Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Клинико-иммунологические и морфологические корреляции в патогенезе хронического гепатита С

На правах рукописи

ШАХМАНОВ Дмитрий Михайлович

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ КОРРЕЛЯЦИИ В ПАТОГЕНЕЗЕ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА С

14.00.10 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2007

Работа выполнена в Военно-медицинской академии им. С М Кирова

Научный руководитель - доктор медицинских наук профессор ЖДАНОВ Константин Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор АНТОНОВА Тамара Васильевна доктор медицинских наук профессор ВИНОГРАДОВА Елена Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «17» сентября 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.01 при Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова {194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова

Автореферат разослан «_» августа 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор ПОНОМАРЕНКО Геннадий Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования В настоящее время в мире проживает не менее 170 млн. человек, инфицированных вирусом гепатита С (ВГС), что составляет около 3% населения планеты Поэтому HCV-инфекция (инфекция вирусом гепатита С) представляет собой глобальную медико-социальную проблему, которая обусловлена стабильным уровнем заболеваемости и высокими затратами на диагностический и лечебный процессы [Балаян М С, Михайлов М И, 1999, Яковлев А А и соавт, 2002, Лобзин Ю В и соавт, 2006, Alter Н J, Seeff L В, 2000, Shepard С W и соавт ,2005]

Особенностью гепатита С (ГС) является его скрытое бессимптомное течение, что имеет существенное эпидемиологическое значение К основным путям заражения ВГС относятся различные парентеральные вмешательства (внутривенное употребление наркотиков, переливания крови и её препаратов, татуаж, пирсинг, оперативные вмешательства, инвазивные процедуры, а также профессиональное инфицирование медицинского персонала) В то же время значение естественных путей передачи (половой, вертикальный) при HCV-инфекции несколько ниже [Рахманова А Г и соавт, 1999, Антонова Т.В., 2002, Шахгильдян И.В., Михайлов М И, 2003].

Персистенция ВГС длится многие годы по типу медленной инфекции и представляет собой последовательность следующих клинических форм, острый гепатит, хронический гепатит стадии отсутствия фиброза, слабого, умеренного и тяжелого фиброза, цирроза, печеночно-клеточная карцинома [Виноградова Е Н, 1997, Соринсон С Н, 1998; Marcelim Р и соавт., 2002, Seeff L В, 2002]

Для ВГС, в отличие от вируса гепатита В (ВГВ), характерно прямое цитопатическое действие на инфицированные клетки. В то же время, углубленное изучение кшншко-лабораторных и морфологических данных позволяет предположить, что в патогенезе HCV-инфекции особое значение отводится иммунным механизмам. Также существуют данные, что при длительной персистенции ВГС появляются аутоиммунные антитела, вносящие определенный вклад в течение заболевания [Серов ВВ., 1997; Лесняк О.М, 1999, Сологуб Т.В. и соавт, 2003, Leone N и соавт., 2002].

Некоторыми исследователями описана репликация ВГС в клетках крови (моноцитах и лимфоцитах), имеющая значение, как для персистенции вируса, так и для реализации внепеченочных проявлений инфекции [Игнатова Т.М, 1998]

Проблеме изучения патогенеза и характера иммунного ответа на ВГС посвящены многие исследования Тип и эффективность иммунной реакции на различные инфекционные агенты определяются активностью клеточного и гуморального звеньев иммунитета Ведущая роль в осуществлении противовирусного иммунного ответа принадлежит Т-лимфоцитам, но из-за низких реактогенных свойств HCV наблюдается слабая Т-клеточная реакция Процессы хронизации при ГС связывают с гуморальным иммунным ответом, развивающегося при доминирующем влиянии Т-хелперов 2-го типа [Николаева Н И, 1999, Сухина И А, 2004, Fan X G и соавт, 1998, Freeman A J и соавт,

2003]

В то же время, результаты оценки иммунного статуса различных контингентов пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС) противоречивы Не до конца определен вклад иммунологических факторов в патогенез НСУ-инфекции в сопоставлении с лабораторными и морфологическими показателями течения на разных стадиях патологического процесса, до конца не ясны значение и механизмы развития аутоиммунного компонента при ГС, не прекращается поиск иммунологических факторов прогрессии заболевания

Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования

Цель исследования. На основании комплексного углубленного обследования установить взаимосвязи между кпинико-морфологическими и иммунологическими показателями у больных хроническим гепатитом С

Задачи исследования.

1 Провести сравнительный анализ юганико-морфологических и иммунологических показателей на разных стадиях хронического гепатита С

2 Выявить юшнико-морфологические корреляции с параметрами клеточного и гуморального иммунитета на каждой стадии НСУ-инфекции

3 Изучить экспрессию мРНК хемокинов и их рецепторов в крови и ткани печени и сопоставить полученные результаты с клинико-лабораторными и морфологическим показателями у пациентов с хроническим гепатитом С.

Научная новизна исследования. На основании комплексного углубленного обследования выявлены взаимосвязи основных клинико-лабораторных, морфологических и иммунологических показателей течения НСУ-инфекции на различных стадиях заболевания Показано, что прогрессирование ХГС характеризовалось ростом активности патологического процесса в ткани печени на фоне снижения репликации вируса и сопровождалось активацией как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета, усилением аутоиммунного компонента, проявляющегося в нарастании частоты встречаемости аутоантител и лимфоидных фолликулов

Обнаружено, что по мере течения ХГС до стадии тяжелого фиброза уровни лимфоцитов с цитотоксической активностью прямо коррелировали с основными клинико-лабораторными и морфологическими проявлениями хронической НСУ-инфекции. При этом на стадии компенсированного цирроза данная зависимость становилась обратной, несмотря на рост активности патологического процесса. Это было связано с повышенной миграцией данных клеток в ткань печени

Установлена прямая взаимосвязь между внутридольковыми некрозами, вирусной репликацией и активностью цитотоксических лимфоцитов на ранних стадиях НС У-инфекции. При этом на поздних стадиях ХГС отмечалось нарастание перипортальных некрозов на фоне снижения вирусной репликации в гепатоцитах при сохраняющейся репликации возбудителя в клетках воспалительного инфильтрата портальных трактов.

Впервые выявлено увеличение показагелей экспрессии мРНК рецепторов лимфо-моноцитарных хемокинов в крови и макрофагального (МСР-1) хемокина в гепатобиоптатах у пациентов с более выраженными изменениями в печени, свидетельствующее об активации клеточного звена иммунной системы, повышенной миграции моноцитов крови в печень и нарастании значения тканевых макрофагов в патогенезе НСУ-инфекции

Практическая значимость. Продемонстрировано, что определение в крови содержания цитотоксических лимфоцитов, Т-киллеров, циркулирующих иммунных комплексов, иммуноглобулинов М и в, антинуклеарных антител может использоваться для неинвазивной оценки степени активности и стадии патологического процесса у больных ХГС

Показано, что экспрессия мРНК рецепторов лимфо-моноцитарных хемокинов крови и макрофагального хемокина (МСР-1) в гепатобиоптатах связана с активностью воспаления и стадией фиброза в печени. Это позволяет использовать данный метод для мониторинга течения заболевания без выполнения пункционной биопсии печени

На основании многофакторного дискриминантного анализа разработаны высоко информативные и значимые математические модели, позволяющие без проведения пункционной биопсии печени выявлять пациентов с минимальной активностью воспаления (индекс гистологической активности (ИГА)<3 балла) и слабым фиброзом, которым комбинированная противовирусная терапия не всегда обязательна

Личное участие автора в получении результатов. Автором проведен сравнительный анализ и выполнено исследование взаимосвязей основных клинико-лабораторных, морфологических и иммунологических проявлений заболевания на различных его стадиях, разработана математическая модель для выявления группы пациентов, не нуждающихся в комбинированной противовирусной терапии.

Автор осуществлял планирование исследования, принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных, организовывал проведение всех лабораторно-инструментальных и гистологических исследований, самостоятельно выполнял пункционные биопсии печени Автором лично сформирована база данных, проводилась статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Прогрессирование ХГС характеризуется нарастанием некро-воспалительных изменений в ткани печени на фоне снижения активности вирусной репликации и сопровождается активацией лимфоцитов с цитогоксическими свойствами, гуморального звена иммунитета, а также усилением аутоиммунных процессов

2 Гепатоцитопатическое действие возбудителя имеет решающее значение в патогенезе ранних стадий НСУ-инфекции, а иммунопатологические,

включая аутоиммунные, процессы являются ведущими на поздних стадиях заболевания и коррелируют с усилением фиброза

3 Динамика суммарной экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) хемокинов и их рецепторов, свидетельствует о значимом вкладе тканевых макрофагов в усиление гистологических нарушений по мере развития фиброза у больных ХГС

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники инфекционных болезней Военно-медицинской академии (ВМедА) им С М Кирова

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и УШ съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002), Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004), Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии-2005» (Санкт-Петербург, 2005), Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней ВМедА им С М.Кирова (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2006» (Санкт-Петербург, 2006); VII Российском съезде инфекционистов (г. Нижний Новгород, 2006), на 12 Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2007)

По материалам исследования опубликовано 11 печатных работ, в том числе 1 статья в реферируемом ВАК журнале

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 5 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 152 источника, в том числе 54 отечественных и 98 зарубежных. Текст содержит 56 таблиц, 2 формулы, 4 машинограммы, 6 рисунков и 1 клинический пример.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Обследовано 133 больных ХГС (анти- НСУ «+», РНК НСУ «+») на различных стадиях заболевания. Возраст больных колебался от 17 до 60 лет и в среднем составил 32,0±1,6 года Большинство обследованных являлись лицами мужского пола - 96 человек (72,2%), женщины составили 37 человек (27,8%).

Все больные поступали в клинику инфекционных болезней для углубленного обследования в связи с обнаружением в крови антител к ВГС В

подавляющем большинстве случаев сывороточные маркеры НСУ-инфекции выявлялись случайно при плановом обследовании по поводу каких-либо других заболеваний, участии в донорстве или диспансеризации. Все обследованные лица отрицали перенесенный ранее вирусный гепатит и считали себя "практически здоровыми" Диагноз ХГС, включая и стадию компенсированного цирроза печени, выставлялся при обследовании впервые

Необходимо отметить, что лица с острым ГС и больные на стадиях суб- и декомпенсированного цирроза печени, а также наркозависимые и употребляющие алкоголь пациенты в исследование не включались

Распределение больных по стадии НСУ-инфекции проводилось на основании оценки выраженности фиброза в гепатобиоптате в соответствии со стандартизированной системой «МЕТАУШ» (1<0 - отсутствие фиброза, Р1 -слабый (портальный) фиброз, ¥2 - умеренный (с порто-портальными септами), БЗ - тяжелый (с порто-центральными септами) и Б4 - цирроз

Таким образом, изучаемые пациенты распределились по стадии ХГС на четыре группы- И - 51 (38,3%), 72 - 49 (36,9%), БЗ - 22 (16,5%), 74 - 11 (8,3%) Комплексное обследование включало в себя- клинический осмотр больного по органам и системам, общие клинические анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, исследование крови на специфические маркеры вирусных гепатитов в иммуноферментном анализе (ИФА), молекулярно-биологические исследования крови с использованием полимеразно-цепной реакции (ПЦР) для оценки качественного и количественного содержания рибонуклеиновой кислоты (РНК) ВГС и его генотипирования, ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости, пункционную биопсию печени с последующим морфологическим и иммуногистохимическим исследованием гепаггобиоптата, иммунологические исследования

Большинство серологических и молекулярно-биологических исследований осуществлялись совместно с городским центром вирусологических исследований г. Санкт-Петербурга и лабораторией вирусных гепатитов Научно-исследовательского института экспериментальной медицины (НИИЭМ) им Л. Пастера.

Морфологические исследования гепатобиоптатов проводились совместно с кафедрой патологической анатомии ВМедА им. С.М. Кирова.

Иммунологическое исследование крови осуществлялось совместно с научно-исследовательской лабораторией (НИЛ) общей иммунологии и иммуногенетики научно-исследовательского отдела (НИО) передовых медико-биологических технологий научно-исследовательского центра (НИЦ) ВМедА им СМ. Кирова. Определение субпопуляций лимфоцитов проводилось на проточном цитометре Расвсап фирмы "ВесЮп ОюктБоп" (США) с использованием следующих комбинаций прямых моноклональных антител и изотипических контролей гой же фирмы: СБЗ/С04/С08, С056/НЬА-

БЛ/СОЗ и СЭ95/С019/С03 Также исследовали другие иммунологические параметры реакцию торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ) с фитогемагглютинином (ФГА) и конканавалином А (Кон А) по методике Д.

б

Бендиксен и соавт (1980) в модификации В Г Морозова и В X Хавинсона (1980), иммуноглобулины (Ig) М, G и А методом простой радиальной иммунодиффузии по G Mancini et al (1965), циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) по методу, предложенному Ю А Гриневичем и А Н Алферовым (1981), функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов (бактерицидность в лакгазокатионном тесте (ЛКТ) и тесте с нитросиним тетразолем (НСТ) по методу Rook JAW(1985); адгезивную и фагоцитарную активность нейтрофилов по методу Root R К (1975))

Исследование интерлейкина-ip (ИЛ-1р), ИЛ-2, ИЛ-8 в крови осуществлялось совместно с лабораторией иммунофармакологии Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов (ГосНИИ ОЧБ)

Исследование крови на аутоиммунные маркеры и определение экспрессии мРНК хемокинов (RANTES, МСР-1, М1Р-1а, МГР-ip) и их рецепторов (CCR1, CCR2, CCR3 и CCR5) в крови и печени проводилось совместно с научно-методическим центром (НМЦ) по молекулярной медицине при СПбГМУ им И.П Павлова

Исходные данные накапливались и подвергались статистической обработке на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Statistica 5 0 для Windows Математическая обработка данных начиналась с оценки вида распределения признака в выборке путем изучения параметров, характеризующих центральную тенденцию и рассеяние наблюдений по области значений признака Проводился расчет числовых характеристик клинико-лабораторных, морфологических и иммунологических показателей: среднего и его стандартной ошибки (для количественных нормально распределенных признаков); медианы и интерквартильных интервалов (для количественных показателей с отличным от нормального видом распределения); относительные частоты (для качественных данных) Проводилась оценка значимости различий средних значений в независимых выборках с помощью t-критерия Стьюдента (для количественных признаков с нормальным распределением), средних рангов по критерию Манна-Уитни (для количественных показателей с видом распределения отличного от нормального), относительных частот по критерию хи-квадрат с поправкой Йетса (для качественных признаков). Из других методов применялись непараметрический корреляционный анализ Спирмена (коэффициент корреляции - R) для оценки направления, силы и значимости корреляционной связи между различными клинико-лабораторными, морфологическими признаками и иммунологическими показателями и многофакторный дискриминантный анализ с построением линейных классификационных функций для дифференциальной диагностики различных групп пациентов с ХГС

Результаты исследования и их обсуждение. При сборе эпидемиологического анамнеза у больных ХГС предполагаемую длительность инфекционного процесса удалось установить у 91 (68,4%) пациента Она

варьировала от 0,5 до 30 лет и в среднем составила 7,5±0,6 года При сравнительном изучении предполагаемого периода инфицирования в зависимости от стадии ХГС выявлено достоверное его нарастание по мере прогрессии заболевания (с 4,1±0,4 при Идо 15,1±2,2 года при F4)

Среди возможных путей инфицирования преобладали эпизодическое введение наркотиков в прошлом (35,2%) и гемотрансфузии (32,9%). Лица, продолжающие употреблять психотропные средства в исследование не включались

При опросе большинство пациентов не предъявляли никаких жалоб и считали себя практически здоровыми людьми В некоторых случаях отмечались, периодически возникающие общая слабость (15%), тяжесть в правом подреберье (29,3%) и снижение аппетита (7,5%)

Анализ биохимических показателей крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания выявил, что во всех группах наблюдались признаки цитолитического синдрома, при этом отмечалось недостоверное нарастание АлАТ (с 137,7±22,7 ЕД/л при F1 до 188,1±85,7ЕД/л при F4) и АсАТ (с 54,9±22,7 ЕД/л при F1 до 120,5±49,9ЕД/л при F4) по мере прогрессии HCV-инфекции

У пациентов с компенсированным циррозом обращало на себя внимание статистически достоверное снижение показателей ПТИ (78,8±9,9%) и альбуминов (37,5±4,1 г/л), при увеличении уровней глобулинов (41,3±2,7 г/л) и тимоловой пробы (5,9±1,2 БД), что отражало угнетение белково-синтетической функции печени, усиление иммуновоспалительного синдрома и свидетельствовало о прогрессировании иммуноопосредованного компонента поражения ткани печени к этой стадии. В то же время у пациентов без цирроза эти изменения практически не наблюдались.

Изучения данных электрофореза белковых фракций крови на различных стадиях ХГС показало, что значимых различий в уровнях al, a2 и р-глобулинов в сравниваемых группах пациентов не наблюдалось. В свою очередь, обращало на себя внимание снижение содержания альбуминов (47,9±3,2%) и повышение у-глобулинов (25,7±3,1%) в крови у пациентов с компенсированным циррозом. Данная ситуация указывала на закономерное нарастание диспротеинемии по мере прогрессирования ХГС, что вызвано угнетением белково-синтетической функции печени и усилением иммуновоспалительного синдрома.

Антитела к ВГС, как к core - антигену, так и неструктурным белкам (NS 3,4,5), а также РНК ВГС в ПЦР определялись в крови у всех пациентов.

При сравнительном анализе уровня виремии на различных стадиях заболевания установлено, что по мере прогрессирования ХГС происходило статистически значимое снижение активности вирусной репликации. В то же время, если на первых трех стадиях уровень виремии находился на уровне 1000000 МЕ/мл, а количество больных с высокой (>400000 МЕ/мл) «вирусной нагрузкой» превышало 70%, то на стадии цирроза уровень виремии составил 550000 МЕ/мл, и увеличилось число пациентов с низкой (<400000 МЕ/мл) «вирусной нагрузкой» (42,9%).

Среди изученных пациентов, в целом, преобладали lb и За генотипы ВГС

(54,3% и 38,2 %, соответственно) 2 генотип выявлялся крайне редко (2,5%).

При полуколичественной оценке степени активности патологического процесса в печени с использованием ИГА по К О. Кпо<1е11 оценивались в баллах первые три составляющие - перипортальные некрозы, внутридольковые некрозы и портальная инфильтрация Прогрессирование ХГС сопровождалось увеличением ИГА (с 4,6±0,3 балла при И до 6,7±0,2 балла при Б4) преимущественно за счет перипортальных некрозов (с 1,0±0,1 балла при И до 1,8±0,3 балла при Б4)

Частота обнаружения яимфоидкых фолликулов в перипортальной соединительной ткани значимо нарастала по мере прогрессирования заболевания (с 22,4% при П до 81,8% при Р4) и позволяло думать об усилении иммунноопосредованного, в том числе аутоиммунного компонента по мере прогрессии заболевания

Ацидофильные апоптотические тельца Каунсильмена встречались со схожей частотой на первых трех стадиях ХГС и статистически значимо нарастали у пациентов с циррозом (с 44,9% при П до 72,7% при Б4)

Экспрессия N83 белка в воспалительном инфильтрате портального тракта не имела отличий на разных стадиях заболевания В свою очередь, в гепатоцитах и желчных протоках она обнаруживалась более интенсивно на ранних стадиях заболевания. В последующем наблюдалось значимое её снижение, свидетельствующее об ослаблении внутрипеченочной вирусной репликации

Сравнительный анализ частоты выявления N83 белка в изученных структурах печени подтвердил вышеизложенные результаты Незначимые различия по частоте обнаружения N83 белка в воспалительном инфильтрате портальных трактов сочетались с существенным снижением его регистрации в гепатоцитах (с 65,3% при до 18,2% при Б4) Факт преимущественного обнаружения (60-70% наблюдений) экспрессии N83 белка НСУ в клетках воспалительного инфильтрата портальных трактов, в том числе и на поздних стадиях заболевания, также подтверждает главенствующую роль именно иммуноопосредованного портального компонента поражения печени в патогенезе ХГС

Выявлена прямая корреляционная зависимость суммарного индекса экспрессии N83 белка ВГС в ткани печени от уровня виремии (11=0,43, р<0,001). Кроме того, у больных ХГС на стадиях слабого и умеренного фиброза экспрессия N83 белка ВГС значимо коррелировала с активностью АлАТ (11=0,41, р<0,001), а также ИГА (11=0,44, р<0,001) за счет выраженности портального воспаления (11=0,48, р<0,001) Эти данные свидетельствовали о том, что на ранних этапах заболевания гепатоцитопатическое действие ВГС определяет активность воспаления в печени и приводит к развитию цитолитического синдрома

Были изучены абсолютное и относительное содержание субпопуляций лимфоцитов, их функциональная активность с Т-клеточными митогенами, содержание и ЦИК, спонтанная и индуцированная продукция ряда цитокинов, а также функциональная активность нейтрофилов и наличие

аутоиммунных антител. Полученные результаты были сопоставлены в группах пациентов на различных стадиях ХГС и контрольной группой, которую составили 30 здоровых доноров

При сравнении показателей субпопуляций лимфоцитов периферической крови на различных стадиях ХГС (табл 1) обращало на себя внимание нарастание относительного количества лимфоцитов у больных циррозом печени Абсолютное содержание Т-хелперов было достоверно повышено на всех стадиях заболевания Что касается цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ), то их абсолютное и относительное количество увеличивалось на всех стадиях ХГС, причем наиболее выраженные изменения наблюдались при циррозе. Это противоречит данным, полученным Маммаевым С Н и соавт, 2000; кеЬегтап В и соавт., 1996, Сг^еа V и соавт, 1997 указывающим, что при ХГС отмечается снижение уровня Т-хелперов у пациентов с ХГС

Уровень естественных киллеров (МС-клеток) оказался сопоставимым на различных стадиях ХГС и не выходил за пределы нормы В тоже время относительное содержание Т-киллеров достоверно нарастало к поздним стадиям болезни.

Аналогичная тенденция наблюдалась и в количестве В-лимфоцитов -достоверное повышение, в сравнении с контрольной группой, и значимое нарастание у больных циррозом печени

Уровни СБ95+-лимфоцитов достоверно превышали показатели контрольной группы и нарастали к поздним стадиям болезни, преимущественно за счет Т-клеток. Напротив, уровни НЬА-БК+-Т-лимфоцитов не отличались в группе контроля и у пациентов с ХГС на всех стадиях заболевания Это, в целом, свидетельствовало о доминировании именно СЮ95+-рецептора в качестве активационного маркера Т-лимфоцитов при хронической НСУ-инфекции С учетом выраженного достоверного нарастания уровней СБ95+-Т-лимфоцитов к стадиям тяжелого фиброза и цирроза печени, был проведен анализ их корреляций с содержанием Т-хелперов, ЦТЛ и Т-киллеров Обнаружена прямая зависимость абсолютных показателей активированных Т-лимфоцитов со всеми субпопуляциями. Однако при углубленном изучении установлено, что на ранних стадиях (Б! и Т2) уровень СБ95+-Т-лимфоцитов взаимосвязан только с количеством ЦТЛ, на стадии тяжелого фиброза - с Т-хелперами и ЦТЛ, а к стадии цирроза печени - всеми Т-клетками, включая Т-киллеры. Полученные взаимосвязи также характеризуют нарастание иммуноопосредованного компонента к поздним стадиям заболевания и активацию Т-киллеров у пациентов с компенсированным циррозом печени

Сравнительная характеристика среднестатистического содержания различных классов ЦИК в крови больных ХГС выявила достоверно большее их количество в сравнении с контрольной группой и постепенное нарастание этих показателей по мере прогрессирования заболевания Наиболее выраженные изменения наблюдались у пациентов с циррозом печени

Таблица 1 Субпопуляцин лимфоцитов в крови больных в зависимости от стадии ХГС, п=111 (М±тх)

Показатели Контроль Р1,п=46 Б2, п=38 РЗ, п=17 Р4,п=10

Лимфоциты % 34,7±0,9 37,3±1.1* 38.4±1,2* 36,2±1,9 43,2±3,5* ***

хю'лГ 2,07±0,08 2,42±0,11* 2,26±0,10 2,32±0,16* 2,51±0,3*

СБЗ+, Т-лимфоциты % 65.02tl.90 67,7±1,3 63.5±1,9 66,3±2,9 68,9±5,2

хЮ7л 1,41 ±0,09 1,62±0,07* 1,38±0,08 1,55±0,13 1,69±0.22

С03+С04+,Т-хелперы % 33,6±1,50 37,4±1,2* 34,5±1,3 37,7±2,2* 37,2±2,5

х109/л 0,73±0,05 0,89±0,04* 0,93±0,05* 0,89±0,09* 0,92±0Д2*

СБЗ+СВ8+, ЦТЛ % 24,6±0,7 26,8±1,1* 26,4±1,0* 25,8±1,4 28,4±1,3* ***

х10"/л 0,49±0,03 0,65±0,04* 0,58±0,04* 0,61±0,06* 0,70±0,13*

СВЗ-С056+,ЫК-клетки (натуральные киллеры) % 12,2±1,1 12,0±1,3 12,3±1,2 14,7±2,9 9,9±3,2

х109/л 0,29±0,03 0,27±0,03 0,25±0,03 0,31±0,06 0,25±0,10

С03+С056+, Т-киллеры % 4,2±0,1 4,3±0,6 4,5±0,4 5,4±1,0* 9,4±2,3*'***

х10ч/л 0,10±0,01 0,10±0,01 0,11±0,01 0,13±0,02* 0,19±0,04*'***

СБ 19+, В-лимфоциты % 10,1±0,9 11,5±0,7 12,9±0,8* 11,3±1,1 15,1±2,1*'***

х107л 0,22±0,03 0,29±0,03* 0,28±0,02* 0,27±0.02* 0,39±0,07*'***

активированные Т-лимфоциты % 2,3±0,2 2,9±0,3* 3,6±0,9* 3,4±0,5* 3,4±0,5*

х109/л 0,06±0,01 0,06±0,01 0,07±0,02 0,08±0,02 0,08±0,02

СБ95+, активированные с АРО-1 (БавК) лимфоциты % 5,8±1,6 17,1±1,9* 16,4±2,б* 24,1±4,8*'** 22,5±5,9*

х109/л 0,13±0,04 0,34±0,04* 0,33±0,04* 0,54±0,13*'** 0,56±0,15*

СБЗ+С095+, активированные с АРО-1 (РааК) Т-лимфоциты % 5,2±1,5 15,7±2,3* 15,0±3,4* 21,3±б,2*'** 20,7±5,1*

х107л 0,11±0,03 0,32±0,05* 0,31±0,06* 0,48±0,17*'** 0,54±0Д8*

* р<0,05 - контроль с ,72, БЗ и Т4, ** р<0,05 - Р2 с ИЗ, *** р<0,05 - БЗ с Р4

Схожие изменения имели место при сравнительном анализе содержания иммуноглобулинов. На первых трех стадиях ХГС количество ^ О было сопоставимым, а на четвертой стадии достоверно повышалось, не выходя при этом за верхнюю границу нормы Выявленные изменения свидетельствуют о нарастании иммуновоспапительного синдрома по мере прогрессии заболевания

При изучении функциональной активности нейтрофилов в крови было выявлено повышение показателей базапьного НСТ-теста во всех сравниваемых группах При этом результаты стимулированного НСТ-теста были значимо снижены только на стадии цирроза ЛКТ и фагоцитарный показатель нейтрофилов были сопоставимы у пациентов всех исследуемых групп В то же время, фагоцитарное число и показатель завершенности фагоцитоза были достоверно ниже у пациентов с ХГС, чем у здоровых лиц и имели тенденцию к снижению по мере прогрессии заболевания.

Анализ цитокинового звена иммунитета выявил некоторый дисбаланс, который проявлялся угнетением индуцированной продукции ИЛ-2 на ранних стадиях (Р1 и Р2) при ее выравнивании на поздних стадиях заболевания. Это косвенно объясняет высокую частоту хронизации при НСУ-инфекции, в том числе связанную с недостаточной продукцией Т-хелперов 1-го типа. Одновременно происходило усиление продукции ИЛ-1(5 и ИЛ-8. Полученные данные косвенно отражали нарастание провоспалительной активности по мере прогрессирования НСУ-инфекции, что также характеризовало усиление иммунноопосредованного компонента поражения ткани печени

Увеличение частоты встречаемости антинуклеарных антител (АЫА) отражало усиление аутоиммунного компонента на поздних стадиях заболевания.

Подводя итог вышесказанному можно предположить, что прогрессирование ХГС характеризовалось нарастанием некро-воспалительных процессов в ткани печени на фоне снижения активности репликации вируса. Данные феномены сопровождались активацией клеточного и гуморального звеньев иммунитета, а также некоторым снижением функциональной активности нейтрофилов. Это, во-первых, проявлялось повышением содержания в крови Т-лимфоцитов, в основном за счет ЦТЛ, а также Т-киллеров и Т-хелперов, особенно на поздних стадиях заболевания, и провоспалительных цитокинов. При этом снижение индуцированной продукции ИЛ-2 на ранних стадиях НСУ-инфекции косвенно свидетельствовало о некотором дефиците Т-хелперов 1-го типа и подтверждало высокую вероятность хронизации инфекционного процесса. Во-вторых, незначительное увеличение общего количества лимфоцитов, главным образом, было обусловлено повышенным образованием В-лимфоцитов, всех фракций ЦИК и иммуноглобулинов, отражающих количественную сторону гуморального звена иммунитета. В-третьих, усиление аутоиммунных процессов проявлялось в нарастании частоты встречаемости аутоантител и лимфоидных фолликулов в печени

Полученные результаты потребовали более углубленного анализа взаимосвязей основных клинико-лабораторных и морфологических данных с иммунологическими показателями, в том числе и на всех стадиях НСУ-инфекции

При проведении корреляционного анализа основных клинических показателей течения ХГС установлено наличие прямой достоверной взаимосвязи возраста пациентов с содержанием Т-хелперов, Т-киллеров, НЬА-БК+-Т-лимфоцитов и СВ95+-Т-лимфоцитов, а также со всеми фракциями изученных иммуноглобулинов и ЦИК. Необходимо отметить, что с относительным и абсолютным содержанием В-лимфоцитов отмечена обратная корреляция С возрастом в момент инфицирования выявлена прямая зависимость значений Т-хелперов и активированных ША-БШ-Т-лимфоцитов), ¡й М и ^ А, а также низкомолекулярных ЦИК, обратная - от содержания МК-клеток Предполагаемая длительность инфицирования имела обратную корреляцию с абсолютным уровнем ЦТЛ, прямую с Т-киллерами, % О, ]£ А и средне- и низкомолекулярными ЦИК.

Анализ взаимосвязей биохимических показателей, характеризующих цитолитический синдром и белковосинтетическую функцию печени, и основными иммунологическими параметрами показал, что уровень АлАТ имел прямую зависимость от уровня ЦТЛ, Т-киллеров, абсолютных показателей В-лимфоцитов, активированных НЬА-В11+-Т-лимфоцитов и СБ95+-Т-клеток Наряду с этим, показатель АсАТ также был взаимосвязан с абсолютными уровнями ЦТЛ, Т-киллеров и НЬА-Ш1+-Т-лимфоцитов, а также А, в и высокомолекулярными ЦИК. В то же время ПТИ имел обратную корреляционную взаимосвязь с ^ О, а также высоко- и среднемолекулярными ЦИК

Анализ взаимосвязей уровня виремии с показателями иммунитета у пациентов с ХГС продемонстрировал наличие прямой корреляционной взаимосвязи «вирусной нагрузки» с относительным уровнем ЦТЛ и ^М

Обнаружено, что ИГА имел обратную корреляцию с относительным содержанием Т-клеток, прямую - с ^ О и высокомолекулярными ЦИК Перипортальные некрозы (ППН) были взаимосвязаны с относительным уровнем Т-лимфоцитов, МК-клеток, высоко- и среднемолекулярными ЦИК Выраженность внутридолъковых некрозов (ВДН) обратно^ зависела от относительного содержания Т-хелперов, О и прямо - от СБ95+-Т-лимфоцитов, ^ М и высокомолекулярных ЦИК В то же время портальное воспаление (ПВ) обратно коррелировало с относительным значением Т-клеток и прямо - с в

При проведении сравнительного анализа между параметрами иммунной системы и некоторыми основными морфологическими показателями выявлено, что у пациентов с наличием апоптотических телец Каунсильмена отмечались большие абсолютные уровни активированных НЬА-В]1+-Т-лимфоцитов (р=0,031) и С095+-Т-клеток (р=0,034), но меньшие - средне- (р=0,007) и низкомолекулярных (р=0,005) ЦИК, что характеризовало вероятный вклад этих показателей в активацию апоптоза при ХГС

Сравнительный анализ различий иммунологических показателей у пациентов с наличием морфологического маркера выраженного иммунноопосредованного компонента - лимфоидных фолликулов - показал, что у пациентов с их наличием отмечались меньшие показатели В-лимфоцитов (р=0,010 для относительного и р=0,009 для абсолютного), уровни активированных НЬА-011+-Т-лимфоцитов (р=0,014) и ^ О (р=0,044) Установленные изменения могли характеризовать повышенную миграцию выявленных субпопуляций клеток иммунной системы в ткань печени для формирования фолликулов

Полученные результаты корреляционного анализа на каждой стадии заболевания позволили предположить, что на стадии слабого фиброза более низкий уровень ЦТЛ взаимосвязан со стабилизацией процесса и что вклад Т-киллеров в прогрессию заболевания еще не достаточно выражен В то же время при прогрессирующем течении хронической НСУ-инфекции ведущим механизмом поражения печени являлась активация ЦТЛ, МК-клеток и Т-киллеров, то есть лимфоцитов с цитотоксической активностью, которая и обуславливала переход заболевания на стадию цирроза Однако на стадии цирроза вклад выявленных клеток в дальнейшее прогрессирование болезни несколько снижался

Следует отметить вклад уровня виремии в активацию иммуннопатологических процессов в организме больного С другой стороны, по мере развития фиброза увеличивалось число обратных взаимосвязей, в первую очередь, с показателями гуморального звена иммунитета. Данная ситуация, вероятно, обусловлена тем, что с прогрессированием заболевания отмечалась активация иммунной системы и нарастание ее влияния на репликацию ВГС. Это проявлялось снижением «вирусной нагрузки» к стадии цирроза печени и сопровождалось ростом иммунопатологических процессов у пациентов с более выраженным фиброзом

Кроме того, по мере прогрессии заболевания до стадии тяжелого фиброза отмечалась прямая взаимосвязь уровня клеток иммунной системы с цитотоксической активностью и показателями активности патологического процесса. Но на стадии компенсированного цирроза эта корреляционная зависимость становилась обратной, что, вероятно, связанно с перераспределением и повышенной миграцией лимфоцитов в ткань печени, где и осуществляются их патологические эффекты. Следствием этого и являлось достоверное нарастание ИГА по мере прогрессии заболевания, как было показано выше

Полученные результаты также позволили предположить, что преимущественный вклад активированных ЦТЛ в апоптоз гепатоциггов имел место на ранних стадиях заболевания

Следует отметить, что на ранних стадиях ХГС среди всех составляющих ИГА именно внутридольковые некрозы в большей степени корелировали с динамическими изменениями лимфоцитов с цитотоксической активностью Это, а также наличие достоверной прямой взаимосвязи между вирусной репликацией и внутридольковыми некрозами определяют решающее значение

гепатоцитопатического действия возбудителя в патогенезе ранних стадий НСУ-инфекции В последующем нарастание некро-воспалительной активности происходило за счет перипортальных некрозов, которые преимущественно коррелировали с изменениями основных иммунологических показателей на фоне снижения вирусной репликации в гепатоцитах, но сохраняющейся репликации в клетках воспалительного инфильтрата портальных трактов В этой связи, иммуноопосредованные, в том числе аутоиммунные, механизмы повреждения становятся ведущими в патогенезе поздних стадий заболевания

При сравнении показателей экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов в крови и печени на различных стадиях ХГС выявлены определенные отличия, свидетельствующие об отсутствии нарастания аутокринной стимуляции Т-лимфоцитов по мере прогрессии заболевания, активации миграции моноцитов крови в ткань печени у пациентов с тяжелым фиброзом и преимущественной активации системного иммунитета (табл 2).

Таблица 2 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов в крови и печени

при ХГС на разных стадиях, у.е. гметод Манна-Уитни, Ме (ЬО; СО))

Хемокины и их рецепторы Р1 ¥2 РЗ

К! зовь

ЯДШЕБ 4,6 (0,0, 5,6) 2,0(1,0; 13,3) 5,7(1,0, 6,8)

МСР-1 0,0(0,0; 0,5) 0,0 (0,0, 0,4) 0,8 (0,0; 1,0)

МПЧа 0,8 (0,0,1,0) 0,8 (0,0, 3,3) 1,7(0,0,4,2)

мпчр 0,0(0,0; 2,3) 0,6 (0,0, 2,7) 2,9 (0,0; 3,5)

ССК1 6,3 (2,1; 8,4)*'** 16,8 (10,2,36,7) 28,2(16,9,43,5)

сст 7,2(6,5; 8,9) 10,5 (7,1,31,6) 22,7 (17,9; 28,4)

ссвз 4,4 (0,0; 5,7)*'** 12,9 (3,0, 31,2) 22,8 (17,9,26,9)

ССК5 4,1 (1,9,4,6)*'** 12,3 (6,6,40,9) 31,4 (22,0; 38,0)

Гепатобиоптат

КАОТЕБ 1,6(0,0,8,2) 0,7(0,0,8,5) 1,6 (0,0, 7,0)

МСР-1 0,0 (0,0,0,7)** 0,5 (0,0, 8,3)*** 8,2 (2,1; 11,3)

МПМа 1,5 (0,0,2,0) 1,7(0,0, 5,6) 0,7 (0,0; 2,5)

МР-1р 1,1 (1,1,11,7) 0,8 (0,0,9,8) 8,0(2,8,15,3)

ССИ1 20,8(18,8; 28,1) 19,5 (14,2,36,3) 13,5 (13,3; 20,1)

ССИ2 23,9 (18,1; 40,6) 29,6 (10,7,35,1) 19,4(5,7; 21,3)

ССКЗ 14,6(4,8,23,4) 13,8 (10,5,32,7) 20,1 (2,7, 21,0)

ССЯ5 12,3(8,1,14,7) 16,2 (9,6,42,8) 14,3(1,0,22,1)

* р<0,05 -Р1 с ¥2, ** р<0,05 - И с ЕЗ, *** р<0,05 - Б2 с Ю

Полученные данные корреляционного анализа экспрессии мРНК основных лимфо-моноцитарных хемокинов и их рецепторов с основными клинико-лабораторными и морфологическими показателями свидетельствовали о большей активации клеток иммунной системы больных инфицированных в старшем возрасте, что, возможно, и обуславливало высокие темпы

прогрессирования НСУ-инфекции Напротив, длительность инфицирования ассоциировалась с меньшими показателями экспрессии рецепторов хемокинов и, возможно, была связана с истощением их продукции у наших пациентов по мере прогрессии заболевания

Выявленные корреляции позволили предположить, что именно активация лимфоцитов и моноцитов (макрофагов) влияет на выраженность цитолитического синдрома у пациентов с ХГС, а, учитывая снижение вклада вируса в поражение печени, становится доминирующей по мере прогрессии заболевания Особый интерес представляет обнаруженная ассоциативная взаимосвязь с уровнем АсАТ, которая, возможно, характеризует наличие более глубокого поражения гепатоцитов с увеличением силы иммунного воздействия.

Необходимо отметить, что обнаруженные корреляционные взаимосвязи выраженности экспрессии мРНК МСР-1 в гепатобиоптате и всех изученных рецепторов хемокинов в крови у пациентов с более выраженным гистологическими изменениями (активность патологического процесса и стадия фиброза), подтвердили вышеизложенную точку зрения о прямой взаимосвязи силы иммунного ответа с выраженностью морфологических изменений в печени

Кроме того, выявленные изменения свидетельствовали, что именно активированные тканевые макрофаги и Т-лимфоциты крови участвуют в осуществлении иммунопатологических эффектов и формировании лимфоидных фолликулов при ХГС

Таким образом, изучение экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов позволило раскрыть некоторые иммунопатогенетические механизмы течения НСУ-инфекции В частности, полученные данные свидетельствовали о взаимосвязи аутокринной стимуляции клеток иммунной системы в крови с активностью патологического процесса в печени и о повышенной миграции моноцитов крови в печень при нарастании значения тканевых макрофагов в выраженность морфологических изменений по мере прогрессии заболевания. Это могло иметь определенное значение для мониторинга течения и неинвазивной оценки изменений в печени при ХГС

В этой связи была разработана модель, позволяющая с использованием наименее трудоемких и вполне доступных исследований (включая экспрессию мРНК рецепторов хемокинов крови), проводимых в любой ПЦР лаборатории, выявить группу пациентов, которым назначение комбинированной противовирусной терапии не является обязательным. Решение задачи по выявлению данной группы больных было возможно лишь с применением методов многофакторного статистического анализа, с использованием дискриминантного анализа, позволяющего отнести изучаемый объект (больной ХГС) к одной из нескольких групп на основе измерения у него некоторого числа признаков (клинико-лабораторные параметры) Были разработаны линейные классификационные формулы (ЛКФ) для пациентов с минимальной активностью и слабым фиброзом и всех остальных пациентов с ХГС

Для определения показаний к проведению курса противовирусной терапии у конкретного больного по клинико-лабораторным параметрам

производился расчет ЛКФ по полученным формулам Больного относили к той группе, для которой ЛКФ принимал максимальное значение

Точность диагностики по решающим правилам в среднем характеризовалась высокой достоверностью (95,2%) Для первой группы (пациенты с Б 0-1 и ИГА<3 баллов) она составила 100%, а для второй группы (пациенты с Б 2-4 или ИГА>Збаллов) - 94,1%

Таким образом, на основании многофакторного дискриминантного анализа получены высоко достоверные модели (ЖФ), позволяющие с учетом достаточно простых клинико-лабораторных показателей (пол, возраст, определение экспрессии мРНК ССЖ.1 и ССК2 рецепторов хемокинов крови) выделить группу пациентов ХГС, которым не обязательно проведение комбинированной противовирусной терапии без выполнения пункционной биопсии печени.

ВЫВОДЫ

1. Нарастание дистрофических и некро-воспалительных процессов в ткани печени сопровождается активацией клеточного звена иммунной системы в виде достоверного повышения содержания в крови СБ95+-Т-лимфоцитов (с 0,32±0,03 хЮ9/л на стадии слабого фиброза до 0,54±0,18 х109/л у больных компенсированным циррозом), в основном за счет цитотоксических лимфоцитов, Т-киллеров на поздних стадиях заболевания, провоспалительных цитокинов, увеличением частоты выявления лимфоидных фолликулов

2 Усиление выраженности фиброза происходит на фоне значимого повышения активности патологического процесса, уменьшения вирусемии в период цирротической трансформации, увеличения в крови количества В-лимфоцитов, всех фракций циркулирующих иммунных комплексов и иммуноглобулинов, а также некоторого снижения функциональной активности нейтрофилов

3 На фоне усиления фиброгенеза отмечается прямая корреляционная связь активации в крови цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-киллеров, активированных Т-лимфоцитов с возрастом пациентов, в целом и в момент заражения, предполагаемой длительностью инфицирования, выраженностью цитолитического синдрома и некро-воспалительных изменений, частотой обнаружения лимфоидных фолликулов и телец Каунсильмена в ткани печени При этом в процессе формирования цирроза данная корреляционная зависимость становится обратной, несмотря на увеличение воспалительной активности, что, вероятно, обусловлено перераспределением и повышенной миграцией данных субпопуляций лимфоцитов в ткань печени у больных ХГС.

4. Наличие достоверной прямой взаимосвязи между внутридольковыми некрозами и вирусной репликацией, а также динамическими изменениями лимфоцитов с цитотоксической активностью свидетельствует о решающем значении гепатоцитопатического действия возбудителя в патогенезе ранних стадий НСУ-инфекции Дальнейшее нарастание активности патологического процесса за счет перипортальных некрозов на фоне снижения вирусной репликации в гепатоцитах при

сохраняющейся репликации возбудителя в клеткахах воспалительного инфильтрата портальных трактов определяют ведущую роль иммунопатологических, в том числе аутоиммунных, механизмов повреждения на поздних стадиях ХГС

5 Достоверное повышение экспрессии мРНК рецепторов хемокинов ССШ, ССЫЗ и ССВ.5 в крови при отсутствии изменений в ткани печени по мере прогрессии фиброза свидетельствует об активации клеточного звена иммунной системы при ХГС Увеличение экспрессии мРНК МСР-1 в печени к стадии тяжелого фиброза, ее прямая корреляция с уровнем АлАТ, ИГА, выраженностью фиброза, наличием лимфоидных фолликулов и обратная зависимость с виремией, характеризует повышенную миграцию моноцитов крови в печень и нарастание значения тканевых макрофагов в патогенезе НСУ-инфекции

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Пациентам с ХГС для неинвазивной оценки активности воспаления и стадии фиброза в печени в динамике следует осуществлять мониторинг иммунологических показателей, включающий в себя определение уровней цитотоксических лимфоцитов, Т-киллеров, циркулирующих иммунных комплексов, иммуноглобулинов М и в, антинуклеарных антител.

2. У больных с ХГС для своевременного выявления усиления ИГА и выраженности фиброза без выполнения пункционной биопсии печени целесообразно проводить исследование экспрессии мРНК лимфо-моноцитарных хемокинов (ССМ, ССШ., ССКЗ и ССК5) в крови

3 Для оценки показаний к назначению противовирусной терапии при наличии противопоказаний к проведению пункционной биопсии печени или отсутствии возможности для её выполнения рекомендовано использование следующих линейных классификационных функций (ЛКФ)-ЛКФ1 =- 9,4 - 0,22 Х1+0.17 Х2+7,09 ХЗ+ 0,21 Х4, ЛКФ2 =- 9,1 - 0,02 Х1+0,34 Х2+3,09-Х3+ 0,09 Х4, где: XI - экспрессия мРНК ССЯ1 рецептора хемокинов (уе), Х2 -возраст (годы), ХЗ - пол (1-мужской, 2-женский), Х4 - экспрессия мРНК ССЛ2 рецептора хемокинов (у е).

Если ЛКФ1>ЛКФ2, следовательно, у пациента ИГА<3 баллов и Б 0-1 -противовирусная терапия на момент обследования не является обязательной

Если ЛКФКЛКФ2, следовательно, ИГА>3 баллов или Б 2-4, пациент нуждается в проведении курса противовирусного лечения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Жданов К В. Иммунологическая характеристика хронического гепатита С у лиц молодого возраста / К В Жданов, Д.А. Гусев, Д М Шахманов, В Ю. Никитин, И А Сухина, М В Яременко // Проблема инфекции в клинической медицине Тез докл. науч конф и VIII съезда Итало-Рос об-ва по инфекц. болезням - СПб, 2002. - С 113

2 Никитин В.Ю Изучение маркеров активации лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С / В Ю Никитин, И А Сухина, К В Жданов, Д А Гусев, В Н Цыган, Д М Шахманов // Проблема инфекции в клинической медицине Тез докл науч конф и VIII съезда Итало-Рос об-ва по инфекц болезням - СПб , 2002 - С 228-229

3 Жданов К В Состояние иммунной системы при хроническом гепатите С / К В Жданов, ДА Гусев, ВЮ Никитин, И А. Сухина, ДМ Шахманов// Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики Тез докл V Рос науч.-практ конф - М, 2003 - С 99-100

4. Жданов К В Изучение морфологических изменений в печени на фоне противовирусной терапии ХГС / КВ. Жданов, В С Чирский, Д А Гусев, Г. А. Алентьев, Б В Голубин, ДМ. Шахманов // Узловые вопросы борьбы с инфекцией Тез докл Рос науч-практ конф - СПб, 2004. - С.92

5 Жданов К В Значение HLA-типирования в прогнозировании ответа на этиотропное лечение при HCV-инфекции / К.В. Жданов, И.М Юркаев, Д А. Гусев, Б.В Голубин, Д.М Шахманов // Узловые вопросы борьбы с инфекцией-Тез докл Рос науч -практ. конф - СПб, 2004 - С.92-93

6 Жданов К.В. HLA-типирование и состояние вирусной репликации при хроническом гепатите С / К В Жданов, И.М Юркаев, Д.А Гусев, Б В Голубин, Д.М Шахманов // Узловые вопросы борьбы с инфекцией Тез докл. Рос науч -практ. конф. - СПб, 2004. - С 93

7 Гусев Д.А Хронический гепатит С и антигены HLA I класса /ДА Гусев, Д М Шахманов // Актуальные вопросы инфекционной патологии-2005 Тез. докл. Всерос. науч конф молодых ученых с междунар. участием - СПб,

2005 -С.17

8 Шахманов Д.М Продукция цитокинов крови на фоне противовирусной терапии хронического гепатита С / ДМ. Шахманов, Б В Голубин, Д.А. Гусев // Тез докл Междунар молодеж. мед конгр - СПб, 2005 -С.37

9 Жданов К.В Аутоиммунные маркеры на фоне противовирусной терапии хронического гепатита С / К В Жданов, Д.А Гусев, Д М Шахманов, А.Н Вавилова, С В. Лапин//Мед иммунология -2006 - Т8, №2/3. - С 222

10 Жданов К.В Значение антигенов системы HLA I класса в прогнозировании ответа на противовирусную терапию ХГС / К В Жданов, ИМ Юркаев, Д.А Гусев, ДМ. Шахманов // Тез. Докл Рос. науч - практ конф , посвящ 110-летию кафедры инфекц. болезней Воен-мед акад - СПб,

2006 - С 115

11 Жданов К В Клинико-иммунологические, вирусологические и морфологические взаимосвязи при хроническом вирусном гепатите С / К.В Жданов, Д А Гусев, В С Чирский, В Ю Никитин, И А. Сухина, Д М Шахманов//Вестн Рос Воен.-мед. акад - 2007.-№2(18) -С.78-82

Подписано в печать 14 08.07 Печать ротапринт Бумага офсетная Формат 60x84 1/16. Объем 1,25 п л Тираж 200 экз Заказ № 50

Отпечатано в типографии ИОВ РАО 191180, Санкт-Петербург, наб р Фонтанки, 78

В настоящее время в мире проживает не менее 170 млн. человек, инфицированных ВГС, что составляет около 3% населения планеты. Поэтому HCV-инфекция представляет собой глобальную медико-социальную проблему, которая обусловлена стабильным уровнем заболеваемости и высокими затратами на диагностический и лечебный процессы [2, 10, 17, 18, 27, 46, 52, 55, 57,58, 85,89, 141].

Особенностью ГС является его скрытое бессимптомное течение, что имеет существенное эпидемиологическое значение. К основным путям заражения ВГС относятся различные парентеральные вмешательства (внутривенное употребление наркотиков, переливания крови и её препаратов, татуаж, пирсинг, оперативные вмешательства, инвазивные процедуры, а также профессиональное инфицирование медицинского персонала). В то же время значение естественных путей передачи (половой, вертикальный) при HCV-инфекции несколько ниже [1, 2, 19, 31, 38, 46, 48, 62, 104, 105, 117, 119, 135, 141].

Персистенция ВГС длится многие годы по типу медленной инфекции и представляет собой последовательность следующих клинических форм: острый гепатит, хронический гепатит: стадии отсутствия фиброза, слабого, умеренного и тяжелого фиброза, цирроза, печеночно-клеточная карцинома [3, 29, 36, 56, 77, 111,140].

Для ВГС, в отличие от ВГВ, характерно прямое цитопатическое действие на инфицированные клетки. В то же время, углубленное изучение клинико-лабораторных и морфологических данных позволяет предположить, что в патогенезе HCV-инфекции особое значение отводится иммунным механизмам. Также существуют данные, что при длительной персистенции ВГС появляются аутоиммунные антитела, вносящие определенный вклад в течение заболевания [16, 34,35, 108].

Некоторыми исследователями описана репликация HCV в клетках крови моноцитах и лимфоцитах), имеющая значение как для персистенции вируса, так и для реализации внепеченочных проявлений инфекции [11, 16].

Проблеме изучения патогенеза и характера иммунного ответа на ВГС посвящены многие исследования. Тип и эффективность иммунной реакции на различные инфекционные агенты определяются активностью клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Ведущая роль в осуществлении противовирусного иммунного ответа принадлежит Т-лимфоцитам, но из-за низких реактогенных свойств НСУ наблюдается слабая Т-клеточная реакция. Процессы хронизации при ГС связывают с гуморальным иммунным ответом, развивающегося при доминирующем влиянии Т-хелперов 2-го типа [25, 39, 79, 85, 101, 129, 138].

В то же время, результаты оценки иммунного статуса различных контингентов пациентов с ХГС противоречивы. Не до конца определен вклад иммунологических факторов в патогенез НСУ-инфекции в сопоставлении с лабораторными и морфологическими показателями течения на разных стадиях патологического процесса, до конца не ясны значение и механизмы развития аутоиммунного компонента при ГС, не прекращается поиск иммунологических факторов прогрессии заболевания.

Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

На основании комплексного углубленного обследования установить взаимосвязи между клинико-морфологическими и иммунологическими показателями у больных хроническим гепатитом С.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Провести сравнительный анализ клинико-морфологических и иммунологических показателей на разных стадиях хронического гепатита С.

2. Выявить клинико-морфологические корреляции с параметрами клеточного и гуморального иммунитета на каждой стадии НСУ-инфекции.

3. Изучить экспрессию мРНК хемокинов и их рецепторов в крови и ткани печени и сопоставить полученные результаты с клинико-лабораторными и морфологическим показателями у пациентов с хроническим гепатитом С.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Прогрессирование ХГС характеризуется нарастанием некро-воспалительных изменений в ткани печени на фоне снижения активности вирусной репликации и сопровождается активацией лимфоцитов с цитотоксическими свойствами, гуморального звена иммунитета, а также усилением аутоиммунных процессов.

2. Гепатоцитопатическое действие возбудителя имеет решающее значение в патогенезе ранних стадий НСУ-инфекции, а иммунопатологические, включая аутоиммунные, процессы являются ведущими на поздних стадиях заболевания и коррелируют с усилением фиброза.

3. Динамика суммарной экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты хемокинов и их рецепторов, свидетельствует о значимом вкладе тканевых макрофагов в усиление гистологических нарушений по мере развития фиброза у больных ХГС.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА На основании комплексного углубленного обследования выявлены взаимосвязи основных клинико-лабораторных, морфологических и иммунологических показателей течения НСУ-инфекции на различных стадиях заболевания. Показано, что прогрессирование ХГС характеризовалось ростом активности патологического процесса в ткани печени на фоне снижения репликации вируса и сопровождалось активацией как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета, усилением аутоиммунного компонента, проявляющегося в нарастании частоты встречаемости аутоантител и лимфоидных фолликулов.

Обнаружено, что по мере течения ХГС до стадии тяжелого фиброза уровни лимфоцитов с цитотоксической активностью прямо коррелировали с основными клинико-лабораторными и морфологическими проявлениями хронической НСУ-инфекции. При этом на стадии компенсированного цирроза данная зависимость становилась обратной, несмотря на рост активности патологического процесса. Это было связано с повышенной миграцией данных клеток в ткань печени.

Установлена прямая взаимосвязь между внутридольковыми некрозами, вирусной репликацией и активностью цитотоксических лимфоцитов на ранних стадиях НСУ-инфекции. При этом на поздних стадиях ХГС отмечалось нарастание перипортальных некрозов на фоне снижения вирусной репликации в гепатоцитах при сохраняющейся репликации возбудителя в клетках воспалительного инфильтрата портальных трактов.

Впервые выявлено увеличение показателей экспрессии мРНК рецепторов лимфо-моноцитарных хемокинов в крови и макрофагального (МСР-1) хемокина в гепатобиоптатах у пациентов с более выраженными изменениями в печени, свидетельствующее об активации клеточного звена иммунной системы, повышенной миграции моноцитов крови в печень и нарастании значения тканевых макрофагов в патогенезе НСУ-инфекции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Продемонстрировано, что определение в крови содержания цитотоксических лимфоцитов, Т-киллеров, циркулирующих иммунных комплексов, иммуноглобулинов М и О, антинуклеарных антител может использоваться для неинвазивной оценки степени активности и стадии патологического процесса у больных ХГС.

Показано, что экспрессия мРНК рецепторов лимфо-моноцитарных хемокинов крови и макрофагального хемокина (МСР-1) в гепатобиоптатах связана с активностью воспаления и стадией фиброза в печени. Это позволяет использовать данный метод для мониторинга течения заболевания без выполнения пункционной биопсии печени.

На основании многофакторного дискриминантного анализа разработаны высоко информативные и значимые математические модели, позволяющие без проведения пункционной биопсии печени выявлять пациентов с минимальной активностью воспаления (ИГА<3 балла) и слабым фиброзом, которым комбинированная противовирусная терапия не всегда обязательна.

ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА В ПОЛУЧЕНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ Автором проведен сравнительный анализ и выполнено исследование взаимосвязей основных клинико-лабораторных, морфологических и иммунологических проявлений заболевания на различных его стадиях, разработана математическая модель для выявления группы пациентов, не нуждающихся в комбинированной противовирусной терапии.

Автор осуществлял планирование исследования, принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных, организовывал проведение всех лабораторно-инструментальных и гистологических исследований, самостоятельно выполнял пункционные биопсии печени. Автором лично сформирована база данных, проводилась статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

АПРОБАЦИЯ И РЕАЛИЗАЦИЯ РАБОТЫ Результаты исследования внедрены в научную, учебную, лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники инфекционных болезней ВМедА им. С.М. Кирова.

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004); Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии-2005» (Санкт-Петербург, 2005); Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней ВМедА им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2006» (Санкт-Петербург, 2006); VII Российском съезде инфекционистов (г. Нижний Новгород, 2006); на 12 Российской конференции

Гепатология сегодня» (Москва, 2007).

По материалам исследования опубликовано 11 печатных работ, в том числе 1 статья в реферируемом журнале.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 141 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 5 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трёх глав результатов собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 152 источника, в том числе 54 отечественных и 98 зарубежных. Текст содержит 56 таблиц, 2 формулы, 4 машинограммы, 6 рисунков и 1 клинический пример.

выводы

1. Нарастание дистрофических и некро-воспалительных процессов в ткани печени сопровождается активацией клеточного звена иммунной системы в виде достоверного повышения содержания в крови СБ95+-Т-лимфоцитов (с 0,32±0,03 х109/л на стадии слабого фиброза до 0,54±0,18 *109/л У больных компенсированным циррозом), в основном за счет цитотоксических лимфоцитов, Т-киллеров на поздних стадиях заболевания, провоспалительных цитокинов, увеличением частоты выявления лимфоидных фолликулов.

2. Усиление выраженности фиброза происходит на фоне значимого повышения активности патологического процесса, уменьшения вирусемии в период цирротической трансформации, увеличения в крови количества В-лимфоцитов, всех фракций циркулирующих иммунных комплексов и иммуноглобулинов, а также некоторого снижения функциональной активности нейтрофилов.

3. На фоне усиления фиброгенеза отмечается прямая корреляционная связь активации в крови цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-киллеров, активированных Т-лимфоцитов с возрастом пациентов, в целом и в момент заражения, предполагаемой длительностью инфицирования, выраженностью цитолитического синдрома и некро-воспалительных изменений, частотой обнаружения лимфоидных фолликулов и телец Каунсильмена в ткани печени. При этом в процессе формирования цирроза данная корреляционная зависимость становится обратной, несмотря на увеличение воспалительной активности, что, вероятно, обусловлено перераспределением и повышенной миграцией данных субпопуляций лимфоцитов в ткань печени у больных ХГС.

4. Наличие достоверной прямой взаимосвязи между внутридольковыми некрозами и вирусной репликацией, а также динамическими изменениями лимфоцитов с цитотоксической активностью свидетельствует о решающем значении гепатоцитопатического действия возбудителя в патогенезе ранних стадий НСУ-инфекции. Дальнейшее нарастание активности патологического процесса за счет перипортальных некрозов на фоне снижения вирусной репликации в гепатоцитах при сохраняющейся репликации возбудителя в . клеткахах воспалительного инфильтрата портальных трактов определяют ведущую роль иммунопатологических, в том числе аутоиммунных, механизмов повреждения на поздних стадиях ХГС.

5. Достоверное повышение экспрессии мРНК рецепторов хемокинов ССЯ1, ССЯЗ и ССЯ5 в крови при отсутствии изменений в ткани печени по мере прогрессии фиброза свидетельствует об активации клеточного звена иммунной системы при ХГС. Увеличение экспрессии мРНК МСР-1 в печени к стадии тяжелого фиброза, её прямая корреляция с уровнем АлАТ, ИГА, выраженностью фиброза, наличием лимфоидных фолликулов и обратная зависимость с виремией, характеризует повышенную миграцию моноцитов крови в печень и нарастание значения тканевых макрофагов в патогенезе НСУ-инфекции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациентам с ХГС для неинвазивной оценки активности воспаления и стадии фиброза в печени в динамике следует осуществлять мониторинг иммунологических показателей, включающий в себя определение уровней цитотоксических лимфоцитов, Т-киллеров, циркулирующих иммунных комплексов, иммуноглобулинов М и G, антинуклеарных антител.

2. У больных с ХГС для своевременного выявления усиления ИГА и выраженности фиброза без выполнения пункционной биопсии печени целесообразно проводить исследование экспрессии мРНК лимфо-моноцитарных хемокинов (CCR1, CCR2, CCR3 и CCR5) в крови.

3. Для оценки показаний к назначению противовирусной терапии при наличии противопоказаний к проведению пункционной биопсии печени или отсутствии возможности для её выполнения рекомендовано использование следующих линейных классификационных функций (ЛКФ):

ЛКФ1 = - 9,4 - 0,22-Х1+0,17-Х2+7,09-ХЗ+ 0,21-Х4,

ЛКФ2 - - 9,1 - 0,02-Xl+0,34-X2+3,09-X3+ 0,09-Х4, где: XI - экспрессия мРНК CCR1 рецептора хемокинов (у.е.), Х2 -возраст (годы), ХЗ — пол (1-мужской, 2-женский), Х4 - экспрессия мРНК CCR2 рецептора хемокинов (у.е.).

Если ЛКФ1>ЛКФ2, следовательно, у пациента ИГА<3 баллов и F 0-1 -противовирусная терапия на момент обследования не является обязательной.

Если ЛКФ1<ЛКФ2, следовательно, ИГА>3 баллов или F 2-4, пациент нуждается в проведении курса противовирусного лечения.

119