Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Ксимедон и верапамил в коррекции коагуляционно-литического потенциала крови при эндотоксикозе

Ни правах рукописи

СЕРНОВА Галина Витальевна

КСИМЕДОН И ВЕРАПАМИЛ В КОРРЕКЦИИ КОАГУЛЯЦИОННО-ЛИТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА КРОВИ ПРИ ЭНДОТОКСИКОЗЕ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Купавна - 2007

003054427

Работа выполнена на кафедре факультетской хирургии медицинского факультета Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Власов Алексей Петрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Балашов Владимир Павлович; доктор биологических наук, профессор Сергеева Светлана Александровна

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится "27" февраля 2007 г. в 10:30 часов на заседании диссертационного совета Д 217.004.0 Г при Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ по адресу: 142450, Московская область, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ.

Автореферат разослан "_"_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Корольченко Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Актуальность проблемы острого панкреатита обусловлена ее социально-экономическим и медицинским аспектами, что связано с высокой заболеваемостью, продолжительностью лечения, высоким уровнем послеоперационной летальности при деструктивных формах панкреатита. Тромбогеморраги-ческие осложнения по праву относят к одним из самых грозных спутников острого панкреатита, в патогенезе которых большую роль играет тромбоцитарный компонент гемостаза (Мачабели М.С.,1962-1992). В результате проникновения в кровь панкреатических ферментов, токсических полипептидов, биогенных аминов и других продуктов ферментной аутоагрессии, а также благодаря активированию калликреин-кининовой, плазминовой и тромбиновой систем крови происходят значительные изменения в ее химическом составе обусловливающие нарушения тромбоцитарного звена гемостаза. Важную роль в патогенезе острого панкреатита отводят свободнорадикальным процессам перекисного окисления липи-дов, участвующим в активации системы гемостаза (Звяговская И.Н.,1991; Мачабели М.С.,1991; Аксенова С.В.,1996). Прогрессирование процессов перекисного окисления липидов приводят к нарушениям липидного метаболизма и, как следствие к мембранодеструктивным явлениям, в том числе и в тромбоцитах. Кроме того, пероксидация липидов приводит к нарушению процессов нормального функционирования "калий-натриевого насоса" и поступлению в клетки кальция, что способствует повышению коагуляционного потенциала самой клетки, активации фосфолипаз, повышению проницаемости клеточных мембран. Комплекс биохимических изменений в составе липидов тромбоцитарных мембран лежит в основе роста агрегационной активности тромбоцитов (Андреенко Г.В., Суворова Л.А., 1986; Гуревич B.C. и др., 1992).

Таким образом, очевидной представляется актуальность коррекции функциональной активности кровяных пластинок путем воздействия на основные звенья патогенеза тромбоцитарной дисфункции, как одной из причин гемостатиче-ских расстройств при остром панкреатите.

Цель работы. Изучение влияния антиоксиданта ксимедона, блокатора кальциевых каналов верапамила и их комбинации на функциональную активность, липидный метаболизм тромбоцитов и состояние гуморального компонента системы гемостаза при остром панкреатите.

Задачи:

1. Исследовать на модели острого панкреатита некоторые функциональные параметры и липидный метаболизм тромбоцитов, а также коагуляционполитический потенциал крови.

2. Определить эффекты влияния ксимедона, верапамнла и комбинации данных препаратов на функциональные изменения исследованных форменных элементов крови при остром панкреатите.

3. Установить при остром панкреатите воздействие изучаемых лекарствен-

ных средств на качественный и количественный липидный состав, интенсивность перекисного окисления липидов и активность мембранных фосфолипаз тромбоцитов.

4. Изучить влияние комбинированной терапии на гуморальный компонент системы гемостаза

5. Определить корреляционную зависимость между эффектами препаратов на функциональную активность кровяных пластинок и их липидный метаболизм.

Научная новизна

Исследования показали, что на фоне острого экспериментального панкреатита снижения времени агрегации и увеличения скорости и степени агрегации свидетельствует о росте агрегационной активности тромбоцитов при данной патологии, что сопровождается нарушениями липидного метаболизма кровяных пластинок и основных процессов его регулирующих. Данные изменения клеточного звена системы гемостаза сопряжены с повышением коагуляционного потенциала плазмы крови.

Установлено, что ксимедон способствует восстановлению функциональной активности тромбоцитов уже после третьей инъекции препарата. На фоне его применения отмечается достоверное уменьшение скорости и степени агрегации тромбоцитов при удлинении времени агрегации относительно контроля. Данный положительный эффект тесно коррелирует с восстановлением липидного состава мембран тромбоцитов.

Выявлено восстановление агрегационной способности тромбоцитов на фоне применения верапамила, хотя положительный эффект препарата менее выражен по сравнению с ксимедонотерапией. Коррекция липидного метаболизма при использовании верапамила в лечении острого панкреатита проявлялась слабее относительно таковой на фоне применения ксимедона.

Показано, что включение комбинации ксимедона и верапамила в терапию острого панкреатита способствует наиболее выраженной модуляции функциональной активности тромбоцитов в виде снижения степени и скорости агрегации и роста времени агрегации относительно контроля, сопряженной с более быстрой коррекцией липидного состава кровяных пластинок, что отмечается уже с первых суток терапии. Восстановление агрегационной активности тромбоцитов на фоне комбинированной терапии сопровождается уменьшением расстройств гуморального компонента системы гемостаза.

Проведенные исследования подтвердили патогенетическую обоснованность эффекта комбинированной терапии. Снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов и активности фосфолипазы А2 обусловлено антиок-сидантным и фосфолипазодепрессивным действием ксимедона и способностью верапамила блокировать кальциевые каналы, предотвращая поступление кальция в клетку, что обеспечивает высокий суммарный липид регулирующий эффект препаратов, корреляционно связанный с коррекцией функциональной активности тромбоцитов крови.

Положения, выносимые на защиту

1. Модуляция агрегационной активности тромбоцитов при остром панкреатите сопровождается дислипидными дестабилизациями мембран кровяных пластинок на фоне интенсификации в них свободнорадикальных процессов пере-кисного окисления липидов и активизации фосфолипазы А2 и протекает на фоне повышения коагуляционного потенциала плазмы крови.

Применение исследуемых препаратов способствует восстановлению функциональной активности тромбоцитов, что тесно коррелирует с нормализацией липидного метаболизма форменных элементов крови и восстановлением процессов его регулирующих. Максимальным положительным эффектом обладала комбинированная терапия с антиоксидантом ксимедоном и блокатором кальциевых каналов верапамилом. Восстановление агрегационной активности тромбоцитов на фоне комбинированной терапии сопровождается уменьшением расстройств гуморального компонента системы гемостаза.

Высокий суммарный липид регулирующий эффект комбинированной терапии в коррекции функциональной активности тромбоцитов крови обусловлен снижением интенсивности процессов перекисного окисления липидов, активности фосфолипазы А2 и блокадой поступление кальция в клетку.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Апробацпя работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на XY Научных чтениях памяти H.H. Бурденко «Актуальные вопросы современной клинической медицины» (Пенза, 2006), Первом Сибирском съезде фармакологов (Барнаул, 2006), XII Российской гастроэнтерологической неделе (М., 2006), VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (М., 2006), на Огаревских чтениях - научно-практической конференции Мордовского университета (Саранск, 2006).

Объем п структура диссертации. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), материалов и методов исследования (2-я глава), результатов собственных исследований (3-я, 4-я, 5-я, 6-я главы), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 265 отечественных и иностранных источников. Работа содержит 22 таблицы и 45 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач были проведены хронические опыты на 48 взрослых беспородных половозрелых собаках обоего пола массой от 6,6 до 10,4 кг, разделенных на следующие группы.

Первая группа (п=12): собакам моделировали острый панкреатит и в динамике заболевания исследовали состав липидов, ПОЛ, активность фосфолипазы А2, активность каталазы и некоторые показатели функционального состояния тромбоцитов.

Вторая группа (п=12): при остром панкреатите исследовали влияние ксиме-

дона (30 мг/кг) на указанные компоненты гомеостаза и функционального состояния тромбоцитов.

Третья группа (п=12): на указанной модели оценивали влияние верапамила (1,5 мг/кг) на исследуемые показатели гомеостаза и функционального состояния тромбоцитов.

Четвертая группа (п=12): при остром экспериментальном панкреатите изучали влияние комбинированной терапии ксимедоном и верапамилом (в тех же дозах) на показатели гомеостаза и агрегационной активности тромбоцитов.

Панкреатит моделировали по способу В.М. Буянова с соавт. (1989) следующим образом. Взрослым беспородным собакам выполняли срединную лапа-ротомию, пунктировали желчный пузырь, забирали желчь с последующим лиги-рованием места пункции. Затем желчь вводили в паренхиму вертикальной части поджелудочной железы по 0,6 мл в 5 точек. Таким образом, воспроизводили медленно прогрессирующую форму течения острого экспериментального панкреатита. Все экспериментальные исследования проводились под внутривенным наркозом, используя тиопентал-натрия из расчета 0,04 г/кг массы животного. В контрольные сроки (1, 3, 5 суток) животным осуществляли забор крови.

В послеоперационном периоде животным проводили инфузионную терапию (внутривенные введения 5% раствора глюкозы и 0,89% раствора хлорида натрия из расчета 50 мл/кг массы животного)

В опытных группах животных в комплексную терапию включали ксимедон и/или верапамил. Во второй группе животным в раннем послеоперационном периоде ежедневно производились внутривенные введения 10% раствора ксимедо-на из расчета 30 мг/кг массы тела; в третьей - введения 0,25% раствора верапамила из расчета 1,5 мг/кг массы тела животного; в четвертой - введения обоих лекарственных препаратов в тех же дозах.

Методы исследования:

Исследование агрегационной активности тромбоцитов. Для определения агрегации обогащенную тромбоцитами плазму разбавляли при необходимости аутологичной плазмой, лишенной тромбоцитов до концентрации 200000 тром-боцитов/мкл. Подсчет тромбоцитов проводили с помощью камеры Горяева по общепринятой методике. В качестве индукторов агрегации использовали адено-зиндифосфорную кислоту (АДФ), конечная концентрация которой в кювете аг-регометра составляла соответственно 20 мкМ. Агрегацию тромбоцитов регистрировали оптическим методом с помощью двулучевого агрегометра THROMLITE 1006 производства СП "БиоХимМак", Москва с подключенным самописцем.

Липиды из тромбоцитов экстрагировали хлороформметаноловой смесью (Хиггинс Дж.А., 1990).

Хроматографическое разделение липидов (тонкослойная хроматография). Липиды фракционировали методом тонкослойной хроматографии на силикагеле-вых пластинах. Полярные фосфолипиды разделяли на пластинах фирмы Merk на стеклянной основе, нейтральные липиды фракционировали на силикагелевых пластинах для обращенно-фазной тонкослойной хроматографии (Хиггинс Дж. А.,

1990; Vaskovsky V.E. et al., 1975).

Количественное определение липидов. Молекулярный анализ проводили на денситометре Model GS-670 (BIO-RAD, США) с соответствующим программным обеспечением (Phosphor Analyst/PS Sowtware).

Определение диеновых и триеновых конъюгатов. Спектрофотометрический метод определения продуктов ПОЛ основан на том, что диеновые коньюгаты обладают характерным поглощением при длине волны 232-233 нм, триеновые коньюгаты имеют максимум поглощения при длине волны 275 нм (Ганстон Ф.Д., 1986).

Содержание малонового диальдегида оценивали в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Для определения антиокислительной активности липидов предварительно проводили индукцию липопереокисления раствором сульфата железа в концентрации 5 мкмоль в течение часа.

Активность каталазы определяли фотометрическим методом, основанным на способности перекисей образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине 410 нм. Активность каталазы выражали в мг Н^ОУмин/г белка.

Определение активности фосфолипазы А2. Активность фосфолипазы А2 оценивали в среде, содержащей 10 ммоль трис-НСЬ-буфер (pH 8,0), 150 ммоль тритон Х-100, 10 ммоль СаС12 и субстрат (1,2 ммоль). В качестве субстрата использовали фосфатидилхолины яичного желтка. Регистрацию каталитической деятельности фермента проводили титрометрическим методом по мере образования свободных жирных кислот. Расчет проводили по калибровочной кривой, построенной по пальмитиновой кислоте и выражали в мкмоль/с/г белка (Трофимов В.А., 1999).

Для оценки состояния гемостаза применялись методики, позволяющие оценить как общую коагуляционную способность крови, так и отдельные звенья свертывающей системы кров: время спонтанного свертывания крови по R.J. Lee и P.D. White (1913); время рекальцификации обычной плазмы - по Bergerhof и Roka (1954); толерантность плазмы к гепарину - по Poller в модификации В.П. Балуды (1954); каолиновое время свертывания плазмы, богатой тромбоцитами, -по P.G.J.Hattersley (1966); протромбиновое время плазмы - по A.J. Quick (1966); тромбиновое время - по R.M. Biggs и R.G. Macfarlane (1962); концентрация фибриногена - по P.A. Рутберг (1961); уровень антитромбина III - по n A. Hense и Е.А. Loelige в модификации K.M. Бишевского (1963); фибринолитическую активность крови - по Н. Kowarzyk, L. Buluck (1954); естественный лизис кровяного сгустка - по М.А. Котовщиковой и Б.И. Кузнику (1962); продукты деградации фибриногена и фибрина (ПДФ) в плазме - по N. Guest.

Полученные цифровые данные обрабатывали методом вариационной статистики, с использованием критерия t Стьюдента. Вычисления производили на CPU 1600 MHz "Intel Pentiuin-IV" с помощью пакета программ Microsoft Office ХР. Использован текстовый процессор Microsoft Word 2000. Динамика показателей отражена на графиках, построенных с использованием программы электронных таблиц Microsoft Excel 2000.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования показали, что при моделировании острого панкреатита функциональная активность тромбоцитов подвергается значительным модификациям, что, вероятно, связано с поступлением в кровоток большого количества тромбо-генпых субстанций из очага воспаления (Баркаган З.С., 1988; Дмитриев В,В.. (Wf). Возрастание агрегацирнноЙ способности тромбоцитов отмечалось в виде увеличения скорости и степени агрегации на 136,36 334.09 и 31.91- 66,70 % (р<0,05) соответственно, а также укорочения времени агрегации кровяных пластинок на 30,01 - 38.26 % (р<0.05) относительно исходных показателей (рис.1). Изменения тромбоцитарной активности согласно литературным данным могли выступать одними из факторов запуска каскада гемостатических реакций. Приводящих, в конечном итоге, к ги пер коагуляции, ми кротромбо образованию, нарушению питания тканей и прогрессищванию пат ологического процесса (Бышевский A.III.. 1994: Jennings P.E. et al.. 1991).

Нарушение |грегационной активности тромбоцитов сопровождается расстройством гуморального эвена системы гемостаза;

500 1 400

зоо 200 100 о

гл

□ норма

□ 1 сутки

03

степень агрегации

скорость агрегации

Рнс.1. Функциональная актвность тромбоцитов при остром панкреатите. Примечание: изменении все* покаиШей достоверны по oi ношению к исходу при р<0,05.

Экспериментально установлено, что повышение агрегационной активности тромбоцитов тесно коррелировало с патологическими изменениями липидного состава биомембран тромбоцитов, что доказывает значимость нарушений липидного обмена кровяных пластинок в патогенезе их функциональных расстройств (табл. I).

Данный факт находит свое подтверждение и в работах Андреенко Г.В.. Суворовой Л.А, (1986), Гуревич В.С. и лр. (1992), где отмечается, что активация тромбоцитов различными агоппстамн приводит к изменениям в фосфолипидном составе плазматических мембран и к перераспределению липидов. Так, при стимуляции АДФ и адреналином повышение концентрации холестерина и соответствующее увеличение микровязкости биомембран являются причиной агрегаций тромбоцитов.

Таблица 1

Корреляционная зависимость между нарушениями функциональной активности, липидным метаболизмом и интенсивностью

Показатели Степень ! Скорость агрегации I агрегации Время агрегации

Суммарные фосфолипиды 0,98 0,96 0,91

Свободные жирные кислоты 0,97 0,95 0,89

Эфиры холестерола 0,99 0,98 0,94

Лизофосфатидилхолин 0,97 0,95 0,90

Фосфатидилсерин 0,98 0,96 0,91

Фосфатидилинозит 0,93 0,90 0,83

Малоновый диатьдегид 1,00 0,99 0,97

Активность фосфолипазы А2 0,99 0,98 0,94

Примечание: жирныи шрифт - достоверная корреляционная связь для п=!2

Исследования показали, что на фоне острого экспериментального панкреатита содержание суммарных фосфолипидов в тромбоцитах достоверно падало на всех этапах динамического наблюдения. Данный показатель был ниже нормы на 14,73 - 22,37 % (р<0,05), свидетельствуя о прогрессировании мембранодестаби-лизирующих процессов, что подтверждается ростом удельного веса фракции свободных жирных кислот на 51,94 - 73,06 % (р<0,05). Накопление большого количества свободных жирных кислот способствовало превращению мембранных фосфолипидов в лизофосфолипиды, количество которых увеличилось на 292,08 -413,86 % (р<0,05) (рис.2).

600 500 400 300 200 100

норма

исход

5 сутки

10 сутки

Рис. 2. Динамика уровня лизофофатидилхолина тромбоцитов при остром панкреатите. Примечание: изменения достоверны по отношению к норме при р<0,05.

Показатель фосфат и Дй л ШШ олам ЙЩ превосходил норм} на 15.79 - 16.14 % <рЧ).05). ¿1 содержание фосфатидилшюзи >а и фос фа тил ил сери на снижалось на 21.79 30.88 и 26.38 39.06 % (р- 0.05) соответственно, что, вероятно, обусловлено наличием в организме путей взаимопревращений отдельных фоефолигш.тов. целесообразность которых, очевидно, связана с необходимостью обеспечения тканей в нужный момент требуемыми фос фолили да,«и (Климов А.Н,, Нихульчева Н.Г., 1999).

□ норма

□ 1 сутки

□ 3 сутки

□ 5 сутки

рис. 3. t 'оста в .......цок тромбоцитов при остром панкреатите. Примечание:

- достоверность по о i но шин ню к* норме при р <(1,115.

Увеличение концентрации эфиров холестерола в тромбоцитах на фоне острого панкреатита на 20.47 35.35 % (р<0,05) по сравнению с исходом, вероятно, обусловлено усиленной эстерификацией холестерола свободными жирными кислотами, который также возрастал на протяжении эксперимента на 16.04 - 28,68 % (р<0,05) относительно нормы. По данный Гуревич B.C. и др. (1992) изменения в концентрации холестерина и жесткости мембран кровяных пластинок обусловливает различия в агрегационной активности тромбоцитов (рис.3).

Липидные дестабилизации тромбоцитарных мембран на фоне дисфункции кровяных пластинок в очередной раз подтверждают тот факт, что липиды модулируют активность тромбоцитов в широких пределах, изменяя величину заряда и адсорбционную способность поверхности тромбоцитов по отношению к ионам кальция, вследствие чего повышается порог чувствительности тромбоцитов к действию агрегирующих факторов (Ишанходжаев Т.ML, 1990). Предполагают, что возрастание уровня л изофос фатиди лхо л и нов, уменьшение содержания суммарных фосфолипидов в тромбоцитах связано, по-видимому, с повышением активности фосфолипазы А2 и пере кис но го окисления лигшдов.

Действительно, в изменений структурной организации мембран тромбешп-тов важная роль отводится гиперпероксидации (Алмазов В.А. и др., 1992), что в данном исследовании подтверждается наличием достоверной корреляционной связи между нарушениями функциональной активности тромбоцитов, диелнпид-ными изменениями их мембран и интенсификацией ПОЛ и ферментативной активности кровяных пластинок. Так. уровни первичных и вторичных продуктов

К)

ПОЛ существенно возрастали на протяжении всего периода наблюдения. Гак. содержание диеновьк конъюгатов превышало нормальны! показатели на 29.17 100,00 %(р<0.05) (рис.4).

В!

_

дк

тк

□ норма

□ 1 сутки

□ 3 сутки

□ Б сутки

Рис. 4. Показатели ............. продуктов перекисного окисления лнпндов громкий гов нЛ фоне острою панкреатита. Примечание: изменения пее\ показателей лосю верны по отношению к исхо ду.

Показатель триеновых конъюгатов в тромбоцитах возрастал 70.59 - ! 41.18 % (р<0,05) по сравнению с нормальными цифрами. Уровни малонового диальде-гида и индуцированного МДА увеличивались на 60.45 116,95 и 50,83 - 80,86 % (р<0,05) соответственно относительно исхода (рис. 5).

% 250

200 150 100 50 0

МДА

Ре-МДА

□ норма £31 сутки ОЗ сутки О 5 сутки

Рис. 5. Показатели вторичных продуктов перекИСнию окисления лнпндов тромбоцитов на фоне острого панкреатита. Примечание: изменения всех показдтелей достоверны по отношен и к] к и моду.

Считается, что основными причинами нарушений нативной структуры мембраны клетки, вызванных свободными радикалами липидной природы, выступают изменения динамических свойств биомембран и увеличение ионов кальция, которым отводится ведущая роль в акгивашш тромбоцитов. В тромбоцитах человека АДФ вызывает изменение кальциевой проницаемости плазмати-

ческой мембраны, способствуя быстрому поступлению ионов кальция из внешней среды через кальций-зависимые каналы (Sage S.O. et al., 1990; Mahaut-Smith M.P. et al., 1992). Кроме того, активизируется высвобождение кальция из внутриклеточных депо (Berridge M.J., 1987). Повышение уровня цитозольного кальция (Власов А.П. и др., 2000), генерация активных форм кислорода и усиление процессов перекисного окисления липидов ведут к активации процесса фосфолипо-лиза (Лукк М.В., 1999). Фосфолипаза А2, Са-зависимым фермент, катализирует высвобождение жирных кислот (в основном арахидоновой) из фосфолипидов, локализуясь в различных участках клеточных мембран, и участвует в передаче гормональных сигналов в клетку (Сергеев П.В. и др., 2000; Hess M.L. et al., 1981; Muller-Reddinghaus R., 1987). В ходе данной серии экспериментов была выявлена значительная интенсификация активности фосфолипазы А2 в тромбоцитах на фоне острого панкреатита, когда показатель активности данного энзима превосходил норму на 117,91 - 206,08 % (р<0,05), что могло способствовать ускоренному образованию циклических эндоперекисей и тромбоксана А2 и, следовательно, повышению активности тромбоцитов (Бышевский А.Ш., 1994) и возрастанию возможности повышенного тромбообразования (Jennings P.E. et al., 1991). На фоне интенсификации свободнорадикальных процессов и фосфолипазы А2 активность каталазы, как одного из антиоксидантных ферментов, снижалась на 53,43 % (р<0,05) относительно нормы.

Таким образом, полученные результаты подтверждают важную роль процессов перекисного окисления липидов в активации системы гемостаза (Звягов-ская И.Н.,1991; Мачабели М.С.,1991; Аксенова C.B., 1996). При повреждении клеточных мембран тромбоцитов высокотоксичными продуктами ПОЛ обнажаются слои фосфолипидов, которые являются матрицей для запуска каскада ферментативных реакций процесса свертывания (Мамот А.П., Бишевский K.M., 1991; Kawai Y., Handa M., 1989) (рис.6).

Исследования показали, что применение традиционной терапии не способствует достаточной коррекции возникших расстройств функционального состояния и нарушений липидного метаболизма тромбоцитов, на ее фоне большинство патологических изменений изучаемых показателей продолжало прогрессировать, что свидетельствует о необходимости включения в терапию острого панкреатита препаратов, способных корригировать нарушения липидного гомеостаза, способствуя восстановлению функциональной активности тромбоцитов.

Рис. 6. Схема функциональных нарушений тромбоцитов при остром панкреатите

В первой опытной группе с целью коррекции возникших нарушений был использован ксимедон. Экспериментально установлено, что применение данного препарата в терапии острого панкреатита способствовало снижению коагуляци-онного потенциала крови за счет уменьшения агрегационной способности тромбоцитов. Так, степень агрегации тромбоцитов снижалась на 18,77 % (р<0,05) по сравнению с контролем, но была выше исхода на 33,18 - 41,64 % (р<0,05). Скорость агрегации падала по сравнению с контролем на 23,21 - 36,31 % (р<0,05), превосходя норму на 107,58 - 233,33 % (р<0,05). Время агрегации удлинялось превышая контроль на 17,01 - 34,10 % (р<0,05), но по-прежнему было меньше нормального на 8,10 - 7,21 % (р<0,05). Положительный эффект ксимедона отмечался уже с третьих суток терапии. На фоне применение ксимедона выявлено восстановление липидного состава тромбоцитарных мембран, начиная с третьих суток терапии, когда были зафиксированы положительные изменения почти всех исследуемых показателей, многие из которых уже на данном этапе терапии были сопоставимы с нормой. Уровни холестерола и его эфиров, свободных жирных кислот, были достоверно ниже контроля на 12,59 и 16,76 - 17,76, 17,09 - 26,51 %

(р 0.05) соответственно. Содержание суммарных фосфодипйлов возрастал^ относительно контроля па 20,23 по (р<0,05), ©Тмечалосъ и Восстановление их качественною состава. Показатели фосфатидилэтанЩамина н лизофосфолппидов падали относительно контроля па 12,77 - 13,73 и 24.4! ■ 39.88 "о (р- 0,05) соответственно. а содержание ф ос фат и дил с ери на и фосфатидилипозитл превышало контрольный показатель на 14.93 — 26,11 и 21.92 % (р<0.05) соответственно (рис.7).

140 1 120 100 80 60 40 20 0

-

hi**

ФИ I

ФИ I!

ФС I

ФС It

ФЭА I ФЭА II

□ норма

□ 1 сутки

□ 3 сутки

□ 5 сутки

1'нс. 7. Состав фосфо.мши.юн тромбоцитов на фоне iсрапни кед мед он ом. Примечаний i - контрольная i pvmia; II - опытная гр> л на; т - достоверность и тенен и ii от носи тёльЯО кон i роля при р<0,05.

Данные изменения тесно коррелировали с нормализацией функциональной активности тромбоцитов, очевидно, связанной с восстановлением структуры биомембран форменных элементов на фоне применения данного препарата, что подтверждает литературные данные о способности мембранных липидов поддерживать Структурную целостность и участвовать в регуляции функций клеток (Власов Л.П. И Др.. 2004). а также значимость липил регулирующего эффекта ксимедона. как препарата способного корригировать основные процессы лииил-ного гомеостаза (Ибрагимов О.Б., 1994).

Липид стабилизирующее действие препарата реализовалось путем регуляции интенсивности процессов ПОЛ и активности фосфолнпазы А2. Содержание первичных и в~оричпых продуктов IЮЛ снижалось с первых - третьих суток терапии. показатель активности фосфолнпазы А2 уменьшался относительно контрольного на 15.44 19.38 % (р- 0.05 V Катал аз пая активность нормализовалась после пятой инъекции препарата. Таким образом, применение ксимедона в коррекции свободно радикальных процессов перекненого окисления липидов и ферментативной активности тромбоцитах в условиях острого панкреатита показало высок} ю эффективность данного препарата (рис.8),

Рис. К. Активность фосфо. шпазы Л2 тромбоцитов на фоне ксимедонотерапии. Придание: 1 - контрольная группа; И - опытная группа. ' - достоверность но отношению к кои Iроли при [><0,05.

Исследования покачали, что влияние верапамида па функциональное состояние тромбоцитов проявилось и снижении степени и скорости агрегации на 16.70 и 16.84 % (р<0.05) соответственно, что способствовало появлению тенденции к более быстрой нормализации агрегационного состояния кровяных пластинок. Эффективность верапамила в коррекции дисфункции тромбоцитов была слабее по сравнению с таковой у ксимедона (рис.9).

степень степень скорость скорость

агрегации! агрегации II агрегации! агрегации II

Рис.9. Фу икниональнан активность тромбоцитов на фоне применения верапамила,

Примечание: I — контрольная групп»; II — опытная группа, т - достоверность по <м ношению к контролю при р<(!,05.

Включение верапамила в терапию острого панкреатита способствовало незначительном) восстановлению липидного состава тромбоцитов лишь к концу терапии. Известно, что лил иды модулируют активность тромбоцитов в широких пределах. Полагают, что они изменяют величину заряда и адсорбционную способность поверхности тромбоцитов по отношению к нонам кальция, вследствие чего повышается порог чувствительности тромбоцитов к действию агрегирующих факторов (Ишанходжаев Т.М.. 1990). Отсюда Очевидным становится, что способность данного препарата корригировать функциональную активность

тромбоцитов, существенно не влияя на их липидный состав, связана с протектйены м действием препарата на уровне клеточной мембраны (Годиков А,П, и др.. 1987). Данный факт подтверждается при исследовании влияния верапамила на процессы перекисного окисления липидов, когда существенной коррекции сво-боднорадикальных процессов в тромбоцитах зафиксировано не было.

Известно, что пероксидация липидов приводит к нарушению процессов нормального функционирований "калип-натриевого насоса" и поступлению в клетки кальция, что способствует повышению коагуляции иного потенциала самой клетки, активации фосфолйпаз, повышению проницаемости клеточных мембран. Способность верапамила блокировать кальциевые каналы, препятствуя накоплению внутриклеточного кальция является одним из путей мембранопротекторного действия препарата и снижения собственной агрегационной активности тромбоцитов. Уменьшение поступления кальция в клетку, вероятно, способствовало снижению активности фосфолипазы А2, которая снижалась относительно контроля на 16.45 % (р<0.05).

Таким образом, основным механизмом коррекции тромбоцит арной дисфункции верапамилом является его способность регулировать поступление ионов кальция в клетку, тем самым разрывая одно из звеньев патогенетической цепи острого панкреатита.

При исследовании комбинации ксимедона н верапамила в коррекции мор-фофункциональных нарушений тромбоцитов был выявлен максимальный положительный результат. Применение данной комбинации препаратов способствовало удлинению времени агрегации на 17,2! 45.76 % (р<0.05), уменьшению степени и скорости агрегации кровяных пластинок на 14,30 20,16 и 22,11 - 27,57 % (р<0,05), что свидетельствует о способности предложенной терапии быстро корригировать дисфункциональные расстройства тромбоцитов, предотвращая прогрессировать нарушений в системе гемостаза и развитие грозных тромбогеморрагических осложнений при остром панкреатите (рис. 10).

500 400

зоо 200 100

тП гтПТ

•X

I П-п.1 ГПТ

□ норма

□ 1 сутки

□ 3

степень степень скорость агрегации I агрегации И агрегации I

скорость время

время

агрегации II агрегации I агрегации

Рие. 10. Функциональная активность гррмбоци юв на фоне комбинированно}) терапии.

Примечание:! - Kohi рольная i руина; II - опытная j р\опа. -лостевсрносгь ноотншаёичю а коитро.по при р<0,»5.

Рис. 11. (ocian ли пило в i рочбошггпв на фоне комбинирован ной терапии.

Примечание: I - кош рольная i р> она; И - опъггнйя i руина;

- достоверноеil по oí ношению к кот ролю н])и р<0,05.

Восстановление агрегационной активности тромбоцитов на фоне комбинированной терапии было корреляционно связано с нормализацией липидного метаболизма форменных элементов крови. На фоне апробируемой схемы терапии показатели холестерола и его эфнров; а также свободных жирных кислот, были достоверно Ниже контроля на 20.96 - 21,09 и 14,15 16,63 % (р<0,05) соответственно. Содержание суммарных фосфолипидов возрастало относительно контроля на 9.32 - ¡ 17.76 % (р<0,05) (рис. 11).

Таблица 2

Корреляционная зависимость между нарушениями функциональной активности. липидным метаболизмом и интенсивностью евободнорадикальныX про-

ticccon в тромбоцитах на фоне комбинированной терапии

Показатели Степень ai регацин Скорость а; регацин 15рсмя агрегации

Сум м арные фосфо.1ИПИДЫ <(,'>1 0,98 0,79

Свободные жирные кислоты 0,91 ощ 0,78

Эфиры холестербла 0,93 0,82 0,67

Л и юфосфати ли л хол и и 0,99 0,94 0,74

фрс фатидилеер и и 0,87 0,95 §§1

Фосфатилилинош! 0,48 0,65 0.35

Малоновы ¡i диальдепйг 0.88 0,91 0.47

Активность фосфолпназы А2 0,89 0,97 0,80

11римеч;шие: жирный шриф [ - достоверная корреляционная связь для н 12

Учитывая высокую корреляционную зависимость между восстановлением гуморального и клеточного компонентов системы гемостаза на фоне применения ксимедона и верапамила, очевидным представляется способность препаратов влиять на гуморальный компонент системы гемостаза. При отсутствии прямого антикоагулянтного эффекта у исследуемых лекарственных средств их применение способствует появлению тенденции к восстановлению коагуляционно-литического потенциала крови, приводя к некоторому уменьшению свертывающей способности и увеличению антикоагулянтной активности крови.

Показатели фосфатидилэтаноламина и лизофосфолипидов уменьшались относительно контроля на 12,47 - 13,20 % (р<0,05) соответственно, а содержание фосфатидилсерина и фосфатидилинозита превышало контрольный показатель на 16,28 - 17,25 и 10,52 - 28,60 % (р<0,05) соответственно. Таким образом, применение комбинированной терапии ксимедоном и верапамилом дает максимальный положительный эффект в коррекции липидных дестабилизации тромбоцитарных мембран, проявляющийся уже с первых суток терапии, что, вероятно, объясняется потенцированием мембраностабилизирующего действия данных препаратов.

Антиоксидант (кснмедон)

Блокатор кальциевых каналов (верапамил)

4 4 4

4 Д Д

Восстановление липидного состава тромбоцитов

Снижение собственной агрегаиконной активности тромбоцитов

Восстановление функциональной активности тромбоцитов

Рис. 12. Схема механизма действия апробируемых препаратов

Экспериментально установлено, что нормализация функциональной активности тромбоцитов тесно коррелировала с восстановлением их липидного метаболизма (табл. 2). Применение комбинации ксимедона и верапамила способствовало быстрой коррекции свободнорадикальных процессов перекисного окисления липидов и ферментативной активности тромбоцитов при остром панкреатите. Уже с первых суток терапии уменьшался удельный вес первичных продуктов перекисного окисления липидов, содержание малонового диальдегида, индуцированного малонового диальдегида и активность фосфолипазы А2 тромбоцитов было ниже контроля на 21,48, 25,16 и 34,42 % (р<0,05) соответственно. Активность каталазы на фоне комбинированной терапии была сопоставима с нормой.

В заключение следует отметить, что включение комбинации ксимедона и верапамила в терапию острого панкреатита дает максимальный положительный результат в коррекции тромбоцитарной дисфункции и нарушений липидного метаболизма кровяных пластинок (рис. 12). Положительный эффект терапии регистрируется уже на первые сутки лечения и, вероятно, обусловливается потенцированием мембраностабилизирующего действия препаратов за счет фармакоди-намической направленности на различные звенья одного патогенетического механизма нарушения структуры и функции тромбоцитов при остром панкреатите. Данный факт в очередной раз свидетельствует о важности обоих путей регулирования клеточных функций тромбоцитов при исследуемой патологии: через инги-бирование процессов липопереокисления и управление содержанием ионов кальция в клетке.

ВЫВОДЫ

1. При остром экспериментальном панкреатите рост агрегационной активности тромбоцитов в виде снижения времени агрегации и увеличения скорости и степени агрегации сопровождается липидными дестабилизациями мембран кровяных пластинок на фоне интенсификации свободнорадикальных процессов перекисного окисления липидов и активизации фосфолипазы А2. Данные изменения клеточного звена системы гемостаза сопряжены с повышением коагуляцион-ного потенциала плазмы крови.

2. Ксимедон способствует восстановлению функциональной активности тромбоцитов: скорость и степень агрегации относительно контроля падают, а время агрегации удлиняется уже после третьей инъекции препарата. Данный положительный эффект тесно коррелирует с восстановлением липидного состава мембран тромбоцитов.

3. На фоне применения верапамила агрегационная способность тромбоцитов также восстанавливается, хотя положительные изменения менее выражены по сравнению с ксимедонотерапией. Коррекция липидного метаболизма при использовании верапамила в лечении острого панкреатита проявлялась слабее относительно таковой на фоне применения ксимедона.

4. При использовании комбинации ксимедона и верапамила в терапии наиболее выраженная модуляция функциональной активности тромбоцитов в виде

снижения степени и скорости агрегации и роста времени агрегации по сравнению с контрольной группой сопровождается более быстрой коррекцией липидного метаболизма кровяных пластинок. Восстановление агрегационной активности тромбоцитов на фоне комбинированной терапии сопровождается уменьшением расстройств гуморального компонента системы гемостаза. Положительный эффект комбинации препаратов отмечается уже с первых суток терапии.

5. Липид коррегирующее действие препаратов проявляется в увеличении суммарных фосфолипидов и снижении содержания свободного холестерола и его эстерифицированной формы, а также свободных жирных кислот относительно контроля. Спад содержания лизофосфолипидов и фосфатидилэтаноламина сопровождается ростом уровней фосфатидилинозитола и фосфатидилсерина.

6. Максимальный положительный эффект комбинированной терапии имеет патогенетическое обоснование. Снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов и активности фосфолипазы А2 обусловлено антиоксидантным и фосфолипазодепрессивным действием ксимедона и способностью верапамила блокировать кальциевые каналы, предотвращая поступление кальция в клетку, что обеспечивает высокий суммарный липид регулирующий эффект препаратов, корреляционно связанный с коррекцией функциональной активности тромбоцитов крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для коррекции нарушений в системе гемостаза при панкреатите показана комплексная терапия с включением в нее ксимедона и верапамила.

2. При панкреатите при оценке риска тромбообразования наряду с общепринятыми методиками рекомендуется учитывать состояние липидного обмена тромбоцитов, процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантную обеспеченность организма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фармакологическая регуляция функционального состояния клеток крови при эндотоксикозе// XY Научные чтения памяти H.H. Бурденко «Актуальные вопросы современной клинической медицины»: Материалы областной научно-практической конференции. Пенза: ИИЦ ПГУ. 2006. С. 60-61. Власова В.П., Мишарин И.В., Горшенина Е.И., Наумова Е.А., Султанова Н.М., Сернова Г.В., Ци-ликина О.В.

2. Фармакологическая модификация липидного состава и функциональной активности форменных элементов крови при эндотоксинемии// Клиническая фармакология и рациональная фармакотерапия: Материалы Первого Сибирского съезда фармакологов. Барнаул: Азбука. 2006. С. 325-329. А.П. Власов, С.В Аксенова, Т.В. Тарасова, В.П. Власова, И.В. Мишарин, Н.М. Султанова, Г.В. Сернова

3. Фармакокоррекция мембранодестабилизирующих явлений при панкреатите// Клиническая фармакология и рациональная фармакотерапия: Материалы Первого Сибирского съезда фармакологов. Барнаул: Азбука. 2006. С. 330-334.

А.П. Власов, И.В. Саушев, В.П. Власова. И.В. Мишарин, И.В. Атаманкин, Т.И. Григорьева, Г.В. Сернова

4. Коррекция липидных дестабилизации при эндотоксикозе//Журнал ассоциации по спортивной медицине и реабилитации больных и инвалидов. 2006. Т. 19. № 2. С. 13. Т.И. Григорьева, В.П. Власова, И.В. Мишарин, Г.В. Сернова, Н.М. Султанова

5. Коррекции функционального состояния и липидного метаболизма клеток крови при панкреатите// Общая реаниматология. 2006. Т. 2. № 4/1. С. 124-126. А.П. Власов, В.Г. Крылов, В.П. Власова, И.В. Саушев, И.В. Мишарин, E.H. Гор-шенина, Г.В. Сернова

6. Реамберин и верапамил в коррекции тромбоцитарной активности при остром панкреатите// Технические и естественные науки: проблемы, теория, эксперимент. Межвузовский сборник научных трудов. Вып. VI. Саранск: РНИИЦ, 2006. С. 103-105. Власова В.П., Сернова Г.В., Наумова Е.А., Маджид А., Алагулов A.A.

7. Восстановление функциональной активности клеточных элементов крови при эндотоксикозе// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, ко-лопроктологии. 2006. Т. XVI. № 5. Приложение № 28. С. 143. Власова В.П., Крылов В.Г., Мишарин И.В., Сернова Г.В., Атеф М.

8. Фармакокоррекция функциональной активности тромбоцитов при эндо-токсинемии // Тезисы докладов VII Международной конференции «Биоантиокси-дант». М.: РУДН, 2006. С. 238-240. Сернова Г.В., Власова В.П., Мишарин И.В., Захаркин А.Г., Циликина О.В., Маджид А.