Автореферат и диссертация по медицине (14.00.44) на тему:Криосохраненные аллографты для сердечно-сосудистой хирургии

Российская академия медицинских наук Научный центр сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева

На правах рукописи.

Бритиков Дмитрий Вячеславович

«КРИОСОХРАНЕННЫЕ АЛЛОГРАФТЫ ДЛЯ СЕРДЕЧНОСОСУДИСТОЙ ХИРУРГИИ»

(сердечно-сосудистая хирургия - 14.00.44)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН

Научный консультант: академик РАМН Л.А. Бокерия

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

В.А. Иванов

доктор медицинских наук, профессор

A.А. Гаджиев

доктор медицинских наук, профессор

B.Т. Селиваненко

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ

Защита диссертации состоится %£щ<>Н&2004 г. в 15.00 часов на заседании Специализированного Совета Д.001.015.01. при Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН (121552, Москва, Рублевское шоссе, 135)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦ ССХ РАМН

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук Д.Ш.

Газизова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы

Аллогенные протезы клапанов сердца прочно вошли в арсенал кардиохирургических центров, благодаря работам D.N. Ross, B.G. BarratBoyes, W.W. Angel!,- M.F. O'Brien, В.И. Бураковского, Г.И. Цукермана, В.П. Подзолкова и других.

На сегодняшний день в ведущих кардиохирургических центрах накоплен обширный успешный опыт клинического применения аллоген-ных протезов.

Эти данные позволяют утверждать, что аллографты являются клапанами выбора у многих групп пациентов.

Параллельно клиническому использованию был выполнен обширный спектр исследований, описывающих физиологические, биохимические, биофизические, биомеханические, гистологические и ультраструктурные характеристики аллогенных биопротезов клапанов сердца на основных этапах их забора, изготовления, хранения, подготовки к имплантации и дальнейшего функционирования после имплантации.

Сейчас основные усилия исследователей сосредоточены на изучении судьбы имплантированных аллографтов у различных категорий пациентов, а также на улучшении качества аллогенных клапанов. В этом направлении заметны две отчетливые тенденции.

Во-первых, многие исследователи полагают, что иммунный ответ на пересаженный аллографт играет решающую роль в развитии кальцино-за и дегенерации протеза. Следовательно, подбор аллографта по антигенным свойствам для каждого конкретного пациента позволит решить проблему долговечности. (Moustapha A., Ross D. 1997, Shaddy R. 1997, Zhao X., O'Brien M. 1994)

Другие авторы вообще не хотят принимать во внимание иммунологический статус пациента, так как они уверены, что межклеточное вещество мало иммуногенно, а клетки — основной иммуногенный материал - они предлагают удалить из ткани клапана, заселив их взамен собственными тканеобразующими клетками реципиента, которые впоследствии и будут обновлять коллагеновый каркас клапана. (Koolbergen D., Hazekamp М. 1995, 1997, O'Brien М. 1999,2000). Эта идея кажется еще более заманчивой, так как уже практически доказано, что донорские клетки после операции постепенно практически полностью элиминируются, замещаясь собственными клетками реципиента Если гипотеза о

самообновлении подтвердится, то мы получим практически идеальный тип биопротеза, живущий столько, сколько сам реципиент. На сегодняшний день в Центре имплантировано уже около 130 трансплантатов. Ре-

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ} БИМИОТЕКА I

зультаты наблюдения за прооперированными больными на имеющихся сроках (до десяти лет) в основном удовлетворительные.

Однако анализ собственных клинических данных и сведений из доступных зарубежных публикаций по применению криосохраненных ал-лографтов ставит и много спорных, неясных вопросов, главными из которых являются:

1. В чем заключается роль клеток реципиента в ткани донорского клапана?

2. Степень биосовместимости трансплантата в зависимости от числа живых и погибших донорских клеток.

3. Факторы реципиента, которые необходимо учитывать при имплантации аллографта, чтобы обеспечить его долговечность.

4. Причины избирательной кальцификации стенки аорты трансплантата перед створками его же клапана.

Цель исследования:

Создание криосохраненных клапаносодержащих аллогенных трансплантатов для коррекции врожденных и приобретенных пороков сердца и венозных сосудов. Задачи исследования:

1. Обобщить опыт организации мелкосерийного производства и создания в НЦССХ банка криосохраненных аллографтов.

2. Обобщить данные экспериментальных исследований по изучению качества аллографтов.

3. Изучить влияние клеточных элементов донора и реципиента на долговечность аллографтов на основе экспериментальных данных.

4. Создать на основе проведенных исследований новый тип криосохра-ненных аллографтов, отвечающих основным требованиям кардиохирургов к этому типу биопротезов.

5. Анализ опыта применения аллографтов при различных врожденных и приобретенных пороках сердца.

Научная новизна исследования.

Настоящее исследование отражает один из этапов работы, проводимой в НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН по разработке и внедрению в клиническую практику новых образцов биологических клапанов для кардиохирургии. В работе обоснована возможность комплексной оценки качества изготавливаемых криосохраненных аллогенных кондуитов с помощью применения методов определения жизнеспособности в сочетании с гистологическими и биомеханическими исследованиями. Выявлены критические параметры технологической схемы, влияющие на качество аллографтов. Получены методы внедрения клеток в матрикс аллографтов, получен новый тип аллографтов на основе методов тканевой инженерии.

Обобщен опыт клинического использования, аллографтов, изготовленных в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева, в сердечно-сосудистой хирургии.

Практическая ценность и реализация результатов.

В результате всего комплекса научно-поисковых работ предложены аллогенные клапаносодержащие кондуиты, изготовленные по новой технологической схеме, с высокими.качественными параметрами.. Данные протезы внедрены в клиническую практику в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. Дана оценка непосредственных и отдаленных результатов применения аллографтов, выявлены их недостатки и уточнены показания к применению.

Положения, выносимые на защиту.

1. Криосохраненные клапаносодержащие аллографты аорты и легочной артерии являются биологическими протезами, способными адекватно корригировать врожденные и приобретенные пороки сердца, венозные аллографты также являются протезами выбора при лечении хронической венозной недостаточности нижних конечностей..

2. Предложенная технология изготовления криосохраненных трансплантатов позволяет без значительных повреждений сохранить клеточные элементы и матрикс аллографтов.

3. Цитотехнологическая модификация аллографтов позволяет улучшить их биосовместимость, в частности, снизить склонность к каль-цификации.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 37 печатных работ, из них 13 - в центральной печати. Их список прилагается. Апробация работы.

Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены:.

• на 9 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 18-21 ноября 2003);

• • на научно-практической конференции «Актуальные вопросы сердеч-

но-сосудистой хирургии» (Н. Новгород, 2003 г.)

• на объединенной научной конференции отделений детей старшего возраста с ВПС, неотложной и реконструктивной хирургии ППС, отдела медицинской биотехнологии НЦ ССХ (15 января 2004 г.)

Объем и структура исследования..

Диссертация состоит из введения, десяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, охватывающего 17 отечественных и 476 иностранных источников. Работа изложена на 250 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 70 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследование выполнено на нативных клапанах человека, забираемых в условиях судебно-медицинского морга через 4-24 часа после смерти, и свиней, забираемых на мясокомбинате сразу после забоя животных. При этом человеческие клапаны исследовались на всех технологических этапах производства аллографтов в Отделе медицинской биотехнологии, включающих забор, ишемическое хранение, выделение аллографтов, стерилизацию и криозамораживание. Свиные аортальные, митральные и легочные клапаны были взяты в качестве модели человеческих клапанов и исследовались по схеме, аналогичной исследованию человеческих клапанов.

Всего исследованы клапаны сердца, взятые от 120 животных и от 200 доноров. Также исследовались образцы клапанов, эксплангированных на операции повторного протезирования аортального клапана в связи с дисфункцией аллографта (3 клапана).

1.Изучение жизнеспособности клеточных элементов аллографтов на различных этапах изготовления аллогенных криосохраненных кондуитов.

Влияние различных физико-химических воздействий при изготовлении аллографтов на жизнеспособность их клеточных элементов оценивали следующими методами.

Люминесцентная микроскопия с витальными красителями (метиле-новый синий, хлортетрациклин, этидиум бромид, Hoechst 33258).

Для изучения динамики накопления связанного кальция в препаратах клапанов сердца использовали флуоресцентный зонд - хлортетрациклин (ХТЦ) ("Sigma" США). Визуализацию и микроспектрофлуори-метрию исследуемых препаратов проводили с помощью люминесцентного микроскопа "Люмам И-3". Использовали волну возбуждения 400 нм, а регистрации - 520 нм. О динамике связанного кальция судили по интенсивности флуоресценции окрашенных фибробластов. Для изучения динамики окислительно-восстановительных процессов в тканях клапанов сердца использовали метиленовый синий (МС) (50мкМ). Спектрофото-метрический сигнал регистрировали в области 605 нм (один из максимумов поглощения света окисленными формами красителя); длина волны освещения - 520 нм. Для изучения целостности клеточных мембран использовали окрашивание тканей аллографтов ядерными красителями. Для этого нативные и поврежденные ткани окрашивали в среде RPMI-1640 этидиум бромидом (5 -10 мкг/мл) или Hoechst 33258 (2 мкг/мл). Для возбуждения люминесценции этидиум бромида использовали свет от лампы КГМ-100, прошедший светофильтр СС-15-2. Люминесценцию фрагментов ткани регистрировали на длине волны 590 нм. Флуоресцен-

цию ткани, нагруженной красителем Hoechst 33258, возбуждали светом длиной волны вблизи 350 нм, используя светофильтры УФС-6-3 и СЗС-21-2. Сигнал люминесценции фрагментов ткани регистрировали на длине волны 535 нм.

Оценка клеточного дыхания по поглощению кислорода..

Дыхание оценивали по уменьшению содержания кислорода в замкнутом объеме в присутствии микрофрагментов ткани размером 0,51,0 мм, полученных измельчением створок клапана ножницами. Измерения проводили электродом Кларка в ячейке объемом 1 мл при 37°С в среде RPMI-1640 при непрерывном перемешивании. Вначале, после внесения ткани, в течение 20- 30 мин записывали кинетику уменьшения содержания кислорода за счет эндогенного дыхания клеток. Затем добавляли сук-цинат до 10 мМ и оценивали стимуляцию дыхания сукцинатом. Оценка синтеза (общей концентрации) ЛТФ и динамики восстановленных и окисленных форм пиридиннуклеотидов.

Для определения АТФ отделяли от препаратов кусочки ткани клапанов, фиксировали в жидком азоте и растирали в фарфоровой ступке. Из полученного порошка экстрагировали АТФ в течение 2 мин при 90°С в растворе (0,5мл) 20мМ фосфатного буфера (рН 7,0). Экстракт центрифугировали и из супернатанта отбирали аликвоты (10-20мкл) для анализа АТФ на хемилюминометре "Люцифер". Среда для определения АТФ (0,5 мл) содержала: 50 мМ KCl, 5 мМ MgC12, 1 мМ EDTA, 10 мМ Трис-буфера (рН 7,5), 250 мкг/мл люциферин-люциферазы и 50 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA).

Для определения NADH и NADPH использовали коммерческий набор реагент для биолюминесцентного анализа", выпускае-

мый Институтом биофизики СО РАН. Определение ПН проводили в среде, содержащей 20 мМ фосфатного буфера (pH 7,0), 10-4 М дитиотриэтола и набор реагентов для люминесцентного анализа.

Изучение включения меченного 3Н - пролина в белки клеток и внеклеточного матрикса.

Кусочек клапана (около 100 мг)тгцательно измельчали ножницами, помещали в 1мл среды RPMI-1640 и инкубировали на шейкере Туре 327 (Польша) в течение 3-7 часов в атмосфере 5% СО2 в присутствии

4°С, затем образцы тщательно гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе, промывали 2 раза по 30 мин с 1 мл 5% ТХУ, ресуспендировали в 5мМ Tris-HCl. Аликвоты по 200 мл отбирали на счет включенной метки (счетчик SL-4000, Франция), али-квоту 100 цл заливали 900 цл 0,1% SDS в IN NaOH для определения белка по Лоури. Из полученных данных вычитался уровень неспецифической сорбции.

Выращивание клеточной культуры фибробластов.

Для получения культуры клеток створок клапанов сердца свиньи применяли методику культивирования первичных эксплантатов. Створки клапана промывали в культуральной среде ДМЕ (Sigma), иссекали ножницами на фрагменты размером 0,5-1 мл и высевали в пластиковые 24-луночные культуральные планшеты (Nunclone) в смесь сред ДМЕ и 199 (1:1) (Sigma) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Sigma), 50 мкг/мл гентамицина и 20 мкг/мл флуконазола. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% двуокиси углерода. 2.Определение упруго - прочностных свойств аллографтов.

Для определения упруго-прочностных свойств вырезали образцы в соответствии с осями привязки в осевом (вдоль свободного края створки) и радиальном направлении. Образцы вырезали в виде лопаток с размерами 8*11 мм и базой 25*5 мм (согласно ГОСТ 11262-80). Образцы испытывали на приборах "Instron 1122" и "Instron 1026" с пневматическими зажимами и скоростью движения зажимов 1 см/мин. Растяжение образцов и его зависимость от приложенного усилия регистрировали графически на самописцах приборов. Определяли предел прочности, модуль упругости, запас деформативной способности.

3.Оценка влияния криосохранения на гистологическую структуру-аллографта.

Участки стенки аорты, примыкающей к клапану, а также створки аортального и легочного клапанов, помещали в 10% раствор формалина, после чего фиксировали в криостате, делали срезы, окрашивали гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону, на эластические волокна и исследовали при световой микроскопии.

4. Модификация аллографта клетками реципиента.

Девитализированную ткань клапанов помещали на дно лунки культу-рального планшета. В лунку наливали 1 мл суспензии клеточной культуры с концентрацией 0,1-0,2 млн. клеток/мл. Через 1, 2, 3 суток брали участок ткани и анализировали люминесцентным методом, применяя окраску красителями и этидиум бромидом или флуоресцеиндиаце-

татом и этидиум бромидом.

5. Девитализация аллографтов.

Девитализация дистиллированной водой, рибонуклеазой (РНК-аза) и дезоксирибонуклеазой (ДНК-аза).

Мы изучали кинетику гибели клеток при инкубации ее в растворе ферментов ДНК-азы (0.2 мг/мл) и РНК-азы (20 мкг/мл). инкубации в воде и переваривание ДНК на образцах стенки аорты и створках аортального клапана свиньи (всего 15 клапанов) размером 0,5x0,5 см с последующим

контролем эффективности девитализации с помощью метода люминесцентной микроскопии

Девитализация растворами трипсина, ЭДТА, РНК-азы, ДНК-азы -

Методика заключается в удалении клеточного материала из имплантатов путем обработки смесью (1:1) растворов трипсина (0.1%) и версена (0.02% ЭДТА) 24 часа с последующей отмывкой и 2 часовой инкубацией ткани в растворах ДНК-азы (0.2 мг/мл) и РНК-азы (20 мкл /мл). Девитализация раствором додецилсульфата натрия, РНК-азы, ДНК-азы

Мы проверяли, насколько инкубация с 0.1% SDS (24 часа) с последующей инкубацией с ДНК-азой (0.2 мг/мл) и РНК-азой (20 мкг/мл) (24 часа) может способствовать удалению клеточного материала, которое оценивали по деградации хроматина, определяемой при люминесцентной микроскопии с ЭБ и Н33342.

Девитализация ткани раствором, содержащим дигитонин, трипсин, ЭДТА, РНК-азу н ДНК-азу.

Было изучено удаление хроматина при одновременной обработке ткани раствором содержащим трипсин (0.12%), версен (0.01% ЭДТА), дигитонин (0.01%), ДНК-азу (0.2 мг/мл) и РНК-азу (20 мкг/мл). Использование ультразвука для элиминации клеточного материала из девитализированной ткани.

Мы попытались использовать для девитализации ультразвуковую обработку на частоте 4.4 МГц, которая, как известно, интенсифицирует проникновение ферментов в ткань. Участки стенок и створок клапанов сердца свиньи инкубировали в растворе с трипсином (0,12%), версеном (0,1% ЭДТА) и дигитонином (0.01%) в течение 6 часов, облучая ультразвуком с указанной частотой.

Использование краткосрочной гипертермии для девитализации ткани.

Ткань в среде RPM1 - 1640 с добавкой антибиотиков инкубировали 2 ч при 42,44, 47, 50, 53°С и затем продолжали инкубацию при 37°С. Затем определяли морфологию ядер клеток ткани после окрашивания Hoechst 33342 и этидиум бромидом.

Инициация апоптотической гибели клеток раствором ЭДТА..

Ткани клапанов сердца свиньи отмывали бескальциевым раствором (0,9% NaCl) и инкубировали в бескальциевой питательной среде MEM pH 7.4 С 2 мМ ЭДТА. Контроль осуществлялся с помощью люминесцентной микроскопии с витальными красителями и этидиум бромид).

6. Иммунолюминесиентный анализ гладкомьннечных клеток.

Монослой клеток 3 раза промывали в PBS (с Са2+ и Mg2+) либо в культуральной среде RPMI-1640, фиксировали и пермеабилизировали в абсолютном метаноле в течение 20 мин при -20°С. Специфические детергенты не использовали. После фиксации клетки трижды (по 3 мин) промывали в PBS без Са2+ и Mg2+ (PBS"), инкубировали 5 мин в PBS" с 1% BSA. промывали трижды PBS", инкубировали в течении 2 ч при 37°С с моноклональными антителами к альфа-актину гладкомышечных клеток ("Sigma") в PBS" " с 1% BSA, разведение 1:200. Затем препараты промывали в РВ8""три раза (по 5 мин), докрашивали этидиум бромидом (1 мкг/мл) и проводили люминесцентный анализ, используя микроскоп «Люмам-ИЗ», освещение ртутной лампы (ДРШ 250-3), возбуждающие светофильтры СС-15-2, СЗС-24-4. светоделительную пластину с отражением в области 360-440 нм и пропусканием 480 -700 нм, запирающий светофильтр ЖС-18+ЖЗС-19.

5.1У1атериал и методы клинического исследования. Применение аллографтов у больных с аортальным пороком.

В период с декабря 1992 до января 1999 года в отделе приобретенных пороков сердца криосохраненные бескаркасные аортальные и легочные аллографты имплантированы 62 больным. Средний возраст больных составил 37,5 лет (11-68 лет). Из них 65% мужчин и 35% женщин. По этиологии порока у 44 больных показанием к операции явился активный инфекционный эндокардит, в том числе у 7 - протезный эндокардит. У 6 больных причиной аортального порока также послужил инфекционный эндокардит, однако больные были оперированы в неактивной фазе заболевания. Врожденный аортальный стеноз имелся у 5 пациентов, ревматическое поражение - у 11. Из 7 больных с активным протезным эндокардитом (ПЭ) 3 ранее уже перенесли ренротезирование аортального клапана механическими протезами по поводу ПЭ. Применение аллографтов у больных с инфекционным эндокардитом трикуспидального клапана.

Митральные аллографты имплантированы в трикуспидальную позицию 10 больным (4 женщины и 6 мужчин, средний возраст 29 лет).

Поражение трикуспидального клапана было изолированным и первичным и сопровождалось относительной недостаточностью клапана. Трое пациентов с ИЭ ТК поступили с клиникой сепсиса с сохранением высокой температуры тела до операции, правожелудочковой недостаточности, не поддающейся медикаментозному лечению, тромбоэмболии в систему легочной артерии с развитием инфарктной пневмонии, почечной недостаточности. До операции у всех пациентов был 3-4 ФК по NYHA. Применение аллографтов у больных с врожденными пороками сердца.

С 1990 по 2003 год в НЦССХ в отделении ВПС оперировано 45 пациентов с применением аллогенных кондуитов, из них с атрезией легочной артерии 2 типа - 8, 1 типа - 7, с транспозицией магистральных сосудов - 19, в т.ч. у 2 - корригированная, с тетрадой Фалло - 5, с двойным отхождением сосудов - 2 человека. Пациентов мужского пола было 25, женского - 20. Средний возраст - 11,7 лет.

Применение аллографтов при лечении хронической венозной недостаточности.

Имплантировано 2 криосохраненных венозных аллографта пациентам 44 и 36 лет, длительно страдавшим хронической венозной недостаточностью.

7. Статистическая обработка результатов.

Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью программы Sigmastat Statistical Analysis System. Version 1.00. Copyright © Jandel corporation, 1986-92 r.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1.Исследование влияния различных этапов технологической схемы изготовления аллогенных кондуитов на их жизнеспособность.

В экспериментах с окрашиванием витальными красителями и последующим люминесцентным анализом выявлено повреждающее влияние тепловой ишемии клапана на характер и интенсивность люминесценции.

Выявлена достоверная обратная зависимость количества

живых клеток в ткани кондуита от времени и условий его хранения. Отмечено незначительное повреждение клеток после криосохранения алло-графтов по используемой нами схеме.

Рис.1. Динамика накопления внутриклеточного кальция в зависимости от времени ишемического хранения аллографтов.

На основании проведенных исследований тканевого дыхания и пролиферативной активности фибробластов была предложена новая схема стерилизации аллогенных кондуитов ("мягкая" схема), при использовании которой жизнеспособность клеточных элементов аллографтов изменялась незначительно.

Рис.2. Дыхание клеток ткани клапанов сердца свиньи после стерилизации по "жесткой" и "мягкой" схеме, (нМ Ог/мг^мин).

Полученные данные показывают, что чем выше степень повреждения ткани до криоконсервации (определяемая по поглощению кислорода), тем большее повреждение вызывает криоконсервация.

На основании полученных данных мы пришли к выводу о том, что процедура криосохранения уменьшает количество жизнеспособных клеток примерно на 35- 40% по сравнению с исходным уровнем (хранение при 4°С в течение 6 часов). Это подтверждает изложенные выше результаты, полученные на основании определения дыхания и окрашивания витальными красителями.

Изучение влияния криосохранения на содержание пиридиннуклеоти-дов в тканях аллографтов.

В интактных препаратах отношение МАВ(Р)Н/ЫАО(Р)= 1,52, что соответствует нормально функционирующим тканям. Отношение ЫАО(Р)Н/ЫАО(Р) в поврежденных препаратах становится меньше (0,70,8). Препараты, подвергшиеся криосохранению, имеют низкие показатели как общего содержания ПН, так и восстановленных форм (соотношение 0,82), что свидетельствует о повреждении клеток до начала процедуры криосохранения.

Таблица 2. Содержание восстановленных и окисленных форм пиридин-нуклеотидов (нМ/г сырой ткани)._

Суммарные ПН Восст. формы ЫАБ(Р)Н Окисл. формы ^Б(Р) Отношение ЫАО(Р)Н ЫАО(Р)

Интактные препараты

Ср. знач. 18,1±1,2 11,2±1,1 7,3±0,8 1,52

Замороженные-размороженные (поврежденные) препараты

Ср. знач. 7,5±0,8 3,3±0,5 4,2+0,6 0,78

Криосохраненные препараты

Ср. знач. 9,6±0,7 6,5±0,7 7,9±0,8 0,82

Изучение влияния криосохранения на биосинтез белка в тканях ал-лографтов

Таблица 3 . Включение метки в клапаны свиньи до и после криоконсерва-ции (срт/мг белка)._

№ образца До криоконсервации После криоконсервации

1 13870 3107

2 14200 2998

3 14900 3520

4 16104 4743

5 15568 3634

среднее значение 14928±829 3600±619

После процедуры криоконсервации уровень включения метки снизился более чем в 3 раза, что свидетельствует о повреждающем влиянии этого этапа технологической схемы изготовления аллографтов на биосинтез белка клетками ткани.

Оценка пролиферативной активности фибробластов аллографта после стерилизации и криосохранения

Оценка физиологической активности методом культуры ткани показала, что чем выше была дыхательная активность, тем больше доля жизнеспособных клеток в ткани, тем раньше появлялись зоны распластанных клеток вблизи эксплантатов и вырастал плотный монослой.

2.Определение упруго- прочностных свойств аллографтов.

Результаты, полученные при испытаниях аллогенных клапанов на разрывной машине, свидетельствуют о том, что процедура обработки и криосохранения практически не вызывает уменьшение упруго-прочностных свойств по сравнению с нативными створками.

Таблица 4. Значения относительного модуля прочности аортальных створок человека до и после криосохранения, МПа. (п=15)

3. Оценка влияния криосохранения на гистологическую структуру аллогенных кондуитов.

По данным световой микроскопии, замораживание тканей в жидком азоте без криопротектора вызывает обширное повреждение клеток и внеклеточных структур вплоть до макроскопических разрывов коллагено-вого матрикса. Использование ДМСО в качестве криопротектора значительно уменьшает, а в ряде случаев сводит к минимуму холодовое повреждение замораживаемых тканей. Исследуемая методика криосохранения с использованием криопротекторной смеси на основе ДМСО обеспечивает высокую сохранность клеточных элементов и волокон в тканях клапанов.

Ткань створок аллографта при замораживании повреждается в значительно меньшей степени, чем стенка аорты даже без использования криопротектора.

Исследовали также эксплантированнный при повторной операции клапан, находившийся в организме реципиента в течение 5 лет. Отмечается сохранение межклеточных волокнистых структур и большое количество клеток (фибробластов) как в области стенки клапана, так и в толще створок. Изучение культуры ткани, полученной при высеве участка экс-плантированного клапана, подтвердило, что растущие клетки, проявляющие высокую пролиферативную активность, являются фибробластами.

4. Использование аллографтов у больных с аортальным пороком.

У всех больных доступ к сердцу осуществляли срединной стерно-томией. Как правило, при первичных операциях канюлировалась восходящая аорта и обе полые вены. У трех больных протезным эндокардитом канюлировалась общая бедренная артерия и правое предсердие двупрос-ветной канюлей. Искусственное кровообращение проводилось с гипотермией 24 - 28°С. Кардиоплегия выполнялась путем прямой инфузии в устья коронарных артерий или ретроградно через правое предсердие кристал-лоидным калий-магниевым раствором. Время ИК составило от 122 до 237 мин, (ср. 169 мин.), время окклюзии аорты-от 88 до 180 мин. (ср. 137 мин.)

При ревизии во время операции вегетации различных размеров обнаружены у всех больных, абсцессы фиброзного кольца - у 6, деструкция фиброзного кольца, основания передней митральной створки с формированием фистулы с левым предсердием - у 1. У одного больного обнаружен ин-трамуральный абсцесс септальной створки трикуспидального клапана диаметром 1 см. У одной больной имелась перфорация передней митральной створки диаметром 1 см с вегетациями по краям дефекта и

14

относительная недостаточность трикуспидального клапана. У 4 больных обнаружено нарушение вентрикуло - аортальной целостности.

Во время операции стремились полностью удалить пораженные инфекционным процессом ткани, а при имплантации аллографта и реконструкции сопутствующих дефектов использовались ткани аллографта, ау-то - или ксеноперикард.

Методика имплантации аллографта отличалась в зависимости от характера поражения и распространенности процесса, а также анатомических особенностей корня аорты. Использовались четыре вида имплантации: классическая субкоронарная методика с иссечением двух или трех синусов аллографта (38 больных); внутриаортальный цилиндр («мини-корень») (8 больных); протезирование восходящего отдела аорты («свободный корень») (9 больных); операция Росса (аутолегочное протезирование аортального корня) (11 больных).

Таблица 5. Особенности хирургической техники имплантации алло графтов при протезировании аортального клапана. (п=49)_

Хирургическая техника Количество больных

Ортотопическая с непрерывной или П-образной проксимальной линией швов 15 35%

Ротация аллографта на 120 градусов 8 21%

Ортотопическая с узловыми проксимальными швами 19 44%

Расширение фиброзного кольца 7 14%

Аортопластика 8 19%

5. Результаты операций у больных с аортальным пороком.

Госпитальная летальность составила 6% (4 больных). Средний срок стационарного лечения в послеоперационном периоде составил 18,9 дня (10-28 дней). Одному больному в госпитальном периоде в связи с полной А-В-блокадой имплантирован электрокардиостимулятор. Данные по непосредственным результатам опепаттий ппе лета в лены в таблитте.

Таблица 6. Непосредственные результаты имплантации аллограф-тов в аорталыгую позицию. (п= 49)_

Результаты Количество больных

Смерть от ОСН 2 4%

Смерть от других причин (сепсис и др.) 2 4%

Несост. проксимальной линии швов 2 4%

Полная атриовентрикулярная блокада 1 2,5%

Отсутствие регургитации 33 75%

Регургитация 1 степени 5 12,5%

Регургитация более 1 степени 4 12,5%

По данным чреспищеводной эхокардиографии во время операции регур-гитация на аллографте отсутствовала у 33 больных и не превышала 1 степени - у 5. Трансторакалыюе эхо-исследование в послеоперационном периоде выявило возникновение регургитации еще у одного больного. У него через 5 дней после операции была обнаружена несостоятельность проксимальной линии швов в зоне правого коронарного синуса на протяжении 2 см. Отслоение основания аллографта вызвало также нарастание средне систолического градиента до 22 мм Однако в связи с отсутствием гемодинамически значимых нарушений больной был выписан. При дальнейшем наблюдении больного в течение 2,5 лет основание аллограф-та стало неподвижным, хотя небольшой диастаз с фиброзным кольцом сохраняется. Створки аллографта тонкие и подвижные. Регургитация на нем не превышает 1 степени, а средне-систолический градиент не превышает 7 мм рт.ст. При анализе субкоронарной методики имплантации в раннем послеоперационном периоде выявлены следующие закономерности. (Табл.7)

Таблица 7. Показатели регургитации на клапане аллографта в раннем послеоперационном периоде при субкоронарной методике им-

плантации. (п= 38), (р<0,05)

Регургитация Количество больных

Отсутствует 18 46%

Минимальная 8 23%

Незначительная 7 18%

Умеренная 5 13%

Результаты имплантации аллографтов в зависимости от методики представлены в таблице.

Таблица 8. Результаты имплантации криосохраненных аллографтов в отдаленном периоде в зависимости от методики имплантации.

(п=40), (р<0,05)

Показатель Ортотопич. с непрер. и П-образн. швами (п=15) Ротация или узловые проксим. швы (п=27)

Регургитация >2ст. 5(13%) 1 (2,5%)

Парапротез. сброс 2 (5%) -

Реоперация 2 (5%) -

Средний срок наблюдения после операции составил 23,7 месяца (14-36 мес). Все больные находятся в удовлетворительном состоянии и ведут активный образ жизни. Рецидивов инфекции не отмечено.

90 70 50 30

01 2345678 910 годы

Рис. 3. Актуарная выживаемость больных после ортотопической имплантации аортальных аллографтов. (п=38).

Рис. 4. Актуарная кривая отсутствия регургитации на аортальном аллографте после ортотопической имплантации. (п=38)

Отдаленные результаты применения аллографтов при лечении пороков аортального клапана представлены в таблице.

Таблица 9. Результаты имплантации криосохраненных аллограф-

Показатель Количество больных

Летальность 3 8%

1-2 функциональный класс 30 86%

Ранний протезный эндокардит 3 8%

Поздний протезный эндокардит 2 5%

Регургитация до 1 ст. 28 80%

Регургитация 2 ст. 5 13%

Парапротезный сброс 2 5%

Средний систолический градиент 6,77+1,5 мм рт.ст.

Дисфункции аллографта 3 8%

6. Применение аллографтов у пациентов с инфекционным эндокардитом трнкуспндального клапана.

Длительность заболевания у всех пациентов составляла от 3 до 45 месяцев (в среднем 8 месяцев). Причиной возникновения инфекционного эндокар-

дита было внутривенное употребление наркотиков - в 8 случаях, сепсис после осложненной флегмоны плеча- в 1 случае и после ожога 60%кожи также в 1 случае. Возраст пациентов на момент операции колебался от 13 до 34 лет (в среднем - 26 лет). Функциональный класс (ЛУНА) III имели 7 больных, ФК IV - у 3 больных, 5 пациентов имели различную степень гепатомегалии от +2 до +25 см, что свидетельствует о значительной тяжести исходного состояния.

Таблица 10. Электрокардиографические данные пациентов при по ступлении._

Кол-во б-ных Синус ритм Откл.ЭОС вправо Гипертр. прав.предс. Гипертр. прав.жел. Блокада пнпг

N=10 10 100% 4 (40%) 3 (30%) 3 (30%) 4 (40%)

Таблица И. Эхокардиографическая картина пациентов при поступлении.

Параметр/ число наблюдений Регургита ция Н-Ш степени Регургита ция Ш-1У степени Диаметр ФК ТК < 4.0 см. Диаметр ФК ТК > 4.0 см.

N=10 3 5 5 5

Из десяти пациентов положительный посев крови при поступлении был получен в 8 случаях

Операции были проведены по стандартной методике. Среднее время искусственного кровообращения составило 140 минут, пережатия аорты -101 минуту. Подшивание аллографта к фиброзному кольцу трехстворчатого клапана производилось за манжетку ткани левого предсердия аллографта. Накладывались три опорных шва, а затем их нити в виде обвивно-го шва направлялись друг к другу и завязывались. В пяти случаях при выраженной дилатации фиброзного кольца трехстворчатого клапана (более 47 мм) мы дополняли процедуру имплантацией опорного кольца Карпан-тье. Послеоперационный период протекал гладко. Все больные прошли 6-недельный курс антибиотикотерапии и были выписаны из клиники на 1847-е (в среднем на 27-е) сутки после операции. На момент выписки у всех больных отсутствовала сердечная недостаточность, отеки, лихорадка. Все пациенты находились в I функциональном классе (ЫУНА). Таблица 12. Эхокардиографические данные пациентов к моменту выписки _____

Параметр/ число пациентов Отсут. регург. Регург. до I степени Пик. градиент Средний градиент ФВЛЖ ФВПЖ

N=10 5 3 4.95± 2.4 З.Ш.2 61% 63.6%

Из 10 прооперированных по описанной методике больных выписаны из клиники все пациенты. Доступными для обследования в отдаленном периоде были все 10 пациентов. В отдаленном периоде имелось 2 летальных исхода через 5 и 18 месяцев после операции. Пациенты принадлежали к группе с имплантацией полного митрального аллографта. Данные летальный исход не были связаны с нарушением в работе сердца и тромбоэмболическими осложнениями (насильственная смерть). Реопера-ции в отдаленном периоде отсутствовали.

Период наблюдения в отдаленном периоде составил от 6 месяцев до 38 месяцев, в среднем - 26 месяцев. Все пациенты выполняли обычную физическую нагрузку, их физическая активность согласно классификации Нью-йоркской ассоциации кардиологов (ЭДУНА) оценивалась как I функциональный класс. Аускультативно у 2 пациентов выслушивается незначительный систолический шум на мечевидном отростке грудины.

Окончательная оценка данного метода должна быть определена при наблюдении в более длительном отдаленном периоде. 7. Применение аллографтов при хирургическом лечении ВПС.

Методика имплантации аллографта заключалась в следующем: дистальный анастомоз накладывался по типу конец-в-бок со стволом или бифуркацией или одной из ветвей легочной артерии, затем приступали к выполнению проксимального анастомоза. Для этого выбирали бессосудистую зону в стенке правого желудочка. Желудочек вскрывался, после чего иссекались гипертрофированные трабекулы в полости правого желудочка, если они создавали препятствие наложению анастомоза. Аллографт фиксировался тремя узловыми швами к разрезу правого желудочка. Затем накладывали анастомоз по типу конец-в-бок непрерывным обвивным швом нитями пролен 4/0 с атравматической иглой, следя за тем, чтобы кондуит не был перекручен и деформирован, а также не был сдавлен грудиной после ее ушивания. При невозможности наложения анастомоза ввиду недостатка ткани аллографта использовали синтетические надставки (ОогеЧех® или витафлон) или заплату из ксеноперикарда, которые выкраивались треугольной формы с учетом возможности расширения выводного тракта правого желудочка. Синтетические материалы для надставки использовались у 18 человек, а ксеноперикард - у 14 человек. Всего имплантировано 29 аллогенных аортальных кондуитов и 16 легочных кондуитов. Госпитальная летальность (за весь период имплантации аллографтов с 1992 по 2003 гг.) составила 22% (11 больных). Причинами смерти больных были:

острая сердечная недостаточность - 5 человек, полиорганная недостаточность - 1 человек, послеоперационное кровотечение - 4 человека,

тромбоэмболия в правую легочную артерию — 1 человек. Выписано в удовлетворительном состоянии 35 человек.

Структура послеоперационных осложнений у выписанных больных представлена в таблице 13.

Таблица 13. Нелетальные послеоперационные осложнения на госпиталь-

Средний срок стационарного лечения в послеоперационном периоде составил 18,9 дня (10-28 дней).

Трансторакальное Эхо-исследование в послеоперационном периоде выявило развитие стеноза проксимального отдела кондуита у 8 прооперированных пациентов в сроки от 2 до 7 лет после операции. Дистальный стеноз аллографта развился у 2 больных. Стеноз и недостаточность клапана аллографта выявлены у 5 пациентов, в том числе выраженная недостаточность 2+ у одного больного. Основной причиной развития стеноза кондуита у всех больных стало отложение кристаллов гидроксиапатита (кальцификация), особенно в области использованной в качестве надставки ксеноперикардиальной заплаты с переходом на клапан. Результаты использования аллографтов в отделениях хирургического лечения ВПС за 10 лет следующие:

Таблица 14. Использование аллографтов в отделении ВПС НЦССХ им. АН. Бакулева РАМН.

Тип протеза Количество Летальность

Аллоаортальный 29 7

Аллолегочный 16 3

Всего 45 10

Средний срок наблюдения после операции составил 24,4 месяца (12-120 мес). В отдаленные сроки обследовано 25 больных, что составляет 71,4% от количества выживших оперированных больных.

Таблица 15. Степень дисфункции у пациентов с аллографтами на различных сроках наблюдения._

Тип протеза Степень дисфункции Всего

Минимальная Умеренная Выражен.

Аллоаортальный 3 5 7 15

Аллолегочный 2 2 1 5

Всего 5 7 8 20

Свобода от дисфункций аллографтов в течение 9 лет наблюдения представлена на графике.

——■^•■•Аплолегочные ы^>"аллоаортальмы

Рис. 5. Зависимость частоты дисфункции аллографтов (%) от сроков наблюдения.

Функциональное состояние оперированных пациентов в отдаленные сроки представлено на рис.8.

□ 1-2 ФК поЫУНА

□ 3-4 ФКпоИУНА

Рис. 6. Функциональный класс оперированных больных в отдаленные сроки после операции.

8. Клиническая характеристика больных перенесших операцию трансплантации клапаносодержащего криосохранённого венозного аллографта.

Оба пациента поступили в отделение с диагнозом посттром-бофлебитический синдром, илеофеморальный тромбоз в стадии частичной реканализации, недостаточность клапанов вен бедренно-подколенного сегмента. Среднее время от момента возникновения заболевания до операции составило 18 лет. Причиной илеофеморального тромбоза у одного больного (мужчина Д. 44 лет) явился перелом костей таза в возрасте 25 лет. У второго пациента (женщина А. 36 лет) илеофемораль-ный тромбоз явился осложнением её первой беременности. У больной А. в 1983 г. была произведена операция тромбэктомии. В 1991г-операция

Линтона, множественные попытки лечения трофической язвы на левой голени методом аутодермопластики расщепленным кожным лоскутом в 1990, 1993, 1995гг. Консервативные методы лечения: приём флебо-тоников, эластичное бинтование оказались неэффективными у обоих пациентов. У обоих больных имплантированы аллографты длиной 35 мм, наружным диаметром 12 мм, содержащие по 1 функционально состоятельному клапану. Пациенты после операции получали гепарин (фракционный или низкомолекулярный). Пероральное применение антикоагулянтов продолжалось в течение 6 месяцев.

Больной Д. на 9-ые сутки после операции в удовлетворительном состоянии после снятия швов был выписан. Повторный осмотр пациента имел место через 7 месяцев. Больной отмечает значительное улучшение состояния, уменьшился отек левой голени, значительно регрессировали индуративные изменения кожи, практические не беспокоят боли в нижней конечности.

У больной А. послеоперационный период протекал без осложнений. Осмотрена через месяц после операции. Отмечена значительная редукция отека, регресс индуративных изменений кожи голени, исчезновение субъективных жалоб, повышение физической активности. При контрольном дуплексном сканировании - трансплантат проходим, клапан состоятелен, отмечено усиление кровотока по левой подвздошной вене, что свидетельствует о нормализации венозного кровотока по бедренной вене и прогрессировании её реканализации.

С целью предотвращения основной причины дисфункции алло-графтов - кальциноза нами были предприняты попытки улучшения их качества с помощью использования методов девитализации и тканевой инженерии.

9. Девитализания аллографтов.

Методика осмотического шока при обработке дистиллированной водой основывалась на опыте O'Brien по созданию живых бесклеточных ксенографтов. Спустя 2 часа инкубации в дистиллированной воде большинство клеток погибли, но есть живые гладкомышечные клетки. После 20 ч инкубации все клетки погибшие. Последующая обработка ДНК-азой и РНК-азой в течение суток не вызвали деградацию хроматина: ядра оставались четко очерченные. Такая же картина наблюдалась и стенках клапанов сердца свиньи.

Полученные результаты показывают, что методика O'Brien et al. неэффективна для удаления клеточного материала.

В стенках аорты крысы через 24 часа инкубации в смеси трипсина с версеном оставались живые клетки, хотя большая их часть погибала.

Добавление ДНК-азы и РНК-азы на 2 часа вызывала расплывание хроматина на поверхности ткани, но внутри ядра оставались четко очерченными. Аналогичная, но более выраженная ситуация наблюдалась при указанной обработке створок клапанов сердца свиньи. В лепестках оставались четко очерченные ядра клеток, и этот результат не понятен, если учитывать тот факт, что толщина лепестков, а, следовательно, и время проникновения ферментов должно быть в десятки раз меньше чем в стенки. Полученные результаты свидетельствуют, что удаление клеточиою материала по методике по крайней мере в лепестках, не дос-

таточно эффективно.

Инкубация с БВБ вызывала в течение 4 ч гибель клеток как в стенках аорты крысы, так н в стенках клапанов сердца свиньи включая медию (данные люминесцентного анализа поперечных срезов стенок).

Последующая отмывка (4 -10 ч) н инкубация с нуклеазами (1 сутки) не способствовала деградации и удалению хроматина, как в стенках, так и в створках клапана. Нуклеазы, добавленные после 10- часовой отмывки от БОБ, будут ингибированы оставшимся в ткани БОБ. Это обстоятельство, а также большая вероятность нарушения тканевого каркаса ставит под сомнение целесообразность использования БОБ для удаления клеточного материала.

Инкубация клеток в течение 10 ч в растворе, содержащем дигито-нин, трипсин и ЭДТА вызывала их быструю гибель (1-4 часа) деградация хроматина, которая выражалась в размывании границы ядер. Таким образом, судя по деградации хроматина, быстрая гибель клеток в растворе с дигитонином с последующим перевариванием трипсином и нуклеазами вызывала эффективное удаление клеточного материала из ткани стенок и лепестков клапанов сердца.

Используя гипертермию, можно вызвать апоптоз, но эффективная апоптотическая гибель происходит только после 2 ч гипертермии около 50°С. Следует отметить, что при этом возникает вопрос о возможном тепловом повреждении матрикса.

Из представленных ранее попыток вызвать апоптотическую гибель клеток в матриксе (острая гипертермия, воздействие ЭДТА) мы остановились на наиболее удачном варианте - на воздействии ЭДТА. Для этого предстояло оценить оптимальные концентрации ЭДТА для инициации апоптоза и снижения кальцификации, и оценить кальцификацию стенок, створок и мышечной ткани ксенографтов клапанов сердца. Согласно клиническим данным нашего центра, кальциноз аллографтов наблюдался в 48,2% случаев через 4 года после имплантации аллоаор-тальных кондуитов в правую позицию (данные предоставлены отделением ВПС) и был клинически не выражен при имплантации легочных

аллогеиных кондуитов. При этом отмечалось поражение стенок аорты с развитием градиента давления до 60 мм Щ. Створки не поражались. 10. Профилактика кальцификации аллографтов путем их обработки апоптотичсскими агентами.

Рис. 7. Кальцификация необработанных створок и стенок аортальных клапанов свиней после подкожной имплантации крысам в течение 2 месяцев.

После удаления клеточного материала путем инкубации в воде и затем с нуклеазами по методике O'Brien et al. кальцификация через 2 месяца подкожной имплантации была больше чем в необработанных стенках.

Рис. 8. Кальцификация створок и стенок аортальных клапанов свиней после обработки дистиллированной водой и нуклеазами с последующей подкожной имплантацией крысам в течение 2 месяцев.

Далее представлены данные о кальцинозе тканей, обработанных способами, вызывающими некроз (обработка дистиллированной водой и затем нуклеазами, раствором трипсина с 0,5 мМ ЭДТА с последующей инкубацией с нуклеазами, додецилсульфатом натрия после 2 меся-

цев подкожной имплантации). Видно, что эти способы обработки не снижают кальциноз тканей по сравнению с необработанными стенками.

Рис. 9. Кальцификация стенок и створок аортального клапана после обработки различными некротическими агентами.

Кальцификация створок и стенок аортальных клапанов свиней при обработке одним дигитонином или раствором, содержащим дигито-нин, трипсин, 0,5 мМ ЭДТА и нуклеазы (некротическая гибель) или 5 мМ ЭДТА (апоптотическая гибель) представлена на следующем рисунке.

Рис. 10. Кальцификация стенок и створок аортального клапана, обработанного некротическими и апоптотическими агентами. Зависимость кальцификации стенок аортальных клапанов от концентрации ЭДТА представлена на рис. 11.

Рис. 11. Кальцификация стенок аортального клапана после апоптотиче-ской обработки различными концентрациями ЭДТА.

11. Модификация аллографтов фибробластами реципиента.

Полученные результаты показывают принципиальную возможность модификации аллографтов путем внедрения в них живых фиброб-ластов реципиента за вполне приемлемое время. Через двое суток после вращения в роллерной установке для посева культуры клеток на девита-лизированную подложку аллографта мы наблюдали живые клетки не только на поверхности, но и внутри ткани, в чем можно было убедиться по данным люминесцентной микроскопии, полученных при наблюдении на разной глубине ткани.

После 2 месяцев подкожной имплантации тканей в наименьшей степени кальцифицировались необработанные стенки клапанов и стенки, модифицированные клетками. Причем, стенки, которые были обработаны одинаковым способом, но без внедрения гладкомышечных клеток, каль-цифицировались значительно больше, чем с клетками (рис.12).

Рис. 12. Кальцификация апоптотически обработанных стенок аортального клапана с использованием и без использования заселения гладкомышеч-ных клеток в ткань клапана.

Этот результат свидетельствует о перспективности внедрения гладкомышечных клеток в ткани аллографтов клапанов сердца с целью уменьшения их способности к кальцификации.

□Обработка дигитоннном бе! лоеевя клеток

О Обработка дигнтокмнрм г последующ»** посевом глддкомышечных клеток, рооственны* реципиенту

выводы.

1. В НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН на основе экспериментальных исследований создана собственная технология производства криосохраненных аллографтов сердечных клапанов и венозных сосудов с клапаном. Решены организационные проблемы по забору, транспортировке и обработке аллогенных кондуитов. Имеющееся у нас современное криогенное оборудование позволяет подобрать адекватный режим замораживания и сохранить аллографты в течение длительного времени.

2. Предложенная технология изготовления аллографтов практически не изменяет их биомеханических свойств, не нарушает морфологическую структуру клапаносодержащих кондуитов и не повреждает структурные элементы тканей.

3. Качество аллографтов может быть достоверно определено с помощью ряда методик: определения поглощения кислорода, синтеза АТФ и пиридиннуклеотидов, включения меченых аминокислот в структурные белки клапанов, люминесцентной микроскопии с витальными красителями, оценки пролиферативной активности фибробластов, упруго-прочностных и гистологических исследований. Для экспресс-оценки качества достаточно выбрать наиболее простые и дешевые исследования, например люминесцентную микроскопию с витальными красителями.

4. Элиминация клеточных донорских элементов из ткани алло-графта путем апоптотического воздействия ЭДТА и заселение матрикса клапана тканеобразующими клетками реципиента по экспериментальным данным позволяет уменьшить склонность аллографта к кальцификации и, следовательно, повысить его долговечность.

5. На основании проведенных экспериментальных исследований скорректирована технология изготовления клапаносодержащих аллограф-тов: изменена схема стерилизации, разработана новая программа криосо-хранения, размораживания и подготовки к имплантации. В технологию изготовления введена апоптотическая обработка с целью снижения каль-циноза. С 2003 г. аллографты, изготавливаемые по новой схеме, используются в клинической практике.

6. При хирургическом лечении врожденных и приобретенных пороков сердца предпочтительнее использовать ортотопическую имплантацию аллографтов по методике «свободного корня». При невозможности такой операции у детей с аномалиями развития легочного клапана операцией выбора является имплантация экстракардиального легочного кондуита. Выполнение аутолегочного протезирования (операции Росса), особенно у молодых пациентов, позволяет улучшить результаты хирургического лечения пороков аортального клапана.

6. Уникальные гемодинамические характеристики и хорошие ближайшие и отдаленные результаты применения аллографтов при хирургической коррекции врожденных и приобретенных пороков сердца, хронической венозной недостаточности позволяют говорить о перспективности дальнейшего применения этого типа биопротезов в кардиохирургии. Анализ 10-летнего опыта применения аллографтов свидетельствует о том, что они адекватно корригируют гемодинамику, удобны и достаточно просты с точки зрения хирургической техники имплантации, позволяют улучшить качество жизни оперированных больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. На различных технологических этапах изготовления криосо-храненных аллографтов следует учитывать повреждающее действие температуры хранения аллографта до обработки, времени и температуры стерилизации, состава смеси антибиотиков, режима замораживания и размораживания, так как эти факторы способствуют повреждению клеточных элементов и матрикса аллографтов, что в дальнейшем может явиться причиной ускоренной дегенерации тканей пересаженного клапана. Точное соблюдение всех режимов разработанной нами технологии позволяет свести к минимуму возможные повреждения.

2. Контроль качества аллографтов должен осуществляться на всех этапах технологической схемы изготовления аллографтов. Наиболее доступной является методика люминесцентной микроскопии с витальными красителями.

3. При создании банка криосохраненных аллографтов необходимо современное криогенное оборудование, позволяющее широко варьировать режимы замораживания и хранения для различных типов аллоген-ных трансплантатов.

4. При создании новых перспективных моделей аллогенных биопротезов необходимо учитывать возможность увеличения их долговечности и биосовместимости за счет предварительной «мягкой» девитализа-ции и использования собственных клеток реципиента, внедряемых в мат-рикс аллографта.

5. При хирургическом лечении врожденных и приобретенных пороков сердца следует учитывать высокие гемодинамические характеристики аллографтов, что позволяет снизить летальность, уменьшить период реабилитации больных и улучшить качество их жизни.

6. При сложности постоянного мониторинга эффективности ан-тикоагулянтной терапии аллографты являются клапанами выбора, так как при их имплантации отпадает необходимость в таком мониторинге.

Список научных работ по теме диссертации:

1. «Влияние криосохранения на биохимические параметры жизнеспособности ткани клапанного аллографта». Грудная и сердечнососудистая хирургия, 1997, №2, с. 52. Соавт. P.M. Муратов, И.И. Ско-пин, B.C. Акатов, Э.И. Лежнев, В.Н. Терехин, В.В. Зайцев, Г.И. Цу-керман.

2. «Протез митрального клапана сердца» Полезная модель 9143 МКИ 6 А 61 F 2/24, 1999, Бюлл. №2. Соавт. И.И. Скопин, ВТ. Костава, P.M. Муратов, В.В. Зайцев, М.А. Сазоненков.

3. «Новый биологический материал для использования в кардиохирургии». Грудная и сердечно-сосудистая хирургия, 1996, №1, с. 10-13. Соавт. В.А. Бухарин, И.И. Каграманов, Ю.И. Бондарев, И.В. Кокше-нев, В.Т. Костава, Р.А Серов, Л.А. Роева, Б.А. Фурсов, Ж.Е. Кондратенко, Н.П. Бакулева.

4. «Изменение биомеханических свойств тканей клапанных аллографтов в процессе криосохранения». Грудная и сердечно-сосудистая хирургия, 1997, №2, с. 174. Соавт. Ж.Е. Кондратенко, В.Т. Костава, Е.Я. Чу-барова.

5. «Биопротезы в сердечно-сосудистой хирургии. Современное состояние проблемы». Грудная и сердечно-сосудистая хирургия, №1,2002, с. 4-10. Соавт. Л.А. Бокерия, В.П. Подзолков, А.И. Малашенков, И.И. Скопин, P.M. Муратов, М.А. Зеленикин, В.Н. Ильин, И.А. Юрлов, В.Т. Костава, Н.П. Бакулева.

6. «Создание жизнеспособного аллографта на основе модификации криосохраненного клапана клетками реципиента. (Экспериментальное исследование)». Бюллетень «Сердечно-сосудистые заболевания», М. 2003, №5, с.3-6.

7. «Кальцификация бесклеточных ксенотрансплантатов клапанов сердца». Вестник трансплантологии и искусственных органов. М., 2002, №4, с. 39-42. Соавт. B.C. Акатов, P.M. Муратов, В.В. Соловьев, Н.И. Рындина, В.Т. Костава, Л.А. Бокерия.

8. «Модификация аллотрансплантатов клапанов сердца методами тканевой инженерии». Цитология, М., 1999, т.41, №3/4, с.256-260. Соавт. B.C. Акатов, P.M. Муратов, И.И. Скопин, Е.Н. Рябоконь, В.В. Соловьев, B.C. Голубков, Э.И. Лежнев.

9. «Неосложненные беременность и роды после имплантации криосо-храненного аортального аллографта при врожденном аортальном стенозе с узким фиброзным кольцом». Грудная и сердечно-сосудистая хирургия, М., 2003, №4, с.79-80. Соавт. И.И. Скопин, P.M. Муратов, Н.Н. Соболева, А.В. Шамилева.

10. «Операция Росса при активном инфекционном эндокардите аортального клапана у взрослого пациента». Грудная и сердечно-сосудистая хирургия, М., 2003, №3, с.76-77. Соавт. Л.А. Бокерия, И.И. Скопин, В.Т. Костава, А.А. Макушин, А.В. Лошаков, М.Ю. Мироненко, И.В. Ежова, А. Г. Тельнова, Д.В. Мурысова.

11. «Использование клеточных технологий для улучшения качества криосохраненных аллографтов» Медицинские науки, М, 2004, №1, с.3-9. Соавт. B.C. Акатов, P.M. Муратов, Н.И. Рындина.

12. «Организация производства аллографтов, опыт их клинического применения в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева и основные направления развития». Медицинские науки, М., 2004, №1, с.10-17. Д.В. Бритиков.

13. «Первый опыт аутолегочного протезирования аортального клапана (операция Росса) при активном инфекционном эндокардите». Медицинские науки, М., 2004, №1, с.18-23. Соавт. Л.А. Бокерия, А.В. Лошаков, И.И. Скопин, А.А. Макушин, М.Ю. Мироненко.

14. " Влияние криосохранения на биохимические параметры жизнеспособности ткани клапанного аллографта". - Грудная и сердечнососудистая хирургия, 1997,№ 2, с. 52. Соавт. P.M. Муратов, И.И. Скопин, B.C. Акатов, Э.И. Лежнев, В.Н. Терехин, В.В. Зайцев, Г.И. Цукерман.

15. "Криосохраненные митральные аллографты в хирургическом лечении активного инфекционного эндокардита". - Тезисы доклада на 4 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов. Москва, 1998, с.315. Соавт. М.А. Сазоненков.

16. "Криосохраненные аллогенные клапаносодержащие кондуиты для коррекции врожденных и приобретенных пороков сердца". - Тезисы доклада на 2 ежегодной сессии Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН. Москва, 1998, с.21. Соавт. Г.И. Цукерман, В.П. Подзолков, И.И. Скопин, М.А. Зеленикин, В.Н. Ильин, P.M. Муратов, В.Т. Костава, В.В. Зайцев, И.В. Кокшенев, А.Ю. Барчуков, И.А. Трусов.

17. "Определение жизнеспособности аллографтов и оптимизация технологии их изготовления". - Там же, с.111. Соавт. P.M. Муратов, В.Т. Костава, В.В. Зайцев, B.C. Акатов, И.И. Скопин.

18. "Технология подбора и изготовления митрального аллографта".- Там же, с. 162. Соавт. М.А. Сазоненков

19. "Протез митрального клапана сердца". Полезная модель 9143 МКИ 6 А 61 F 2/24, 1999 Бюлл.№2. Соавт. Скопин И.И., Костава В.Т., Муратов P.M., Зайцев В.В., Сазоненков М.А.

20. "Изучение принципиальной возможности модификации криосохра-ненного аллогенного клапана клетками реципиента". Тезисы доклада

на 4 ежегодной сессии Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН. Москва, 2000, с.212.

21. "Создание жизнеспособного аллографта на основе модификации криосохраненного клапана клетками реципиента". - Там же с. 181. Соавт. Муратов P.M., Акатов B.C., Костава В.Т., Зайцев В.В., Скопин И.И.,.

22. "Цитотехнологическая модификация аллографтов". - Там же с. 184.. Соавт. P.M. Муратов, B.C. Акатов, И.И. Скопин,

23. "Анализ современных методов химической стабилизации биологических тканей при изготовлении биопротезов". Там же, с. 226. Соавт. Н.П. Бакулева, И.А. Терещенкова, В.Т. Костава, Ж.Е. Кондратенко, Б.П. Мищенко, В.В. Зайцев.

24. "Влияние криосохранения на упруго-прочностные свойства аллографтов". Тезисы доклада на 4 ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, Москва, 2000., с. 183. Соавт. Кондратенко Ж.Е., Костава В.Т., Чубарова ЕЯ.

25. «Первый опыт создания криосохраненных клапаносодержащих аллографтов», Д.В. Бритиков, В.Т. Костава. Тезисы доклада на 8 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов. М, 2002, с.318.

26. «Криосохраненные клапаносодержащие аллографты: 10-летний опыт клинического применения при врожденной патологии». В.П. Подзол-ков, В.Н. Ильин, В.Т. Костава, И.А. Юрлов, Д.В. Бритиков. Тезисы доклада на 8 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов. М,2002,с.319.

27. «Клеточная инженерия криосохраненных аллографтов: перспективы развития». B.C. Акатов, Д.В. Бритиков, В.Т. Костава, P.M. Муратов. Тезисы доклада на 8 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов. М, 2002, с.319.

28. «Влияние различных методик обработки и хранения на механическую целостность аллографтов». Д.В. Бритиков, В.Т. Костава, Р.А. Серов. Тезисы доклада на 8 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов. М, 2002, с.324.

29. «Организация производства аллографтов и опыт их клинического применения в НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН». Д.В. Бритиков, В.Т. Костава. Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы сердечно-сосудистой хирургии» Н. Новгород, 2003 г., с. 136.

30. «Следующий шаг в тканевой инженерии аллографта: оценка возможности заселения клетками стенки аорты». B.C. Акатов, P.M. Муратов, И.И. Скопин, Д.В. Бритиков, В.Т. Костава, Л.А Бокерия. Материалы 7 Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. М., 27-30 ноября 2001 г., с. 67.

31. «Применение криосохраненных аллографтов в сердечно-сосудистой хирургии». Бокерия Л.А., Подзолков В.П., Костава В.Т., Скопин И.И., Муратов P.M., Бритиков Д.В., Абалмасов К.Г. Материалы 9 всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. М., 18-21 ноября 2003 г., с. 17.

32. «Применение тканевых и клеточных технологий для усовершенствования биопротезов». Акатов B.C., Костава В.Т., Бритиков Д.В., Муратов P.M., Бакулева Н.П. Там же, с. 31.

33. «Анализ результатов применения биологических кондуитов в качестве искусственного ствола легочной артерии». Подзолков В.П., Юрлов И.А., Ковалев Д.В., Дехканов О.Х., Костава В.Т., Бритиков Д.В., Морозов Р.Б., Зеливянская М.В., Крюков В.А. Там же, стр. 35.

34. «Протезирование аортального клапана и корня аорты бескаркасными протезами». Муратов P.M., Скопин И.И., Крестинич И.М., Костава В.Т., Соболева Н.Н., Бритиков Д.В., Бабенко СИ., Бокерия Л.А. Там же, стр. 38.

35. «Непосредственные результаты использования криосохраненных легочных аллографтов для реконструкции выводного отдела правого желудочка при операциях Росса». Аль-Хаджабед Х.Ф., Бритиков Д.В. Там же, стр.347.

36. «Криосохраненный аллографт митрального клапана в лечении инфекционного эндокардита трикуспидального клапана». Скопин И.И., Муратов P.M., Сазоненков М.А., Костава В.Т., Бритиков Д.В. Там же, стр. 348.

37. «Десятилетние результаты использования биологических протезов в хирургии митрального клапана». Муратов P.M., Скопин И.И., Мала-шенков А.И., Бабенко СИ., Соболева Н.Н., Костава В.Т., Бакулева Н.П., Бритиков Д.В. Там же, стр. ПО.

ДЛЯ ЗАMETОK

Тираж 100

Отпечатано в НЦССХ им. А. Н. Бакулева РАМН

»-9942

Аллогенные протезы клапанов сердца прочно вошли в арсенал карднохирургическнх центров, благодаря работам D.N. Ross, B.G. Barrat-Boyes, W.W. Angelí, MF. O'Brien, В.И. Бураковского, Г.И. Цукермана, В.П. Подзолкова и других.

Изготовление биопротезов, в точности воспроизводящих нативные свойства подлежащих замене пораженных участков системы кровообращения, является весьма труднодостижимой проблемой. На сегодняшний день лишь использование донорских клапанов позволяет в наибольшей степени приблизиться к исходным характеристикам подлежащего замене естественного клапана

Как показал многолетний опыт применения, аллогенные клапаны адекватно коррегируют внутрисердечную гемодинамику, существенно снижают риск тромбоэмболических осложнений, не требуют пожизненной антикоагулянтной терапии, улучшают качество жизни оперированных больных.

Первая успешная клиническая имплантация аллогенного аортального клапана была выполнена в 1956 г. G. Murrey с соавторами в нисходящую аорту больному с аортальной недостаточностью.

Среди зарубежных исследователей основная заслуга в разработке проблемы применения аллогенных клапанов сердца принадлежит B.G. Barrat-Boyes из Оклеидского университета (Новая Зеландия) и D.N. Ross из клиники Harley Street (Лондон, Великобритания). Их фундаментальные работы, основанные на обширном клиническом и экспериментальной материале, открыли новые горизонты в реконструктивной кардиохирургии.

Большой вклад в развитие проблемы внесли национальные тканевые банки крносохранеиных аллографтов, объединившие исследователей по проблемам биологии клеток, клиницистов, использующих в своей практике криосохраненные клапаны, и коммерческих представителей. Благодаря этому в настоящее время аллографты стали практически повсеместно доступны, улучшилось их качество, повысилась долговечность. Клеточные технологии не просто вошли в повседневную практику исследователей, но и позволили решить целый ряд сложных проблем, связанных с повышением биосовместимости биоклапанов.

На сегодняшний день в ведущих карднохирургическнх центрах накоплен обширный успешный опыт клинического применения аллогенных протезов.

Эти данные позволяют утверждать, что аллографты являются клапанами выбора у многих групп пациентов. Вместе с тем рассеялась эйфория, занимавшая умы клиницистов, что аллографты являются идеальным заменителем пораженного сердечного клапана. Проблема кальциноза, являющаяся основным препятствием на пути применения биопротезов, невыясненные вопросы иммунологии аллографтов, четкий перечень показаний и противопоказаний к применению аллографтов в том или ином конкретном случав, особенности технологии изготовления аллографтов, техники их хирургической имплантации - вот целый комплекс невыясненных вопросов, выявленный в результате анализа многолетнего клинического опыта использования этого типа биопротезов.

Параллельно клиническому использованию был выполнен обширный спектр исследований, описывающих физиологические, биохимические, биофизические, биомеханические, гистологические и ультраструктурные характеристики аллогеиных биопротезов клапанов сердца на основных этапах их забора, изготовления, хранения, подготовки к имплантации и дальнейшего функционирования после имплантации.

Несмотря на то, что по всем вышеперечисленным направлениям были получены впечатляющие результаты, позволяющие адекватно интерпретировать накопленный клинический опыт, остаются не до конца выясненными многие факторы, определяющие функциональную состоятельность и долговечность имплантированных аллогеиных биопротезов клапанов сердца Очевидно, что эти факторы можно разделить на две основные группы:

- факторы трансплантата, то есть биологические, биомеханические и физико-химические характеристики протеза, определяемые в общем плане технологией его изготовления, хранения и подготовки к имплантации;

- факторы реципиента, определяемые его клиническим статусом перед операцией, особенностями интраоперацнонного, а также ближайшего и отдаленного послеоперационного периодов.

Сейчас основные усилия исследователей сосредоточены на изучении судьбы имплантированных аллографтов у различных категорий пациентов, а также на улучшении качества аллогеиных клапанов. В этом направлении заметны две отчетливые тенденции.

Во-первых, многие исследователи полагают, что иммунный ответ на пересаженный аллографт играет решающую роль в развития кальциноза и дегенерации протеза Следовательно, подбор аллографта по антигенным свойствам для каждого конкретного пациента позволит решить проблему долговечности. (Moustapha A., Ross D. 1997, Shaddy R. 1997, Zhao X., O'Brien ML 1994)

Другие авторы вообще не хотят принимать во внимание иммунологический статус пациента, так как они уверены, что межклеточное вещество мало нммуногенно, а клетки - основной иммуногенный материал - они предлагают удалить из ткани клапана, заселив их взамен собственными тканеобразующнми клетками реципиента, которые впоследствии и будут обновлять коллагеиовый каркас клапана (Koolbergen D., Hazekamp М. 1995,1997, O'Brien М. 1999,2000) Эта идея кажется еще более заманчивой, так как уже практически доказано, что донорские клетки после операции постепенно практически полностью элиминируются, замещаясь собственными клетками реципиента (Armiger L 1997). Если гипотеза о самообновлении подтвердится, то мы получим практически идеальный тип биопротеза, живущий столько, сколько сам реципиент.

В НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН исследования по изучению крносохраненных аллографтов ведутся с 1990 г. Причем по сей день Центр остается единственным в России учреждением, где накоплен самый большой опыт имплантации аллографтов при различных типах врождённых и приобретённых пороков сердца В этой области мы сохраняем незыблемый приоритет, так как именно у нас создан банк крносохраненных трансплантатов, ведутся исследования по изучению свойств тканей аллографтов, а также цитотехнологнческие разработки.

Отдел медицинской биотехнологии, созданный в Центре 7 лет назад , координирует все работы в этом направлении, тесно сотрудничая как с клиническими подразделениями Центра, так и с другими научио-исследовательскнми учреждениями.

Пионерами использования алло генных клапаносодержащих трансплантатов, изготавливаемых в Центре, являются академик Подзолков В.П. (отделение ВПС), проф. Цукерман Г. И., проф. Скопин И.И. (отделение ППС), проф. Зелеиикин М.А. (отделение ДРВ с ВПС), проф. Ильин В. К (отделение ЭХИТ). Использование аллогенных трансплантатов является операцией выбора при некоторых видах врожденных и приобретенных пороков сердца

На сегодняшний день в Центре имплантировано уже около 130 трансплантатов. Результаты наблюдения за прооперированными больными на имеющихся сроках (до десяти лет) в основном удовлетворительные.

Однако анализ собственных клинических данных и сведений из доступных зарубежных публикаций по применению крносохраненных аллографтов ставит и много спорных, неясных вопросов, главными из которых являются: 1. В чем заключается роль клеток реципиента в ткани донорского клапана?

3. Факторы реципиента, которые необходимо учитывать при имплантации аллографта, чтобы обеспечить его долговечность.

4. Причины избирательной кальцификации стенки аорты трансплантата перед створками его же клапана.

В связи с этим, целью настоящей работы является:

Создание криосохраненных клапаносодержащих аллогенных трансплантатов для коррекции врожденных и приобретенных пороков сердца и венозных сосудов. Задачи исследования:

1. Обобщить опыт организации мелкосерийного производства и создания в НЦССХ банка криосохраненных аллографтов.

2. Обобщить данные экспериментальных исследований по изучению качества аллографтов.

3. Изучить влияние клеточных элементов донора и реципиента на долговечность аллографтов на основе экспериментальных данных.

4. Создать на основе проведенных исследований новый тип криосохраненных аллографтов, отвечающих основным требованиям кардиохирургов к этому типу биопротезов.

5. Анализ опыта применения аллографтов при различных врожденных и приобретенных пороках сердца.

Научная новизна исследования.

Настоящее исследование отражает один из этапов работы, проводимой в НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН по разработке и внедрению в клиническую практику новых образцов биологических клапанов для кардиохирургии.

В работе обоснована возможность комплексной оценки качества изготавливаемых криосохраненных аллогенных кондуитов с помощью применения методов определения жизнеспособности в сочетании с гистологическими и биомеханическими исследованиями.

Выявлены критические параметры технологической схемы, влияющие на качество аллографтов.

Получены методы внедрения клеток в матрикс аллографтов, получен новый тип аллографтов на основе методов тканевой инженерии.

Обобщен опыт клинического использования аллографтов, изготовленных в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева, в сердечно-сосудистой хирургии.

Практическая ценность и реализация результатов. В результате всего комплекса научно-поисковых работ предложены аллогенные клапаносодержащие кондуиты, изготовленные по новой технологической схеме, с высокими качественными параметрами. Данные протезы внедрены в клиническую практику в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. Дана оценка непосредственных и отдаленных результатов применения аллографтов, выявлены их недостатки и уточнены показания к применению.

Положения, выносимые на защиту.

1. Криосохраненные клапаносодержащие аллографты аорты и легочной артерии являются биологическими протезами, способными адекватно корригировать врожденные и приобретенные пороки сердца, венозные аллографты также являются протезами выбора при лечении хронической венозной недостаточности нижних конечностей.

2. Предложенная технология изготовления криосохраненных трансплантатов позволяет без значительных повреждений сохранить клеточные элементы и матрикс аллографтов.

3. Цитотехнологическая модификация аллографтов позволяет улучшить их биосовместимость, в частности, снизить склонность к кальцификации.

Настоящая работа выполнена:

В отделе медицинской биотехнологии (руководитель - канд. биол. наук В.Т. Костава), отделении реконструктивной хирургии приобретенных пороков сердца (руководитель -проф. И.И. Скопин), отделении неотложной хирургии приобретенных пороков сердца (руководитель - проф. P.M. Муратов), отделении врожденных пороков сердца детей старшего возраста (руководитель - академик РАМН В.П. Подзолков), лаборатории патологической анатомии с прозектурой (руководитель - проф. P.A. Серов), отделении микрососудистой и пластической хирургии (руководитель - проф. К.Г. Абалмасов), отделении моделирования и изучения патологии сердца и сосудов с оперблоком и виварием (руководитель - проф. М.В. Соколов), отделении переливания крови (руководитель - канд. мед наук С.А. Шаноян), лаборатории гематологии (руководитель - д.м.н. H.H. Самсонова) Научного Центра сердечно- сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН. Совместные исследования по клеточной инженерии проводились на базе лаборатории цитотехнологии (руководитель - д.ф.-м.н. B.C. Акатов) Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Автор считает приятным долгом выразить благодарность научному консультанту, директору НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, академику JI.A. Бокерия за предоставленную возможность провести исследования и выполнить данную работу, а также за общее руководство и координацию работы, руководителю отдела медицинской биотехнологии В.Т. Костава, а также руководителю отделения неотложной хирургии приобретенных пороков сердца, проф. P.M. Муратову за неоценимую помощь и поддержку на всех этапах работы, руководителю отделения врожденных пороков сердца, академику РАМН В.П. Подзолкову и сотрудникам его отделения за любезно предоставленные материалы для работы, сотрудникам лаборатории цитотехнологии ИТЭБ РАН и лично ее руководителю — д.ф.-м.н. B.C. Акатову за огромный вклад в совместные экспериментальные исследования аллографтов, сотрудникам лаборатории нейрофизиологии НИИ нормальной физиологии РАМН им. П.К. Анохина (руководитель - д.м.н., проф. В.В. Шерстнев), а также коллективу НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН в целом, и всем, кто принял активное участие в совместной работе, за помощь и поддержку.

ВЫВОДЫ.

1. В НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН на основе экспериментальных исследований создана собственная технология производства криосохраненных аллографтов сердечных клапанов и венозных сосудов с клапаном. Решены организационные проблемы по забору, транспортировке и обработке аллогенных кондуитов. Имеющееся у нас современное криогенное оборудование позволяет подобрать адекватный режим замораживания и сохранить аллографты в течение длительного времени.

2. Предложенная технология изготовления аллографтов практически не изменяет их биомеханических свойств, не нарушает морфологическую структуру клапаносодержащих кондуитов и не повреждает структурные элементы тканей.

3. Качество аллографтов может быть достоверно определено с помощью ряда методик: определения поглощения кислорода, синтеза АТФ и пиридиннуклеотидов, включения меченых аминокислот в структурные белки клапанов, люминесцентной микроскопии с витальными красителями, оценки пролиферативной активности фибробластов, упруго-прочностных и гистологических исследований. Для экспресс-оценки качества достаточно выбрать наиболее простые и дешевые исследования, например люминесцентную микроскопию с витальными красителями.

4. Элиминация клеточных донорских элементов из ткани аллографта путем апоптотического воздействия ЭДТА и заселение матрикса клапана тканеобразующими клетками реципиента по экспериментальным данным позволяет уменьшить склонность аллографта к кальцификации и, следовательно, повысить его долговечность.

5. На основании проведенных экспериментальных исследований скорректирована технология изготовления клапаносодержащих аллографтов: изменена схема стерилизации, разработана новая программа криосохранения, размораживания и подготовки к имплантации. В технологию изготовления введена апоптотическая обработка с целью снижения кальциноза. С 2003 г. аллографты, изготавливаемые по новой схеме, используются в клинической практике.

6. При хирургическом лечении врожденных и приобретенных пороков сердца предпочтительнее использовать ортотопическую имплантацию аллографтов по методике «свободного корня». При невозможности такой операции у детей с аномалиями развития легочного клапана операцией выбора является имплантация экстракардиального легочного кондуита. Выполнение аутолегочного протезирования (операции Росса), особенно у молодых пациентов, позволяет улучшить результаты хирургического лечения пороков аортального клапана.

7. Уникальные гемодинамические характеристики и хорошие ближайшие и отдаленные результаты применения аллографтов при хирургической коррекции врожденных и приобретенных пороков сердца, хронической венозной недостаточности позволяют говорить о перспективности дальнейшего применения этого типа биопротезов в кардиохирургии. Анализ 10-летнего опыта применения аллографтов свидетельствует о том, что они адекватно корригируют гемодинамику, удобны и достаточно просты с точки зрения хирургической техники имплантации, позволяют улучшить качество жизни оперированных больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. На различных технологических этапах изготовления криосохраненных аллографтов следует учитывать повреждающее действие температуры хранения аллографта до обработки, времени и температуры стерилизации, состава смеси антибиотиков, режима замораживания и размораживания, так как эти факторы способствуют повреждению клеточных элементов и матрикса аллографтов, что в дальнейшем может явиться причиной ускоренной дегенерации тканей пересаженного клапана. Точное соблюдение всех режимов разработанной нами технологии позволяет свести к минимуму возможные повреждения.

2. Контроль качества аллографтов должен осуществляться на всех этапах технологической схемы изготовления аллографтов. Наиболее доступной является методика люминесцентной микроскопии с витальными красителями.

3. При создании банка криосохраненных аллографтов необходимо современное криогенное оборудование, позволяющее широко варьировать режимы замораживания и хранения для различных типов аллогенных трансплантатов.

4. При создании новых перспективных моделей аллогенных биопротезов необходимо учитывать возможность увеличения их долговечности и биосовместимости за счет предварительной «мягкой» девитализации и использования собственных клеток реципиента, внедряемых в матрикс аллографта.

5. При хирургическом лечении врожденных и приобретенных пороков сердца следует учитывать высокие гемодинамические характеристики аллографтов, что позволяет снизить летальность, уменьшить период реабилитации больных и улучшить качество их жизни.

6. При сложности постоянного мониторинга эффективности антикоагулянтной терапии аллографты являются клапанами выбора, так как при их имплантации отпадает необходимость в таком мониторинге.