существенно ускоряет процесс старения циркулирующих эритроцитов, нарушает их структурно-метаболический статус, функцию и приживаемость в сосудистом русле в течение 13-ти суток, а солянокислый фенилгидразин в эквивалентной дозе вызывает выраженные структурно-метаболические нарушения эритроцитов до 13-х суток эксперимента и глубокую анемию до 7-х суток. Для нитритной метгемоглобинемии в острый период характерно появление в крови экспериментальных животных эритроцитов с глубокой узкой центральной впадиной, а для фенилгидразиновой метгемоглобинемии - трансформация дискоцитов в дискоциты с множественными выростами.

Ретикулоцитоз при фенилгидразиновой анемии формируется за счет поступления в кровоток молодых форм эритроцитов с выраженным нарушением метаболизма и функции, что приводит к их повышенному разрушению и снижению эффективности компенсаторных механизмов костного мозга.

Практическая значимость работы

Выявленные изменения в эритроцитах при экспериментальных метгемоглобинемиях, вызванных однократным внутрибрюшинным введением нитрита натрия и солянокислого фенилгидразина, позволяют уточнить патогенез интоксикаций данными веществами и возможные отдаленные последствия. Результаты исследования структурно-метаболического статуса периферического звена эритрона создают основу для целенаправленного поиска новых высокоэффективных средств лечения отравлений ксенобиотиками данных групп и профилактики развивающихся осложнений при отравлениях метгемоглобинобразователями. Предложен способ оценки интенсивности внутрисосудистого гемолиза при экспериментальных метгемоглобинемиях.

Положения, выноснмые на защиту

1.Введение животным нитрита натрия в дозе 90 мг/кг (LD50) и солянокислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг (LD50) приводит к выраженным структурно-

метаболическим и функциональным нарушениям эритроцитов периферической крови и анемии различной тяжести продолжительностью до 2-х недель. Эти изменения обусловлены главным образом снижением содержания БН-групп и липопротеидов в эритроцитах, изменением их формы, нарушением агрегации и деформируемости.

2.Нарушения морфофункционального статуса эритроцитов при экспериментальных метгемоглобинемиях зависят от химического строения метгемоглобинобра-зователей, особенностей механизмов окисления гемоглобина, концентрации метге-моглобина в крови и продолжительности острого периода метгемоглобинемии.

3.Анемия у экспериментальных животных после введения нитрита натрия максимально выражена при наибольшем содержании метгемоглобина в крови. После введения солянокислого фенилгидразина анемия четко выражена к исходу периода повышенного уровня метгемоглобина.

4,Одним из ведущих звеньев патогенеза экспериментальных метгемоглобине-мий является нарушение морфофункционального статуса эритроцитов.

5.К неспецифическим (общим) изменениям острого периода нитритной и фе-нилгидразиновой метгемоглобинемий относятся уменьшение содержания БН-групп и липопротеидов в эритроцитах, изменение формы, снижение агрегации и деформируемости зрелых эритроцитов, повышенный эритродиэрез и развитие анемии. Степень структурно-метаболических нарушений циркулирующих зрелых и юных форм эритроцитов, сроки формирования и тяжесть развивающейся анемии зависят от вида метгемоглобинобразователя.

Общими проявлениями восстановительного периода обоих типов метгемоглобинемий является продолжительность нарушений морфофункционального статуса эритроцитов (до 2-х недель). К специфическим особенностям нитритной метгемоглобинемии в этот период относится повышенная агрегация эритроцитов. Фенилгидра-зиновая метгемоглобинемия в соответствующий период сопровождается длительным снижением агрегационной способности эритроцитов. Ретикулоцитоз при фенилгидра-зиновой анемии формируется за счет клеток с нарушенным метаболизмом и функцией.

Реализация результатов работы. Результаты диссертационного исследования используются в процессе обучения курсантов и слушателей факультетов подготовки врачей на кафедре военно-полевой терапии Военно-медицинской академии Министерства обороны РФ (г. Санкт-Петербург), кафедры токсикологии и медицинской защиты Томского военно-медицинского института Министерства обороны РФ.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на итоговых научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и слушателей Томского военно-медицинского института, г. Томск, 2000, 2001, 2002; на Всероссийской конференции «Актуальные вопросы современной медицины», г. Новосибирск, 2001; на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической морфологии», г. Томск, 2002; на заседаниях кафедр токсикологии и медицинской защиты и военно-полевой терапии Томского военно-медицинского института.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка, включающего 283 источника (210 отечественных и 73 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 41 рисунком.

Материал и методы исследования.

Эксперименты проведены на 240 крысах-самцах линии Вистар массой 190-250 грамм. Метгемоглобинемии вызывали однократным внутрибрюшинным введением 0,6% раствора нитрита натрия (НН) в дозе 90 мг/кг (LD50) и 2% раствора солянокислого фенилгидразина (ФГ) в дозе 150 мг/кг (LD 50). Определение LD50 для НН и ФГ проводили с использованием табличного экспресс-метода по В.Б. Прозоровскому (1994).

Степень гипоксии определяли по критериям, предложенным Н. Ф. Иваницкой (1976) (табл. 1).

Таблица 1

Показатели крови при различной степени гипоксии (Х±т)

Степени гипоксии Клинические проявления Содержание metHb, %

1 - легкая Общее состояние удовлетворительное, цианоз слизистых и незначительное учащение дыхания 18,5+0,9

2 - средняя Разлитой цианоз и выраженная одышка 35,9±0,9

3 - тяжелая Резко выраженный цианоз ушей, лапок, слизистых оболочек, периодическое дыхание типа Чейна - Стокса. 53,4±1,4

Динамика метгемоглобинобразования и периоды гибели экспериментальных животных обусловили время забора крови и проведения исследований от момента введения метгемоглобинобразователей: 0,5, 1,5, 2,5, 6 часов, 1-е, 2-е, 3-е, 5-е, 7-е, 13-е и 21-е сутки. Кровь получали методом отрезания кончика хвоста (Западнюк И. П. и соавт., 1983), стабилизировали гепарином в конечной концентрации 50 ЕД на 1 мл крови.

У всех выживших животных проводили комплексное изучение морфофунк-ционального состояния эритроцитов периферической крови: определение относительного содержания метгемоглобина в крови; определение количественных показателей красной крови (Алексеев М.А. и соавт., 1985), в том числе количества ретикуло-цитов (на 1000 эритроцитов) с подсчетом ретикулоцитограмм (Быкова И.А.,1993); определение уровня внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) в плазме крови (Тонкош-курова Т.А. и соавт., 1996); исследование поверхностной архитектоники эритроцитов методом сканирующей электронной микроскопии; определение концентрации SH-групп (Chevremont М. et al.,1943) и липопротеидов (ЛП) в эритроцитах (Barenbaum М.С., 1956). исследование агрегации эритроцитов (АЭ) (Плотников М.Б. и соавт., 1995), деформируемости эритроцитов (Белкин A.B. и соавт., 1991).

Результаты обработаны статистически с использованием t-критерия Стьюден-та. Достоверность различий считали значимой при р<0,05 (Славин М. Б., 1989). Вычисления производились на ПЭВМ с использованием статистических программ "EXCEL 5,0".

Результаты исследований и их обсуждение

Образование metHb в эритроцитах происходит за счет окисления железа гема до трехвалентного состояния. MetHb отличается высокой прочностью связи железа геминовой группировки с кислородом и не играет никакой роли в процессе дыхания.

Исследования выявили максимальный уровень metHb в крови у крыс через 1,5 часа от начала опыта (50,2±1,3% при 4,1±0,2% в контроле, р<0,05). С 24-х часов и до окончания периода наблюдения (21-е сут) уровень metHb не отличался от контроля (рис.1).

Однократное введение ФГ в дозе 150 мг/кг через 30 мин приводило к максимальному за весь период наблюдения повышению концентрации metHb (до 21,1±0,4% при 4,1+0,2% в контроле, р<0,05). В последующем уровень его содержания постепенно снижался и с 3-х по 21-е сутки наблюдения достоверно не отличался от нормы.

Рис. 1. Динамика содержания метгемоглобина (МеШЬ %) в крови у крыс после однократного введения нитрита натрия (НН) (90 мг/кг) и солянокислого фенилгидразина (ФГ) (150 мг/кг)

Примечание: * - здесь и на рис. 2-9 - показатель достоверности различия с контролем (р<0,05).

В целом можно считать, что явления метгемоглобинемии после однократного введения НН продолжались в течение 1-х суток, а после введения ФГ - 2-2,5 суток эксперимента. Исходя из этого, для более наглядного анализа полученных результатов мы условно разделили эксперимент на два периода: острый и восстановительный. Соответственно этому, острый период метгемоглобинемии при воздействии НН длился 1 сутки, а восстановительный - 20 суток. Продолжительность острого периода метгемоглобинемии после введения ФГ составила 2 суток, а восстановительного - 19 суток.

Процессы образования и разрушения эритроцитов в организме находятся в состоянии динамического равновесия, обеспечивающегося комплексом сложных физиологических механизмов, регулирующих интенсивность кроветворения и разрушения форменных элементов крови и их распределение в сосудистом русле (Гольдберг Е.Д. и соавт.,1997, 1999,2000; Хлусов И.А. и соавт.,2000). Метгемоглобинобразую-щие вещества, превращая НЬ в metHb, вызывают одновременно и гемолиз эритроцитов (Trawlos G.W. et al.,1996; Anik В. et al.,1999). Гемолитическое действие связано с непосредственным действием метгемоглобинобразователей, либо с опосредованным влиянием промежуточных продуктов их метаболизма (McMillan D.C. et al., 1991; Evert R.etal., 1998).

После введения НН первые сутки эксперимента наблюдалась анемия, максимально выраженная через 2,5 часа. При этом количество эритроцитов было снижено на 16,7%, общего гемоглобина - на 20,9%, гематокрита - на 14,3%, уровень ВЭГ по сравнению с контролем был увеличен в 3,7 раза (табл. 2).

Введение ФГ вызывало глубокую анемию на 2-3-и сутки со снижением числа эритроцитов на 67,6%, общего гемоглобина на 78%, гематокрита - на 65,3%, концентрация ВЭГ превышала значения контрольной группы в 3,2 раза.

В период с 2,5 часа до 5-ти суток после введения животным НН в крови увеличивалось число ретикулоцитов с максимальным их содержанием на 3-й сутки (130,9±5,9 %0 при 55,3±2,5%о в контроле, р<0,05). Максимальное изменение ретику-лоцитограммы отмечалось через 6 часов после введения НН (рис. 2).

В период с 6-ти часов до 13-х суток после введения ФГ выявлялось достоверное увеличение содержания ретикулоцитов с наибольшим их количеством на 3-й сутки эксперимента (523,7±22,8%о при 55,3±2,5%0 в контроле, р<0,05). Максимальное изменение ретикулоцитограммы отмечалось на 3-й сутки эксперимента (рис. 3).

Снижение количественных показателей красной крови после однократного введения НН и ФГ в дозе ЬО50 обусловлено, по нашему мнению, гемодилюцией и повышенным эритродиэрезом. Очевидно, что гемодилюция происходила вследствие перемещения в кровеносное русло внесосудистой жидкости в ответ на гипотензивное действие ксенобиотиков и гипоксией (Лисаченко Г.В.,1992; Джурко Б.И.,1994; Сива-ченко В.Н.,1995; Банных С.В.,1997). Повышение эритродиэреза обусловлено истощением антиокислительного потенциала клетки (Бурбелло А.Т. и соавт., 1991; Р!гто-Иашес! М. е1 а1., 1996), изменением гомеостаза организма.

В ответ на гипоксию происходили выход из депонирующих органов эритроцитов и стимуляция костномозгового кроветворения, что проявлялось увеличением числа ретикулоцитов, «левым сдвигом» ретикулоцитограммы (Ужанский Я.Г.,1968, Быкова И.А.,1993). Ретикулоцитоз, более выраженный при фенилгидразиновой метге-моглобинемии, обусловлен более длительным периодом метгемоглобинемии и выраженной анемией.

В норме эритроциты имеют форму двояковогнутого диска (дискоциты), а в патологических условиях происходит постепенная трансформация их конфигурации из диска в сферу (Новицкий В.В. и соавт.,2000; Рязанцева Н.В.,2001).

Через 1,5 часа после введения НН отмечалось максимальное за весь период наблюдения повышение обратимых (эллипс, плоские диски, дискоциты с выростом, гребнем, множественными выростами) форм эритроцитов (14,10+0,91% при 11,02±0,77% в контроле, р<0,05), необратимых (5,ЗОЮ,15% при 1,70±0,21% в контроле, р<0,05) и дегенеративных (2,77+0,11% при 0,47±0,08% в контроле, р<0,05). Содержание дискоцитов было снижено на 9,7% (р<0,05) (рис. 4). В динамике на 2-3-и сутки эксперимента увеличивалось количество дискоцитов на фоне снижения переходных и дегенеративных форм клеток. С 5-х по 7-е сутки наблюдалось повторное снижение количества дискоцитов наряду с повышением содержания переходных (за счет плоских дисков и дискоцитов с множественными выростами), необратимых и дегенеративных форм. Нормализация исследуемых показателей (за исключением повышенного уровня дегенеративных форм) наблюдалась к 21-м суткам исследования.

Острый период нитритной метгемоглобинемии до 6-ти часов включительно сопровождался появлением в крови эритроцитов округлой формы, размеры практически не отличались от основной массы клеток, с ровной поверхностью,

Таблица 2

Показатели периферической крови у крыс после однократного введения нитрита натрия (НН) (90 мг/кг) и солянокислого фенилгидразина (ФГ) (150 мг/кг), Х±т_

Сроки исследования

Показатели Контроль 0,5 ч 1,5 ч 2,5 ч 6ч 1 сут 2 сут 3 сут 5 сут 7 сут 13 сут 21 сут

Эритро- НН 6,31 6,1 5,61 5,32 5,45 5,82 6,05 6,18 6,21 5,94 6,0 6,18

циты, ±0,62 ±0,42* ±0,32* ±0,42* ±0,26*' ±0,41* ±0,51* ±0,36* ±0,43* ±0,45* ±0,41 ±0,2

Х1012/л ФГ 6,25 6,59 6,18 5,21 4,67 3,8 2,44 2,04 2,5 3,33 5,83 6,2

±0,36 ±0,41 ±0,29* ±0,43* ±0,27** ±0,19** ±0,22** ±0,18** ±0,25** ±0,24** ±0,22 ±0,25

Общий- НН 162,9 155,2 135,1 121,3 131,8 146,6 153,4 158,9 163,4 160,6 161,1 160

гемо- ±3,1 ±4,6 ±4,5*" ±6,2*" ±4,2** ±5,9** ±6,1* ±3,6* ±4,2* ±5,5* ±2,1* ±2,2

глобин, ФГ 161,2 153,3 116,5 103,6 92,3 58,2 34,3 39,3 70,1 104,2 146,6 163,1

г/л ±3,0 ±4,2* ±2,6*" 2,8** ±2,4** ±2,7** ±1,4** ±2,4** ±3,3** ±3,6** ±4,3** ±1,5

Гемато- НН 42.1 39,5 36,4 36.1 37.1 40.1 40.9 41.5 41.9 42.5 42.8 41,2

крит, ±1.5 ±1,1* ±1.3** ±1.6* ±0.9** ±1.9* ±1.5* ±1.1* ±0.8* ±1.0* ±0.8 ±0,5

% ФГ 42,4 45,8 41,2 35,2 30,3 21,5 16,1 14,7 27,3 32,2 42,1 42,5

±1,1 ±0,9** ±1,0* ±0,8* ±0,9*" ±0,9** ±0,8** ±0,7** ±0,8** ±0,5** ±0,7 ±0,6

ВЭГ, НН 0,12 0,12 0,53 0,51 0,38 0,31 0,29 0,26 0,19 0,12 0,11 0,12

г/л ±0,01 ±0,02 " ±0,04** ±0,02** ±0,04** ±0,01** ±0,04* ±0,04** ±0,01* ±0,01 ±0,01 ±0,01*

ФГ 0,12 0,38 0,32 0,29 0,27 0,23 0,26 0,22 о а 0,12 0,1 0,08

±0,01 ±0,02** ±0,04** ±0,03** ±0,03** ±0,02** ±0,02* ±0,01** ±0,02* ±0,01 ±0,01* ±0,01**

Примечание: * - здесь и в табл. 3 - 5 - показатель достоверности различия по сравнению с контролем (р<0,05).

# - здесь и в табл. 3 - 5 - показатель достоверности различия между опытными группами (р<0,05). Количество животных в каждой группе - 6.

Сроки исследования ■ 0-1 гр Ш 2гр Ш 3 гр 0 4гр

Рис. 2. Динамика ретикулоцитограммы по группам зрелости (%) у крыс после однократного введения нитрита натрия (90 мг/кг)

Сроки исследования ■ Нормобласты, 0-1 гр Ш 2гр Ш Згр Н 4гр

Рис. 3. Динамика ретикулоцитограммы по группам зрелости (%) у крыс после однократного введения солянокислого фенилгидразина(150 мг/кг)

*

ЛВ'та'О'ОООООиО 8. О - ГЧ _ <4

| Сроки исследования

и -

■ Дегенеративные □ Необратимые § Обратимые

Рис. 4. Динамика содержания морфологических форм эритроцитов (%) у крыс после однократного введения нитрита натрия (90 мг/кг)

Рис. 5. Динамика содержания морфологических форм эритроцитов (%) у крыс после однократного введения солянокислого фенилгвдразина (150 мг/кг)

с глубокой узкой центральной впадиной диаметром до 0,5 мкм в центре. Максимальное содержание таких эритроцитов было зарегистрировано через 1,5 ч после введения НН (2,10±0,05%). Динамика процентного соотношения морфологических форм эритроцитов сопровождалась параллельным изменением отношения размера центральной впадины к внешнему диаметру эритроцитов, что свидетельствовало о тенденции к сфероидной трансформации клеток (Степовая Е.А.,1999; Рязанцева Н.В. и со-авт.,2000).

Через 30 минут после введения ФГ в дозе 150 мг/кг на электронограммах эритроцитов подопытных животных дискоцитов с двояковогнутой формой не определялось. Обращало на себя внимание резкое (в среднем в 210 раз) увеличение количества дискоцитов с множественными выростами (80,21 ±3,22% при 0,38+0,07% в контроле, р<0,05), клеток «в виде тутовой ягоды» (2,48±0,43% при 0,07±0,01% в контроле, р<0,05) и дегенеративных форм (14,64±1,10% при 0,48±0,07% в контроле, р<0,05) (рис. 5).

Появление двояковогнутых дискоцитов было зафиксировано на 1-е сутки наблюдения. Их количество было достоверно ниже контроля даже на 21-е сутки эксперимента. Число дискоцитов с множественными выростами снижалось вплоть до 2-х суток, но оставалось повышенным в течение всего периода наблюдения. Количество необратимых и дегенеративных форм увеличивалось до максимальных значений на 2-е сутки эксперимента (в среднем в 3,2 и 82,1 раза больше контрольных значений соответственно). В последующем их содержание в крови животных снижалось, но на 21-е сутки наблюдения отмечалось достоверно высокое их количество. В связи с практически полным отсутствием дискоцитов в течение первых двух суток, измерение размеров внутреннего диаметра не представлялось возможным. С 3-х суток наблюдения динамика изменения процентного соотношения морфологических форм эритроцитов сопровождалась параллельным изменением отношения размера центральной впадины к внешнему диаметру эритроцитов.

Изменение морфологической картины красной крови в острый период метге-моглобинемий были вызваны, по всей видимости, нарушением внутриклеточного метаболизма и водно-электролитного баланса эритроцитов, что связано с повышенным содержанием в них метгемоглобина и активацией ПОЛ. Известно, что реакции восстановления metHb являются высокоэнергетичными (Кушаковский М.С.,1968), а снижение уровня макроэргов нарушает работу трансмебранных ионных переносчиков и антиоксидантных систем (Степовая Е.А.,1999; Новицкий В.В. и соавт.,2000). Окси-дантное повреждение НЬ и гипоксия инициируют образование радикалов и перекисей, повреждающих липидный бислой мембран, изменяя их структуру. Ухудшение электронограмм эритроциов на 5-7-е сутки после введения НН были, по нашему мнению, признаком ускоренного старения эритроцитов вследствие повышенной окислительной нагрузки, истощения ферментных и антиоксидантных систем эритроцитов.

ФГ более существенно, чем НН, ингибирует Г-6-ФДГ (Мышкин В.А. и со-авт.,1999; Башарин В.А.,2001), что усугубляет дефицит макроэргов, необходимых для восстановления metHb, поддержания осмотического градиента по обе сторны мембраны и функции антиоксидантных систем эритроцитов. С этим, на наш взгляд, связаны более продолжительный острый период метгемоглобинемии, выраженные изменения структурно-метаболических и функциональных нарушений эритроцитов при фенилгидразиновой метгемоглобинемии по сравнению с нитритной. Несмотря на выраженный ретикулоцитоз в период глубокой фенилгидразиновой анемии особенности

морфологической картины в указанный период свидетельствовали об имеющихся структурно-метаболических и функциональных нарушениях ретикулоцитов.

Полноценность эритроидных элементов можно оценить по содержанию в них SH- групп и липопротеидов, которые играют важную роль в метаболизме клетки и поддержании ее целостности (Козинец Г.И.,1982; Колосова М.В.,1999; Степовая Е.А., 1999; Новицкий В.В. и соавт.,2000; Рязанцева Н.В.,2001).

После однократного введения крысам НН в дозе 90 мг/кг через 30 минут среднее содержание SH-групп в эритроцитах повышалось (0,323±0,01б у.е. при 0,298+0,012 у.е. в контроле, р<0,05). В последующем содержание субстрата в течение 1-х суток и на 5-7-е сутки эксперимента было снижено с максимальным отклонением от контроля через 1,5 часа после введения НН (0,263±0,011, р<0,05) за счет повышения доли клеток с низкой концентрацией тиоловых веществ (32,2 +5,8% при 13,3±1,1% в контроле, р<0,05) (рис. 6).

Через 1,5-6 часов от начала наблюдения отмечалось появление эритроцитов с патологически низким содержанием SH-групп с наибольшим числом клеток через 1,5 часа от начала эксперимента (0,6+0,2% при отсутствии в контроле).

После введения крысам ФГ в дозе 150 мг/кг в период с 30-ти минут до 2,5 часов среднее содержание SH-групп в эритроцитах было повышено (0,342+0,018 у.е. при 0,302±0,012 в контроле, р<0,05). С 1-х и вплоть до 5-х суток опытов имело место снижение данного показателя с наименьшими значениями на 2-е сутки, что составляло 60,6% от соответствующих значений у интактных животных (0,185±0,013, р<0,05). В течение 1-х суток обнаруживались эритроциты с очень высокой концентрацией субстрата (более 4,0 у.е., в контроле они отсутствовали). Появление клеток данной популяции отмечалось также на 7-е и 13-е сутки (рис. 7).

Уровень эритроцитов с низким содержанием субстрата через 30 минут после введения ФГ был снижен по сравнению с контролем в среднем в 2,1 раза, а в последующие сроки эксперимента превышал соответствующие значения у животных контрольной группы в течение всего периода наблюдения (21 сут) с максимальным содержанием SH-групп на 2-е сутки (53,3±4,8% у.е. при 12,9±1,1% в контроле, р<0,05). С 6-ти часов по 5-е сутки обнаруживались эритроциты с патологически низким (ниже 20 у.е.) содержанием тиоловых соединений. При этом на 2-е сутки количество их было максимальным (11,5±1,1% при отсутствии в контроле).

В физиологических условиях SH-группы служат внутриклеточной антирадикальной защитой эритроцитарных элементов. Избыточное накопление свободных радикалов и продуктов их окислительной деструкции способствует окислению SH-содержащих соединений, изменению проницаемости и конформационных свойств мембран эритроцитов, оказывая тем самым системное повреждающее действие на клетку (Грацианова Н.Д.,1999; Колосова М.В.,1999; Новицкий В.В. и соавт.,2000; Рязанцева Н.В.,2001).

К увеличению тиоловых соединений в эритроците может приводить нарушение пространственных взаимоотношений между белками, изменение влияния на сульфгидрильные группы смежных аминокислотных радикалов в результате разрыва ассоциативных связей между пептидными цепями, влияние на SH-группы факторов внешней по отношению к белку среды (Грацианова Н.Д.,1999; Колосова М.В.,1999; Степовая Е.А.,1999). Повышение уровня SH-групп в эритроцитах в начальный период эксперимента после введения НН расценивалось нами как конформационные изменения белковых компонентов эритроцитов, так как в последующем содержание тиолов

*

Komp 0,5ч 1,5ч 2,5ч бч 1с 2с Зс 5с 7с 13с 21с Сроки исследования

. О Очень высокое @ Высокое ® Среднее В Низкое и патологически низкое

Рис. 6. Гистограмма распределения эритроцитов (%) по содержанию SH-rpynn у крыс после однократного введения нитрита натрия (90 мг/кг)

Контр 0,5ч 1,5ч 2,5ч бч 1с 2с Зс 5с 7с 13с 21с Сроки исследования

□ Очень высокое Ш Высокое Ш Среднее Я Низкое и патологически шпкое |

Рис. 7. Гистограмма распределения эритроцитов по содержанию БН-групп (%) у крыс после однократного введения солянокислого фенилгидразина (150 мг/кг)

снижалось на фоне относительно стабильных количественных показателей красной крови. Повышение концентрации тиолов в эритроцитах после введения ФГ больше свидетельствовало в пользу деструктивных изменений, что подтверждалось выраженным снижением количественных показателей красной крови, существенными изменениями на электронограммах эритроцитов. ФГ вызывает деструкцию белков гемоглобина (Гарибов Р.Э. и соавт.,1980; Shetlar M.D. et al.,1985), в результате чего увеличивается число определяемых SH-групп (Рябов С.И. и соавт.,1973).

Снижение содержания тиоловых веществ в эритроцитах у экспериментальных животных после введения НН и ФГ объясняется повышенной активацией ПОЛ вследствие окислительной нагрузки на эритроциты и гипоксии тканей, а также снижением синтеза и восстановления глутатиона в условиях дефицита энергопродукции. Более выраженные изменения при фенилгидразиновой метгемоглобинемии, по всей видимости, являются проявлением мощных прооксидантных свойств ФГ (Башарин В.А.,2001). Ретикулоцитоз после воздействия ФГ сопровождался низким уровнем SH-групп в эритроцитах, что указывало на структурно-метаболические нарушения в клетках.

Липопротеиновый комплекс является составной частью мембраны эритроцита и во многом определяет его форму, деформабельность, функцию и физиологическую сохранность. Разрушение липопротеидных структур оболочек эритроцитов начинается с процессов, вызывающих разрушение липидного бислоя клеток. Процессы разрушения липидного матрикса эритроцитарных мембран возникают в результате активации ПОЛ и снижения антиоксидантной защиты эритроцитов, повышения активности фосфолипаз и эстерификации холестерина. Они становятся причиной изменения структурной организации липидного бислоя оболочки и повреждения белкового скелета мембраны. Его разрушение затрагивает все белки, формирующие мембранные домены, от основных интегральных протеинов до спектрин-актиновой сети, и становятся причиной нарушения эластичности клеток. Этот процесс лежит в основе потери деформируемости эритроцитов, превращая их в ригидные формы, блокирующие мик-роциркуляторное сосудистое русло (Колосова М.В.,1999; Степовая Е.А.,1999; Новицкий В.В. и соавт.,2000; Рязанцева Н.В.,2001).

После однократного введения крысам НН в дозе 90 мг/кг отмечалось снижение средней концентрации ЛП в эритроцитах первые 2 суток и с 5-х по 7-е сутки эксперимента с минимальным средним содержанием субстрата через 1,5 часа от начала наблюдения (0,418±0,012 у.е. при 0,457±0,013 у.е. в контроле, р<0,05). Огмечались отсутствие клеток с очень высокой концентрацией ЛП и снижение уровня клеток с высоким содержанием субстрата первые сутки наблюдения, максимальное увеличение числа клеток с низким содержанием ЛП через 1,5 часа (27,1±2,2% при 15,2±1,2% в контроле, р<0,05). В течение первых 6-ти часов в крови животных выявлялись клетки с патологически низкой (менее 0,3 у.е.) концентрацией ЛП (0,6±0,2% при отсутствии в контроле) (рис. 8).

После однократного введения животным ФГ в дозе 150 мг/кг до 5-х суток имело место снижение содержания ЛП в эритроцитах с наименьшим их количеством на 2-е сутки - 71,5% показателей нормы. Первые 3 суток эксперимента в крови отсутствовали эритроциты с очень высоким содержанием ЛП. Их появление было зафиксировано на 5-е сутки, а нормализация их количества - на 7-е сутки опытов. Содержание эритроцитов с высокой концентрацией ЛП снижалось в течение 5-ти суток (на 2-е сутки наблюдения эритроциты данной популяции вообще не определялись). В течение

80%

60%

40%

20% =

Контр 0,5ч 1,5ч 2.5ч

Сроки исследования

В Очень высокое и высокое В Среднее И Низкое и патологически нюкое

Рис. 8. Гистограмма распределения эритроцитов по содержанию липопротеидов (%) у крыс после однократного введения нитрита натрия (90 мг/кг)

100%

80%

60%

40%

20% -

0%

Контр 0,5ч 1,5ч 2,5ч 6ч 1с : 2с Зс 5с 7с 13с 21с Сроки исследования

Э Очень высокое и высокое Ш Среднее ¡3 Нюкое и патологически низкое

Рис. 9. Гистограмма распределения эритроцитов по содержанию липопротеидов (%) у крыс после однократного введения солянокислого фенилгидразина (150 мг/кг)

всего эксперимента (21 сут) уровень клеток с низким содержанием субстрата был выше исходных показателей с максимальными значениями на 2-е сутки (52,3+4,5% при 15,7±1,1% в контроле, р<0,05). Первые 5 суток наблюдения обнаруживались эритроциты с патологически низким (ниже 0,3 у.е.) содержанием ЛП, достигая максимума на 2-е сутки эксперимента.

Анализ результатов исследования SH-групп и ЛП показал, что при нитритной и фенилгидразиновой метгемоглобинемиях в острый период проявлялись прооксидант-ные свойства ксенобиотиков, более выраженные у ФГ. Это определяло развитие глубокого повреждения эритроцитарных структур при данной форме метгемоглобинс-мии. При этом низкое содержание субстратов в период ретикулоцитоза указывало на структурно-метаболические нарушения ретикулоцитов, чего нельзя сказать о нитритной метгемоглобинемии. Снижение уровня тиолов и ЛП в эритроцитах в период нормального содержания metHb в крови после введения НН рассматривается нами как результат повышенного старения эритроцитов вследствие окислительного стресса.

К основным параметрам, характеризующим клеточную гемореологию, относятся функциональные параметры эритроцитов: агрегация и деформируемость (Reinhart W.H.,1995; Тухватулин Р.Т.,1996; Колтунов A.A.,1997; Рязанцева Н.В.,2001).

Исследования выявили нарушение обратимой агрегации эритроцитов, на что указывало увеличение полупериода агрегации Tia в течение всего острого периода метгемоглобинемии после введения НН (табл. 3). Максимально высокие значения Т|/2 соответствовали наибольшему содержанию metHb в крови.

В период с 1-х по 13-е сутки отмечалось снижение Т|/2, что свидетельствовало о повышенной агрегируемости эритроцитов.

В группе животных после введения ФГ наблюдалось более выраженное нарушение агрегации эритроцитов, что проявлялось в повышении Т|д в течение 13-ти суток эксперимента. Наибольшее значение полупериода агрегации отмечалось на 3-й сутки: практически в 12 раз выше контрольных величин (95,03±13,55 сек при 7,44±1,45 сек в контроле).

Значительное нарушение обратимой агрегации эритроцитов свидетельствует об ухудшении реологических свойств крови и развитии гипоксии тканей (Галенок В.А. и соавт., 1987; Шуваева В.Н., 1994), что, с одной стороны, характеризует нарушение адаптационных механизмов организма (Баевский P.M., 1979), а с другой - способствует этим нарушениям. Согласно существующей гипотезе, участие обратимой агрегации эритроцитов^ в регуляции кровотока происходит за счет изменения межэритроци-тарных расстояний, что приводит к изменению толщины пристенного слоя и, в свою очередь, способствует изменению скорости кровотока (Тухватулин Р.Т.,1996). Усиление обратимой агрегации эритроцитов улучшает структуру кровотока, способствует кровоснабжению многих органов и тканей, что поддерживает кислородный запрос организма.

Выявленное нами нарушение обратимой агрегации указывало на выраженные нарушения функциональных свойств эритроцитов не только в период повышенного содержания metHb в крови, но и в отдаленные сроки. Более выраженные изменения обратимой агрегации после введения ФГ очередной раз свидетельствовали о более повреждающем действии этого вещества, причем изменения наблюдались среди всех возрастных популяций красных клеток крови.

Подтверждением развития функциональных нарушений эритроцитов служили результаты исследования их деформационных свойств (табл. 4). Деформация эритро-

цитов определяется различными внешними и внутренними факторами, а также состоянием метаболизма, которые реализуют своё влияние через детерминанты деформации: внутреннюю вязкость, эластичность мембраны и "клеточную геометрию". Деформацию следует рассматривать как интегральный показатель функционального состояния эритроцитов (Борисюк М.В. и соавт.,1989; Колтунов А.А.,1997; Андреева В.Ю.,2001).

После однократного введения нитрита натрия в дозе 90 мг/кг у крыс отмечалось снижение индекса деформируемости эритроцитов (ИДЭ) первые 2,5 часа опытов с наибольшими изменениями к 1,5 часам исследования (ниже контроля на 26% и 24,3% при скоростях сдвига 360 с"' и 890 с"1 соответственно, р<0,05). В дальнейшем показатели деформируемости эритроцитов были ниже соответствующих значений в контрольной группе на 1-е сутки и в период с 5-х по 13-е сутки наблюдения.

Уже через 30 минут после однократного введения животным ФГ ИДЭ по сравнению с контролем был снижен в среднем на 31,9%, 35,4% и 44,4% при скоростях сдвига 180 с"1, 360 с"', 890 с"1 соответственно (р<0,05). В динамике наблюдалось снижение ИДЭ при всех скоростях сдвига с минимальными значениями на 2-е сутки исследования: ИДЭ при 890с'1 ниже на 72% по сравнению с фоновым (р<0,05).

Изменение деформационных свойств эритроцитов в период повышенного содержания metHb в крови в обоих случаях было связано, по всей видимости, со снижением уровня АТФ, уменьшением антиоксидантного потенциала, что вело к активации ПОЛ и, как следствие, изменению структуры бислоя и формы мембран (Lubin A. et al., 1972; Гаврилов О. К. и соавт., 1985; Санников А. Г., 1999; Башарин В. А., 2001).

Более выраженные нарушения деформируемости при фенилгидразиновой мет-гемоглобинемии обусловливались мощным прооксидантным действием ФГ. Низкие значения ИДЭ в период ретикулоцитоза подтверждало предположение о функциональной неполноценности ретикулоцнтов при данной форме экспериментальной мет-гемоглобинемии, в то время как ретикулоцитоз у животных после введения НН сопровождался нормальными значениями ИДЭ.

Снижение ИДЭ на 5-13-е сутки после введения НН свидетельствовало о повышенном старении части эритроцитов.

Таким образом, экспериментальные метгемоглобинемии, вызванные однократным введением НН и ФГ вызывали существенные морфофункциональные нарушения эритроцитов периферического звена эритрона в целом. Наибольшие изменения изучаемых параметров при нитритной метгемоглобинемии соответствовали периоду максимального содержания metHb в крови при отсутствии выраженных признаков эритродиэреза, в то время как для фенилгидразиновой модели было характерно прогрессивное развитие структурно-метаболических и функциональных нарушений эритроцитов к исходу 2-х суток при относительно невысоком уровне метгемоглобина с развитием ярко выраженной гемолитической анемии. Выявленные изменения во многом определялись химическим строением и прооксидантными свойствами метге-моглобинобразователей, особенностями механизмов окисления НЬ, структурно-метаболической состоятельностью молодых форм эритроцитов и ретикулоцитов.

В целом можно сказать, что деструктивные процессы в эритроцитах и перфе-рическом звене эритрона при воздействии ФГ более выражены, чем после введения НН.

Таблица 3

Динамика полупериода агрегации (Тш, секунд) эритроцитов у крыс после однократного введения нитрита натрия (НН) (90мг/кг) __и солянокислого фенилгидразина (ФГ) (150 мг/кг), Х±т_

Показатели Сроки исследования

Контроль 0,5 ч 1,5 ч 2,5 ч 6ч 1 сут 2 сут 3 сут 5 сут 7 сут 13 сут 21 сут

Полупериод агрегации эритроцитов, (Т1/2),сек НН 7,44 ±1,45 11,08 ±1,28** 14,58 ±1,63** 13,58 ±1,64*" 10,33 ±1,39*' 3,54 ±0,57** 3,67 ±0,40*' 4,41 ±0,77** 3,91 ±0,84*' 4,33 ±0,42*' 5,87 ±0,64** 5,54 ±0,57

ФГ 7,51 ±1,43 45,17 ±4,86** 33,41 4:7,02** 41,5 18,69** 47,58 ±8,79** 52,13 ±5,22** 72,83 ±9,0** 95,03 ±13,55** 78,95 ±13,55** 75,67 ±9,31** 14,13 ±0,90** 7,13 ±0,44

Таблица 4

Динамика индекса деформируемости эритроцитов (ИДЭ, усл. ед.) у крыс после однократного введения нитрита натрия (НН) (90 мг/кг) и солянокислого фенилгидразина (ФГ) (150 мг/кг), Х±т

Скорость сдвига, с"1 Период исследования

Контроль 0,5 ч 1,5 ч 2,5 ч 6ч 1 сут 2 сут 3 сут 5 сут 7 сут 13 сут 21 сут

90 НН 0.089 ±0.041 0.061 ±0.021 0.063 ±0.022* 0.071 ±0.031* 0.070 ±0.017 0.052 ±0.014 0.085 ±0.025* 0.068 ±0.011' 0.055 ±0.011* 0.057 ±0.024** 0.062 ±0.032* 0.090 ±0.026

ФГ 0.085 ±0.040 0.061 ±0.012 0.041 ±0.011** 0.045 +0.021* 0.071 ±0.003 0.036 ±0.012* 0.017 ±0.023*' 0.012 ±0.012*' 0.068 ±0.043 0.094 ±0.024* 0.069 ±0.022 0.068 ±0.035

180 НН 0.144 ±0.032 0.098 ±0.023* 0.111 ±0.026 0.110 ±0.015' 0.120 ±0.025* 0.113 ±0.031* 0.134 ±0.022* 0.125 ±0.035' 0.138 ±0.034 0.093 ±0.027*' 0.131 ±0.025 0.112 ±0.033

ФГ 0.145 ±0.035 0.099 ±0.011* 0.093 ±0.011* 0.068 ±0.028** 0.083 ±0.025** 0.059 ±0.019** 0.044 ±0.021*' 0.049 ±0.021*' 0.142 ±0.011 0.136 ±0.024* 0.119 ±0.011 0.148 ±0.047

360 НН 0.244 ±0.032 0.151 ±0.030* 0.171 ±0.025** 0.163 ±0.021** 0.224 ±0.041* 0.172 ±0.035** 0.195 ±0.034' 0.238 ±0.022' 0.167 ±0.033*' 0.168 ±0.034*' 0.163 ±0.025* 0.214 ±0.021

ФГ 0.247 ±0.036 0.143 ±0.021* 0.116 ±0.017*' 0.095 ±0.021** 0.127 ±0.011** 0.107 ±0.029** 0.079 ±0.012*' 0.054 ±0.025*' 0.199 ±0.036' 0.249 ±0.016' 0.189 ±0.062 0.209 ±0.005

890 НН 0.371 ±0.024 0.294 ±0.011** 0.258 ±0.025** 0.331 ±0.021** 0.352 +0.033* 0.321 ±0.018** 0.351 ±0.024' 0.381 ±0.029' 0.279 ±0.025* 0.288 ±0.033*' 0.298 0.026** 0.355 ±0.031

ФГ 0.361 ±0.022 0.206 ±0.026** 0.172 ±0.023** 0.159 ±0.028*' 0.154 ±0.024*' 0.147 ±0.036** 0.105 ±0.014*' 0.126 ±0.038*' 0.265 ±0.031* 0.352 ±0.019' 0.342 ±0.037* 0.353 ±0.021

Однако результаты исследования содержания ВЭГ в плазме крови экспериментальных животных свидетельствовали об обратном, а именно: практически весь период наблюдения (за исключением исследований через 0,5 часа и 5 суток после введения метгемоглобинобразователей) концентрация изучаемого субстрата после введения НН была выше таковой у крыс после введения ФГ (табл. 2). В данной ситуации результаты исследования уровня ВЭГ для оценки степени повреждения эритроцитов не приемлемы. В то же время определение уровня ВЭГ является простым, доступным и распространенным способом оценки интенсивности эритродиэреза (Морозова В.Т.,1988; Левина Л.Д. и соавт.,1993; Тонкошкурова О.А. и соавт.,1996). Нами решалась задача «адаптировать» интерпретацию результатов определения ВЭГ при метге-моглобинемиях, в частности, нитритной и фенилгидразиновой.

По нашему мнению причиной низкого уровня ВЭГ у животных в острый период фенилгидразиновой метгемоглобинемии явилась денатурация гемоглобина вследствие специфического действия ФГ (Гарибов Р.Э. и соавт.,1980; Shetlar M.D. et al., 1985). В восстановительный период метгемоглобинемии низкий уровень ВЭГ был обусловлен эритроцитопенией, подобно тому, как при анемиях снижено содержание билирубина - промежуточного продукта превращений гемоглобина (Капитаненко И.И. и соавт.,1989). Учитывая фракционный состав общего НЬ, определяемого содержанием ВЭГ и НЬ эритроцитов, нами предположено, что оценка изменения содержания одного из компонентов этой системы позволит судить об интенсивности деструкции эритроцитов. Эта зависимость нами представляется как:

ИДсЭ (у.е) = ВЭГ (г/л)х 1 ООО / ОбНЬ (г/л),

где: ИДсЭ - индекс деструкции эритроцитов; ВЭГ - уровень внеэритроцитарного гемоглобина в плазме крови; 1000 - коэффициент для удобного восприятия полученных результатов; ОбНЬ - концентрация общего гемоглобина в крови.

При интерпретации результатов увеличение ИДсЭ указывает на повышение интенсивности эритродиэреза и наоборот.

Попадание НЬ в плазму сопровождается образованием белково-гемоглобиновых комплексов, таких как гаптоглобин-гемоглобиновый (основная форма связывания ВЭГ). метгемальбуминовый. Спектры свободного и связанного с гап-тоглобином оксигемоглобина идентичны с максимумами при 545 и 575 нм, спектр метгемальбумина имеет максимумы при 403, 500, 540 и 620 нм (Кушаковский М.С., 1968).

Содержание общего гемоглобина и ВЭГ определяется методами, основанными на превращении гемоглобина и его дериватов в результате взаимодействия с цианидами в цианметгемоглобин (CNmetHb). НЬ, НЮ2, карбгемоглобин, нитрозогемогло-бин, metHb при добавлении феррицианида и цианида легко превращаются в CNmetHb (Кушаковский М.С.,1968).

Нами проведено измерение спектров гемолизатов отмытых эритроцитов и плазмы крови интактных крыс и животных после однократного внутрибрюшинного введения нитрита натрия в дозе 90 мг/кг и солянокислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг. Выявлено, что после добавления трансформирующего раствора к исследуемым субстратам во всех случаях определяется один максимум при длине волны 540 нм, что характерно для CNmetHb. Следовательно, в предложенной формуле определения степени деструкции эритроцитов соотносятся качественно равные компоненты, что позволяет интерпретировать полученные данные с высокой степенью надежности.

Проведенные расчеты ИДсЭ для контрольной и опытных групп представлены в таблице 5. Наибольший ИДсЭ при нитритной метгемоглобинемии зафиксирован через 1,5 часа от момента введения НН. В группе с финилгидразином максимум значений ИДсЭ приходится на 2-е сутки от начала эксперимента, что соответствует периодам наиболее выраженных морфофункциональных нарушений эритроцитов (по результатам ранее проведенных иследований).

Таблица 5

Показатели индекса деструкции эритроцитов (ИДсЭ) у крыс после однократного введения нитрита натрия (90 мг/кг) и солянокислого фенилгидразина (150

№ п/п НН ФГ

Содержание общего НЬ, г/л Содержание ВЭГ, г/л ИДсЭ, у.е. Содержание общего НЬ, г/л Содержание ВЭГ, г/л ИДсЭ, у.е.

Контроль 162,9±3,1 0,12±0,01 0,71±0,04 161,2±3.0 0,12±0,01 0,71 ±0,04

0,5ч 156,2±4,8 0,13±0,01* 0,86±0,03** 153,0±4,3* 0,38±0,01** 2,50±0,07**

1,5ч 135,8±3,1** 0,55±0,06** 4,03±0,44*# 116,0±2,5*# 0,32±0,02** 2,76±0,14**

2,5ч 120,9±3,5*# 0,44±0,01** 3,61±0,1*" 103,3±4,1** 0,29±0,02*" 2,85±0,11**

6,0ч 131,8±4,2*" 0,38±0,04*# 2,86±0,30* 92,0±4,6** 0,26±0,02** 2,89±0,31*

1сут 146,6±5,9** 0,31 ±0,01** 2,13±0,12*# 57,5±б,3** 0,23±0,01** 4,01±0,37**

2сут 153,4±6,1* 0,29±0,04** 1,79±0,22** 33,7±5,6** 0,26±0,01*" 8,12±),43**

Зсут 158,9±3,б" 0,26±0,04*# 1,63±0,23** 39,3±2,4** 0,22±0,01*" 5,71 ±0,70*"

5сут 163,4±4,2* 0,19±0,01** 0,96±0,05** 70,1±3,3** 0,20±0,01** 2,87±0,17**

7сут 160,6±5,5* 0,12±0,01 0,72±0,02* 104,2±3,6*# 0,11 ±0,01 1,13±0,04**

13сут 161,1±2,1* 0,11±0,01 0,66±0,07 146,6±4,3** 0,11±0,01 0,74±0,07

21сут 160,2±2,2 0,12±0,01 0,71 ±0,05 163,1±1,5 0,10±0,01 0,64±0,05

У животных после введения НН величина ИДсЭ была достоверно выше контрольных значений только в течение первых 5-ти суток эксперимента. Вместе с тем результаты исследования БН-групп и ЛП, морфологическая картина и деформируемость эритроцитов до 13-х суток включительно указывали на повышенное их разрушение. То же самое наблюдалось и у животных после введения ФГ: ИДсЭ был достоверно выше исходных величин в течение первых 7-ми суток наблюдения, в то время как отмечались высокое содержание эритроцитов с низкой концентрацией БН-групп до 13-х суток, повышенный уровень клеток с низкой концентрацией липопротеидов и предгемолитических форм эритроцитов до 21-х суток наблюдения.

Анализируя полученные данные и литературные сведения мы пришли к выводу, что разрушение эритроцитов в различные периоды метгемоглобинемии имело различную локализацию.

Известно, что гемолиз может происходить в просвете кровеносных сосудов (внутрисосудистый гемолиз) и в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (внутриклеточный гемолиз) (Выговская Я.И. и соавт.,1981; Морозова О.А.,1988; Шиффман Ф.Дж.,2000). В ответ на повышенное разрушение эритроцитов происходит гиперплазия и увеличение функции РЭС (Григорович Н. А., 1966). Следовательно, можно предположить, что на смену внутрисосудистому гемолизу в более ранние сроки метгемоглобинемии приходит внутриклеточный, при котором гемоглобинемия не наблюдается (Морозова О. А., 1988; Шиффман Ф. Дж.,2000). Так как гемоглобинемия является прямым признаком разрушения эритроцитов и одним из основных симпто-

мов внутрисосудистого гемолиза, то предложенный нами индекс деструкции эритроцитов свидетельствует об интенсивности внутрисосудистого гемолиза.

Выводы

1.Однократное внутрибрюшинное введение крысам метгемоглобинобразовате-лей - нитрита натрия в дозе 90 мг/кг (LD50) и солянокислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг (LD50), несмотря на относительно короткий период метгемоглобинемии, приводит к длительным выраженным нарушениям структурно-метаболического статуса и функционального состояния эритроцитов периферической крови и развитию анемии различной степени тяжести.

2.Выраженность и направленность нарушений периферического звена эритрона при экспериментальных метгемоглобинемиях зависят от химического строения токсикантов, концентрации метгемоглобина в крови, продолжительности острого периода метгемоглобинемии, особенностей механизмов окисления гемоглобина. При этом наиболее выраженные изменения в данной системе после введения нитрита натрия обусловлены высоким содержанием метгемоглобина в крови. При воздействии солянокислого фенилгидразина прямой зависимости между уровнем метгемоглобина и степенью нарушения морфофункционального статуса эритроцитов не выявляется.

3.Выраженность анемии при экспериментальных метгемоглобинемиях определяется степенью нарушения морфофункционального статуса зрелых и юных форм эритроцитов. Метгемоглобинемия у крыс после введения нитрита натрия в LD50 сопровождается невыраженной анемией, но влечет за собой повышенное старение циркулирующих эритроцитов с нарушением их структурно-метаболического статуса и функции в течение 13-ти суток. Солянокислый фенилгидразин в LD50 вызывает выраженные структурно-метаболические нарушения эритроцитов до 13-х суток эксперимента и глубокую анемию до 7-х суток. Ретикулоцитоз при фенилгидразиновой анемии сопровождается нарушением метаболизма и функции молодых форм эритроцитов, приводящим к их повышенному разрушению в течение 5-ти суток.

4.В патогенезе гипоксических состояний при экспериментальных метгемоглобинемиях важную роль наряду с высоким содержанием метгемоглобина в крови играют нарушения морфофункционального статуса эритроцитов.

5.К характерным нарушениям, выявляемым в острый период нитритной и фенилгидразиновой метгемоглобинемий, относятся уменьшение содержания SH-групп и липопротеидов в эритроцитах, изменение формы, снижение агрегации и деформируемости эритроцитов, повышенный эритродиэрез и развитие анемии. Проявления восстановительного периода обоих типов метгемоглобинемий характеризуются продолжительностью нарушений морфофункционального статуса эритроцитов (до 2-х недель).

6.Специфические изменения в острый период экспериментальных метгемоглобинемий характеризуются степенью выраженности структурно-метаболических нарушений циркулирующих зрелых и юных форм эритроцитов, периодами формирования и тяжестью анемии. Для нитритной метгемоглобинемии в острый период характерно появление в крови экспериментальных животных эритроцитов с глубокой узкой центральной впадиной, а для фенилгидразиновой - трансформация дискоцитов в дискоциты с множественными выростами.

7.Восстановительный период нитритной метгемоглобинемии характеризуется повышением агрегации эритроцитов. Фенилгидразиновая метгемоглобинемия в соот-

ветствующий период сопровождается длительным торможением способности эритроцитов к агрегации. Ретикулоцитоз при фенилгидразиновой анемии формируется за счет поступления в кровоток функционально неполноценных клеток.

Практические рекомендации

Модели экспериментальных метгемоглобинемий, вызванных однократным внутрибрюшинным введением нитрита натрия и солянокислого фенилгидразина могут быть использованы при изучении эффективности лекарственных препаратов для лечения отравлений метгемоглобинобразователями. Для оценки интенсивности внут-рисосудистого гемолиза при экспериментальных метгемоглобинемиях целесообразно использовать индекс деструкции эритроцитов (ИДсЭ), оценивающий уровень вне-эритроцитарного гемоглобина в плазме крови в зависимости от концентрации общего гемоглобина крови.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

¡.Деформируемость и морфологические изменения эритроцитов при экспериментальной острой метгемоглобинемии у крыс // Актуальные вопросы современной медицины. Тезисы докладов одиннадцатой научно-практической конференции врачей. - Новосибирск, 2001 - С.429-430 (соавт.: В.В. Новицкий, М.В. Зеневич, В.Н. Си-ваченко, М.Б. Плотников, О.И. Алиев, А.Н. Михайленко).

2.Динамика гемолитического процесса при острой экспериментальной метгемоглобинемии у крыс // Там же. - С. 430-432 (соавт.: В.В. Новицкий, М.В. Зеневич, В.Н. Сиваченко, В.В. Бас).

3.Функциональные свойства эритроцитов при острой экспериментальной метгемоглобинемии // Сборник докладов Юбилейной научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Б. М. Шершевского. - Томск, 2001. - С. 181183 (соавт.: В.В. Новицкий, М.В. Зеневич, В.Н. Сиваченко, О.И. Алиев).

4.Агрегационные свойства эритроцитов при экспериментальных метгемоглобинемиях // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии / Под редакцией профессора C.B. Логвинова. - Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2002. - Выпуск 2. - С.270 (соавт.: O.A. Жаткин).

5.Морфология эритроцитов при фенилгидразиновой метгемоглобинемии // Там же. - С. 270-271 (соавт.: O.A. Жаткин).