Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Металлосвязывающие белки в системе факторов неспецифической резистентности организма у детей

8 ОД

санкт-петербургский пвдшршескил ;адщинскил

институт

На правах рукописи

ТУРКИН Валерий Владимирович

мегамосшзшзащие белки в системе факторов ^специфической резистентности организм у двтй1

14.00.09 - педиатрия 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора •лнцииинскя'х нэуг

Санкт-Петербург 1991

Работа выполнена в Санкт-Петербургском педиатрическом медицинском институте.

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор И.М.Воронцов; лауреат Государственной премии СССР, доктор медицинских наук, профессор А.М.Королюк.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.В.Юрьев доктор медицинских наук, профессор В.В.Иванова доктор медицинских наук, профессор И.С.Фрейдлин.

Ведущая организация: Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного обучения.

Защита диссертации состоится "/1$ " уУ 1994г.

в час. на заседании специализированного совета

Д 084.18.01 в Санкт-Петербургском педиатрическом медицинском институте, 194100, Санкт-Петербург, ул.Литовская 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского педиатрического медицинского института.

Автореферат разослан " " ей/0/??/} 1994 ГОца

Ученый секретарь специализированного совета - кандидат медицинских наук, доцент К.И. Пшеничная

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на значительный прогресс теоретической медицины, клинической педиатрии и иммунологии в последние годы имеют место не только стабилизация младенчесной и детской смертности, но и наметившаяся тенденция к их росту. Особенную тревогу вызывает возрастающая роль эпидемических вспышек инфекционных заболеваний (дифтерия, корь, коклюш, кишечные инфекции), увеличение роли нозокомиальных и внутренних инфекций в структуре смертности. Поэтому любые попытки и поиски новых путей управления специфической и неспецифической реактивностью организма у детей не теряют своей актуальности.

При различной патологии детского организма существенно нарушается метаболическое равновесие и концентрация в биологических средах микроэлементов, в частности, железа и меди, а также связанных с ними белков - трансферрина (ТФ), лактоферрина (ЛФ), церулоплазмина (ЦП), супероксицдисмутазы (СОД) и других. Эти белки - важнейшие звенья в системе факторов неспецифической резистентности /Яковлев А.М. и соавт., 1988; Дубинина Е.Е., 1989/, обеспечивающих первичную устойчивость к различным повреждающим агентам, особенно инфекционным /Алешкин В.А. и соавт.1988/.

Защитное гомеостатическое действие металлопротеидов реализуется по нескольким направлениям. Основное - это выраженный •^противовоспалительный эффект, создаваемый антиоксидантной системой (АОС).

Ключевым фактором ферментативной АОС является СОД, которую принято рассматривать как цигоплазматический фермент. Однако при ряде состояний (гипероксия, гипоксия, инфекционно-воспалительные процессы) генерация активных форм кислорода (АФК) наблюдается как внутри клетки, так и вне ее. Только совместное действие интра-целлюлярной и зкстрацеллюлярной защиты может предотвратить повышение уровня реакционноспособных метаболитов кислорода.

Второе направление защиты антибактериальная и вирусшгиби-рующая активность металлопротеидов. Связывая свободные ионы металлов, инактивируя.бактериальные токсины, препятствуя адсорбции

вирусов на чувствительных клетках и вызывая образование дефектных вирусных частиц, эти белки тормозят развитие бактериальной и вирусной агрессии / Вагкег в., Вееег г., 1987; Сиверина О.Б.

и соавт., 1987; Каргоэия И.И., 1987/.

В последние годы стал известным еще один аспект защитного действия металлопротеидов. Многие из них обладают^йммунорегулятор-ными свойствами. Так, основные транспортные белки плазмы крови ТФ и ЦП имеют выраженный иммуностимулирующий эффект, оказывая влия- ■ ние и на гуморальные, и на клеточные факторы: усиливают продукцию интерлейкинов I и 2, выработку антител и бласттрансформацию лимфоцитов, хелперную и цитстоксическую активность Т-клеток / ео^1та е. е* «I.,' 1986/.

Несомненный теоретический и практический интерес представляет изучение способности металлосвязывающих белков усиливать сопротивляемость детского организма к инфекциям, а также их взаимодействия с другими факторами неспецифической резистентности и иммунобиологической реактивности как у здоровых детей, так и при различных формах патологии; оценка этих показателей при инфекциях бактериальной и вирусной природы; установление характера и степени повреждения системы металлопротеидов при указанных условиях; исследования возможностей детского организма и сроков восстановления этой системы до «сходного уровня. Для,решения этих проблем необходимо иметь высокочувствительные диагностические препараты, позволяющие определять содержание ыеталлопротеидов в биологических средах организма. В этой связи представляются важными исследования, направленные на разработку простых и экономичных способов ввделения металлосодержащих белков, получения антисывороток к ним и создание соответствующих тест-систем.

Целью исследования явилось изучение содержания и динамики изменений комплекса метаилопротеидов, выявление их взаимосвязей меяаду собой и с другими факторами естественной защиты детского организма в норме н при отдельных формах патологии.

В соответствии с поставленной целью в ходе работы предстояло решить следующие задачи:

I. Провести комплексное исследование металлосвязывающих белков в системе некоторых факторов гуморального и клеточного звеньев иммунитета у здоровых новорожденных детей и детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию и заболевших в раннем неона-

тальном периоде, а также их матерей.

2. Изучить содержание и динамику изменения металлопротеидов и отдельных показателей иммунобиологической реактивности у детей, больных псевдотуберкулезом (ПТ) и инфекционным мононуклеозом (ИМ).

3. Выявить взаимосвязи между металлопротевдами и некоторыми факторами неспецифической резистентности: сопоставить характер их изменений при псевдотуберкулезе и инфекционном мононуклеозе.

4. Разработать способы выделения и очистки ЛФ и СОД из биологических жидкостей; тест-системы для иммуноферментного анализа металлосвязквающих белков - ЛФ, СОД, ЦП.

0сновньте_лоложеншА_вшос1№!е_на_за!щту2

1. Анализ содержания металлопротеидов в пуповинной крови здоровых детей и детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию, представляет большие информативные возможности для оценки состояния ферментативной антиоксидантной защиты в организме новорожденного ребенка. Низкие величины металлосодержащих белков

(ЛФ, ТФ, СОД плазмы) свидетельствуют о недостаточной активности АОЗ, что способствует ускорению процессов перикисного окисления липидов. Высокие значения показателей Щ1 можно рассматривать как компенсаторную реакцию в ответ на длительную кислородную недостаточность.

2. Содержание металлопротеидов ЦП и ТФ в сыворотке крови детей, больных псевдотуберкулезом и инфекционным мононуклеозом достоверно увеличивается. Динамика изменения уровней сходна: концентрация ЦП достигает максимума уже в начале болезни, а ТФ постепенно нарастает в ходе заболевания. Повышенное содержание металлосвязывающих белков при инфекционном мононуклеозе может использоваться как вспомогательный тест дифференциальной диагностики между бактериальной и вирусной инфекциями.

3. Обратная взаимосвязь между ЦП и ТФ, а также прямые корреляции медьсвязывающего белка с СЗ фракцией комплемента, иммуноглобулинами (Иг) М, (т, лейкоцитами, СОЗ, ЛФ свидетельствуют об активном участии этих металлопротеидов в патогенетическом процерсе

при инфекционных заболеваниях у детей.

У§УН?1§я_новизна;-I.Впервые проведено комплексное исследование металлопротеидов (ТФ, ЛФ, ЦП, СОД плазмы, СОД и каталазы эритроцитов) и некоторых факторов неспецифической резистентности и иммунобиологической

реактивности (Т- и В-лимфоцитов; Иг М, О , А; общей фракции комплемента; циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК); иммунных комплексов (ИК) грудного молока) у здоровых новорожденных детей и детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию и заболевших в первый месяц после родов. Выявлены высокие концентрации СОД плазмы пуповинной крови у здоровых новорожденных детей и ЦП у детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию.

2. Впервые проведено параллельное изучение содержания и дина-ммки изменений металлопротеидов (ЦП, ТФ, ЛФ) у детей, больных ПТ

н ИМ. Установлено достоверное увеличение концентраций ЦП и ТФ при бактериальной (1ГГ) и вирусной (ИЮ инфекциях. Показаны одинаковые тенденции изменения их содержания (повышение уровней ЦП в начале и ТФ - в конце заболевания). Отмечены достоверно более высокие значения показателей основных металлопротеидов у детей больных ИМ. Выявлены корреляционные связи этих белков между собой и с другими показателями неспецифической резистентности и иммунобиологической реактивности в ходе развития псевдотуберкулеза и инфекционного мононуклвоза.

3. Разработан методический подход к изучению комплекса основных металлопротеидов (ТФ, ЛФ, ЦП, СОД плазмы) в биологических жидкостях организма. Доказана принципиальная возможность применения разработанных тест-систем в лабораторном исследовании ЛФ, ЦП

и плазменной СОД.

4. Предложен новый способ выделения и очистки СОД из плазмы крови человека. Впервые получены сыворотки против плазменной СОД и создана тест-система для иммуноферментного анализа СОД. Показана возможность количественного определения СОД в плазме крови.

5. Впервые разработан простой в реализации, достаточно информативный, обладающий высокой чувствительностью способ выявления ИК в грудном молоке (молозиве).

6. Предложен простой и экономичный способ выделения и очистки ЛФ из грудного молока. Создана и апробирована тест-система для иммуноферментного анализа ЛФ.

Практическая ценность работы:

Показано, что определение низких концентраций и активности СОД плазмы, повышенного содержания ЦП в пуповинной крови новорожденных детей является одним из доказательств перенесения ими длительной кислородной недостаточности, что открывает перспективные дополнительные возможности диагностики постгипоксических осложнений.

Установлено, что определение уровней ЦП и ТФ в сыворотке крови детей больных псевдотуберкулезом и инфекционным мононуклво-зом может использоваться как вспомогательный тест в дифференциальной диагностике бактериальной и вирусной инфекций.

Показано, что повышение содержания металлосвязывающих белков ЦП и тф в сыворотке крови больных детей может служить одним из показателей', характеризующих остроту воспалительного процесса, степень тяжести бактериальных и вирусных инфекций.

Разработаны методы количественного определения ЛФ, ЦП и СОД плазмы с помощью "сэндвич"-варианта иммуноферментного анализа; показана возможность их применения, эффективность использования для измерений соответствующих белков в сыворотке крови больных и здоровых детей.

Предложены достаточно простые и экономичные методы ввделе-ния лф из грудного молока и СОД из плазмы крови, пригодные для получения очищенных препаратов этих белков и применения юс в качестве диагностических средств в клинической практика и эксперименте.

Апроба15ия_работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на заседаниях научно-медицинского общества детских врачей (Ленинград,1983, 1987), на научной конференции ЛПМИ (1987), на заседаниях научного общества микробиологов и эпидемиологов (Ленинград, 1988, 1991), на 17-ом Международном конгрессе по химиотерапии (Берлин, ФРГ,

1991), на 4-ой Международной конференции инфекционных, н онкологических заболеваний (Прага, Чехословакия, 1992), на 1-ой Мездуна-родной конференции по иммунореабилитации (Сочи-Дагомыс, РосЬкя,

1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2Ь печатных работ.

Внедрение результатов исследования. Методы количественного определения металлопротевдов в сыворотке крови, ИК в грудном молоке используются в практической работе отделений новорожденных детей клинической больницы СПЫ1Ш, инфекционной

клиники СПбПШ, клиники респираторных вирусных инфекций НИИ гриппа РАМН. Полученные данные внедрены в учебный процесс со студентами и слушателями факультета повышения квалификации на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбПМИ.

Разработано и внедрено в практику II рационализаторских предложений. По результатам исследования оформлены четыре изобретения:

1. "Способ получения вещества, обладающего супероксидцисму-тазной активностью" - авторское свидетельство № I43II22 от 15.06.88 г.

2. "Способ получения иммунных сывороток против СОД" -авторское свидетельство № I62I72I от 15.09.90г.

3. "Способ выявления иммунных комплексов в биологической жидкости" - авторское свидетельство № I68I26I от 01.06.91г.

4. "Способ получения лактоферрина" - авторское свидетельство № 1803992 от 09.10.92г.

Материалы диссертации изложены на 365 страницах машинописного текста, включающего введение, обзор литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждение, выводы и практические рекомендации. Работа иллюстрирована 72 таблицами и 67 рисунками. В списке литературы приведено 345 источников, в том числе иностранных 240.

СОДЕРМНИЕ РАБОТЫ.

Объем исследования.

Контингент обследованных детей. Всего было обследовано 350 детей. Группа беременных женщин составляла 131 человек, из них 46 перенесли длительно текущий (более четырех недель) поздний токсикоз (гестоз) беременных. В контрольную группу (132 человека) входили дети:

- родившиеся в срок от здоровых матерей - 85 человек;

- интактные по отношению к ПТ и M - 48 человек (14 детей, обследованных в клинике нервных болезней СПбПМИ; 24 ребенка, находящиеся в санатории по поводу склонности к респираторным заболеваниями (стадия ремиссии не менее трех месяцев); 10 детей из специнтерната № 14).

Группа_больных детей составляла 218 человек. В эту группу входили:

- новорожденные дети первой недели жизни, перенесшие хроническую внутриутробную гипоксию - 36 человек (у 18 из них были выявлены инфекционно-воспалительные заболевания в течение первого месяца жизни после родов);

- дети в возрасте от года до 14 лет больные ПТ - 98 человек;

- дети в возрасте от года до 14 лет больные ИМ - 84 человека.

У 18 детей, заболевших в течение первого месяца жизни были

диагностированы: гнойный омфалит (2), гнойный коньюктивит (2), везикулопустулез (I), пневмония (I), гнойный коныоктивит и омфалит (5), гнойный коньюктивит и везикулопустулез (2); гнойный и катаральный отит (2), острая респираторная вирусная инфекция (3). Диагноз основывался на совокупности данных клинического обследования: явления гипоксии, признаки возбуждения ЦНС, функциональной незрелости; анамнестических данных: перенесенные матерью заболевания во время беременности, а именно, острые респираторные заболевания, инфекционные поражения мочеполовой системы, хронические очаги воспаления в желчевыделительной и мочеполовой системах; бактериологических данных - обнаружение патогенных возбудителей в исследуемом материале, взятом от ребенка; серологических данных- постановка серологических реакций РТГА, РИГА, РОПГА, РСК; гистологических данных - характерные патоморфологические изменения в плаценте.

Диагнозы ПТ и Ш ставились на основании характерней клинической картины, эпидемиологических данных и специфических лабораторных тестов: для ПТ - выделение возбудителя и нарастание титра специфических антител в РИГА с псевдотуберкулезньм эритроцитар-ным диагностикумом от 0 до 1:100 - 1:3200; для №4 - наличие антипичных лимфоцитов в крови и положительной реакции Гоффа-Бауера.

Методы исследования.

Исследование здоровых доношенных детей проводили при рожде-* нии (пуповинная кровь) и в динамике (венозная кровь). У новорожденных детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию, брали пуповинную кровь и кровь из вены в количестве 0,-2-0,3 мл, ограничиваясь определением активности ключевых ферментов АОС -- СОД, каталазы.

У детей, заболевших ПТ и ИМ, материалом для исследования служила кровь, взятая натощак из локтевой вены в первые дни поступления в инфекционную клинику и через 5-10 дне* - перед выпис-

кой. Сыворотку крови после центрифугирования при 600 р в течение 10-15 мин. замораживали в день взятия и хранили при температуре -20°С. При изучении СЗ и СЗа фракций комплемента использовали плазму крови. Консервантом служил 0,1 М раствор ЭДГА рН 7,4. Плазму центрифугировали при ЮОф- 5 мин.; пробы замораживали в течение 4 часов от момента взятия и хранили в жидком азоте.

Для исследования ЛФ и ИК использовали грудное молоко, взятое от беременных женщин в разные сроки лактации в количестве 1,5-2,0 мл. Пробы молока центрифугировали при 4000е в течение 30 мин., удаляли жировую пленку, обрабатывали '¿% раствором уксусной кислоты, выдерживали в течение двух часов при 37°С и снова центрифугировали при 8000г в течение часа; надосадочную жидкость замораживал!! и хранили при температуре -'¿0°С.

В соответствии с целью и задачами работы были использованы современные методы исследования.

Активность СОД определяли по степени снижения скорости восстановления нитросинего тетразолия в присутствии НД1Щ и фена-зинметасульфата и выражали в условных единицах на I мин, рассчитанных на I мл исследуемого биологического материала (зритро-цитарная взвесь, кровь, плазма), на мг гемоглобина при работе с эритроцитами и на мг белка - при работе с плазмой (сывороткой) / Лг1еа е., 1975/. Для определения активности ССД в гемолизате эритроцитов или цельной крови гемоглобин, которой мешал определению ферментативной активности, осаждали смесью спирта и хлороформа в соотношении 2:1.

Активность каталазн определяли в гемолизате эритроцитов, (разведенном цеионизированной водой из расчета 1-.2С0С, активность фермента выражали в международных ециниках по количеству разрушенной перекиси водорода в ммолях за I мин. и относили к I мл эритроцитарной взвеси или на I г гемоглобина / веиПегЕ., 1075/.

Определение молекулярной массьт ЛФ и СОД плазмы в присутствии додецилсульфата (ДЦС) и £ -меркаптоэтанола; относительной электрофоретической подвижности белков в агаре, изоялектрической точки; ферментативной активности; отношения к термической обработке, а также проведение характеристических реакций осуществляли по известным методикам /Яровая Г.А. и соавт.1982; Филиппович Ю.Б. и соавт., 1982; Северин С.Е., Соловьева Г.А., 1989/ на базе кафедры биохимии СПбПМИ.

Содержание металлопротеидов ЦП, гф в сыворотке крови, лф в грудном молоке, изучали с помощью метода радиальной иммунодиффу-ции в агаровом геле / Kanchlnl g. et al., 1965/, использовали собственные антицерулоплазминовые, антилактоферриновые и стандартные антитрансферриновые сыворотки ("Севак", Прага).

Оксидазную (ферментативную) активность ЦП выявляли по методу Ravin ж. А./1961/ в лаборатории молекулярной биохимической генетики НКИЭМ РАМН.

Количество Т-лимфоштов определяли в реакции спонтанного Е-розеткообразования по модифицированной на;-!и методике Аоруж-ко А.П., Карзова Е.Ю., 1984/, число B-лимфоцитов в реакции розет-кообразования с мышиными эритроцитами по известной методике /Понякина И.Д. и соаг.т., 1983/.

Оценку уровня СЗ фракции комплемента и продукта ее активации СЗа проводили с применением метода конкурентного иммунофермент-нсго анализа Д'рофимов A.B. и соавт., 1988/ на базе лаборатории выделения и очистки препаратов хроматог'рафическими методами НИИ ОЧБП, активности общей фракции комплемента титрованием 50% гемолиза /Резникова Л.С., 1967/.

Концентрацию сывороточных Иг M, G , А исследовали методом радиальной иммунодиффузии в агаровом геле / Kœohini s, et 1965/ с применением моноспецифических сывороток Горьковского НИИЭиМ; ЦИК сыворотки крови путем преципитации полиэтиленгликолем 6000.

Определение содержания меди, железа, марганца в исследуемых образцах проводилось методом атомной абсорбции на пламенном спектрофотометре AA-I в ЛГУ на базе НИИ химии (кафедре аналитической химии).

Спектры элекчронного парамагнитного резонанса (ЭПР) регистрировались на радиоспектрометре 3-сантиметрового диапазона РЭ--1306 с мощностью СВЧ 0,1 мВт в стеклянном капилляре диаметром 3,0 мм в жидком азоте. Применялся метод усреднения (накопления) сигнала. Работа выполнялась на кафедре радиационного материаловедения ЛИХТИ им.Ленсовета и на базе НИИ физики в ЛГУ.

Лазерную корреляционную спектроскопию (ЛКС) очищенных препаратов ЛФ проводили на экспериментальной установке в лаборатории проф.В.А.Носкина на базе НИИ ядерной физики им.Б.П.Константинова.

Результаты исследования обрабатывали методом вариационной статистики, расчеты проводились на микро-ЭВМ CM-I800 на базе

НИИ гриппа РАМН.

Металлопротеиды в системе факторов неспецифической резистентности и иммунобиологической__

детей.

Основные механизмы физиологической адаптации ребенка в результате перехода на новый легочной тип снабжения кислородом и изменения направленности метаболических процессов в тканях формируются во внутриутробном развитии. Сам процесс родового акта можно рассматривать как начальную стадию адаптационной реакции ребенка в окружающей среде. От характера и степени мобилизации систем, осуществляющих запуск стрессорной реакции, от ее длительности во время родов, с одной стороны, и от интенсивности и своевременного включения механизмов, тормозящих действие стрес-сорных факторов и обеспечивающих совершенную адаптацию ребенка после рождения, с другой стороны, зависят особенности протекания его постнатального развития. Во время родов ребенок находится в состоянии относительной гипоксии разной длительности, а после родов - в состоянии относительной гипероясии. Эта смена состояний сопряжена с усилением процессов генерации АФК, степень проявления токсических свойств которых зависит от активности АОЗ организма. Соответственно, состояние этой защитной системы в организме плода перед родами и во время родового акта и включение дополнительных резервов антиоксидантов после ровдения являются одним из важных факторов патогенеза постнатальных осложнений у ребенка.

Нами в луповинной крови здоровых новороященных детей было зарегистрировано статистически достоверное снижение концентрации основных металлосоцержащих белков - ЦП, Тф, Л3>, а также некоторых показателей клеточного (Т- и 3-лимфоциты) и гуморального (Иг М, й- , А, общая фракция комплемента, ЦИК) звеньев иммунитета ло сравнению с их уровнем в крови их матерей, что свидетельствует о физиологической незрелости всех компонентов, обеспечивающих как естественную резистентность, так и специфическую реактивность в защите детского организма от повреждающего действия инфекционного агента.

Содержание и активность основного фермента АОС - СОД плазмы

пуповинной крови оказалось статистически достоверно более высоким, что, по-видимому, связано с высвобождением металлов переменной валентности (железа и меди) из комплексных соединений их с белками, снижением концентрации последних и, как следствие, усилением генерации самого реакционноспособного метаболита кислорода -гидроксильного радикала (табл.1).

Параллельно с высоким уровнем активности СОД плазмы были выявлены высокие цифры активности СОД и кагалазы эритроцитов. Как в эритроцитах, так и в цельной крови здоровых новорожденных детей была обнаружена более высокая скорость утилизации перекиси-водорода. Если сравнить скорость утилизации ^0^ в процентах в эритроцитах и цельной пуповинной крови со взрослыми, то у'новорожденных в цельной крови она выше на 34%, а 'в эритроцита*: -на 70%.

Таким образом, у здоровых доношенных детей выявлен высокий уровень содержания и активности основных ферлентов антиоксидант-ной специфической системы, что свидетельствует о мобилизации ферментативной АОЗ при физиологическом течении беременности за счет включения механизмов нейрогуморальной регуляции.

При осложнении беременности гестозом отмечаются функциональные нарушения маточно-плапентарного звена, что является причиной хронической гипоксии плода /Шелезнов В.И., Шмаков Г.С., 1982; Гечкин М.В., Рафикова Н.Х., 1985; Федорова М.В., Калашникова Е.П. 1986/. Недостаток кислорода в тканях плода приводит к нарушению процессов биологического окисления, что сопровождается повышением восстановительного потенциала клеток, сдвигом рН в кислую сторону, активацией протеолитических ферментов, которые вызывают превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. Все это создает условия для интенсивной генерации АФК. Выявленное нами статистически достоверное снижение содержания металло-протеидов (ТФ, ЛФ, СОД плазмы), активности СОД плазмы, СОД и каталазы эритроцитов, и высокий уровень ЦП у детей, перенесших хроническую гипоксию, являются одним из показателей нарушения становления компенсаторно-приспособительных механизмов организма плода к состоянию относительной гипероксии (табл.2).

Таблица I.

Сравнительный анализ специфических и неспецифических Факторов антиоксицантноЯ защиты у здоровых новорожденных детей и их

матерей.

Группа ' о*слет;ованн"х К-во оболе— до-ванных __Исслез^емые_им^нологические_ Концентрация и_Йиох™ические_показатели_______ Активность (усл.ед.)

ЦП г/л СОД нг/мл ТФ г/л ЛФ мкг/мл СОД плазмы (на 1мл биол. мат.) СОД эритроцит . (на I мг гемогл.) Каталаза (на I мл биол.мат.]

Здоровье новорожденные (пуповин-ная ч-ровь") 34 0,091± 0,010 57,8± 1,8 I,957± 0,054 0,313± 0,013 4,65±0,34 1,34±0,04 7,46±0,31

Здоровые матери 34 0,ЗЮ± 0,012 52,43,6 3,836± 0,034 0,836± 0,036 3,26±0,13 1,78±0,01 8,20±0,72

Р с 0,001 >0,050 <0,001 <0,001 ^ 0,001 <Г0,001 >0,050

Таблица 2.

Сравнительный анализ содержания металлосвязывающих белков в пуповинноЯ крови здоровых новорожденных детей и детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию.

-------------- Группы обследованных 'К-во об-сле-до-в энных 'Исследуемые иммунобиологичес Концентрация ^§_и_биохтические_показатели_ Активность (усл.ед.)

ЦП г/л сод нг/мл ТФ г/л ЛФ мкг/мл СОД плазмы (на 1мл биол. мат.) СОД эритроцит . (на I мг гемогл.) Каталаза (на I мл биол.мат.)

Здоровые дети 34 0,0910,010 -57,81,8 I,9571 0,054 0,3131 0,013 4,65±0,34 1,3410,04 7,4610,31

Дети, перенесшие хроническую гипоксию 36 0,1631 0,056 50,131 1,3 1,8641 0,022 0,2971 0,017 2,7510,22 0,93±0,04 ЗДОЮ.П

Р <0,001 <0,050 >0,050 >0,050 < 0,001 <0,001 С 0,001'

При длительном воздействии гипоксии на организм плода наступает истощение приспособительных механизмов и, в частности, генетического аппарата, о чем свидетельствует отсутствие компенсаторного повышения содержания и активности СОД плазмы, активности СОД и каталазы эритроцитов в крови новорожденных детей, перенесших хроническую гипоксию по сравнению со здоровыми новорожденными детьми.

При кислородной недостаточности меняется жизнедеятельность плода и начинают включаться компенсаторно-приспособительные механизмы в системе мать-плацента-плод, повышая адаптацию плода к гипоксии. В основе развития адаптационных механизмов мать-плод лежат процессы активации синтеза нуклеиновых кислот и белков. Это прйводит к увеличению массы плаценты у матери с гипоксическим состоянием, что увеличивает поверхность газообмена, наблюдается увеличение поверхности плацентарной мембраны и емкости капиллярной сети плодовой части плаценты. У ребенка при состоянии гипоксии компенсаторно увеличивается кровоснабжение мозга и печени, как жизненно важных органов /Федорова М.В., 1962,1965/. Именно в печени происходит синтез многих белков крови и, прежде всего, ЦП, который в отличие от СОД восстанавливает супероксидные радикалы до воды, церехватывает таким образом продукты метаболизма кислорода и предохраняет липидосодержащие структуры от их повреждающего действия.

Таким образом, нарушение адаптивной функции основных ферментов АОЗ - СОД плазмы, СОД и каталазы эритроцитов, а также снижение уровней ТФ и ЛФ, в ответ на хроническую внутриутробную гипоксию при переходе ребенка на легочный тип дыхания может являться одной из причин не только посггипоксических осложнений, но и развития инфекционно-воспалич'ельных заболеваний в первый месяц жизни после родов.

При сравнительном изучении отдельных показателей иммунобиологической реактивности наиболее информативными наряду с металлопро-теидами, оказались значения уровней ИК в пуповинной крови заболевших детей, а также в сыворотке крови и грудном молоке их матерей.

Содержание и частота выявления ИК в грудном молоке беременных женщин, дети которых перенесли хроническую внутриутробную гипоксию и заболели в первый месяц жизни после родов, были статистически достоверно выше по сравнению со здоровыми матерями. Так, в группе

матерей с гестозом Ж в грудном молоке обнаруживались в 100% случаев. Средние показатели ИН (57,4^6,3) превышали средние значения у здоровых матерей (36,3±5,5). Аналогичная картина имела место и при исследовании ЦИК в сыворотке крови (115,7^10,9 и 96,4-7,8 соответственно).

Высоким уровням ИК в грудном молоке и сыворотке крови беременных женщин с гестозом соответствовали высокие цифры в пуловин-ной крови их детей.

Проведение корреляционного анализа показало наличие обратной зависимости между ЦП и СОД плазмы (коэффициент корреляции 0,64). Истощение АОС при хронической гипоксии у детей сопровождалось снижением количества специфического фермента плазмы пуповинной крови и повышением содержания неспецифического антиоксиданта - ЦП, который также является белком "острой фазы" воспаления и принимает активное участие в формировании естественной защиты детского организма от инфекции. Обратная корреляционная связь имела место и между ЦП и ТФ, (коаффициент корреляции 0,68), содержание которого снижалось по сравнению со здоровыми новорожденными. Причем это снижение предшествовало развитию инфекционно-воспалительных заболеваний у детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию.

Прямые корреляции были установлены между ЦИК в пуповинной крови и Иг М и обратные - между ЦИК и комплементом. Развитие инфекционно-воспалительных заболеваний сопровождалось снижением количества общей фракции комплемента и увеличением содержания в пуповинной крови преимущественно уровней ЦИК и Иг i, а также, в значительно меньшей степени, Иг Q- и А. По-видимому, происходит нейтрализация и выведение антигенов из макроорганизма.

Таким образом, полученные данные'позволяют считать, что металлопротеицы не только выполняют важную защитную функцию, но и являясь существенным связующим звеном в системе факторов гуморальной и антиоксицантной защиты, обеспечивают преемственность этих двух систем, способствуют сохранению постоянства внутренней срецы детского организма.

резистднтности и иммунобиологической реактивности при псевцотуберкулезе и инфекционном мононуклеозе.

Анализ данных, полученных при исследовании детей больных ПТ

и ИМ позволил выявить определенное сходство и некоторые отличия в изменении уровней железо- и медьсвязывающих белков. Так, сходным в содержании металлопротеидов было:

- достоверное увеличение в ходе болезни концентрации ЦП и ТФ (рис.1 и 2);

- динамика содержания белков: снижение высокого уровня ЦП (рисЛ) и постепенное повышение ТФ в ходе заболеваний (рис.2);

- значительное повышение активности медьоксидазы;

- максимальные показатели ЦП, ЛФ и минимальные ТФ при тяжелых формах ПТ и ИМ.

Можно предположить, что указанные общие свойства обусловлены особенностями исследованных металлопротеидов как реактантов острой фазы воспаления. Основной признак белков этой гргуппы - быстрое и значительное изменение концентрации в результате нарушения гомеостаза независимо от природы и места приложения вызвавшего его стимула. Как известно, механизм острофазной реакции заключается в следующем: под воздействием повреждающего фактора выделяются биологически активные вещества; способствующие ускорению синтеза интерлейкина I и других. Стимулируются защитные реакции детского организма и увеличивается синтез "белков острой фазы" воспаления печенью, в частности - ЦП. Поэтому при выраженной воспалительной реакции наблюдается более высокая концентрация медьсвязываю-щего белка в крови, что и было установлено при исследовании тяжелых форм инфекций (рис.1).

Необходимо отметить, что у больных ПТ и Ш детей увеличивался уровень не только иммунореактивной формы ЦП, значительно возрастало содержание в крови ферментативно-активной фракции этого белка (0,508^0,043 г/л у детей с бактериальной инфекцией и 0,565^0,053 - с вирусной; в контрольной группе - 0,329^0,022). Последнее позволяет предположить важную защитную роль именно этой формы ЦП, что, по-видимому, обусловлено способностью медьоксидазы инактивировать свободные радикалы кислорода, в избытке имеющиеся в очаге воспаления / tounis м. к., Bixch et. j., 1985; nisiivestro к.

А., BaTid Е. а., , 1986/.

Принято считать, что основной железосодержащий белок относится к отрицательным "острофазным белкам", концентрация которого падает в начале болезни. Более низкое содержание протеида у больных тяжелой формой псевдотуберкулезной инфекции подтверждает это

Больны;

Больные

Уело кие

эбозначения:

| [-контрольная

_ группа

1583-при-

поступлении

-перед випивквй

Б/ В !ави5имэвти вт степени тяжвбти.

0.6^ г/л

0,5 0,4

.V.»

8 $

о.б

г/д 0,5

о л

I

I

■А

Л»«'

Л

¿¿¿I

Услввные эбозначения:

| ^контрольная

_ группа

Щ-легка*

^^-ерелняя [ЩЩЬтяжелая

В/ Возраит детей.

Условнее обо зяа чзяия:

"1-контволькм J группа до 2 лет

ш

-е 3 б лет -е 7 д» лет

Рис. I. СОДЕРЖАНИЕ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА при бпггеркчльной и вирусной инфекциях у цотей.

Уединив •безначеиия:

| | -кентрольная и——' групп» -при

поступлении

ЩД1-ИМ

-перед аааисквЯ

Б/ В зниеимвсти «т степени тяжеети.

г/л 3.0

2,5

Усл«вхыс обозначения:

V

г/л 3.5

3.0

Условные обозначения:

г/'л 3.0

2.5

1

[-центральная 1//^]-сргдняя групп»

ЦЩ-легк»я [Щ|Ц-мжелая

В/ Ввзр»«т детей.

[• |-контрольная

группа -до 2 лет

-с 3 до 6 лет -е 7 до лет

Рис.2. СОДЕРЖАНИЕ ТРАНСФЕРРИНД при бактериальной и вирусной инфекциях у детей.

положение (рис.2). .Механизм тот же - развитие острой фазы воспалительного ответа. Увеличение уровня интерлейкина I способствует освобождению ЛФ нейтрофилами, именно ЛФ захватывает железо и ведет к гипосидеремии. По-видимому, снижение уровня сывороточного железа, сопровождающее развитие многих воспалительных заболеваний и приводит к уменьшению концентрации ТФ. Возможно, и медьсвязываю-щий белок участвует в этом процессе, так как обладает выраженными ферроксидазными свойствами: он окисляет двухвалентное железо в трехвалентное, которое и встраивается в молекулу апотрансферринси

Несколько более высокие концентрации металлопротеидов в динамике заболеваний у детей до двух лет (рис.1 и 2) подтверждают важную роль ЦП и ТФ как факторов собственно естественной резистентности развивающегося детского организма.

Описанное выше сходство в характере изменений металлосвязыва-ющих белков у детей при ПТ и Ш не исключает и ряда существенных различий и особенностей в зависимости от этиологии инфекции (рис.3). Эти отличия заключаются в следующем:

- достоверно более высокие концентрации ЦП, ТФ у больных ИМ детей и ЛФ - ПТ;

- при ИМ у детей уровень основного железосвязнвающего белка не опускался ниже значений контрольной группы.

По-видимому эти отличия обусловлены патогенетическими особенностями обеих инфекций. Так, ИМ - быстротекущий доброкачественный лимфопролиферативный процесс, вызванный активирующим влиянием вируса Эпштейна-Барр на иммунную систему детского организма. Резко увеличивается общее количество клеток в кровяном русле, особенно З-Лимфоштов / ТагоИоап Е. et а1., 1983, ТоваЪ й. В1аезе Е. М., 1985/. ПТ, наоборот, медленно, постепенно развивающаяся бактериальная инфекция. Иерсинии устойчивы к действию фагоцитирующих клеток, так как капсульная субстанция и внеклеточный антигенный комплекс ингибируег переваривающую активность фагоцитов. Следовательно, микроорганизмы могут длительное время персистировать и даже размножаться в Фагоцитирующих клетках, будучи защищенными от гуморальных Факторов. 3 результате медленнее развивается и специфический иммунный ответ. Необходимо отметить, что сниженные уровни ТФ у больных ПТ детей могут быть обусловлены и утилизацией этого белка иерсиниямл. Известно, что эти микроорганизмы имеют железорегулируемне белки и способны использовать в качестве ис-

ДО

ОЛ 0,55

ЦП

2000 мкг/ид

1500 1000

тттт

сз

450 МЕ/ид 350"

250"

150"

I 2 3-4

V

200 МЕ/мд

150 125

I 2 3-4 Иг а

20. мм/ч 15" 10"

¿ 2 соэ

3-4

I 2 Условнее ОС

3-4

3,0]

2,5

мкг/мл-3,01.0

1 2 3 4 СЗ»

150 НЕ/мл

100

200 ед.вп. пл.

50

хЮ /л

9

I 2 3-4 Иг А

I 2 ЦИК

3-4

12 3-4 *•. Лчйк»цкти

3-4

)бо зиачеяия: " " пседдотуберкудез заболевания

•*• инфекционный мононуклеоз

Рис.3. Динамика показателей' иммунобиологической реактивности

при псевдотуберкулезе и инфекционном мононуклеозе у детей.

N

\

*

и

точника жизненно необходимого им железа белок гемин / шгту в. в., ВгаЪакаг Н. Н., 1979; Уоо1ооок J. В., 1988/.

В целом полученные данные о достоверно более высоких уровнях ЦП и ТФ у больных ИМ детей по сравнению с больными ПТ могут быть использованы в качестве дополнительного теста ранней дифференциальной диагностики этих заболеваний.

Изучение факторов иммунобиологической реактивности и естественной резистентности при бактериальной и вирусной инфекциях у детей также позволило выявить общие закономерности (рис.3):

- значительное увеличение содержания в плазме крови больных СЗ фракции комплемента с одновременно низким уровнем СЗа - продукта активации этого компонента;

- рост концентраций Иг М, , Л и ЦИК;

- высокие показатели СОЭ, лейкоцитоза, постепенно снижающиеся при реконвалесценции.

Полученные данные об увеличении концентраций Иг и ЦИК в целом совпадают с исследованиями, приведенными другими авторами при аналогичных заболеваниях /Бутянова И.Г., 1983; Гордеец А.В., 1986, 1989; Ценева Г.Я. и соавт.1986/.

Были выявлены и некоторые отличия межд^ изученными показателями у больных ПТ и Ш (рис.3):

- более высокий уровень СЗ фракции комплемента и его постепенное снижение при ПТ инфекции; у детей, больных ИМ следует отметить тенденцию к увеличению содержания этой франции в динамике заболевания;

- различный характер динамики Иг М, в , А и ЦИК.

Высокий уровень СЗ компонента ко.мплемента в начале ПТ и его

постепенное снижение в последующем связано с ускорением синтеза этой фракции под воздействием бактериальных эндотоксинов /тмм А., 1990/. Более низкие концентрации Иг и ЦИК у больных ПТ по сравнению с детьми, переносящими Ш, обусловлены депрессивным воздействием иерсиний на иммунный ответ, ингибирующим влиянием на фагоцитарные процессы /Сомов Г.П. и соавт.,1990/. Однако, развитие бактериальной инфекции сопровождалось постепенно возрастанием и повышенными уровнями Иг на протяжении всего периода наблюдения. При Ш у детей отмечено уже со второй недели заболевания снижение концентраций Иг М, что подтверждается литературными данными /ХапесгЬо г., 1982/.

В результате проведения корреляционного анализа были установлены достоверные связи (Р <0,05) между изученными показателями иммунобиологической реактивности (табл.3).

При обоих заболеваниях обнаружены положительная корреляция между иммунореактивной и ферментативно-активной формами медьсвя-зывающего белка, СОЭ. Общей для этих инфекций была и обратная зависимость между уровнями ТФ и медьоксидазой. Таким образом было показано, что взаимодействие между основными металлосодержащими белками сыворотки крови ЦП и ТФ реализуется именно через фермен-тативно-активную форму ЦП. Следует отметить обратный характер связи и ее проявление только в динамике заболеваний.

Выявлены и некоторые отличия корреляционных связей при бактериальной и вирусной инфекциях у детей. Так, у больных ПТ были обнаружены прямые корреляции иммунореактивного ЦП с СЗ фракцией системы комплемента, лейкоцитами, то есть с неспецифическими защитными факторами; ферментативно-активного - с ЛФ. У больных ИМ детей взаимосвязи, предположительно, отражают уже следующий этап развития иммунного ответа: прямые корреляции медьсвязывающего белка с Иг 0- , усиливающиеся в динамике заболевания, отсутствие связей с ЛФ, Такое иммуномодулирующее влияние ЦП подтверждается положительными взаимодействиями ферментативно-активной формы этого белка с Иг М, 0- .

Обнаруженная прямая зависимость между уровнем медьсвязывающего белка и концентрацией Иг & соответствует известным экспериментальным данным / КоДта е. et а1,1986/ об иммунопотенцирующем действии этого металлопротеида.

Биологический смысл выявленного изменения уровней металло-соцержащих белков и взаимосвязанных с ними факторов реактивности при бактериальной и вирусной инфекциях заключается в каждом отдельном случае в том, что включается и запускается комплекс защитных специфических и неспецифических реакций. При этом характер изменения уровней - более раннее повышение ЦП и последующее ТФ -обеспечивает преемственность реакций этих двух белков, длительный защитный эффект металлопротеицов в организме ребенка.

Таблица 3

Корреляционные связи металлосвязывающих белков при бактериальной и вирусной инфекциях.

Металлопротеиды Корреляционные связи меящу собой и с другими факторами иммунобиологической резистентности Значение коэффициентов корреляции

при поступлении при выписке

Ишгтаореакгивньй ЦП 0,78 Ферментативно-активный ЦП п 0,98 Ферментативно-активный ЦП п

0,33 0,29 0,23 0,22 СЗ фракция комплемента п СОЭ м Иг 0 м Лейкоциты п 0,47 -0,52 0,34 03 фракция комплемента п СЗа фрагмент м Иг а м

Ферментативно-активный ЦП 0,70 Иммунодеактивный 0,88 -0,79 0,91 0,90 Иммунореактив-ный ЦП й Трансферрин п Иг а м Иг М м

Трансферрин - -0,74 Ферментативно-активный ЦП м

Лактоферрин 0,23 0,26 0,34 Ферментативно-активный Ш п Иг А 11 Лейкоциты л -

Условные обозначения: п - данные приведены для детей, больных ПТ

м - данные приведены для детей, больных ИМ Подчеркнуты корреляционные связи, выявленные при обрих инфекциях.

Таким образом, полученные результаты исследований позволяют считать, что ыеталлосвязывающие белки выполняют важную защитную функцию, являются существенным звеном в системе факторов неспецифической резистентности и иммунологической реактивности. '

Количественное определение металло-протеидов.

Для изучения содержаниями динамики изменений комплекса ме-таллопротеидов в системе факторов неспецифической резистентности детского организма нами была разработана методическая база:

. - предложены новые способн выделения и очистки СОД плазмы из донорской крови (авт.свид-во № 1431122, 1988) и ЛФ из грудного молока (авт.евид-во № 1803992," 1992);

- получены специфические антисупероксиддисмутазные (авт. свяд-во № 1621721, 1990), антилактоферриновые и антицерулоплазыи-новые сыворотки;

- созданы высокочувствительные тест-системы для иммунофермент-ного анализа основных металлопротеидов - плазменной СОД, ЛФ, ЦП,

Для ввделения СОД к плазме донорской крови человека добавляли этиловый спирт-96° и хлороформ в соотношении 1:0,3:0,15, перемешивали и в полученную смесь вносили кристаллический дигидрофос-фат калия из расчета 300 мг на I мл плазмы. Смесь энергично встряхивали на холоде в течение 20 мин. Полученную густую массу с желтоватым оттенком центрифугировали при 12000 е в течение 20 мин. при'+4°С. В результате такой обработки осаждается основной медьсодержащий белок плазмы - ЦП и балластные белки. К полученной прозрачной голубоватого цвета надосадочной жидкости приливали 0,6 объема охлажденного ацетона для осаждения СОД, смесь перемешивали 10 мин. и центрифугировали 20 мин. при 2000 е и температуре +4+5°С. Подученный голубоватый осадок отделяли от надосадочной жидкости и суспендировали в фосфатном буферном растворе каС1 (рН 7,6; 0,075 моль/литр) из расчета 0,2-0,3 мл на I мл нативной плазмы. Суспензию голубоватого цвета центрифугировали при 6000 е в течение 30 хин. и температуре +4+5°С. Голубоватый осадок растворяли в таком количестве фосфатного буфера (рН 7,8; 0,075 ыоль/ юггр), чтобы содержание белка в этом растворе составляло 10-18 мг

в I мл.

Для осавдения балластных белков полученный раствор, содержащий СОД фракцию, подвергали термической обработке в кипящей бане в течение 5-6 мин., охлаждали и центрифугировали при 6000 g в течение 10 мин. для отделения СОД, находящейся в супернатанте.

Дальнейшую очистку СОД проводили методом гель-фильтрации на ультрагелях фирмы шв (Швеция). Раствор, содержащий СОД, в количестве Ю мл наносили на колонку (44x2 см, объемом 141 мл), заполненную ультрагелем АсА-34, содержащим 3¡£ акриламвда, 4% агаро-зы и уравновешенным 0,08 М раствором ВаИ рН 6,0. Элшию проводили тем же раствором и собирали фракции, обладающие СОД активностью. Их концентрировали с помощью лиофильной сушки, затем растворяли в 0,08 моль/литр растворе шя. из расчета 50 мг сухого веса в 0,6 мл. Рехроматографию проводили на ультрагелях АсА-44, содержащих 4% акриламида и 4% агарозы с тем же равновесным раствором. На элюционной диаграмме вьивляли один пик по поглощению при 280 нм. На электрофореграмме зоне активности СОД соответствовала единственная белковая фракция. Сравнительный анализ очищенного препарата СОД представлен в таблице 4. ■

Для выделения ЛФ грудное молоко или молозиво, взятое в количестве 100 мл, центрифугировали на холоду в течение 30 мин. при 6000 g . Образовавшуюся жировую пленку удаляли механическим путем. Белки молочной плазмы осаждали при комнатной температуре насыщенным раствором сульфата аммония с конечной концентрацией в смеси 72-74%. Смесь оставляли до полного формирования осадка 24 часа при 4°С. Осадок отделяли центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин., а затем растворяли в минимальном объеме фос-фатно-солевого буфера 0,01 М рН 7,4.

Лактоферриновые фракции, полученные в результате высаливания, подвергали очистке от солей на колонке с сефадексом G -25 грубый. Элюиию проводили 0,1 М Фосфатным .буфером рН 8,6. Балластные белки удаляли методом гель-фильтрации на ультрагелях АсА-44 фирмы ысв (Швеция). Раствор, содержащий ЛФ, в количестве 10 мл наносили на колонку (44x2 см, объемом 141 мл), заполненную ультрагелем АсА-44, содержащим 4% акриламида,- 4^ агарозы и уравновешенным 0,08 М раствором пая. рН 6,0. Элгоцию проводили тем же раствором. На элюционной диаграмме чистому ЛФ соответствовал третий пик по поглощению при 280 м>л. На электрофореграмме выявляли только

Таблица 4.

Сравнительный анализ очищенного препарата СОД плазмы и СОД эритроцитов.

ш пп Параметры Эритроцитарная Плазменная сод

I. Молекулярная масса 30000-32000 101000-150000

2. Содержание ионов меди 9,00-Ю_бмМ на мг белка 3,14* КГ^мМ на мг белка

3. Электр офоретичес-кая подвижность разная (2-3 фракции) разная (I Фракция с ДЦС - 2 фракции)

4. Спектры поглощения максимум поглощения в УФ и видимой частях спектра - 680нм максимум поглощения^ в УФ и видимой частях спектра -420-490 нм 13 пика)

5. Отношение к термической обработке (5-6 мин. в кипящей водяной бане) гермолабильный белок термоустойчивый белок

6. Влияние ДЦГ полностью ингибиру-ет не влияет

7. Влияние (0,47 М) тормозит активирует

8. Азид натрия I мМ - активирует с 10 мМ - тормозит не влияет

9. ЭПР - спектры вг -2,680; 2-2 960 Ц -3^240 нет сигнала ЭПР

одну белковую фракцию. Сравнительный анализ очищенного препарата ЛФ представлен в таблице 5.

Таблица 5.

Сравнительный анализ очищенного препарата ЛФ и ЛФ фирмы "Сигма" (США).

Исследуемые параметры

Молекулярная масса

Относительная электро-форетическая- подвижность в агаре

Изоэлектрическая точка Отношение к температуре

Ферментативная активность: эстеразная фосфотазная йротеиназная Осаждение 60$ ацетоном

Осаждение 50% этанолом

Осаждение 0,9 II хлорной кислотой

Диск-электрофорез с ДДС Л К С

Очищенный препарат ЛФ

83000^6000

0,44^0,005

9,2

ив 30 мин.

истончив при Б5О _ -зп

.1

отсутствует отсутствует отсутствует полное

не осаждается

необратимое

гомогенен

микрогетерогенен

ЛФ фирмы "Сигма"

77000

0,45±0,01 9,2

стойчиз при - 30 мин.

I.

65

отсутствует отсутствует отсутствует полное

не осаждается

необратимое гомогенен микрогетерогенен

Специфические антилактоферриновыо и антицерулоплазминовые сыворотки получали путем многократной иммунизации кроликов очищенными препаратами ЛФ и ЦП ("ЦП жидкий человеческий" производства СПбНИИЭМ им.Пастера) с использованием обычных схем. Суммарная доза по белку на одного животного составляла 15 и 160 мг соответственно.

Дня получения специфических антител против плазменной СОД очищенные препараты вводили на 1-8 дни внутримышечно в область ■

подколенных лимфоузлов задних лап в смеси с адьювантом Фрейнда (1:1) в дозе 0,2 мг/мл (0,5 мл р-ра СОД в 0,08 моль/литр Kaci ). На 15-й день у кроликов последовательно, в течение 12,5 мин., облучали область вилочковой железа и паховых лимфоузлов на рентгеновской установке РУМ-17 (фильтры - 2мм cu + I мм ai ; тубус - кожно-фокусное расстояние 50 см, поле облучения -10x15 см; мощность дозы при напряжении 200 кВ, силе тока 10 мА составляла 0,2 Грёй/20 рад на каждое поле в течение I мин.). Стимулирующая доза зависела от массы животного и достигала в среднем 5 Грей (0,2 Грей • 12,5 мин. = 2,5 Грей на каждое поле) для каждого кролика. На 21-45 дни вводили по 0,25 мг/мл СОД (I мл р-ра СОД в 0,08 моль/литр Haci ) внутривенно. Реиммуни-зацию проводили шестикратно в конъюктиву глаза с интервалом между инъекциями 4-5 дней в дозе 2 мг/мл. Общее количество введенного белка дост^игалб до 15 мг.

Специфичность и активность сывороток против металлопротеи-дов оценивали методом двойной радиальной иммунодиффузии в агаровом геле /Бем Э., 1987/. Титры антилактоферриновых, антисупер-оксиддисмутазных антител составляли 1:8, 1:16; антшерулоплазми-новых - 1:64.

Для повышения титра антител против ЛФ и плазменной СОД избыточный объем выделенных иммуноглобулинов многократно пропускали через колонку с иммуносорбентом ( Вгсн - сефарозой), уравновешенным 0,02 М натрийфосфатньм буфером рН 7,2 в присутствии 0,05 М

к»С1 . Иммуносорбент получали по известной методике /Янкина Н.$., Ванеева Л.И., 1985/. В качестве лиганта специфического сорбента/ использовали очищенные препараты ЛФ и СОД. Титры антилактоферриновых и антисупероксиддисмутазных антител существенно возрастали и составляли 1:32, 1:64. Сравнительный анализ специфичности иммуноглобулинов, выделенных хроматографией на конъюгированной с вгсм - сефарозой СОД, представлен в таблице 6.

В ходе дальнейших исследований были получены конъюгаты пер-оксидазы и антител против ЛФ, ЦП и СОД плазмы, разработаны методы твердофазного иммуноферментного анализа для количественного определения этих металлопротеидов на основе "сэндвич" -модификации и показана возможность их практического применения.

Параллельно у части беременных женщин изучали ИК в грудном молоке (авт.свид-во № I68I26I, 1991).

Таблица б.

Сравнительный анализ специфичности СОД плазмы и СОД эритроцитов.

Концентрация А н т и г е н

иммуноглобули- Плазменная СОД Эритроцитарная С0Дх

нов, мкг на I мл геля разведение антигена диаметр колец преципитации ,мм разведение антигена диаметр колец преципитации, мм

16,0 1:50 7,5 1:50 -

1:100 6,5 1:100 -

1:500 4,5 1:500 -

50,0 1:50 11,0 1:50 -

1:100 8,0 1:100 -

1:500 5,0 1:500 -

х - очищенный препарат эритроцитарной СОД (Ереван, СССР) : - прочерк - кольиа отсутствуют._

Грудное молоко (1,5-2,0 мл) центрифугировали при 4000 е в течение 30 мин., удаляли жировую пленку и к 1,0 мл надосадочной жидкости добавляли 2% раствор уксусной кислоты в соотношении 1:1. Полученную смесь выдерживали 2 часа при 37°С, а затем центрифугировали при 8000 в в течение часа. К надосадочной жидкости (0,5 мл) добавляли равное количество 2% раствора ПЭГ-6000. В качестве контроля использовали пробы с добавлением в нИх 0,5 мл раствора хлорида натрия. После перемешивания пробы инкубировали при 4°С в течение 2 часов (можно на ночь) и центрифугировали при 4000 г в течение 30 мин. Фотоколориметрирование проводили на спектрофотометре (СФ-26) при длине волны 380 нм в кювете с длиной оптического пути I см. Полученный результат выражали в условных единицах экстинции (разницу исследуемой и контрольной проб умножали на 1000 и получали количество ИК в 100 мл грудного молока).

31

выводы

1. Высокая концентрация и высокая активность плазменной супероксидцисмутазы в пуповинной крови здоровых новорожденных детей по сравнению с их величинами в крови детей первой недели жизни, здоровых матерей и взрослых доноров являются показателями интенсификации свободно-радикальных процессов, анализ которых представляет большие информативные возможности для оценки состояния ферментативной антиоксидантной системы в организме новорожденного ребенка.

2. Низкие уровни содержания металлопротеадов - трансферри-на, лактоферрина, плазменной супероксидцисмутазы - в пуповинной крови новорожденных детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию, свидетельствуют о недостаточной активности ферментативной антиоксидантной системы, что предрасполагает к черезмерной активации перикисного окисления липидов.

Одновременно у этих детей выявлено статистически достоверное повышение концентрации церулоплазмина, что можно рассматривать как компенсаторную реакцию в ответ на длительную кислородную недостаточность.

3. Изучение комплекса ыегаллопротеицов в сыворотке крови матерей с гестозом беременности способствует повышению диагностической точности выявления внутриутробного гипоксического состояния плода, особенно при малосимптомном течении гестоза беременных.

4. Содержание кзталлосвязывающих белков церулоплазмина и трансферрина в сыворотке крови достоверно вше у больных псевдотуберкулезом я инфекционным мононуклеозом детей по сравнению со здоровыми. Максимальные концентрации церулоплазмина отмечаются при тяжелых формах псевдотуберкулеза и инфекционного мононуклеоза.

5. Динамика изменения уровней металлопротеидов сходна при изученных заболеваниях - псевдотуберкулезе и инфекционном моно-нуклеозе: содержание церулоплазмина достигает максимума в начале болезни, а трансферрина постепенно возрастает в ходе заболевания. Однако для инфекционного мононуклеоза характерны достоверно более высокие концентрации ыеталлосодержащих белков, что может использоваться как вспомогательный тест ранней дифференциальной диагностики исследованных инфекций.

6. При сравнительном изучении псевдотуберкулеза и инфекционного мононуклеоза установлено достоверно более высокое содержание

иммуноглобулинов М, 0- , А и циркулирующих иммунных комплексов у детей, больных инфекционным мононуклеозом.

7. Выявлены корреляции между изменениями содержания металло- ¡> протеидов церулоплазмина и трансферрина, а также взаимосвязь ! медьсодержащего белка с другими изученнными факторами, в частности с СЗ и СЗа компонентами комплемента, иммуноглобулинами М, 0- , А лейкоцитами, СОЭ, свидетельствующие об активном участии металло-содержащих белков в течение псевдотуберкулеза и инфекционного мононуклеоза.

8. Разработана методическая база для изучения комплекса металлопротеидов в биологических средах. Предложены новые способы выделения и очистки лактоферрина и плазменной супероксиддисмута-за. Изучены свойства выделенных белков, проведен сравнительный анализ. Получены сыворотки против лактоферрина, церулоплазмина, впервые против плазменной супероксиддисмутазы. Созданы высокочувствительные тест-системы для иммуноферментного анализа металлосвязывающих белков. Доказана принципиальная возможность применения разработанных тест-систем в лабораторном исследовании лактоферрина, церулоплазмина, плазменной супероксиддисмутазы в норме и при патологических состояниях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. В качестве дополнительных методов диагностики перинатальных гипоксий рекомендуется использовать определение:

- содержания и активности плазменной супероксиддисмутазы

в пуповинной крови как дополнительный дифференциальный тест между острой и хронической гипоксией;

- снижения концентрации и активности плазменной супероксиддисмутазы как доказательство перенесенной хронической внутриутробной гипоксии;

- повышения уровня церулоплазмина как вспомогательный тест для прогнозирования хронизации процесса и постгипоксических осложнений.

2. С целью совершенствования диагностики псевдотуберкулеза

и инфекционного мононуклеоза рекомендуется использовать определение:

- содержание церулоплазмина и трансферрина в сыворотке крови больных детей как вспомогательный дифференциальный тест между

бактериальной и вирусной инфекциями;

- повышения концентрации церулоплазмина и трансферрина в сыворотке крови больных детей как одного из показателей остроты воспалительного процесса и оценки тяжести заболевания.

3. Разработанные методы иммуноферментного анализа лактоферри-на, церулоплазмина, плазменной супероксиддисмутазы могут использоваться для исследования данных металлопротеидов в биологических средах организма как в норме, так и при различных патологических состояниях.

4. Предложенные методы очистки плазменной супероксиддисмутазы и лактоферрина могут быть внедрены в лабораторную практику

с целью получения диагностических препаратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Определение трансферрина и лактоферрина как показателей неспецифической резистентности к инфекции.// Сб.науч.трудов: "Иммунологические исследования в клинике и эксперименте". - Л., ЛШИ, 1984 - С.36-40.

2. Клинико-бактериологические и иммунологические показатели при гнойно-септических заболеваниях и внутриутробной инфекции у недоношенных детей первых месяцев жизни.//Педиатрия. - 1985 - №12. - С.19-23 (соавт.Калиничева В.И., Мацко Г.Ф., Яковлев A.M., Касаткина Т.Н. и др.).

3. Иммунологическая характеристика грудного молока женщин, родивших преждевременно. //Тез.докл.Л1 Всерос.съезда детских врачей. - Иваново, 1987 - Т.2. - C.I86-I87 (соавт.Калиничева В.И., Яковлев A.M., Мацко Г.Ф., Степанова Э.А. и др.К

4. Значение количественного определения лактоферрина в молоке женщин, родивших преждевременно. // Тез.докл.П съезда гигиенист., микробиол., эпидемиол. и паразитол. Молд.ССР -Кишинев, 1987. - Ч.2.- С.65-66 (соавт.Толмазова Т.В, Яковлев A.M.)

5. Роль железо- и медьсвязывающих белков в резистентности к инфекции (обзор). //Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол.-1982-№ Ю - С.75-79 (соавт.Яковлев A.M., Толмазова Т.В.).

6. Выделение супероксиддисмутазы из плазмы крови. - Л., 1989 - Пс. - Рукрпись деп.в ВИНИТИ № 7043 - В89 (соавт.Дубинина Е.Е., Дробот И.В.).

7. Получение антител против плазменной супероксиддисмутазы. Л., 1989. - 9с. - Рукопись деп.в ВИНИТИ № 6I22-B89 (соавт.Дубинина Е.Е., Яковлев A.M., Толмазова Т.В., Дробот И.В,).

8. Содержание иммуноглобулинов при инфекционном мононуклеозе и псевдотуберкулезе у детей.//Тез.докл.X Всесогаз.науч. конф.: "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" - Челябинск, 1990.-С.45-46 (Дробот И.В., Яковлев A.M.).

9. Иммуноферментный анализ перулоплазмина. //Журн.микрЪбиол., эпицемиол.и иммунол.-1991-Г»7 - С.66-69 (соавт.Дробот И.В.).

10. Изучение факторов неспецифической резистентности при инфекционном мононуклеозе и псевдотуберкулезе.//Сб.науч.трудов: "Современные вопросы иммунологии и методологии изучения заболеваемости детей".-Л., ПМИ, 1991.- С.72-74 (ооавт.Дробот И.В., Яковлев A.M.).

11. Металлопротеиды сыворотки крови детей, больных инфекционным мононуклеозом и псевдотуберкулезом.//Тез.докл.У1 Всерос. съезда микробиол.,эпидемиол. и паразитол.- Нижний Новгород,1991-T.I.- С.76-77 (соавт.Дробот И.В., Яковлев A.M.).

12. Показатели неспецифической резистентности, иммунитета и микрофлоры грудного молока женщин; родивших преждевременно в зависимости от способов его хранения.//Тез.доклЛ съезда аллергол. и иммунол.Чувашской ССР.-Чебоксары, 1991. -С.13-14 (соавт. ¡(алиничева В.И., Манко Г.Ф., Булатова E..V1., Степанова Э.А. и др.)

13. Металлосвязнваюдие белки как показатели неспецифической резистентности в сыворотке крови недоношенных детей первых недель жизни.//Тез.доклЛ съезда аллергол. и иммунол.Чувашской ССР.-Чпбоксары, I391.-С.37-38 (соэзт.Манко Г.Ф., Первунина И.А., Дробот И.В., Зверева К. д.).

14. Кеталлосвя^раюдие белки сыворотки крови детей, больных инфекционн™ мононуклеозом и псевцотубер*улезом.//Тез.докл.

I съезда аллергол.и иммунол. Чувашской ССР,- Чебоксары, 1991,-C.II-T2 (соавт.Дробот И.В.,Яковлев A.M.).

15. Использование реаферона цля лечения больных простым герпесом. //Сб.науч.трудов: "Интерферон-92"-М.,НШЭМ.-19Э2.-С.250--256 (соавт.Исаков В.А., Рахманова А.Г., Пригсжина В.К..Ермоленко Д.КЛ

16. Применение реаферона в комплексной терапии инфицированных ВИЧ.//Сб.науч.трудов: "Интерферон-92"-М.,НИИЭМ.-1992.-С.51-58 (соавт.Рахманова А.Г., Исаков В.А., Киселев О.И., Степанова Е.В.1.

17. Выделение и свойства супероксиддисмутазы плазмы крови человека.//Биохимия.- I992.-T.58,' выл Л2.-С.1892-1901 (соавт. Дубинина Е.Е., Бабенко Г.А., Исаков В.А.1.

IS. The results of application of lmnmomodulator In the treatment of HIV-infeotlon. //She IT-^th International Congress of Chemotherapy.-Berlin« I99I»-N 1553 (Eakhananova A. G., Iaakov 7. A., SchuloY TU. П.).

19. Characteristic of superoxide dismatase of human hlood plasma. //Free Radio. Biol, and Med.-I990.-I, Suppl.-P.i30.

20. Advanoe In Treatment of patients with herpes simpler. //The International Congress on the Management of Infection (lad) .-Amsterdam, I992.-IJ FOI3 (Isafajv У. A., Eroolenko D. K., Kanyahentsev N. T., Bryaizlkova T. S. et el.}.

21. Prospecta of iimmnorehaMlitatlon In patients vith herpes simpler. //The First International Conference on Immonorehahilitation.-Soohi-Iagoniys, I992.-P.II5-II6 (Isakor 7. A., Ennolenio I. K., Bryazzikova T. S., Klngo Z.J.

22. Иммунобиологические особенности молока женщин при преждевременных родах.//В кн.: "Естественное вскармливание детей", /под ред.Воронцова И.М., Фатеевой Е.М., Хазенсон Л.Б.-СПб, ППМИ, 1993.-СЛ28-134 (соавт.Калиничева В.И., ,'Лацко Г.Ф., Булатова Е.М., Яковлев A.M. и др.).