Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Критерии активности болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

00461720

ХАНДАМИРОВА Ольга Олеговна

КРИТЕРИИ АКТИВНОСТИ БОЛЕЗНИ КРОНА И НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЯЗВЕННОГО КОЛИТА У ДЕТЕЙ

14.01.08 - педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2010

004617201

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук

Сергей Александрович Румянцев Петр Валентинович Шумилов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Василий Михайлович Делягин Евгений Васильевич Неудахин

Ведущее учреждение: ГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М. Ф. Владимирского

Защита диссертации состоится «26» ноября 2010 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.050.01 в Федеральном государственном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Минздравсоцразвития России (117997, Москва, Ленинский проспект 117, корпус 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава и на сайте www.niidg.ru. Автореферат разослан «_»_2010 года

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор В.М.Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) до настоящего времени остаются одной из наиболее серьезных и нерешенных проблем в педиатрии и гастроэнтерологии. В последние годы отмечается стремительный рост неспецифического язвенного колита (НЖ) и, особенно, болезни Крона (БК) во всем мире, включая индустриально развитые страны, где тенденция роста наиболее высока. Распространенность ВЗК в мире в настоящее время составляет от 2,2 чел до 6,8 чел. на 100 ООО населения. Частота НЖ в России составляет 20 случаев на 100 000 населения (из них около 10% составляют дети), а БК 3,5 на 100 000 (20-25% дети) (Симбирцев A.C., 2002; Philippe G., et al., 2007). До 25% всех новых случаев ВЗК приходится на детский возраст. Почти у 40% больных манифестация заболевания происходит в подростковом возрасте (Behrens R., et al., 1996; Lanfholz E., et al., 1997).

Этиология ВЗК остается неизвестной. С современных позиций патогенез ВЗК рассматривают как генетически детерминированную дисрегуляцию иммунной системы хозяина на патоген-ассоциированные молекулы, в том числе резидентную микрофлору кишечника и антигены пищи. В первую очередь эта дисрегуляция проявляется на уровне слизистой оболочки кишечника, где происходит максимальное взаимодействие микрофлоры с различными компонентами иммунной системы. В результате изменений функций клеток, участвующих в поддержании адекватного локального иммунного ответа происходит не контролируемое высвобождение растворимых медиаторов воспаления, итогом чего является развитие патологии, в том числе ВЗК (Pallone F., et al. 2003). Эти изменения в первую очередь затрагивают Т-клеточное звено иммунитета. С другой стороны, накоплено достаточно много новой информации о роли врожденного иммунитета в патогенезе ВЗК, что ставит под сомнение первичность ТЫ и Th2 ответов в возникновении БК и НЯК. Эти ответы являются следствием дефектов, в механизмах иммунного ответа (Vainer В., et al., 2000; Ogura Y., et al., 2001; Krajina T., et al., 2003; Miyake K., et a]., 2004; Brand S., et al., 2005).

Продукция цитокинов Thl-клетками вызывает активацию макрофагов, которые, в свою очередь, продуцируют 1L-12, IL-18 и фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, что вызывает дальнейшую стимуляцию Thl-клеток и замыкает порочный круг. Активированные макрофаги продуцируют спектр различных воспалительных цитокинов (TNF, IL-1, IL-6), которые усиливают процессы воспаления и повреждения тканей, что в результате приводит к клинической манифестации заболевания. (Groux H., et al., 1997; Toms С., et al., 2001). Возможно функции клеток врожденного иммунитета, а также

функциональная активность TLR и NOD нарушены при ВЗК. Трансфекционные исследования показали, что мутации NOD2 приводят к дефектной способности отвечать на липополисахариды при БК (Ogura Y, et al., 2001; Miyake К.,2004).

Хотя принято считать, что БК и НЯК разные заболевания, однако в своей клинической манифестации, по иммунологическим механизмам развития данной патологии и терапевтическому алгоритму они весьма схожи, что позволяет их рассматривать совместно как группу заболеваний.

Лечение ВЗК является многоступенчатым и требует назначения гормональной и цитостатической терапии, а также при неэффективности терапии - хирургического лечения.

Для оценки состояния больного, определения тактики терапии, ее объема, прогноза заболевания, своевременного выполнения хирургического лечения необходима адекватная оценка тяжести и активности основного процесса. На сегодняшний день существует множество разных индексов активности воспалительного процесса (Truelov и Witts, ESPGHAN, Rachmilewitz, индекс Ван-Гееса, индекс активности для БК (CDAI) по Best, Perianal Disease Activity Index, эндоскопический индекс активности CDEIS, педиатрический индекс активности БК), не один из них не дает представление об истинной картине воспалительного процесса, так как не отражает всю полноту иммунопатогенетических особенностей болезни, следовательно, требует пересмотра с учетом новых знаний об иммунных нарушениях, происходящих при этих двух заболеваниях при использовании современных лабораторных методик. Поэтому работы по стандартизации методов оценки активности ВЗК у детей являются крайне актуальными.

Цель исследования:

Оценить информативность существующих критериев активности ВЗК заболеваний на основании комплексного изучения особенностей иммунного ответа у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом для их оптимизации и адаптации применительно к детскому возрасту.

Задачи исследования:

1. Оценить активность процесса при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей по существующим клиническим и эндоскопическим критериям.

2. Определить концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов (IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, TNF-a, TNF-ß, IL-5, 1L-12) в сыворотке крови у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом с разной локализацией и активностью воспалительного процесса.

3. В эксперименте изучить спонтанную и стимулированную (липополисахаридом, мурамилпептидом, и их сочетанием) продукцию про- и противовоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, TNF-a, TNF-p) в культуре цельной крови и изолированных моноцитов периферической крови у детей с БК и НЯК с разной локализацией и активностью воспалительного процесса.

4. Оценить экспрессию м-РНК про- и противовоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, TNF-a, TNF-P) и рецепторов (TLR4 и NOD2) в клетках цельной крови и биоптата слизистой оболочки кишечника у детей с БК и НЯК с разной локализацией и активностью воспалительного процесса.

5. На основании сопоставления традиционных критериев активности БК и НЯК с особенностями иммуно-воспалительной реакции при разной локализации и активности воспалительного процесса ВЗК у детей определить их информативность и предложить дополнительные критерии оценки активности заболеваний.

Научная новизпа

Впервые установлены особенности иммунного воспаления в зависимости от клинических форм, локализации процесса и течения у детей при БК и НЯК на основании проведенного комплексного изучения иммунного воспаления по данным сывороточного уровня основных про- и противовоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, TNF-a, TNF-p, 1L-5, IL-I2), их спонтанной и стимулированной продукции в культуре цельной крови и изолированных моноцитов периферической крови, экспрессии м-РНК про- и противовоспалительных цитокинов и паттерн-распознающих рецепторов (NOD2 и TLR4) в клетках крови и слизистой оболочки толстой кишки.

Оптимизирована оценка информативности традиционных индексов активности БК и НЯК при сопоставлении с объективными показателями иммунного ответа у детей с ВЗК с разной локализацией и активностью воспалительного процесса.

Предложены новые дополнительные критерии активности болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей:

■ клинические критерии высокой активности иммунного воспаления БК: изолированное поражения верхних отделов ЖКТ, изолированный илеит, наличие внекишечных проявлений, а также стенозирующее и/или пенетрирующее течение заболевания;

■ клинические критерии высокой активности иммунного воспаления НЯК: наличие внекишечных проявлений;

■ лабораторные критерии высокой активности иммунного воспаления БК и НЯК: повышенная продукция IL-8, особенно LPS-стимулированная продукция;

• лабораторные критерии ремиссии является высокий уровень IL-10.

Практическое значение

Выявленные особенности иммунного воспаления у детей с БК и НЯК с разной локализацией и активностью воспалительного процесса позволяют объективно оценить активность патологического процесса для оптимального подбора терапии.

Результаты, полученные в ходе исследования, позволили оптимизировать критерии оценки активности ВЗК у детей на основании патогенетически обоснованных научных данных, что позволяет рационализировать терапию, прогнозировать течение и рецидив заболевания. Показана высокая информативность педиатрического индекса активности болезни Крона (PCDAI).

Показано, что оценка иммунного воспаления должна базироваться на комплексном исследовании концентрации цитокинов в нативной сыворотке, их спонтанной и стимулированной продукции в культуре крови и экспрессии их генов в крови и тканях, так как исследование только концентрации в сыворотке не отражает истинного характера иммуно-воспалителъной реакции.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в работу ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, отделения гастроэнтерологии ФГУ Российской детской клинической больницы Минздравсоцразвития России. Основные положения и выводы диссертации используются в подготовке специалистов педиатров, гастроэнтерологов на кафедре госпитальной педиатрии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Апробация диссертации. Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников клинических и лабораторных отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, кафедры госпитальной педиатрии и кафедры онкологии и гематологии Педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава 6 июля 2010 г.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XIV Российской Гастроэнтерологической неделе (Москва 6-8 октября 2008г), VII Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва 21-23 октября 2008 г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 статьи опубликовано в журналах, рецензируемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Материал диссертации изложен в одном томе на 200 страницах машинописного текста, содержит 112 таблиц и проиллюстрирован 278 рисунками. Указатель литературы включает 37 источников отечественной и 164 зарубежной литературы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания

материалов и методов, глав результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы в методы исследования Работа выполнена в ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России (директор - член-корр. РАМН, д.м.н., профессор А.Г. Румянцев) в лабораториях молекулярной биологии (зав. лаб. - к.м.н. В.О. Бобрынина), регуляции кроветворения (зав. лаб. - д.б.н. Е Ю. Осипова), стволовых клеток и клеточных технологий (зав. лаб. - к.м.н. Е.В. Боякова) отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии (зав. отдела - д.м.н., профессор С.А.Румянцев), на базе отделения гастроэнтерологии с гепатологической группой (зав. отд. - д.м.н., профессор А.С.Потапов) НИИ Педиатрии ГУ НЦЗД РАМН (директор - академик РАМН, д.м.н., профессор A.A. Баранов), отделения гастроэнтерологии (зав. отд. - J1.M. Карпина) ФГУ Российской детской клинической больницы Минздравсоцразвития России (гл. врач - д.м.н., профессор Н.Н.Ваганов).

За период 2007 - 2009 гг. был обследован 61 ребенок с воспалительными ВЗК, которые находились на стационарном лечении в выше перечисленных лечебных учреждениях. Контрольную группу составили 56 соматически здоровых детей, госпитализированных для проведения планового хирургического лечения по поводу неосложненных форм крипторхизма и пупочной грыжи в хирургическом отделении № 1 (зав. отд. - к.м.н. И.Н. Корзникова) ДГКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова г. Москвы (гл. врач -д.м.н. Попов В.В.). Забор крови у них проводился в предоперационном периоде.

Клиническая характеристика пациентов Обследован 61 ребенок с ВЗК в возрасте от 1,4 лет до 17 лет 10 мес., среди которых 34(55,7%) мальчика и 27(45%) девочек, средний возраст составил 12,5±3,97 лет. Из них у 39 детей был диагностирован WJK и у 22 детей - БК (Табл. 1). У всех больных диагноз ВЗК был установлен на основании стандартных методов исследования, включающих в себя клинические, рентгенологические, эндоскопические и гистологические критерии.

Максимальное число детей с ВЗК встречалось в старшей возрастной группе: от 13 до 18 лет - 29 (47,5%) детей, что составило против 22 детей (36,6%) из средней возрастной группы. Среди больных с ВЗК мальчиков было больше как в группе детей с БК 13 детей (21,5%), так и с НЯК 23 ребенка (37,7%).

Таблица 1.

Характеристика исследуемой группы детей с БЗК (п=61) по полу и возрасту.

до 3-х лет 4 года -12 лет 13 лет- 18 лет

БК мальчики 1(1,6%) 5(8,3%) 7(11,6%)

девочки 0 3(5%) 4(6,6%)

НЯК мальчики 5(8,2%) 8(13,1%) 10(16,4%)

девочки 4(6,6%) 6(9,8%) 8(13%)

Всего 10(16,4%) 22(36,2%) 29(47,5%)

Средний возраст детей с БК составлял 11,7+3,42 лет. В данной группе преобладали дети с илеоколитом 10 человек (46%). Изолированный илеит отмечался у 6 (27%) больных, изолированный колит - у 4 (18%), поражение верхних отделов ЖКТ - у 2 (9%). Среди детей с БК клиническая ремиссия отмечалась у 2 (9%), высокая клиническая активность - у 6 (21%), умеренная - у 7 (32%), низкая - у 7 (32%) детей. Эндоскопическая ремиссия выявлялась у 1 (4%) больного, высокая активность - у 4 (18%), умеренная - у 7 (32%), низкая - у 10 (46%). Самым частым вариантом течения БК у исследуемых детей было воспалительное (не стенозирующее не пенетрирующее) - у 19 (86,4%) больных, стенозирующее - у 3 (13,6%), пенетрирующее - у 2 (9,1%), у одного ребенка отмечались и стенозы, и свищи. Перианальное проажение было выявлено у 3 (13,6%) детей. Внекишечные проявления отмечались у 12 (54,5%) детей с БК. Самыми частыми внекишечными проявлениями были суставной синдром у 4 (33%), патология печени у 2 (16,6%). Снижение минеральной плотности костных тканей отмечено у 3 (25%) детей с БК. Средний возраст детей с НЯК составлял 10,2±3,76 лет. В данной группе преобладали дети с тотальным колитом 25 (63%), левосторонний колит был отмечен у 2 (5%), проктосигмоидит - у 8 (21%), проктит - у 4 (10%). Среди детей с НЯК клиническая ремиссия отмечалась у 14 (36%), высокая клиническая активность - у 8 (20%), умеренная клиническая активность - у 7 (18%), низкая - у 10 (26%). Эндоскопическая ремиссия выявлялась у 4 (10%), высокая активность - у 7 (18%), умеренная - у 10 (26%), низкая - у 18 (46%). Самыми частыми внекишечными проявлениями были патология печени 2 (18%), суставной синдром 1 (10,3%) ребенка. Снижение минеральной плотности костных тканей отмечено у 2 (19%) детей с НЯК.

Клиническое исследование пациентов включало: сбор анамнеза заболевания, анамнеза жизни и наследственности, оценку жалоб и динамики основных симптомов, общий клинический осмотр и лабораторно-инструментальные методы исследования. Физическое развитие детей оценивали по стандартным центильным таблицам И.М. Воронцова (Воронцов И.М., 2009).

Определение клинической и эндоскопической активности НЯК Для определения клинической и эндоскопической активности НЯК у детей использовали индекс КасЫпЛеху^. Критерии клинической активности включали: частоту стула в течение недели, примесь крови в стуле в течение недели, общее состояние, интенсивность болей в животе, наличие или отсутствие лихорадки, внекишечные проявления и лабораторные показатели: СОЭ, гемоглобин. Каждый параметр оценивался в баллах. Сумма баллов от О до 4 соответствовала ремиссии заболевания, 5-10 баллов - низкой, 11-15 баллов - средней и более 16 баллов - высокой степени клинической активности НЯК. Критерии эндоскопической активности НЯК включали: наличие грануляций слизистой оболочки кишки и их способность к светоотражению, характер сосудистого рисунка, ранимость слизистой оболочки, наличие или отсутствие язв, эрозий, а также присутствие слизи, фибрина, гноя, на поверхности слизистой оболочки кишки. Оценка проводилась по максимально измененному сегменту кишки, без учета протяженности поражения. Сумма баллов равная 0, оценивалась как эндоскопическая ремиссия, 1-4 балла - низкая активность, 5-8 баллов - умеренная, 9 и более баллов - высокая эндоскопическая активность.

Определение клинической и эндоскопической активности БК. Клиническую активность БК определяли с помощью Педиатрического индекса активности болезни Крона (РСВЛ1). РСОЛ1 включает в себя жалобы на боли в животе, частоту и консистенцию стула, наличие крови в стуле, данные физикального обследования: рост, вес, ректальные поражения (фистула, абсцесс), наличие внекишечных проявлений и лабораторные показатели: гематокрит, СОЭ, уровень сывороточного альбумина. Минимальная сумма баллов 0, максимальная - 100. Чем больше сумма баллов, тем выше активность БК. Для определения эндоскопической активности БК применялся простой эндоскопический индекс активности БК (БЕЗ-СБ). При этом учитывалась проходимость кишечника и наличие стенозов, протяженность поражения, наличие и выраженность язвенных дефектов. Каждый пункт предусматривал оценку от 0 до 3 баллов.

Получение крови и сыворотки. Венозную кровь больных ВЗК и условно здоровых детей получали в утренние часы натощак, из локтевой вены объемом 3 мл и помещалась в пробирки с гепарином. Сыворотку крови получали путем центрифугирования крови в течение 15 минут при 2500 оборотах/мин, поле 20 минутного инкубирования при 37°С в пробирках с активатором свертывания. Архивирование сыворотки до проведения исследования, осуществлялось при температуре - 80°С.

Получение биопсийного материала. Забор материала для исследования проводился во время плановой диагностической фиброколоноскопнн с лестничной биопсией, которая

назначалась лечащим врачом, согласно индивидуальному плану обследования. Брался один дополнительный биоптат слизистой оболочки сигмовидной кишки, помещался в пластиковую микропробирку типа эппендорф, содержащую фиксатор RNA-Later (Ambion, Texas, USA), вортексировался, помещался в камеру с температурой +4,0°С на 6-8 часов для лучшей фиксации материала. Затем RNA-Later аккуратно удаляли, а эппендорф убирали на хранение при температуре -80°С до проведения исследования.

Определение клеточного состава крови. Подсчет клеток крови проводился двумя методами: 1) автоматическим счетчиком клеток крови АВХ Pentra 60 С+ в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров; 2) использовали мазки ПК, окрашенные по методу Паппенгейма-Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда и краской Романовского);

Стимуляция клеток цельной крови. Для определения способности клеток цельной крови продуцировать цитокины их разводили 1:5 полной посадочной средой RPMI 1640 (ООО НПП «ПанЭко» Россия), с добавлением 10% феталыюй телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L -глутамина. Было сформировано четыре группы: 1) клетки цельной крови без добавления стимуляторов. 2) клетки цельной крови, активированные только LPS. 3) клетки цельной крови, активированные только MDP. 4) сочетанная стимуляцию LPS+ MDP цельной крови.

Клетки были распределены в четырехлуночную планшету с плотностью 2,5x105 клеток в лунке в среде RPMI 1640 (Пан-Эко, Россия) в присутствии 10% телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L -глутамина и простимулированны MDP в концентрации 20 нМ и LPS в концентрации 20 нМ Ю0пкг/мл в соответствии с составленными группами исследования. Затем клетки инкубировали при температуре 37°С, 5% СО? в течение 24 часов. Бесклеточная составляющая была получена посредством центрифугирования на 2000 оборотах в течение 15 минут и хранилась при температуре -80°С до исследования.

Проведение иммуномагнитной сепарации. Для выделения чистой моноцитарной культуры из периферической гепаринизированной венозной крови были использованы полистерольные магнитные частицы, связанные с моноклональными мышиными антителами класса IgG2a, распознающими поверхностные гликопротеины моноцитов -Dynabeads MyPure Monocyte Kit 2 for Untouched human cclls (Invitrogen Осло, Норвегия).

Стимуляция выделенной чистой культуры моноцитов. Стимуляция выделенной чистой культуры моноцитов проводилась с помощью LPS (липополисахарид) и MDP (мурамилдипептид), предоставленые лабораторией экспериментальной иммунологии и иммунофармокологии ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития России (зав. - д.м.н., профессор И.Г. Козлов).

Были сформированы такие же четыре группы как и при стимуляции цельной крови. Клетки были распределены в четырехлуночную планшету с плотностью 2,5*105 клеток в лунке в среде RPM1 1640 (Пан-Эко, Россия) в присутствии 10% телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L -глутамина и простимулированны MDP и LPS в концентрации 20 нМ и 100пкг/мл соответственно. Выделенная и стимулированная чистая клеточная культура подвергалась инкубации в течение 24 часов при температуре 37°С, 5%С02. Бесклеточная составляющая была получена посредством центрифугирования на 1000 оборотах в течение 5 минут и хранилась при температуре -80°С до исследования.

Определение концентрации цитокинов с использованием цитометрического метода. Концентрации цитокинов исследовались в четырех образцах изолированной культуры моноцитов и клеток цельной крови, прошедших стимуляцию белками бактериальных оболочек, в сыворотках больных ВЗК и условно здоровых детей. Исследование проведено с помощью цитометра BDFaxCantoFIowCytomix (США), набора антител к цитокинам и флуоресцирующих красителей, связывающихся с антителами BMS810FF (Bender MedSistem GmbH Viena Austria). Для достижения параллельности отображения кривых событий требовалась индивидуальная настройка напряжений для каждого FL сенсора.

Определение уровня экспрессии м-РНК цитокинов, NOD-2 и TLR-4 в биологическом

материале

Выделение РНК Выделяли РНК из архивных образцов с использованием набора «Рибо-Сорб» (АмплиСенс, Россия, Москва) ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора в соответствии с методикой производителя.

Получение к-ДНК на матрице РНК. С целью получения к-ДНК на матрице РНК для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции мы использовали комплект реагентов «РЕВЕРТА» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия, Москва). Материалом для исследования служил раствор РНК выделенного из образцов. Постановка реакции обратной транскрипции осуществлялась в соответствии с методикой производителя. При работе с РНК использовались только одноразовые пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-free», «DNase-free».

Проведение полимеразной цепной реакции. ПЦР проводили в автоматическом режиме, используя амплификатор Dyad. Постановку реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использованием праймеров синтезированых ЗАО «Синтол» (Россия). Последовательность праймеров представлена в табл. 2.

Реакционная смесь, в конечном объёме 20 мкл содержала: 5 мкл. кДНК, по 1 мкл. каждого праймера (включая GAPDH) до конечной концентрации 0,25 пмоль/мкл., по 2,5

мкл. с1КГР, 0,5 мкл. Тац ДНК-полимеразы, ПЦР буфер (производства «ИЗОГЕН»), MgC12 в соответствии с условиями, подобранными при оптимизации ПЦР.

Таблица 2.

Последовательность праймеров, использованных, для проведения ПЦР

№ Ген Праймер 5'-3'

1. IL-1B прямой G A TCGCTTA TTACAGTGGCAA TG

обратный CTTTGAA GAA GAA С СТА ТС TTCTTCG

зонд ROX-AA CA G A TGAA GTGCTCCTTCCA-(BHQ2)

2. IL-2 прямой GAA ТТАА TAA TT A CAA GAA TCCCAAA CTCA С

обратный CTGGAA CT AAA GGGA TCTGAAA CA

зонд ROX-CCCAAGAAGGCCACAGAACT-(BHQ2)

3. IL-6 прямой ACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAG

обратный GAACAAGCCAGAGCTGTGC

зонд ROX-ATTCAATGAGGAGACTTGCCTG-(BHQ2)

4. ILS прямой TTCTCCA CA A G CGCCTTC

обратный CAA TGA GGA G A CTTGCCTGG

зонд ROX-CCCTGA G AAA GGA G A CA TG TAA CA-(BHQ2)

5. IL-10 прямой A G TGAA G A CTTTCTTTCAAA TGA AGG

обратный CTGTCATCGATTTCTTCCCTGT

зонд ROX-ACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGC-(BHQ2)

6. IFN-G прямой AA G AAA TA TTTTAA TGCA GGTCA TTC A G

обратный GACTAATTA TTCGGTAACTGACTTGAA TG

зонд ROX-AA TTGGAAA G A GGA G A G TGA С AG A A- (BHQ2)

7. NOD2 прямой GCTCTGTATTTGCGCGATAAC

обратный CA TTGAGGCTGGGGAA TAACTAC

зонд ROX-AATTGCAGAAGTTAGCTCTATTCAACAA-(BHQ2)

8. TLR4 прямой GGCA TTTA GGCA GCTA TA GCTTC

обратный A CA GCCA CCA GCTTCTG TA А А С

зонд ROX-A TTTA TCCA GGTG TGAAA TCCA G A C-(BHQ2)

9. TNFA прямой TCTGCCTGCTGCACTTTG

обратный CTTGA GGGTTTGCTA CA ACA TG

зонд ROX-CCCAGGCAGTCAGA TCA TCTT-(BHQ2)

10. GAPDH прямой GTCGGA GTCAA CGGA TTTGGTC

обратный GCAAATGAGCCCCAGCCTTCTC

зонд RóG-ACCTCAACTACATGGTTTACATGTTCCAA-(BHQl)

ПЦР проводили с использованием следующей программы: 1) активация полимеразы-95°С , 5с; 2) денатурация — 94°С, 20 с; 3) отжиг праймеров —, 60°С 15 с; 4) элонгация — 75°С, 45 с.1-4циклы повторялись 10 раз с целью наработки максимального количества ампликонов для повышения эффективности реакции. Детекция флуоресценции в пробирках в режиме реального времени производилась с использованием двух каналов. Канал Orange использовался для детекции флюоресценции

внутреннего контроля (GAPDH-ген), длина волны - возбуждение 585 нм, эмиссия 610 нм. Канал Yellow-возбуждение 470 нм, эмиссия 510 нм.

Статистическая обработка

Статистическую обработку данных осуществляли для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STAT1STIKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Учитывая клинические и эндоскопические критерии активности заболевания, всех пациентов с НЯК распределяли по степеням клинической активности с использованием индекса активности Rachmilewitz. В результате такого распределения наибольшая часть обследуемых детей с НЯК 14 (36%) находились в клинической ремиссии. Низкая и умеренная активность воспалительного процесса отмечались у 10 (26%) и 7 (18%) детей соответственно. 8 (20%) детей имели высокую клиническую активность по индексу Rachmilewitz. С учетом эндоскопических критериев оценивали индекс эндоскопический активности Rachmilewitz, а так же локализацию и распространенность процесса. В результате такого обследования было установлено, что среди обследованных детей с НЯК преобладали распространенные формы поражения толстой кишки (панколит) - 25 (64%) и проктосигмоидит в 8 (21%), однако, при эндоскопии в большинстве случаев - у 18 (46%) определена низкая степень активности, в то время как умеренная активность отмечена у 10 (26%) детей, а высокая у 7 (18%). У 4 (10%) детей эндоскопическая картина соответствовала стадии ремиссии.

Распределение детей страдающих БК по степеням клинической активности осуществлялось с использованием педиатрического индекса активности БК (PCDAI). Большая часть пациентов имели низкую и умеренную активность процесса, по 7 человек (32%) в каждой группе. С высокой активностью было 6 детей, что составило 27%. В ремиссии основного заболевания в момент обследования находились 2 ребенка. У

каждого ребенка с БК оценивали простой эндоскопический индекс БК (ЙЕЗ-СП) на основании колоноскопии. 7 (32%) детей с БК имели умеренную степень эндоскопической активности, у 4 (18%) высокую, 10 (46%) низкую степень эндоскопической активности. На момент исследования в ремиссии находилось 1 (4%) ребенок. В ходе исследования оценивалась локализация воспалительного процесса, так илеоколит диагностирован у 10 (46%) больных, илеит у 6 (27%), колит у 4 (18%), изолированное поражение верхних отделов желудочно-кишечного тракта у 2 (9%) детей.

При анализе спектра продуцируемых цитокинов от нозологической формы было отмечено, что дети с НЯК имели более высокие значения №N-7 в сыворотке крови, при спонтанной и стимулированной продукции и экспрессии мРНК, чем дети с БК. В то время как дети с БК имели несколько более высокие значения П-4 и 1Ь-5. Наибольшие изменения отмечались в уровне как провоспалительных (1Ь-1р, 1Ь-6, 1Ь-8, ТОТ-а), так и противовоспалительных (1Ь-4, 11,-10). У детей с БК отмечены более четкие закономерности развития иммунопатологического процесса, его связь с распространенностью, тяжестью и характером течения. У детей с НЯК изменения менее выражены. При НЯК в сыворотке крови (Табл. 3) отмечается значимо повышенная концентрация островоспалительных цитокинов. 11,-8 (р<0,05), 11.-6, Т№-а (р<0,01), 1Ь-1(5, а также повышены концентрации №N-7 (р<0,01), II,-] 0 (р<0,01), 1Ь-2 (р<0,01) по сравнению с контрольной группой. По сывороточным концентрациям большинства исследуемых цитокинов, за исключением 1Ь-1р и Т№-р, дети с НЯК превосходят и пациентов с БК, а в случае ТМ7-« (р<0,01) и 11.-10 (р<0,05) эти различия статистически значимы. В группе детей с БК также отмечается повышенная по сравнению с контролем концентрация 1Ыр, 11.-4 (р<0,05), 11,-8, 1Ы0 (р<0,05), ШЫ-у (р<0,01), ТОТ-а, ТОТ-р.

При сравнении концентрации цитокинов при их спонтанной продукции клетками периферической крови с их концентрацией в нативной сыворотке крови обращают внимание, что у детей с БК отмечается более высокая продукция 11.-6, чем при НЯК (9036,1 пкгр/мл против 5298,8 пкг/мл) и значительно выше, чем в контрольной группе (372,4 пкгр/мл). При БК также отмечается более высокий уровень II,-ф (977,9 пкг/мл) и ТЫГ-а (514,5 пкг/мл), чем при НЯК (428,2 пкг/мл и 296,2 пкг/мл соответственно). При НЯК отмечался более высокий уровень, чем при БК, II.-8 (1704,7 пкг/мл против 1311,7 пкг/мл), что было ранее отмечено и в сыворотке крови (Табл. 3).

Таблица 3. Концентрация цитокинов у детей исследуемых групп.

Концентрация цитокинов в сыворотке крови Концентрация цитокинов в супернатапте при спонтанной продукции в культуре лейкоцитов крови

БК НЯК Контроль БК НЯК Контроль

1Ь-1р 39,4 [22,7-93,1] 21,0 [0-122,41 17,5 [0-618,01 977,9 [728,4-990,11 532,5 [428,2-562,11 0 [0-01

1Ь-2 0 [0 - 2,44] 1,49 ** [0-128.61 0 [0-01 0 [0-01 0 Г0-01 0 [0-01

1Ь-4 1,28 * [0 - 44,5] 1,00 ** [0-197,31 0 [0-01 0 [0-01 0 [0-01 1104,1 [1009,1-1113,7]

1Ь-6 42,0 + [0-183,7] 77,0 | [34,4-408,21 48,6 [38,3 - 133,0] 9218,5** [9036,1-1006,81 5298,8 [4312,1-5584,3] 372,4 [231,1-394,2]

1Ь-8 555,5 [78,9-2561,3] 619,1 * [292,9- 1606,8] 135,0 [15,9-1146,7] 1311,7 [1144,2-1329,6] 1704,7 [1700,1-1714,9] 0 [0-01

1Ь-10 21,2 М [0-36,4] 134,5 ** | [1,00- 1945,51 0 [0 - 0,08] 76,5 [62,9-77,41 86,2 [74,1-88,4] 2427,1 [2418,1-2445,1]

НЯ-г 30,7 ** [0-1156,0] 120,1 [0-1381,5] 0 [0-0] 0 [0-0] 0 [0-01 7375,4 [7328,1-7401,6]

ЮТ-а 55,7 П [9,74-117,9] 175,0 ** П [85,4-918,91 0 [0-139,7] 514,5 [328,4-542,91 296,2 [201,6-305,51 0 [0-01

ТОТ-р 21,7 [0,32 - 64,0] 0,87 [0 - 40,91 0 [0-77,41 0 [0-01 0 [0.01 0 [0-01

1Ь-12р70 0 [0-22,5] 0 [0-116,1] 0 [0-236,5] 0 [0-0] 0 [0-01 1714,1 [1698,8-1723,3]

1Ь-5 0 [0-0,521 0 ** [0-11,71 0 [0-01 2,16 [1,23-3,121 0 [0-01 0 [0-01

Примечание: - жирным шрифтом дана Медиана, в квадратных скобках 25 и 75-ый перцентиль; *- р<0,05 - по сравнению с контрольной группой; **- р<0,01 - по сравнению с контрольной группой; - | - р<0,05 - между НЯК и БК; - ||-Р<0,01 -между НЯК и БК

Рис. 1. Концентрация цитокинов в культуре цельной крови у детей исследуемых

групп: спонтанная и стимулируемая продукция (пкг/мл)

(р<0,01, р<0,05- статистически значимые различия концентраций интерлейкинов в зависимости от вида стимуляции методом многофакторного анализа)

При анализе продукции отдельных цитокинов в зависимости от вида сгимулящ (рис. 1) минимальные значения IL-lp, IL-6, TNF-a, как у детей с БК, так и НЯГ, отмечаются в не стимулированной пробе, с более высокими значениями при стимулящ LPS, MDP, а максимальные значения выявлены в пробах с комплексной стимуляцией

a I.PS+MDP

в MDP

■ LPS □ спонтанно

4000

Контроль

О спонтанно

15994

20000

10000

Контро/

0 L+M

о mdp

в LPS □ спонтанно

TNF-a

Контроль

IL-8

Контроль НЯК

(LPS + MDP). Эти различия для всех трех цитокинов статистически значимы (р<0,01). По уровню IL-6 в пробах стимулированных LPS и LPS+MDP были выявлены статистически значимые различия между группами с БК и НЯК. Показатели TNF-a у детей с БК и НЯК различаются минимально. У детей с НЯК спонтанная продукция IL-8 была выше на 23%, чем при БК. Стимуляция привела к повышению уровня на 39,4% (р<0,05). При БК изменения 1L-8 были также статистически значимы (р<0,05). Более высокая концентрация отмечена в пробе со стимуляцией LPS (3503,3 пкг/мл), а максимальное повышение (в 4 раза) при комплексной стимуляции (5328 пкг/мл). Продукция IL-4 была выявлена только у детей с БК и только в пробах со стимуляторами (р<0,05). Продукция IL-5 была отмечена тоже только у детей с БК.

При анализе продукции цитокинов моноцитами спонтанная выработка IL-8 была отмечена только у детей с НЯК (р<0,01), а IL-4, как у детей с НЯК, так и при БК, но значение их было выше, чем в контрольной группе, в случае НЯК эти различия были статистически значимы (р<0,05). В группе детей с НЯК также отмечалась высокая продукция IL-8, которая имела максимальные значения в спонтанной пробе (113,5 пкг/мл) и при комплексной стимуляции LPS+MDP (119,6 пкг/мл), на фоне изолированной стимуляции LPS и MDP продукция IL-8 была ниже, причем при стимуляции LPS в 2,3 раза. Данные изменения были статистически значимыми (р<0,01).

При анализе экспрессии мРНК цитокинов в клетках крови и слизистой оболочки кишки было установлено, что дети с БК имеют в крови повышенную, по сравнению с контролем и детьми с НЯК, экспрессию IL-8 (р<0,05) и TNF-a, по сравнению с условно здоровыми детьми - экспрессию TLR4. Дети с НЯК имели повышенные значения LL-1 ¡3 и TLR4, как по сравнению с контролем, так и детьми с БК. В слизистой оболочке кишки и дети с НЯК, и дети с БК имели экспрессию мРНК значительно ниже, чем у детей контрольной группы. У детей с БК экспрессия мРНК в биоптате по сравнению с кровью была значительно выше: IL-6 (7,0 против 1,01 копий мРНК/клетка), IL-8 (49,5 против 7,0 копий мРНК/клетка ) (р<0,01), TNF-a (6,53 и 5,0 копий мРНК/клетка ) и TLR4 (11,0 и 0,51 копий мРНК/клетка ), а экспрессия генов IL-lp и IFN-y была выявлена только в биоптате слизистой оболочки кишки. У детей с НЯК преобладала экспрессия генов в крови: IL-1J}, IFN-y, TLR4 и NOD2 экспрессировались только клетками крови, а IL-8 и TNF-a экспрессировались и клетками крови, и клетками слизистой оболочки. Экспрессия TNF-a была выше в крови-2,02 против 0,52 копий мРНК/клетка в биоптате (р<0,05), а IL-8 выше (р<0,01) в слизистой оболочке кишечника- 99,0 копий мРНК/клетка в то время как в крови 1,02 копий мРНК/клетка.

1Ь-1р 11-2 1Ь-4 1Ь-6 1Ь-10 ^N-7 ТОТ-а Т№-Р И-12 1Ь-5

Рис. 2. Концентрация цитокинов в нативной сыворотке крови у детей с болезнью Крона с различной локализацией

□ Илеит

□ Колит

Ш Илеоколит ЕВОЖКТ

Рис. 3. Концентрация 1Ь-8 в нативной сыворотке крови у детей с болезнью Крона с

различной локализацией

1Ь-1 ЬРБ^ МОР

£3 1Ь-1 МОР

МОР

2000

3000

4 ООО

ЗООО 4 ООО 5 ООО 6 ООО

2000

14483 3

ЬРБ-!-МОР

В 1Ь-6 ЬРв-» МОР □ 1Ь-6 МОР

ЕЗ 11,-8 МОР

В 1Ь-6 ЬРБ

12453.

□ 1Ь-6

9877

15000

2 О ООО

2000

4000

6000

8000

5 ООО

IО ООО

О 1Ь- 10 ЬРв+

МОР □ IО МОР

О 1Ь-4 ЬРБ-» МОР

О 1Ь-4 МОР

В 1Ь-4 ЬРБ

1Ь-10

1500

Нами была выявлена связь активности иммунного воспаления с локализацией патологического процесса, как у детей с БК, так и у детей с НЯК. При БК наиболее выраженные изменения отмечались при изолированном поражении верхних отделов ЖКТ и изолированном илеите. Дети с данной локализацией БК (рис. 2, 3) имели более высокие концентрации в сыворотке 1Ь-1р, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-10, ТОТ-а, ТОТ-р. Они также характеризовались более активной спонтанной и стимулированной продукцией 1Ь-

8, Т№-а, 1Ь-2, 1Ь-5, по сравнению с детьми с изолированным колитом и илеоколитом. При изучении экспрессии мРНК в клетках крови и слизистой оболочки кишки данной закономерности установить не удалось. У детей с НЯК зависимость иммунопатологического процесса от локализации была менее выражена, но наибольшая активность иммунного воспаления отмечалась при тотальном и левостороннем колите, хотя максимальная концентрация 1Ь-8 была отмечена у детей с проктосигмоидитом.

О ю 20 30 40 50

Рис. 4. Продукция цитокииов культурой цельной крови у детей с болезнью Крона с различным течением (пкг/мл)

Также на активность иммунного воспаления оказывали влияние характер течения и наличие внекишечных проявлений. Дети со стенозирукяцим и/или пенетрирующем течением БК (рис. 4) имели более высокие показатели спонтанной и стимулированной продукции клетками крови 1Ь-1р, 11.-2,1Ь-6,11.-8, ТЫИ-а, 1Ь-5 и более низкие значения 1Ь-4 и П.-10. Подобные изменения отмечались и при оценке экспрессии мРНК этих цитокинов в клетках крови и в клетках слизистой оболочки кишки. Была выявлена сильная прямая корреляционная связь наличия стенозов и свищей со спонтанной продукцией П.-1Р (Я=0,85 р<0,01) и обратная сильная связь иерианального поражения с ЬРБ-стимулированной продукцией 11.-10 (К=-0,89 р<0,01).

У детей с БК наличие внекишечных проявлений является показателем более активного иммунного воспаления. При оценке спонтанной и стимулированной продукции клетками крови при наличии внекишечных проявлений отмечена высокая продукция II.-1 р, 11.-2, 11.-6, 11.-8, П-'И-'у, 11.-5. У детей без внекишечных проявлений выявлены максимальные значения II.-4 и ЬРЗ+МОР-стимулируемой продукции 11.-10. Больные БК с внекишечными проявлениями имели более высокие значения экспрессии клетками крови и тканей ЮТ-а, а также тканевой экспрессии 11.-8, значения которой при внекишечных проявлениях составило 49,5 копий мРНК/клетка, в то время как без этих проявлений экспрессия составила 38,5 копий мРНК/клетка. Эти закономерности подтверждены выявленными сильными корреляционными связями наличия внекишечных проявлений со спонтанной продукцией 11.-1 р (И=0,8 р<0,05) и с ЬРЗ-стимулированной продукцией 1Ь-10 (Я=-0,8 р<0,05). При исследовании моноцитарной продукции для внекишечных проявлений также было характерным более высокие значения 11.-8.

У детей с НЯК наличие внекишечных проявлений также указывало на высокую активность иммунного воспаления. Дети с внекишечными проявлениями имеют более высокие сывороточные значения всех цитокинов (за исключением 11.-1(5, который был выше при отсутствии внекишечных проявлений), высокие значения спонтанной продукции 1Ь-1р и 11.-8. Со спонтанной продукцией 11.-8 были выявлены корреляционные связи наличия внекишечных проявлений (К=0,72 р<0,05). При исследовании моноцитарной продукции для внекишечных проявлений было характерным более высокие значения 11.-8 и II.-4. При оценке экспрессии мРНК, экспрессия Т№-а клетками крови, была выше при внекишечных проявлениях (5,0 копий мРНК/клетка против 0 копий мРНК/клетка).

Отдельной задачей нашего исследования была оценка состояния иммунного ответа у детей с БК и НЯК в зависимости от показателей клинической и эндоскопической активности.

11,4

11,6

ПЧК-о о

1000 1500 2000 2500

10447

а 1Ь-в ьря+МОР

Н 11,8 МОР а !Ь-8 ЬРБ О 1Ь-8 спонтанно

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

1Ь-10 О 500 1000 1500 2000 2500 3000

Рис. 5. Продукция цитокинов культурой цельной крови у детей с болезнью Крона с различной клинической активностью) (пкг/мл)

У детей с БК прослеживается зависимость оценки клинической активности по РСЭА! и состоянием иммунного ответа, в виде изменений спектра и уровня продуцируемых цитокинов и степени их экспрессии. При анализе цитокиновой продукции в нативной сыворотке крови в зависимости от клинической активности было установлено, что у детей с БК в период обострения отмечается существенное повышение концентрации №N-7, Т№-а, 1Ь-12, и их значения практически одинаковые и не зависят от степени клинической активности. Концентрация ГЬ-4, 1Ь-8, 11.-6. 1Ь-2 выше при умеренной и высокой клинической активности, чем при низкой активности. При низкой клинической

активности выявлено более высокое значение IL-10. Период клинической ремиссии у детей с БК характеризуется более низким сывороточным содержанием IL-Iß, IL-8 и TNF-а.

При изучении особенностей продукции цитокинов клетками цельной периферической крови детей с БК в зависимости от клинической активности (рис. 5) было выявлено, что для активной стадии заболевания характерно преобладание продукции основных провоспалительных цитокинов: IL-lß, TNF-a, IL-6, IL-8, концентрации которых был выше, чем в период клинической ремиссии. Значения IL-lß, 1L-6 и IL-8 у детей с активной стадией БК были минимальным в нестимулированных пробах, постепенно возрастали на фоне стимуляции LPS, MDP и были максимальными в пробах с LPS+MDP. Концентрация 1L-8 была максимальной при стимуляции LPS, превышая концентрацию в пробах с MDP и LPS+MDP в 1,4-1,7 раза (р<0,01). Период ремиссии характеризовался высокой спонтанной продукцией 1L-4 (22,4 пкгр/мл) и IL-10 (623,5 пкгр/мл), на фоне стимуляции их уровень повышался до 40,01 пкгр/мл для IL-4 и до 2556,0 пкгр/мл для ILIO (р<0,05). Для детей в активной стадии была характерна продукция этих цитокинов только при стимуляции, в спонтанных пробах IL-4 и IL-10 не определялись.

При оценке влияния клинической активности на экспрессию генов основных цитокинов и паттерн-распознающих рецепторов у детей с БК отмечено, что в крови максимальная экспрессия отмечена у детей с клинической ремиссией. Среди детей с клинической активностью более высокие значения IL-lß, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, TNF-a, TLR4 и NOD2 выявлялись у детей с высокой и умеренной клинической активностью, но данные различия статистически не значимы.

При исследовании экспрессии изучаемых генов в биоптате слизистой оболочки кишки также отмечены более высокие значения IL-lß, IL-8, IFN-y, TNF-a, TLR4 и NOD2 в группах в умеренной и высокой клинической активностью.

Таблица 4.

Ранговая корреляция клинической активности по РСБ1А в показателей иммунного ответа у детей с БК

Корреляционные пары Коэффициент Спирмана (R) Р

Низкая степень активности (10-20 бал.) концентрация П.-2 в сыворотке 0,60 0,008

концентрация 1Е-10 в сыворотке 0,47 0,048

Ремиссия (0-10 бал.) Спонтанная продукция 1Е-10 цельной кровью 0,72 0,05

При исследовании отдельных показателей педиатрического индекса активности БК и их связи с особенностями иммунного ответа у обследуемых детей были выявлены корреляционные связи (табл. 4).

ООО 2ООО 3000 4000

ршша

ТЬ-6

В 1Ь-6 ЬРБ+МОР

а 1Ь-6МОР

В 1Ь-6 ЬРБ □ 1Ь-6 с

50 200

500 1000 1500 2000 2500 3000

И 704 4 ^889

Щ 1 269 Н 1357 3

I I -

за П.-8 и^+МОР ЕЗ 11.-8 МОР Ш 11-8 ЬРБ О 11 — 8 спонтанно

5000 10000 15000 20000 25000

182 5

В 1Ь-10 ЬРБ+МОР Н 1Ы0 МПР

т И-юьрб

С) 11-10 спонтанно

Рис. 6. Продукция цитокииов культурой цельной крови у детей с НЯК с различной клинической активностью (пкг/мл)

При исследовании степени выраженности иммуновоспалительного процесса у детей больных НЯК с разной оценкой по индексу КасЬтПе\уЦг в нашем исследовании не было получено столь яркой зависимости, как при БК.

При анализе цитокинового спектра сыворотки крови у детей с НЯК в зависимости от индекса клинической активности обращает на себя внимание крайне высокое значение

"ШР-и- 417,3 пкгр/мл,- при высокой активности процесса, а в ремиссию его концентрация составляет 209,1 пкгр/мл. Также в активный период НЯК выявляются более высокие сывороточные значения, как провоспалительных 1Ь-6 (234,0 пкгр/мл против 55,4 пкгр/мл), 11.-8 (834,5 пкгр/мл против 387,6 пкгр/мл), так и противовоспалительного П.-10 (1890,0 пкгр/мл против 106,0 пкгр/мл). Зависимости изменений концентраций данных цитокинов от степени клинической активности но Кас1шн1е%уйг выявлено не было. Стадия клинической ремиссии характеризуется максимальными значениями 11.-4 (191,0 пкгр/мл), 11.-2 (77,6 пкгр/мл), П.-12 (29,4 пкгр/мл), II.-10 (86,4 пкгр/мл), 11.-5 (5,91 пкгр/мл). Различия значений П.-5 в группах с разной клинической активностью статистически значимо (р<0,05).

Дети с различной степенью клинической активности НЯК (рис. 6) имели достаточно активную продукцию провоспалительных цитокинов. Максимальные значения спонтанной продукции 11,-1(1 имели дети с низкой клинической активностью, на фоне стимуляции сопоставимая по уровню продукция этого цитокина отмечалась и у детей с клинической ремиссией. Концентрация 11.-1 р у детей с высокой активностью была крайне низкой. Спонтанная продукция ТОТ-а существенно не различалась у детей с разной клинической активностью. При стимуляции более высокие значения ЮТ-а были отмечены у детей с низкой и высокой клинической активностью. Уровень продукции 11.-6 на фоне стимуляции был высоким во всех исследуемых группах. Но при анализе спонтанной продукции было отмечена зависимость от степени клинической активности -максимальные значения продукции были у детей с клинической ремиссией, по мере нарастания клинической активности уровень спонтанной продукции 1Ь-6 падал, и был минимальным у детей с высокой клинической активностью. При анализе продукции 11.-8 отмечались максимальные значения и хороший ответ на изолированную и комплексную стимуляцию у детей с низкой клинической активностью, у детей с клинической ремиссией и высокой активностью имели сопоставимые с группой низкой активности значения спонтанной продукции, но в ответ на стимуляцию продукция росла незначительно или же даже падала. Дети с высокой клинической активностью имели максимальные значения II.-4, 11.-5, 11.-12 и 1ЕЫ-у. У детей других групп продукция этих цитокинов была незначительной или отсутствовала. Дети с клинической ремиссией и низкой активностью имели более высокие значения продукции П.-10- 233,0 пкгр/мл и 43,5 пкгр/мл соответственно, но при ремиссии ее концентрация была выше, за исключением продукции на фоне комплексной стимуляции ЬРБ+МБР, при которой значения П.-10 в этих группах были почти одинаковыми (728,6 пкгр/мл и 698,5 пкгр/мл соответственно).

При исследовании влияния клинической активности НЯК на экспрессию исследуемых генов было выявлено, что дети с клинической ремиссией имеют максимальные значения экспрессии клетками крови TNF-a и NOD2, превосходящие данные показатели у детей с клинической активностью НЯК. При анализе экспрессии других генов (IL-ip, IL-6, IL-8, IFN-y, TLR4) была выявлена их зависимость от степени клинической активности: чем выше уровень активности, тем выше значение их экспрессии. Исключение составляет экспрессия IL-8, которая при умеренной активности была выше (3,01 копий мРНК/кл), чем при высокой клинической активности НЯК (2,55 мРНК/кл). Различия экспрессии IL-ip были статистически значимыми (р<0,05).

При исследовании тканевой экспрессии у детей с разной клинической активностью НЯК более высокие значения имел IL-8, который был максимальным у детей с клинической ремиссией ( 202,2 мРНК/кл), что выше, чем у детей с низкой активностью (30,1 мРНК/кл), и выше, чем при высокой клинической активности НЯК (100,1 мРНК/кл). Максимальные значения экспрессии IL-ip были у детей с высокой клинической активностью, а IL-6, IL-10, IFN--y, TNF-a - у детей с низкой клинической активностью. Дети с умеренной клинической активностью имели самые высокие значения тканевой экспрессии.

При анализе корреляционных связей продукции основных цитокинов со степенью клинической активности были выявлены сильные прямые корреляционные связи между высокой клинической активностью по индексу Rachmilewitz и спонтанной продукцией клетками цельной крови IFN-? и IL-5 (R=0,74 р<0,01 и R=0,74 р<0,01 соответственно). Корреляционные связи с другими показателями имели слабую или среднюю силу. Болевой синдром был связан со стимулированной (LPS+MDP) продукцией IL-8 клетками цельной крови (R=0,7 р<0,025), наличие внекишечных проявлений также завесила от спонтанной продукции IL-8 клетками цельной крови (R=0,72 р<0,018). Наличие крови в стуле определялось продукцией провоспалительных цитокинов IL-6 и 1L-8. На что указывают сильные прямые корреляционные связи с LPS+MDP-стимулированной продукцией IL-6 клетками цельной кровью (R=0,77 р<0,02), с LPS-, MDP- и LPS+MDP-стимулированной продукцией IL-8 клетками цельной кровью (R=0,70 р<0,025, R=0,70 р<0,025, R=0,70 р<0,025 соответственно).

При оценке особенностей иммунного ответа у детей с разной эндоскопической активностью полученные результаты были крайне противоречивы, как у детей с БК, так и у детей с НЯК. При исследовании продукции цитокинов в сыворотке крови, в культуре клеток цельной крови и изолированных моноцитах не было выявлено четкой зависимости активности иммунного ответа от уровня эндоскопической зависимости. Нами не было

выявлено значимых различий между пациентами с БК, имеющими эндоскопические признаки активности, и пациентами с эндоскопической ремиссией. Не было выявлено зависимости ни от степени активности, ни от продукции II.-1 (1,11.-2,11.-6, 11.-8, ТОТ-а, II.-4,II.-1 0 и Н.-5, ни в ответе клеток периферической крови на проводимую стимуляцию.

Определенная логичность результатов была отмечена при оценке экспрессии генов цитокинов и паттерн-распознающих рецепторов, но только у детей с БК. В крови определялась экспрессия 11.-1 р, 11.-6, 11.-8, П.-10, №N-7, ЮТ-а, Т1.Г(4 и N002, и значения ее нарастало по мере повышения активности, но различия были минимальными и статистически незначимыми. В тканях слизистой оболочки кишки определялась экспрессия 1Ь-1р, 11.-6, 11.-8, 1КЫ-у, ТОТ-<1, ТЬИ4 и N002. Экспрессия генов цитокинов и рецепторов нарастала по мере роста эндоскопической активности, и максимальные значения отмечены у детей с высоким уровнем эндоскопической активности БК.

При анализе влияния эндоскопической активности на продукцию цитокинов клетками периферической крови у детей с НЯК было установлено, что, как и в случае клинической активности, продукция провоспалительных острофазовых цитокинов (11.-1 р, ЮТ-а, 11.-6) была повышена у всех детей с НЯК, независимо от степени эндоскопической активности. Исключением является продукция 11.-8, значения которой на фоне стимуляции была выше у детей с умеренной эндоскопической активностью, а ее концентрация у детей с эндоскопической ремиссией и низкой активностью была в 15,726,7 раза ниже и практически не менялась на фоне стимуляции. Дети с низкой эндоскопической активностью НЯК имели максимальные значения, как спонтанной, так и стимулированной продукции 11.-10 и 11.-4.

У детей с НЯК была выявлена моноцитарная продукция II.-1р, 11.-2,11.-8, 1РЫ-у, II.-4, 11.-5. Наиболее показательными были изменения Н.-4 и 1Ь-8. Провоспалительный 11.-8 определялся только в пробах с высоким индексом эндоскопической активности, причем только у детей с умеренной и высокой клинической активностью, а у детей с эндоскопической ремиссией медиана значений продукции П.-8 была равна нулю. 11.-4 определялся у детей всех групп. Наиболее высоким он был при эндоскопической ремиссии.

При анализе влияния эндоскопической активности НЯК на экспрессию генов основных цитокинов и паттерн-распознающих рецепторов была выявлена зависимость экспрессии генов клетками крови от степени активности. Максимальные значения экспрессии 11.-1 р, 1Ь-6, 11.-8, №N-7 отмечались у детей с высокой эндоскопической активностью. Экспрессия ТОТ-а была выше у детей с низкой эндоскопической активностью (5,0 мРНК/кл). Значение экспрессии рецепторов Т1.Я4 и N002 был выше у

детей с эндоскопической ремиссией (3,0 и 2,01 мРНК/кл соответственно). При исследовании тканевой экспрессии было установлено, что дети с эндоскопической ремиссией имели максимальные значения 11,-10, 11.-8, ТМ--а, ТОТ-Р и ТЬЯ4. У детей с высокой эндоскопической активностью был повышен только II.-4 (10,2 мРНК/кл), при эндоскопической ремиссии его значения были ниже (5,01 мРНК/кл ) (р<0,05).

Таким образом, нами было выявлено, что активность иммунного воспалительного процесса адекватно отражает только Педиатрический индекс активности болезни Крона (РС13А1), при оценке тяжести по которому выявлено соответствие с уровнем продукции в крови и экспрессии в тканях основных цитокинов островоспалительной реакции. При высокой степени клинической активности БК по РСБА! отмечаются максимальные значения провоспалительных цитокинов (1Ь-1 р, 11,-6, 11.-8, П-М-у, ТКТ-а, ТЫБ-р, П.-5, 1Ь-12) и минимальная продукция противовоспалительных 11.-4 и П.-10. Данный критерий является информативным.

Оценка активности НЯК у детей по индексу КасИтПеду^ не отражает основные закономерности развития воспалительного процесса. Методы оценки клинической активности НЯК у детей требуют дальнейшей разработки. Методы эндоскопической диагностики ВЗК с использованием эндоскопических индексов активности БК (ЗЕЙ-СО) и НЯК (индекс КасЬтПеууИг) у детей являются крайне субъективными и не позволяют адекватно оценить активность иммунного воспаления.

ВЫВОДЫ

1. У детей с БК степени клинической активности по Педиатрическому индексу активности болезни Крона (РСОА1) соответствуют активности иммунного воспаления. При высокой степени клинической активности БК отмечаются максимальные значения провоспалительных цитокинов (1Ь-1р, 1Ь-6, 11,-8, 1ЕЫ-у, ТОТ-а, ТОТ-Р, 11,-5, II.-12) и минимальная продукция противовоспалительных 11.-4 и П.-10. Информативность РСОА1 подтверждается сильной корреляционной связью с 1_Р5+МОР-стимулированной продукцией 11,-1 клетками цельной крови (11=0,898 р<0,006). Не выявлено соответствия оценки по индексу ЯасЬтЛе^укг у детей с НЯК и эндоскопическим индексам при БК и НЯК активности иммунного воспаления.

2. Болезнь Крона у детей по сравнению с неспецифическим язвенным колитом характеризуется выраженной воспалительной реакцией. Выявлена зависимость воспаления от локализации, тяжести и течения БК. НЯК характеризуется высокой гетерогенностью иммунного воспаления.

3. Клиническими критериями высокой активности иммунного воспаления при БК являются изолированное поражения верхних отделов ЖКТ и изолированный илеит, а также стенозирующее и/или пенетрирующее течение заболевания.

4. Внекишечные проявления при БК и НЯК является высоко информативными клиническими показателями высокой активности иммунного воспаления, что подтверждается выявленными сильными корреляционными связями при БК со спонтанной продукцией клетками крови 1Ь-1 [1 (Я=0,8 р<0,05) и с ЬРБ-стимулированной продукцией 1И0 (К=-0,8 р<0,05); при НЯК - со спонтанной продукцией клетками крови 1Ь-8 (Я=0,72 р<0,05) и с уровнем мРНК ТОР-а в клетках крови (К=0,48 р<0,05).

5. Лабораторными критериями высокой активности иммунного воспаления при БК и НЯК является повышенная продукция 1Ь-8, особенно ЬР5-стимулированная (р<0,01) при БК, что подтверждается выявленными корреляционными связями продукции ГЬ-8 с болевым синдромом (К=0,7 р<0,05), примесью крови в стуле (11=0,70 р<0,05) и внекишечными проявлениями (Я=0,72 р<0,05) у детей с НЯК.

6. Показателем клинической ремиссии является высокий уровень 1Ь-10, выявлена сильная корреляционная связь спонтанной продукции 1Ь-10 клетками цельной кровью с клинической ремиссией БК (К =0,72 р<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Оценивать активность и определять прогноз течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей необходимо по результатам исследования концентрации цитокинов в сыворотке и при стимуляции цельной крови, а так же определяя экспрессию основных цитокинов и рецепторов ТЬЯ4, N002 методом ПЦР в режиме реального времени в биоптатах слизистой толстого кишечника и в периферической крови.

2. Морфологическое исследование биоптатов слизистой оболочки толстой кишки у детей с воспалительными заболеваниями кишечника должно сопровождаться изучением экспрессии основных цитокинов и рецепторов Т1Л4, N002 методом ПЦР в режиме реального времени, что важно для диагностики, определения распространенности патологического процесса и построения прогноза.

3. Диагностическими критериями воспалительных заболеваний кишечника у детей служат нарастание концентрации провоспалительных цитокинов в сыворотке крови, при стимуляции цельной крови и снижение концентрации противовоспалительных цитокинов, что требует активации проводимой терапии

4. Для оценки активности и определения прогноза течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей целесообразно использовать разработанные нами дополнительные диагностические критерии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хандамирова О.О., Шумилов П.В., Ипатова М.Г., Цимбалова Е.Г., Цветков П. М., Осипова Е.Ю., Карпина Л.М. // Индукция цитокинов под влиянием белков бактериальных оболочек у детей с воспалительными заболеваниями кишечника // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2008,- Т. XVIII, №5,- Приложение №32 «Материалы XIV Российской Гастроэнтерологической Недели, 6-8 октября 2008г., Москва. - С.64.

2. Ипатова М.Г., Шумилов П.В., Хандамирова О.О., Цимбалова Е.Г., Осипов Г.А., Хромова С.С., Бобрынина В.О., Щиголева НЕ. Микробный фактор при воспалительных заболеваниях кишечника у детей.// Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии,- 2008 - Т. 18.-№5,- стр.58.

3. Хапдамирова О.О., Шумилов П.В., Ипатова М.Г., Цимбалова Е.Г., Цветков П. М., Румянцев С.А., Мухина Ю.Г. Особенности экспрессии цитокинового профиля при воспалительных заболеваниях кишечника у детей // Сборник материалов Седьмого Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва, 2008 г. - С. 65.

4. Хандамирова О. О. Цитокиновый профиль у детей с воспалительными заболеваниями кишечника //Педиатрическая фармакология. - 2008. - Том 5,N 6 . - С. 130.

5. Шумилов П.В., Хандамирова О.О., Малахинова H.A., Ипатова М.Г., Румянцев С.А., Потапов A.C. Роль иммунных нарушений и микробного фактора в развитии воспалительных заболеваний кишечника у детей // Вопросы детской диетологии. -2009,- Т.7, №4. - С. 13-19.

6. Хандамирова О.О., Шумилов П.В., Румянцев С.А. Особенности неспецифической иммунной реакции на микробные антигены у детей с воспалительными заболеваниями кишечника // Российский иммунологический журнал. - 2009. - Т. 3(12), №3-4. - С. 318-325.

7. Шумилов П.В., Хандамирова О.О., Ипатова М.Г., Пащенко А.Б., Потапов A.C. Особенности иммунного воспаления у детей при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите //Вопросы детской диетологии. - 2010.-Т.8, № 2. - С 13-18.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БК - болезнь Крона

ВЗК - воспалительные заболевания кишечника

ВОЖКТ - верхние отделы желудочно-кишечного тракта

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

МПК - минеральная плотность костной ткани

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

НЯК - неспецифический язвенный колит

ПК - периферическая кровь

ПЦР - полимеразная цепная реакция

IL - интерлейкин

LPS - липополисахарид

МБР - мурамилдипептид

РСРА] - педиатрический индекс активности болезни Крона 8Е5-СО - простой эндоскопический индекс активности болезни Крона

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) до настоящего времени остаются одной из наиболее серьезных и нерешенных проблем в педиатрии и гастроэнтерологии. По тяжести течения, частоте осложнений, и летальности болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (НЯК) занимают одно из ведущих мест в структуре болезней желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) детского возраста. В последние годы отмечается стремительный рост НЯК и, особенно, БК во всем мире, включая индустриально развитые страны, где тенденция роста наиболее высока. С каждым годом отмечается омоложение заболевания и уже регистрируются новые случаи болезни у детей первого года жизни.

На сегодняшний день распространенность ВЗК в мире составляет от 2,2 чел до 6,8 на 100 ООО детей. Частота НЯК в России составляет 20:100 000 населения из них около 10% составляют дети. Частота болезни Крона 3,5 на 100 000, из них 20-25% составляют дети [22]. Пик заболевания приходится на юношеский возраст и составляет около 1-2 случаев заболевания на 1000 человек [73]. Реальная частота ВЗК существенно выше, так как легкие формы НЯК и БК часто остаются не распознанными.

Хотя принято считать, что БК и НЯК разные заболевания, однако в своей клинической манифестации, по иммунологическим механизмам развития данной патологии и терапевтическому алгоритму они весьма схожи, что позволяет их рассматривать совместно как группу заболеваний.

Этиология ВЗК неизвестна. С современных позиций патогенез ВЗК рассматривают как генетически детерминированную дисрегуляцию иммунной системы хозяина на патоген-ассоциированные молекулы, в том i числе резидентную микрофлору кишечника и антигены пищи. В первую очередь эта дисрегуляция проявляется на уровне слизистой оболочки кишечника, где происходит максимальное взаимодействие микрофлоры с различными компонентами иммунной системы. В результате изменений функций клеток, участвующих в поддержании адекватного локального иммунного ответа происходит не контролируемое высвобождение растворимых медиаторов воспаления, итогом чего является развитие I патологии, в том числе ВЗК [131].

Иммунопатогенез БК и НЯК отличаются уровнем дифференцировки и активации Т-клеточного звена иммунитета. При обоих заболеваниях идет активация Т-клеток, но при БК в силу преобладания в слизистой СБ4-клеток с фенотипом Т-хелперов 1 типа (Thl) идет продукция преимущественно IFNy, TNFa и IL-23. В то время как при НЯК в слизистой отмечается повышение СВ4-клеток с фенотипом Т-хелперов 2 типа (Th2) и, следовательно, гиперпродукция IL-5 и IL-13 [46, 97, 165]. Подобная активация Thl возможно связана с подавлением контролирующих механизмов, в частности регуляторных клеток (CD4+CD25+,Th3). [158]. I

Важную роль в этом процессе играют и функциональные нарушения Trl-клеток, которые секретируют в высоких дозах IL-10, цитокин, подавляющий активность Thl-клеток [74]. Детальные исследования на лабораторных животных показали, что длительная стимуляция продукции цитокинов Thl-клетками вызывает активацию макрофагов, которые, в свою очередь, продуцируя IL-12, IL-18 и фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, вызывая дальнейшую стимуляцию Thl-клеток. Активированные макрофаги в свою очередь так же продуцируют спектр различных воспалительных цитокинов - TNF, IL-1, IL-6, что, в конечном счете, приводит к продукции неспецифических медиатров воспаления и повреждению тканей, а, следовательно, манифестации заболевания [158]. Итогом чрезмерной Т-клеточной активности при ВЗК является возникновение чрезмерного и продолжительного синтеза цитокинов в очаге воспаления.

С другой стороны накоплено достаточно много новой информации о роли врожденного иммунитета в патогенезе ВЗК, что ставит под сомнение первичность Thl и Th2 ответов в возникновении БК и НЯК. Возможно, эти ответы являются следствием дефектов, в механизмах врожденных иммунных ответов. Процесс распознавания микробных агентов с помощью врожденного иммунитета, происходит через То11-подобные рецепторы (TLR), которые располагаются на мембране клеток, и протеинами NOD, располагающимися в цитоплазме. Эти рецепторы обладают строгой специфичностью. Возможно, функциональная активность TLR и NOD нарушены при ВЗК. Трансфекционные исследования показали, что мутации NOD2 приводят к дефектной способности отвечать на липополисахариды (LPS) при БК [86].

Все эти исследования совместно с наблюдением животных моделей и генетическими ассоциациями, являются серьезными фактами, объясняющими огромную роль дефектов врожденного иммунитета в качестве ключевого компонента в основе развития ВЗК и, особенно, БК. Достаточно ли одиночных дефектов иммунитета или только их комбинация необходима для запуска и поддержания воспалительного процесса пока неизвестно, и требует дальнейшего исследования.

НЯК и БК до сих пор остаются неизлечимыми заболеваниями. Лечение ВЗК является многоступенчатым и требует назначения гормональной и цитостатической терапии, а также при неэффективности терапии -хирургического лечения. Для оценки состояния больного, определения тактики терапии, ее объема, прогноза заболевания, своевременного выполнения хирургического лечения необходима адекватная оценка тяжести и активности основного процесса. Разными авторами были предложены индексы активности воспалительного процесса, выраженные в баллах, включающих, как правило, клинические и/или эндоскопические изменения. Одним из первых индексов для НЯК были разработаны критерии активности предложенные в 1955 году Truelov и Witts [1-3, 28, 161], чуть позже появились индексы Schroeder, Масевича. Для применения в педиатрии был разработан индекс активности ESPGHAN. В настоящее время в педиатрической практике широко используется индекс активности Rachmilewitz, который, как считается, наиболее полно отражает тяжесть заболевания [6,10, 23].

Для БК был разработан в 1980 году индекс Ван - Гееса, несколько I позже появился индекс активности для БК (CDAI) по Best. Для больных со свищевой формой БК в 1990г. был предложен Perianal Disease Activity Index (PDAI), но и он не дает полного представления о тяжести процесса так как не отражает эндоскопическую картину заболевания. В 1989 г. был выработан эндоскопический индекс активности CDEIS, появились и другие индексы: Harvey Bradshaw, CapeTown index. В 1991г. для использования в мультицентровых исследованиях был составлен педиатрический индекс активности болезни Крона (PCDAI) [28] и в настоящее время широко используется в практической медицине. Наличие большого количества систем оценки активности, как БК, так и НЯК, указывают на неоднозначность и недостатачную информативность этих показателей.

Практически не существует зарубежных работ, сопоставляющих индексы активности между собой и только по данным исследований отечественных авторов проведенных на базе Научного Центра Здоровья детей РАМН Цимбаловой Е.Г., была дана комплексная оценка критериев активности ВЗК и было показано, что для оценки тяжести НЯК у детей максимально информативным является клинический индекс активности Rachmilewitz, который наиболее полно отражает тяжесть заболевания ребенка, а для БК наиболее информативным является педиатрический индекс активности - PCDIA так как он учитывает возрастные особенности детей и отражает степень тяжести заболевания ребенка.

Не смотря на огромное количество спредложенных индексов активности, не один из них не дает представление об истинной картине воспалительного процесса, так как не отражает всю полноту иммунопатогенетических особенностей болезни, а следовательно требует пересмотра с учетом новых знаний о иммунных нарушениях, происходящих при этих двух заболеваниях.

Цель исследования:

Оценить информативность существующих критериев активности ВЗК заболеваний на основании комплексного изучения особенностей иммунного ответа у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом для их оптимизации и адаптации применительно к детскому возрасту.

Задачи исследования:

1. Оценить активность процесса при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей по существующим клиническим и эндоскопическим критериям.

2. Определить концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов (IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, TNF-a, TNF-ß, IL-5, IL-12) в сыворотке крови у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом с разной локализацией и активностью воспалительного процесса.

3. В эксперименте изучить спонтанную и стимулированную (липополисахаридом, мурамилпептидом, и их сочетанием) продукцию про- и противовоспалительных цитокинов (IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, ILIO, IFN-y, TNF-a, TNF-ß) в культуре цельной крови и изолированных моноцитов периферической крови у детей с БК и НЯК с разной локализацией и активностью воспалительного процесса.

4. Оценить экспрессию м-РНК про- и противовоспалительных цитокинов (IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, TNF-a, TNF-ß) и рецепторов (TLR4 и NOD2) в клетках цельной крови и биоптата слизистой оболочки кишечника у детей с БК и НЯК с разной локализацией и активностью воспалительного процесса.

5. На основании сопоставления традиционных критериев активности БК и НЯК с особенностями иммуно-воспалительной реакции при разной локализации и активности воспалительного процесса ВЗК у детей определить их информативность и предложить дополнительные критерии оценки активности заболеваний.

Научная новизна:

Впервые установлены особенности иммунного воспаления в зависимости от клинических форм, локализации процесса и течения у детей при БК и НЯК на основании проведенного комплексного изучения иммунного воспаления по данным сывороточного уровня основных про- и противовоспалительных цитокинов (1Ь-1(3,1Ь-2,1Ь-4,1Ь-6,1Ь-8,1Ь-10, ШИ-у, ТОТ-а, ТИР-Р, 1Ь-5, 1Ь-12), их спонтанной и стимулированной продукции в культуре цельной крови и изолированных моноцитов периферической крови, экспрессии м-РНК про- и противовоспалительных цитокинов и паттерн-распознающих рецепторов (N002 и ТЫ14) в клетках крови и слизистой оболочки толстой кишки.

Оптимизирована оценка информативности традиционных индексов активности БК и НЯК при сопоставлении с объективными показателями иммунного ответа у детей с ВЗК с разной локализацией и активностью воспалительного процесса.

Предложены новые дополнительные критерии активности болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей: клинические критерии высокой активности иммунного воспаления БК: изолированное поражения верхних отделов ЖКТ, изолированный илеит, наличие внекишечных проявлений, а также стенозирующее и/или пенетрирующее течение заболевания; клинические критерии высокой активности иммунного воспаления НЯК: наличие внекишечных проявлений; лабораторные критерии высокой активности иммунного воспаления БК и НЯК: повышенная продукция 1Ь-8, особенно ЬР8-стимулированная продукция; лабораторные критерии ремиссии является высокий уровень 1Ь-10.

Практическая значимость:

Выявленные особенности иммунного воспаления у детей с БК и НЯК с разной локализацией и активностью воспалительного процесса позволяют объективно оценить активность патологического процесса для оптимального подбора терапии.

Результаты, полученные в ходе исследования, позволили оптимизировать критерии оценки активности ВЗК у детей на основании патогенетически обоснованных научных данных, что позволяет рационализировать терапию, прогнозировать течение и рецидив заболевания. Показана высокая информативность педиатрического индекса активности болезни Крона (PCDAI).

Показано, что оценка иммунного воспаления должна базироваться на комплексном исследовании концентрации цитокинов в нативной сыворотке, их спонтанной и стимулированной продукции в культуре крови и экспрессии их генов в крови и тканях, так как исследование только концентрации в сыворотке не отражает истинного характера иммуно-воспалительной реакции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Оценивать активность и определять прогноз течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей необходимо по результатам исследования уровня цитокинов в сыворотке и при стимуляции цельной крови, а так же определяя уровень экспрессии основных цитокинов и рецепторов Т1Л4, N002 методом ПЦР в режиме реального времени в биоптатах слизистой толстого кишечника и в периферической крови.

2. Морфологическое исследование биоптатов слизистой оболочки толстой кишки у детей с воспалительными заболеваниями кишечника должно сопровождаться изучением уровня экспрессии основных цитокинов и рецепторов ТЬЫ4, N002 методом ПЦР в режиме реального времени, что важно для диагностики, определения распространенности патологического процесса и построения прогноза.

3. Диагностическими критериями воспалительных заболеваний кишечника у детей служат нарастание уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке крови, при стимуляции цельной крови и снижение уровня противовоспалительных цитокинов, что требует активации проводимой терапии I

4. Для оценки активности и определения прогноза течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей целесообразно использовать разработанные нами дополнительные диагностические критерии.