Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Клеточные механизмы избыточной регенерации тканей глаза после антиглаукомных операций

На правах рукописи

МАРТУ СЕВИЧ Япа Александровна

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗБЫТОЧНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНЕЙ ГЛАЗА ПОСЛЕ АНТИГЛАУКОМНЫХ ОПЕРАЦИЙ

14.01.07 ~ глазные болезни 14.03.03 - патологическая физиология

4843657

Автореферат диссертации иа соискание учёной степени кандидата медицинских наук

О з ем да

Красноярск - 2011

4843657

Работа выполнена на кафедре офтальмологии ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Росздрава» и Национальном исследовательском Томском политехническом университете

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Кривошеина Ольга Ивановна

доктор медицинских наук, профессор Хлусов Игорь Альбертович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Козина Елена Владимировна

доктор медицинских наук Смирнова Ольга Валентиновна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится «/у» 2011 г. в_часов на заседании совета

по защите докторских и кандидатских диссертаций Д208.037.02 при ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Росздрава» (660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. В.Ф. Войно-Ясенецкого Росздрава» по адресу 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1

Автореферат разослан « Ж 1 г.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.037.02 ГОУ ВПО КрасГМУ Росздрава

кандидат медицинских наук, доцент Л.В. Кочетова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Проблема пролиферативных процессов при хирургическом лечении больных первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) является сложной и до сих пор нерешенной, в силу чего находится в центре внимания современной офтальмологии и патофизиологии (Балашова JI.M., 2000; Лебедев О.И., 2008; Ловпаче Д.Н., 2000). По мнению большинства офтальмологов, хирургическое лечение глаукомы в настоящее время является приоритетным направлением в стабилизации уровня внутриглазного давления (ВГД) и отличается высокой эффективностью (Егоров В.В., 2000; Молчанова Е.В., 2007; Нестеров А.П., 2000). Достаточный гипотензивный эффект в раннем послеоперационном периоде отмечен в 90-97% случаев (Бикбов М. М., 2008; Мег-moud А., 2000).

Однако, по многочисленным клиническим наблюдениям, у 30% прооперированных больных глаукомой отмечается рецидив гипертензии, в среднем, в течение пяти лет после операции (Захарова Н.М., 2004; Ehrnrooth Р., 2002). Это требует проведения дополнительных мер для снижения ВГД (дес-цеметогониопунктура, местная гипотензивная терапия). При этом число больных с офтальмотонусом ниже 21 мм рт. ст. сокращается до 34% (Лебедев О.И., 2008; Шухаева E.H., 2008). По мере увеличения периода наблюдения эффективность гипотензивных операций еще более снижается, что требует повторного хирургического вмешательства со всеми возможными негативными явлениями (Козлова Т.В., 2000).

Основной причиной снижения эффективности хирургического, лечения больных ПОУГ является рубцевание вновь созданных путей оттока внутриглазной жидкости (Кобзева В.И., 1996; Shingletown B.J., 1996). Внестоящее время большое внимание уделяется выявлению факторов риска рубцевания в зоне оперативного вмешательства (Бессмертный A.M., 2005; Волкова Н.В., 2006). Многочисленные современные исследования посвящены выявлению взаимосвязи между полом, возрастом, стадией ПОУГ, наличием псевдоэкс-фолиативного синдрома, концентрацией некоторых биохимических показателей в сыворотке крови и во влаге передней камеры, и послеоперационным рубцеванием путей оттока (Журавлева А.Н., 2008; Курышева НИ., 2001; Drolsum L., 2006; Ferreira S.M., 2004; Siriwardena D., 2002).

Были изучены некоторые факторы, непосредственно участвующие в процессе заживления тканей глаза после гипотензивных операций и оказывающие на них существенное влияние. По мнению О.И. Лебедева (2004), ведущая роль в избыточной регенерации вновь сформированных путей оттока у больных ПОУГ принадлежит местным трофическим изменениям соединительной ткани дренажной системы и склеры, местной воспалительной реакции и активации коллагеногенеза после операции.

Таким образом, патогенез пролиферации в зоне гипотензивных операций у больных открытоугольной глаукомой является не до конца изученным,

сложным, динамичным и многофакторным процессом. Прежде всего, это ка сается этиологии и факторов риска, способствующих рубцеванию, состава роли клеточных элементов, участия микроокружения в процессе дифферен цировки и созревания клеток. Не до конца выяснены вопросы гидродинами ческого влияния внутриглазной жидкости (ВГЖ) на патогенез избыточно регенерации у больных ПОУГ.

Все вышеперечисленное обусловливает уменьшение эффективност хирургических методов лечения больных ПОУГ и требует разработки мет дов профилактики избыточной пролиферации в области хирургическог вмешательства. Очевидно, что решение данной проблемы возможно тольк на основе углубленного изучения патогенетических механизмов пролифер - Тивного синдрома.

Настоящее исследование, учитывая актуальность проблемы и недост ; ток имеющейся Информации, посвящено выявлению роли патогенетически ; факторов избыточной регенерации после хирургических операций у больны ПОУГ.

Целью исследования явилось выявление механизмов избыточно регенерации тканей глазного яблока после гипотензивных фистулизирующи операций у больных первичной открытоуголыюй глаукомой.

Задачи исследования:

1. Изучить клиническую эффективность гипотензивных фистулизиру1 щих операций у больных первичной открытоугольной глаукомой в з висимости от линейных параметров вновь сформированных путей о тока внутриглазной жидкости.

2. Определить влияние диатермокоагуляции сосудов конъюнктивы скл ры на клинико-функциональные результаты гипотензивных фистул! зирующих операций у больных ПОУГ в разные сроки наблюдения.

3. В эксперименте in vitro изучить влияние направленного потока жидк сти, моделирующего движение внутриглазной жидкости после гип тензивных операций при глаукоме, на механизмы морфофункционал ного созревания фибробластоидных клеток.

4. Изучить влияние диатермокоагуляции сосудов конъюнктивы склеры процессы репаративной регенерации тканей глаза в эксперименте.

Научная новизна исследования В результате клинико-экспериментальных исследований получены н вые данные о факторах, предрасполагающих к избыточной регенерации тк ней глаза у больных ПОУГ после гипотензивных операций.

Впервые при длительном, в течение 3-х лет, наблюдении прооперир ванных больных ПОУГ прослежена прямая зависимость между площадь созданной фильтрационной зоны и продолжительностью гипотензивно

эффекта. Чем меньше площадь фильтрационной зоны, тем короче гипотензивный эффект.

В результате длительного .-срока наблюдения впервые выявлено, что проведение диатермокоагуляции в ходе фистулизирующих гипотензивных операций у больных ПОУГ сокращает продолжительность гипотензивного эффекта в среднем на 8 месяцев.

Впервые в эксперименте in vitro доказано, что при биомеханическом воздействии направленного потока жидкости, моделирующего движение ВГЖ после фистулизирующих операций, в фибробластоидных клетках отмечается значительное повышение активности внутриклеточных ферментативных систем, свидетельствующее об ускорении процессов их морфофункцио-нального созревания в зрелые, коллагенсинтезирующие формы.

Впервые в эксперименте in vivo установлено, что после диатермокоагуляции склеры отмечается развитие выраженной воспалительной реакции в зоне воздействия с замедлением смены клеточных фаз, что может способствовать избыточному фиброгенезу.

Практическая значимость

Предложен новый способ культивирования стромальных стволовых клеток и получен патент РФ на полезную модель № 95663 «Устройство для культивирования клеток» от 10. 07. 2010 года.

Предложен новый способ оценки состоятельности фильтрационной подушки после антиглаукоматозных операций и получен патент РФ № 2400126 «Способ оценки состоятельности фильтрационной подушки после антиглаукоматозных операций» от 27. 09. 2010 года.

Установлено, что уменьшение линейных параметров разрезов при фистулизирующих гипотензивных операциях у больных глаукомой до 2 мм нецелесообразно, так как способствует увеличению скорости оттока внутриглазной жидкости и, как следствие, интенсификации процессов рубцевания вновь сформированных путей оттока.

Клиническими и экспериментальными исследованиями in vivo выявлено неблагоприятное влияние диатермокоагуляции тканей в области хирургического вмешательства, способствующее выраженной местной воспалительной реакции, что является дополнительным фактором риска рубцевания вновь сформированных путей оттока ВГЖ у больных глаукомой.

Технология проточного культивирования клеток обеспечивает возможность получения биоинженерных конструкций, состоящих из скеффолдов, заселенных дифференцированными клетками, в более короткие сроки, чем при стационарном культивировании.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Высокая скорость оттока внутриглазной жидкости при выполнении фистулизирующих операций у больных первичной открытоугольной глаукомой в позднем послеоперационном периоде приводит к интен-

сификации процессов рубцевания в области хирургического вмешательства, и, как следствие, - сокращению срока компенсации офталь-мотонуса.

2. Проведение диатермокоагуляции тканей глазного яблока в области хирургического вмешательства у больных первичной открытоуголь-ной глаукомой способствует выраженной местной воспалительной реакции с замедлением смены клеточных фаз, что приводит к увеличению сроков заживления и сЬздает предпосылки для рубцевания вновь сформированных путей оттока внутриглазной жидкости.

3. При моделировании оттока внутриглазной жидкости после фистули зирующих операций в виде проточного культивирования in vitro фиб робластоидных клеток человека происходит ускорение их морфо функционального созревания, что лежит в основе клеточных меха низмов избыточной регенерации тканей глазного яблока после опера ций у больных первичной открытоугольной глаукомой.

Апробация работы Основные положения и материалы диссертации доложены и обсужде ны на заседаниях Томского областного общества офтальмологов (2008 2010); V Международной научно-практической конференции «Пролифера тивный синдром в офтальмологии» (Москва, 2008); IV Всероссийской науч ной конференции молодых ученых с участием иностранных специалисте «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2009); Международнои конгрессе «The Association for Research in Vision and Ophthalmology (Ericeira • Portugal, 2009); XI конгрессе с международным участием молодых ученых специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010); конкурсе научных рабо молодых ученых СибГМУ (Томск, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 23 научные работы, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссер тационных исследований, 2 - в международной печати.

Получен патент РФ на полезную модель № 95663 «Устройство дл культивирования клеток» от 10.07.2010 года.

Получен патент РФ № 2400126 «Способ оценки состоятельност фильтрационной подушки после антиглаукоматозных операций» от 27. 0 2010 года.

Личный вклад автора заключается в разработке алгоритма исследо ваний и реализации основных его этапов, обследовании больных первично открытоугольной глаукомой, систематизации полученного материала, ег статистической обработке, анализе и интерпретации полученных результа тов.

Структура и объём диссертации

Диссертационное исследование состоит из введения, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 135 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 30 рисунками. Список литературы включает 243 источника, в том числе: 154 - отечественных авторов и 89 - зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертационное исследование выполнено при поддержке федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (государственный контракт № 02.512.11.2285 от 10.03.2009).

Материалы и методы исследования Клинические исследования

Офтальмологическое обследование включало следующие методы исследования: визометрия, периметрия, биомикроскопия переднего отрезка глаза, гониоскопия, обратная бинокулярная офтальмоскопия, тонография. Ретроспективный анализ включал изучение жалоб больных, анамнеза заболевания и данные офтальмологического осмотра.

Клинические исследования проведены в II этапа.

В ходе I этапа проведен сравнительный анализ результатов хирургического лечения 220 больных ПОУГ (220 глаз), лечившихся в офтальмологической клинике СибГМУ (2007- 2009), в зависимости от особенностей линейных параметров хирургической фильтрационной зоны. Все пациенты I этапа исследований составили две клинические группы. В основную группу были включены 100 пациентов (108 глаз), у которых линейный размер глубокого корнеосклерального лоскута составил 2 мм. Группу сравнения составили 102 больных ПОУГ (112 глаз), у которых линейный размер глубокого корнеосклерального лоскута составил 4 мм.

Для исключения возможного влияния наведенных факторов на достоверность ожидаемых результатов при формировании групп сравнения мы придерживались принципа идентичности клинико-анамнестической характеристики и дооперационных параметров сравниваемых признаков. Диатермо-коагуляция во время проведения операции не проводилась.

Половозрастной состав в сравниваемых группах был идентичным, составив: мужчин 53% в основной группе, 51% — в группе сравнения, и женщин 47% в основной группе, 49% — в группе сравнения. Средний возраст больных ПОУГ составил 65,7±2,1 лет в основной группе и 66,1±1,8 лет — в группе сравнения (здесь и далее Х±ш).

У всех пациентов ранее никаких хирургических или лазерных вмешательств не выполнялось.

Техника операции, проводимой больным 1-го этапа клинических исследований.

Конъюнктиву отсепаровывали в верхнем сегменте в 5 - 6мм от лимба. С целью гемостаза использовали гемостатическуто губку. Лезвием выкраивали лоскут склеры квадратной формы размером 4 * 4 мм в 54 толщины склеры. Лоскут отсепаровывали до роговичной части лимба с вхождением на 1мм в прозрачные слои роговицы. У пациентов основной группы из подлежащих слоев склеры выкраивали лоскут треугольной формы основанием, обращенным к лимбу, с линейным размером 2 мм, у пациентов группы сравнения -линейным размером фильтрационной зоны 4 мм. На вершине треугольного лоскута склеру иссекали до цилиарного тела. Начинали отсепаровывать от вершины треугольного лоскута и постепенно доходили до круговой связки. Затем отсепаровывали его от круговой связки вместе с наружной стенкой щлеммова канала и полоской корнеосклеральной ткани. Ширина удаляемой роговичной ткани составила 0,5-0,8 мм, доходя до десцеметовой мембраны. .Десцеметову мембрану освобождали единым лимбально-склеральным лоску-*том или отдельно от склеры. В заключение накладывали 2 узловых шва на поверхностный склеральный лоскут, а также непрерывный шов на конъюнктиву.

В ходе II этапа клинических исследований проведен проспективный анализ результатов эффективности хирургического лечения 208 больных ПОУГ (232 глаза) с различными видами гемостаза, также лечившихся в офтальмологической клинике СибГМУ (2007 — 2009). Все пациенты этого этап исследований были разделены на две группы. В 1-ю группу были включены 106 больных ПОУГ (120 глаз), которым при производстве глубокой склерэк-томии (ГСЭ) выполняли диатермокоагуляцию сосудов конъюнктивы склеры; во II группе было 102 больных ПОУГ (112 глаз), которым выполняли глубо кую склерэктомию без проведения диатермокоагуляции.

С целью исключения возможного влияния наведенных факторов н достоверность ожидаемых результатов при формировании групп сравнени мы придерживались принципа идентичности клинико-анамнестической ха рактеристики и дооперационных параметров сравниваемых признаков. По ловозрастной состав в сравниваемых группах был идентичным, составив мужчин 52% в 1-й группе, 51% - во второй, и женщин 48% в 1 -й группе, 49"/ - во в 2-й; средний возраст - 67,8±1,4 лет в 1-й группе и 66,1±1,8 лет - во 2-(здесь и далее Х±ш). У всех пациентов ранее никаких хирургических или ла 'зерных вмешательств не выполнялось. Диагноз глаукома ставился в соответ ствии с современной классификацией ПОУГ.

Техника операции, проводимой больным П -го этапа клинических исследований.

Конъюнктиву отсепаровывали в верхнем сегменте в 5 - 6мм от лимба Больным 1-й группы для прижигания кровоточащих сосудов использовш диатермокоагулятор ДК-1-3. В аппарате обеспечивается 10-ступенчатая ре гулировка выходной мощности через (1 + 0,5) Вт, которая контролируете

индикатором мощности. Для проведения диатермокоагуляции использовали 4-6 ступени регулировки выходной мощности (3+0,5 Вт). Дозировку выходной мощности осуществляли до начала воздействия на пациента. Больным II-й группы с целью гемостаза использовали гемостатическую губку.

Лезвием выкраивали лоскут склеры квадратной формы размером 4x4 мм в 'А толщины склеры. Лоскут отсепаровывали до роговичной части лимба с вхождением на 1мм в прозрачные слои роговицы. Из подлежащих слоев склеры выкраивали лоскут треугольной формы основанием, обращенным к лимбу и размером 4 мм. На вершине треугольного лоскута склеру иссекали до цилиарного тела. Начинали отсепаровывать от вершины треугольного лоскута и постепенно доходили до круговой связки. Затем отсепаровывали его от круговой связки вместе с наружной стенкой шлеммова канала и полоской корнеосклеральной ткани. Ширина удаляемой роговичной ткани составила 0,5 -0,8 мм, доходя до десцеметовой мембраны. Десцсметову мембрану освобождали единым лимбально-склеральным лоскутом или отдельно от склеры. В заключение накладывали 2 узловых шва на поверхностный склеральный лоскут, а также непрерывный шов на конъюнктиву.

Экспериментальные исследования in vitro

Экспериментальная часть работы проведена в научном образовательном центре «Биосовместимых материалов и биоинженерии» при Национальном исследовательском Томском политехническом университете (начальники - д-р тех. наук В.Ф. Пичугин, д-р мед. наук, профессор И.А. Хлусов).

Для изучения влияния направленного движения жидкости на морфо-функциональное состояние фибробластоидных клеток выполнена серия экспериментальных исследований in vitro. Культура фибробластоидных клеток человека (ООО «Банк стволовых клеток», Томск) представляет собой популяцию стромальных стволовых клеток разной формы и размеров с ограниченным сроком жизни, сохраняющую при пассажах стабильный кариотип.

В ходе эксперимента культуру фибробластоидных клеток человека в концентрации 5-101 клеток/см2 клонировали в течение 24 - 48 час на фильтрах в 35-мм чашках Петри (стационарная культура) и в системе, моделирующей направленное движение питательной среды (динамическая культура), при строгом соблюдении температурного режима (37°С), содержания С02 (57%) и уровня влажности (100%). В качестве культуральной среды применяли ДМЕМ в модификации Искова, объемом 200 мл с добавлением гентамицина из расчета 50 мг/л.

Проточная система представляет собой замкнутую систему с камерой, содержащей полупроницаемый фильтр. Камера соединяется с емкостью, заполненной питательной средой. Через роликовый насос, снабженный поддерживающим клапаном, обеспечивается равномерное однонаправленное движение жидкости. Камера снабжена боковым клапанным отверстием для введения клеточного материала, а полупроницаемый фильтр служит местом

для его размещения. Аппарат «Аспиратор - 01» работал в постоянном режиме со скоростью 1-2 мм3/мин.

По окончании эксперимента фильтры извлекали, сушили на воздухе. Клеточный материал фиксировали в течение 30 сек. в парах формалина для проведения цитохимической окраски на щелочную фосфатазу и а-нафтилацетатэстеразу. Оптическую микроскопию окрашенных клеток проводили в отраженном свете на металлографическом микроскопе Olympus GX-71 при увеличении 400. Методом компьютерной морфометрии выявляли количественные параметры клеток посредством измерения их оптических характеристик. Определяли число окрашенных клеток, вычисляли их площадь и оптическую плотность при помощи программы Adobe PhotoShop 7.0, согласно статистике серых уровней в модификации для непрозрачных объек тов. Площадь выражали в квадратных микрометрах, оптическую плотность в условных единицах оптической плотности (у.е.о.п.).

Интегральный коэффициент отражения: RR,G,B = SR,G,В / WR,G,B где S - яркость тестируемого участка, W - яркость белого стандарта. Значе ния нормировали по фону: XR = RT/RO, где RT - коэффициент отражеш ткани, R® - коэффициент отражения фона. Оптическая плотность объекта D= 100 lg (1/XR).

Экспериментальные исследования in vivo

Для изучения характера воспалительно-репаративной реакции склерь после диатермокоагуляции выполнена серия экспериментов на 50 половозре лых крысах линии Wistar с первоначальной массой 200-250 г, полученных и вивария СибГМУ (зав. - В.Н. Воронцова). Перед экспериментом всех живот ных выдерживали на протяжении двухнедельного карантинного срока в ус ловиях вивария на обычном рационе.

Животным основной группы (п = 25) в условиях операционной по эфирным наркозом проводили конъюнктивотомию и диатермокоагуляцш склеры: в верхне-наружном квадранте правого глаза выполняли разрез конъ юнктивы склеры и диатермокоагуляцшо склеры. Животным группы сравне ния (п = 25) проводили конъюнктивотомию склеры: в верхне-наружно квадранте правого глаза выполняли разрез конъюнктивы склеры (аналогичн с животными основной группы).

В ходе эксперимента проводили биомикроскопию и фоторегистраци переднего отдела глаз крыс на 1, 3, 5, 7, 14 и 21-е сутки. После каждой био микроскопии, за исключением 1-х суток, под эфирным наркозом декапити ровали по 5 животных из каждой группы. Выполняли энуклеацию обои глаз. Материалом для гистологических исследований служили энуклеиро ванные глаза экспериментальных животных. Гистологические исследовани проводили на кафедре гистологии и эмбриологии СибГМУ (зав. кафедрой д-мед. наук, профессор C.B. Логвинов). Полученный в ходе экспериментов м териал фиксировали для световой микроскопии. В качестве фиксирующе жидкости использовали 10% раствор нейтрального формалина. После приг

товления парафиновых срезов препараты окрашивали гематоксилином и эозином и по методу Ван-Гизона.

методы статистической обработки

Статистическую обработку проводили с применением программ «STATISTICA for Windows 6.0», «Microsoft Excel 2002».

Для описания изменчивости количественных признаков использовали общепринятые статистические процедуры; включая расчет параметров распределений (средние значения, их ошибки, дисперсии). Проверку на нормальность распределений осуществляли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. В клинической части работы и в экспериментах in vivo наблюдалось нормальное распределение показателей. Для оценки статистической значимости различий выборок применяли параметрический t-критерий Стьюдента, уровень статистической значимости различий р<0,05.

В экспериментах in vitro наблюдалось распределение показателей, отличное от нормального. В связи с этим для оценки статистической значимости различий выборок применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты клинических исследований

Целью I этапа клинических исследований явилось проведение сравнительного анализа результатов хирургического лечения больных с ПОУГ в зависимости от линейных параметров хирургической фильтрационной зоны. Стадии ПОУГ в обеих группах были сопоставимы (табл. 1).

Таблица 1

Распределение обследованных больных по стадиям ПОУГ

Стадии глаукомы Число случаев

основная группа группа сравнения

Начальная 27 глаз (25.1%) 24 глаза (21,5%)

Развитая 51 глаз (47,3%) 53 глаза (47,3%)

Далеко зашедшая 30 глаз (27,6%) 35 глаз (31,2%)

Всего 108 глаз (100%) 112 глаз (100%)

Исходные тонометрические и тонографические показатели также были сопоставимы в обеих группах. Исходное ВГД у пациентов основной группы было 33,2±1,2 мм рт. ст. У больных группы сравнения - 33,1±0,7 мм рт. ст. Тонографические показатели до операции у больных основной группы: Ро = 27,1±0,1 мм рт. ст., С = 0,08±0,01 мм3/мин-мм рт. ст.; Б = 1,65±0,04 мм3 /мин. У больных группы сравнения: Р0 = 27,4±0,4 мм рт. ст., С = 0,07±0,03 мм3/мин-мм рт. ст.; Б = 1,56±0,04 мм3 /мин. Поля зрения в сумме по восьми

меридианам у больных основной группы составляли 340,1±8°, у больных группы сравнения 335,2±14°. Гониоскопически у всех пациентов обеих групп угол передней камеры был полностью открыт. При анализе сроков декомпенсации офтальмотонуса получены следующие данные (табл. 2).

Таблица 2

Показатели гидродинамики у больных с разными линейными параметрами фильтрационной зоны в различные сроки наблюдения, р

Гидродинамические показатели

Основная группа (линейный размер фильтрационной зопы 2 мм)

Ро, мм рт. ст.

мм3/мип ■мм рт. ст.

F, ммЗ /мин

Группа сравнения (линейный размер фильтрационной зоны 4 мм)

Ро, ммрт.

С,

мм3/мин •мм рт. ст.

F,

ммЗ /мин

до операции

27,1±0Д

0,08±0,01

,65±0,0 4

27,4±0,4

0,07±0,03

1,5б±0, 4

1 мес.

15,8±0,3

0,2б±0,01

1,7+0,4

16,1±0,6

0,24±0,02

1,4*0,3

3 мес.

16,1±0,2

0,24±0,02

1,8±0,2

16,3±0,2

0,22±0,01

1,5±0,1

6 мес.

16,4±0,2

0,19±0,03

1,8+0,1

16,6+0,3

0,21+0,01

1,6*0,3

12 мес.

19,6±0,5

0,14±0,01

1,7±0,3

18,1 ±0,6

0,18±0,01

1,6*0,2

24 мес.

23,5±0,3

0,1±0,01*

1,6±0Д

21,8±0,1

0,15±0,02

1,5*0,1

36 мес.

26,6±0,1

0,07±0,01

1,6±0,4

23,5±0,6

0,11±0,01 *

1,6±0,5

Примечание: *) отмечены статистически значимые различия р<0,05

Гипотензивный эффект сохранялся стабильным у пациентов обей групп в ранние (до 1 месяца) и поздние (3-6 месяцев) послеоперационны сроки. Однако через 1 год после операции у пациентов основной групп уровень ВГД стал достоверно выше, чем в группе сравнения (табл. 2). Сре ний срок декомпенсации ВГД у пациентов с линейными размерами фильтр ционной зоны в 2 мм составил 18,0±2,1 месяца против 28,0±1,2 месяца больных группы сравнения с размером фильтрационной зоны в 4 мм.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при лине" ном размере фильтрационной зоны в 2 мм в ранние сроки после оперативн го вмешательства (до 6 месяцев) показатели гидродинамики характеризов лись большей стабильностью.

Данный факт можно объяснить увеличенной скоростью оттока ВГ вследствие уменьшения гидравлического сопротивления, что согласуется данными Е.Х. Тахчиди (2008). Однако в позднем послеоперационном пери де высокая скорость оттока жидкости приводит к интенсификации процесс рубцевания в области хирургического вмешательства, что доказано в наше эксперименте in vitro и подтверждается данными клинических исследовани (табл. 2). При большей протяженности зоны фильтрации (4 мм) скорость п тока ВГЖ резко уменьшается, процессы цитодифференцировки происход

медленнее, что способствует более длительному сохранению гипотензивного эффекта фистулизирующих операций.

Распределение по стадиям 208 больных ПОУГ (232 глаза), участвующих во II этапе клинических исследований, было репрезентативно (табл. 3).

Таблица 3

Распределение обследованных больных по стадиям ПОУГ

Стадии глаукомы Число случаев

1-я группа 2-я группа

Начальная 27 глаз (22.5%) 24 глаза (21,5%)

Развитая 62 глаза (51,7%) 53 глаза (47,3%)

Далеко зашедшая 31 глаз (25,8%) 35 глаз (31,2%)

Всего 120 глаз (100%) 112 глаз (100%)

Исходное ВГД в I - й группе составило 32,7±1,1 мм рт. ст., во II -33,1±0,7 мм рт. ст. Всем пациентам до и в различные сроки после оперативного вмешательства проводили топографическое исследование. Исходные тонографические показатели также были сопоставимы в обеих группах: Ро = 28,9±0,4 мм рт. ст., С = 0,09±0,02 мм3/мин-мм рт. ст.; Р = 1,82±0,03 мм3 /мин в 1-й группе и Ро = 27,4±0,4 мм рт. ст., С = 0,07±0,03 мм3/мин-мм рт. ст.; Б = 1,56±0,04 мм3 /мин - во Н-й группе.

Острота зрения в обеих группах была сопоставима и составляла: рг.сеПа-0,05 соответственно в 25 и 30%; 0,06-0,1 - 12 и 15%; 0,2-0,3 - 33 и 30%; выше 0,3 - 29 и 23% случаев. На величину остроты зрения влияло и наличие сопутствующей патологии. Катаракта начальной степени зрелости сопровождала основной диагноз соответственно в 56 и 62% случаев, миопия средней степени в 6 и 9%; возрастные дистрофические изменения макуляр-ной области в 12 и 8% случаев. Поля зрения в сумме по восьми меридианам: 337,3±10° в I -й группе и 335,2±14° - во II -й. Гониоскопически у всех пациентов обеих групп угол передней камеры был полностью открыт.

В ходе анализа динамики гипотензивного эффекта в послеоперационном периоде было выявлено следующее. Через 1 месяц после операции показатели гидродинамики у пациентов обеих групп были стабильными. Средний уровень ВГД в I- й группе в среднем составил 16,3±0,2 мм рт.ст., во II- й группе - 16,1±0,6 мм рт .ст. (табл. 4). Однако через 3 месяца после хирургического вмешательства повышение ВГД наблюдалось у 16% больных (19 глаз) 1-й группы и у 14% больных П-й (16 глаз). Через 6 месяцев декомпенсация ВГД отмечена еще в 12% случаев (14 глаз) у больных 1-й группы и в 8% случаев (9 глаз) во 2-й; через 12 месяцев у 9% (11 глаз) прооперированных пациентов 1-й группы и у 4% (4 глаза) во II- й группе. Через 2 года после оперативного лечения число больных с повышенным ВГД увеличилось еще на 24% (29 глаз) в 1-й группе и только на 15% (16 глаз) во II - й. Через 3 года

уровень ВГД выше 21 мм рт. ст. наблюдался у 78% (94 глаза) прооперированных больных ПОУГ 1-й группы и у 51% (57 глаз) больных П - й группы.

Таблица 4

ПОКАЗАТЕЛИ ГИДРОДИНАМИКИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПРОВЕДЕНИЯ ДИАТЕРМО-КОАГУЛЯЦИИ ТКАНЕЙ ГЛАЗНОГО ЯБЛОКА В РАЗЛИЧНЫЕ СРОКИ НАБЛЮДЕНИЯ,

Р

Гидродинамические показатели до операции 1-я группа больных (дпатермокоагуляцию проводили) 2-я группа больных (дпатермокоагуляцию не проводили)

Ро, мм рт. ст. с, мм3/мнн ■мм рт. ст. F, ммЗ /мин Ро, мм рт. ст. С, ммэ/мнн •мм рт. ст. F, ммЗ /мин

28,9±0,4 0,09*0,02 1,82±0,0 3 27,4±0,4 0,07±0,03 1,56±0,0 4

1 мес. 16,3±0,2 0,23±0,01 1,7±0,4 16,1±0,6 0,24±0,02 1,4±0,3

3 мес. 16,6±0,3 0,21±0,02 1,8±0,2 16,3±0,2 0,22±0,01 1,5±0,1

6 мес. 17,3±0,5 0,17±0,03 1,9±0,1 16,6±0,3 0,21±0,01 1,6±0,3

12 мес. 19,1±0,6 * 0,13±0,01 * . 1,9±0,3 18,1±0,6 * 0,18±0,01 * 1,6±0,2

,24 мес. 23,8±0,4 * 0,1±0,01* 1,8±0,1 21,8±0,1 * 0,15±0,02 * 1,5±0,1

36 мес. 27,3±0Д * 0,08±0,01 * 1,7±0,4 23,5±0,6 * 0,11±0,01 * 1,6±0,5

Примечание: *) отмечены статистически значимые различия р<0,05

Компенсация ВГД (без дополнительного медикаментозного лечения) у больных 1-й группы сохранялась в среднем 21±2,8 месяц, у больных П-й группы - 28±1,2 месяцев.

Таким образом, диатермокоагуляция сосудов конъюнктивы склерь может способствовать усилению воспалительной реакции в области фисту лизирующего отверстия и, как следствие, явиться дополнительным факторо риска рубцевания сформированных новых путей оттока.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ IN VITRO При культивировании фибробластоидных клеток человека в стацио нарных условиях на протяжении всего периода наблюдений цитохимически ' клетках отмечалась умеренная активность а-нафтилацетатзстеразы (табл. 5).

Таблица 5

Оптическая плотность фибробластоидпых клеток человека

при культивировании in vitro в различных условиях, x (у.е.о.п.), р

Сроки исследовании, часы Метод культивирования клеток Изучаемый фермент

а-нафтилацетат-эстераза щелочная фосфатаза

24 часа Стационарный 22,56 (QL 17,76;QU 26,34) (п-10) 0 (п=10)

Проточный 22,98 (QL 20,16;QU 26,65) (п-10) 10,28* (QL 6,35;QU 15,73) (п=10)

48 часов Стационарный 22,91 (QL 20,07;QU 26,58) (п=10) 0 (11=10)

Проточный 25,70 (QL 14,04;QU 29,81) (п=10) 15,79* (QL 9,75;QU 24,16) (п=10)

Примечаиие: здесь и в табл. 6-7 (*) - уровень статистической значимости различий р < 0,05 (при сравнении со стационарным культивированием); п - число просчитанных полей зрения на каждом фильтре. Для каждой группы использовали 3 фильтра.

При этом с увеличением срока исследования (с 24 до 48 час.) незначительно повышалась плотность распределения клеток на искусственной поверхности (в 1,4 раза) (табл. 6). Их оптическая плотность также незначительно увеличивалась (на 2%), однако, средняя площадь ферментативной окраски на а-нафтилацетатэстеразу статистически значимо снижалась (на 31 %, р<0,05) (табл. 7), что свидетельствовало о процессах цитодиффереицировки. Диаметр окрашенных клеток варьировал в пределах 10 мкм2. Щелочная фос-фатаза в фибробластоидных клетках, культивируемых в стационарных условиях, на протяжении всего эксперимента не выявлялась (табл. 5-7). В проточной культуре с увеличением срока исследования (с 24 до 48 час.) число стромальных клеток с позитивной реакцией на а-нафтилацетатэстеразу увеличилось в 3,6 раза (табл. 6). Оптическая плотность клеток возросла на 12% (табл. 5), а средняя площадь ферментативной окраски на а-нафтилацетатэстеразу уменьшилась на 41% (р<0,05) (табл. 7).

Таблица

Число окрашенных фибробластоидных клеток человека в 1 мм1

_при культивировании ш vitro в различных условиях, x, р

Сроки исследования, часы Метод культивировании клеток Изучаемый фермент

а-нафтилацетат-эстераза щелочпан фосфат аза

24 часа Стационарный 45,74 (QL 18,27;QU 64,04) (п=10) 0 (п=10)

Проточный 1,86* (QL 0,74;QU2,61) (п=10) 2,57* (QL 5,14;QU 1,38) (п=10)

48 часов Стационарный 63,75 (QL 49,04;QU 87,98) (п=10) 0 (п=10)

Проточный 6,77* (QL 13,54; QU 3,39) (n=10) 9,56* (QL 19,21; QU 8,56) (п=10)

В динамических условиях через 48 часов от начала эксперимента культивируемых клетках статистически значимо повышалось восприяти красителя для щелочной фосфатазы. При этом число окрашенных клеток н фильтре увеличилось в 3,7 раза (табл. 6). Их оптическая плотность выросл на 54% (табл. 5), средняя площадь ферментативной окраски на щелочну фосфатазу уменьшилась на 7% (табл. 7) Позитивно окрашивающиеся на ще лочную фосфатазу клетки имели большую, по сравнению с окраской на а нафтилацетатэстеразу, площадь (примерно 20-25 мкм) и неправильную фор му.

Стволовые клетки проявляют себя только в процессе функционирои ния, поэтому на современном этапе знаний наиболее адекватными методам их обнаружения являются функциональные, например, цитохимические пр бы. Известно, что фибробласты, производные мультипотентных мезенх мальных стромальных клеток, позитивно окрашиваются на щелочную фо фатазу. При этом активность клеточного фермента возрастает по мере их с зревания.

При биомеханическом (гидравлическом) воздействии направленног тока жидкости клетки, вследствие прилипания к поверхности, проявлял преимущественно, фибробластоидный фенотип: неправильная форма, увел чение числа окрашенных клеток, диаметра (до 20-25 мкм) и площади окраск на щелочную фосфатазу. Обращает внимание факт ускорения созревай стромальных клеток при динамическом культивировании (24 — 48 ч) в сра нении со стационарным способом. Например, известно, что оптимальны срок стационарного культивирования колониеобразующей единицы фибро ластов человека составляет 7-14 дней. При этом постановка эксперимента,

частности, отсутствие в культуральной среде ключевых питательных добавок, стимулирующих жизнедеятельность клеток, позволяет говорить о дифференцированном значении однонаправленного потока жидкости для процессов их созревания.

Таблица 7

Площадь цитохимической окраски фибробластоидиых клеток чело-

beka при культивировании in vitro в различных условиях, x (мкм2), р

Сроки исследования, часы Метод культивирования клеток Изучаемый фермент

а-иафтилацетат-эстераза щелочная фосфа-таза

24 часа Стационарный 119,77 (QL 90,05; QU 161,7) (п=10) 0 (п=10)

Проточный 117,89 (QL 89,31;QU 185,1) (п=10) 463,61* (QL 78,18; QU667.6) (п=10)

48 часов Стационарный 82,55 (QL 62,52 QU 96,58) (п=10) 0 (п=10)

Проточный 69,98 (QL 53,02; QU 109,8) (п=10) 432,39* (QL 72,92; QU622.1) (п=10)

Результаты экспериментальных исследований in vivo

В ходе экспериментальных исследований на крысах получены следующие данные.

При проведении биомикроскопии переднего отдела глаза у животных обеих групп выявлены следующие изменения. На 1-е сутки после проведенного эксперимента у животных основной группы в месте нанесения коагулята отмечен выраженный отек и гиперемия конъюнктивы склеры, субконъ-юнктивальные микрокровоизлияния, расширение эписклеральных сосудов, отек эпителия роговицы в верхней трети. У животных группы сравнения после эксперимента в области конъюнктивотомии выявлены умеренный отек конъюнктивы склеры, единичные субконъюнктивальные кровоизлияния.

На 3 - 5-е сутки у животных основной группы в месте нанесения коагулята отмечено усиление локального отека и гиперемии конъюнктивы склеры, микрокровоизлияния, отложение фибриновых сгустков. Конъюнктива была спаяна с подлежащей склерой. Наблюдался выраженный отек эпителия роговицы в верхней трети. В области конъюнктивотомии у животных группы сравнения сохранялся отек конъюнктивы склеры, единичные геморрагии.

На 7-е сутки у животных основной группы в зоне диатермокоагуляции отмечалось отложение фибриновых сгустков, сохранялись выраженный отек

и гиперемия конъюнктивы склеры, субконъюнктивальные кровоизлияния Конъюнктива была плотно спаяна с подлежащей склерой. У животных груп пы сравнения края области конъюнктивотомии полностью адаптированы конъюнктива склеры спокойна, отделяемое не обнаружено.

На 14-21-е сутки у животных основной группы в области диатермокоа гуляции обнаружены грубые фиброзные изменения со стороны конъюнктивь и склеры. При этом обе оболочки были плотно спаяны между собой. Оте конъюнктивы уменьшался. Кровоизлияния полностью рассосались. У живот ных группы сравнения в области конъюнктивотомии биомикроскопически изменений не выявлено.

В ходе гистологических исследований были получены следующие ре зультаты.

На 1-е сутки у животных основной группы в области диатермокоагуля ции обнаружен большой участок деэпителизации конъюнктивы. Сохранив шийся эпителий уплощен. Склера отечна, коллагеновые волокна утолщены гомогенны. Пучки коллагеновых волокон дугообразные, слабопереплетаю щиеся. Капилляры расширены. Инфильтрат очаговый.

У животных группы сравнения в области конъюнктивотомии много слойный плоский неороговевающий эпителий местами был сохранен, однак имелось его истончение. Склера представлена рыхлой волокнистой соедини тельной тканью. Коллагеновые волокна формировали тонкие короткие изви тые пучки. Присутствовал воспалительный, диффузный, полиморфноклеточ ный инфильтрат, который был менее выражен по сравнению с инфильтраци ей у животных основной группы (табл. 8).

Таблица

Динамика плотности клеточного инфильтрата в 1 мм2 среза

у животных обеих групп, р

Период наблюдения Основная группа Группа сравнения

1 сутки 7560 ±207* 5141±129*

3 сутки 7991 ±211* 5457±113*

5 сутки 5118 ±408* 6013 ±307*

7 сутки 4904 ±122* 3372±16**

14 сутки 3776±105** 2902 ±99**

21 сутки 3025 ±105** 1099±103**

Примечание: *) - уровень статистической значимости различий р < 0,01 у животных ка дой группы в различные сроки наблюдения,

**) - уровень статистической значимости различий р < 0,05 у животных каждой группы различные сроки наблюдения, X - среднее значение, ±т - ошибка средней.

К 3-м суткам у животных основной группы в области вмешательст эпителий местами уплощен, с умеренным спонгиозом и признаками орогов

ния. В склере обширный участок коагуляционного некроза (гомогенный, пропитанный фибрином). По периферии некроза - отек. Мелкие сосуды расширены, в большинстве капилляров — стаз форменных элементов. Обнаруживались участки диапедезных кровоизлияний. В зоне некроза — выраженный инфильтрат с преобладанием гранулодитов, У животных группы сравнения эпителий конъюнктивы в области вмешательства на всем протяжении уплощен, без признаков спонгиоза. В склере наблюдался периваскулярный отек. Коллагеновые волокна формировали тонкие короткие извитые пучки. Сохранялся диффузный инфильтрат, однако менее выраженный, чем у животных основной группы. В инфильтрате отмечено увеличение количества фибробластов и лимфоидных клеток (табл. 9).

На 5 - 7-е сутки у животных основной группы в области вмешательства участки утолщения эпителия чередовались с участками истончения. Склера отечна, расслаивалась. Пучки коллагеновых волокон тонкие (в виде ажурной сети). Сосуды микроциркуляторного русла резко расширены, запустевшие, в части сосудов стаз. Отмечено уменьшение диапедезных кровоизлияний, уменьшение плотности инфильтрата. При этом выявили существенные различия в клеточном составе инфильтрата (табл. 8).

У животных группы сравнения эпителий конъюнктивы имел нормальное строение. В склере коллагеновые волокна формировали тонкие короткие извитые пучки, располагающиеся в разных направлениях. К 7-м суткам плотность инфильтрата уменьшалась (табл. 8), в основном за счет уменьшения количества фибробластов (табл. 9).

На 14-е сутки у животных основной группы эпителий конъюнктивы имел нормальное строение. Уменьшалась толщина склеры, сохранялся небольшой отек межклеточного вещества. Коллагеновые волокна были тонкими, под эпителием формировали более толстые, продольно ориентированные пучки. Сохранялась высокая клеточность в инфильтрате, однако при этом изменялось соотношение клеток. В группе сравнения гистологическая картина, в основном, соответствовала таковой на 7-е сутки, однако отмечено уменьшение толщины склеры и клеточности (преобладали фибробласты) (табл. 8, 9). Пучки коллагеновых волокон были толще, чем на 5 — 7-е сутки и располагались плотнее друг к другу.

Таблица 9

Соотношение клеток (%) в инфильтрате в 1 мм2 среза_

Период на- Основная группа Группа сравнения

блюдения гр мф л Ф т гр мф л Ф т

1 сутки 40,9 14,7 21,9 20,6 1,9 34,3 17,1 19,3 28,2 1,1

3 сутки 47,3 10,1 19,3 23,3 0 39,9 37,2 34,8 32,1 0

5 сутки 46,6 7,8 20,5 26,1 12,0 41,7 40,7 46,0 43,1 1,9

7 сутки 37,4 34,7 31,1 32,7 1,7 37,9 35,3 41,1 36,8 1,7

14 сутки 32,3 ил 29,6 23,9 3,1 18,8 15,6 13,7 51,9 0

21 сутки 19,7 3,6 4,8 71,5 0,4 7,9 5,1 8,3 77,6 1,1

Примечание, гр - граиулоциты (пейтрофилы и эозинофилы), мф - макрофаги,

л - лимфоциты, ф - фибробласты, т - тучные клетки.

На 21-е сутки у животных основной группы эпителий конъюнктив имел нормальное строение. Склера была утолщена. Наблюдался неравномер ный отек межклеточного вещества. Коллагеновые волокна располагались не равномерно, местами рыхло, неупорядоченно, либо формировали толсты плотно расположенные ориентированные пучки (как в фиброзной ткани Инфильтрат сохранялся, однако его плотность была меньше, чем на 14-е су тки. Среди клеток преобладали фибробласты. У животных группы сравнен эпителий конъюнктивы имел нормальное строение. Ткань склеры представ ляла собой плотную неоформленную соединительную ткань. В поле зрен наблюдались единичные лейкоциты и фибробласты (табл. 8).

Таким образом, сравнительный анализ результатов экспериментальны и гистологических исследований позволил выявить, что диатермокоагуляци конъюнктивы и подлежащей склеры индуцирует развитие более выраженно местной воспалительной реакции с массивной инфильтрацией тканей кл точными элементами.

Так, у животных основной группы общее количество клеток в склерс ( 1 мм2), начиная с 1-х суток, было в 1,5 раза больше, составив 7560 ± 20 (5141 ± 129 у животных группы сравнения, р<0,05). Такая тенденция сохр нялась в течение всего периода наблюдения (табл. 8) и к 21-м суткам пло ность клеточного инфильтрата в 1 мм2 у животных основной группы была 2, раза больше, составив 3025 ± 105 и 1099 ± 103 у животных группы сравн ния, соответственно.

Кроме того, у животных основной группы продолжительность нейтр филыюй фазы увеличилась в 2,5 раза: смена нейтрофильной популяции i лимфоцитарно-фибробластическую наблюдалась на 7-е сутки, в то время к у животных группы сравнения уже на 3-й сутки. Все это дает основание п лагать, что проведение диатермокоагуляции тканей глазного яблока в хо хирургического лечения больных первичной открытоугольной глауком является дополнительным фактором риска избыточной регенерации вно сформированных путей оттока внутриглазной жидкости.

Выводы

1. Установлено, что оптимальные линейные параметры зоны гипотензивно фистулизирующего вмешательства при хирургическом лечении больнь первичной открытоугольной глаукомой составляют не менее 4 мм с общ площадью зоны фильтрации в пределах 8 мм2.

2. Сокращение зоны фистулизирующего вмешательства с уменьшением л нейных параметров разрезов при хирургическом лечении первичной о крытоуголыюй глаукомы нецелесообразно, так как приводит к увелич нию скорости оттока внутриглазной жидкости, что способствует более б строй реализации дифференцировочного потенциала фибробластоиднь клеток и рубцеванию вновь сформированных путей оттока.

3. Моделирование in vitro потока внутриглазной жидкости аналогичного п фистулизирующих операциях у больных первичной открытоугольн

глаукомой выявило, что он вызывает ускорение морфофункционального созревания фибробластоидных клеток в зрелые, коллагенсинтезирующие формы, что, в свою очередь, приводит к избыточной регенерации тканей глазного яблока и снижает эффект операции.

4. Диатермокоагуляция тканей глазного яблока является дополнительным фактором риска избыточной регенерации вновь сформированных путей оттока внутриглазной жидкости при фистудизирующих операциях у больных первичной открытоугольной глаукомой, что, в среднем на 8 месяцев, укорачивает срок нормализации внутриглазного давления.

5. Экспериментальное течение репаративной регенерации после диатермо-коагуляции сосудов конъюнктивы склеры характеризуется развитием выраженной местной воспалительной реакции с массивной инфильтрацией клеточными элементами, а также замедлением смены нейтрофильной популяции на лимфоцитарно-фибробластическую, что удлиняет сроки заживления и является предрасполагающим фактором рубцевания вновь сформированных путей оттока внутриглазной жидкости

Практические рекомендации

1. При выполнении фистулизирующих гипотензивных операций у больных первичной открытоугольной глаукомой линейный размер глубокого склерального лоскута должен быть не менее 4 мм с общей площадью зоны фильтрации в пределах 8 мм2.

2. Проведение диатермокоагуляции тканей глаза в ходе фистулизирующих операций при лечении первичной открытоугольной глаукомы необходимо ограничить, так как это способствует развитию выраженной местной воспалительной реакции, увеличению сроков заживления, и, как следствие, избыточной регенерации в зоне оперативного вмешательства.

3. Применение проточного культивирования клеток в ходе экспериментальных исследований обеспечивает возможность получения биоинженерных конструкций, заселенных дифференцированными клетками, в более корот-

, кие сроки, чем при стационарном культивировании.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мартусевич, Я.А. Декомпрессионная хирургия глаукомной оптической нейропатии / Я.А. Мартусевич, И.В. Запускалов, О.И. Кривошеина // Глаукома теории, тенденции, технологии. Сборник научных статей V международной конференции. -Москва, 2007. - С. 178-183.

2. Мартусевич, Я.А. Внутренняя пограничная мембрана сетчатки и пульсация центральных ретинальных сосудов на диске зрительного нерва / Я.А. Мартусевич, И.В. Запускалов, О.И. Кривошеина // Глаукома теории, тенденции, технологии. Сборник научных статей V международной конференции. -Москва, 2007. - С. 272-277.

3. Мартусевич, Я.А Патогенетические аспекты избыточной регенерации тканей глаза с позиций функциональной морфологии / Я.А. Мартусевич, О.И.

Кривошеина, И.В. Запускалов // Новые технологии в офтальмологии. Материалы международной научно-практической конференции. - Казань, 2008. С. 152-155.

4. Мартусевич, Я.А Влияние диатермокоагуляции склеры на развита пролиферативного процесса в переднем отрезке глаза / Я.А. Мартусевич / Состояние и пути совершенствования качества офтальмологической помощ в регионах России. Материалы Всероссийской конференции офтальмологов -Махачкала, 2008. - С. 143-144.

5. Мартусевич, Я.А Ферментативная активность мононуклеаров кров при проточном культивировании / Я.А. Мартусевич, О.И. Кривошеина, И.В Запускалов, И. А. Хлусов // Сибирский консилиум. Медико фармацевтический журнал. - 2007. - №7. - С. 52-53.

6. Мартусевич, Я.А Изучение воспалительно-репаративных реакций по еле диатермокоагуляции фиброзной оболочки глаза в эксперименте / Я.А Мартусевич, О.И. Кривошеина, О.Б. Кочмала // Актуальные проблемы оф тальмологии. Сборник научных работ П1 Всероссийской научной конферен ции молодых ученых. - Москва, 2008. - С. 336 -337.

7. Мартусевич, Я.А Биореактор in vitro - как основа изучения клеточны механизмов избыточной регенерации / Я.А. Мартусевич, О.И. Кривошеин И.А. Хлусов И Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии орган зрения. Материалы научно-практической конференции. - Москва, 2008. С.82-84.

8. Мартусевич, Я.А Клинико-морфологические изменения фиброзно оболочки глаза после диатермокоагуляции / Я.А. Мартусевич, О.И. Крив шеина, О.Б. Кочмала // Глаукома: реальность и перспективы. Материалы н учно-практической конференции. — Москва, 2008. - С. 120-124.

9. Мартусевич, Я.А Динамика репаративной регенерации после диате мокоагуляции фиброзной оболочки глаза / Я.А. Мартусевич, О.И. Кривоше на, И.В. Запускалов, А.Н. Дзюман // Пролиферативный синдром в офтальм логии. Материалы V международной конференции. - Москва, 2008. - С. 15 153.

10. Мартусевич, Я.А Новый подход к изучению клеточных механизмов и быточной регенерации тканей глаза / Я.А. Мартусевич, О.И. Кривошеин И.А. Хлусов, И.В. Запускалов // Ижевские родники - 2008. Материалы Ро сийской научно-практической конференции офтальмологов с междунаро ным участием - Ижевск, 2008. - С. 594-596.

11. Мартусевич, Я.А Влияние диатермокоагуляции на характер воспал тельно-репаративной реакции склеры в эксперименте / Я.А. Мартусеви О.И. Кривошеина, М.А. Мартусевич, И.В. Запускалов, А.Н. Дзюман // Гла кома теории, тенденции, технологии. Сборник научных статей VI междун родной конференций. - Москва, 2008. - С. 302-309.

12. Мартусевич, Я.А Результаты клинико - морфологического исследов ния склеры после диатермокоагуляции / Я.А. Мартусевич, И.В. Запускало

О.И. Кривошеина, Л.Н. Дзюман, О.Б. Кочмала // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. - №1 (8). - С. 14-18.

13. Мартусевич, Л.А Изучение-патогенеза избыточной регенерации тканей глаза с помощью проточного культивирования / Я.А. Мартусевич, О.И. Кривошеина, И.А. Хлусов, О.Б. Кочмала // Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в офтальмологии. Сборник материалов межрегиональной научно-практической конференции. - Барнаул - Белокуриха, 2009. - С. 51 -54.

14. Мартусевич, Я.А Диатермокоагуляция склеры как фактор патогенеза избыточной регенерации / Я.А. Мартусевич, О.И. Кривошеина, А.Н. Дзюман, О.Б. Кочмала // Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в офтальмологии. Сборник материалов межрегиональной научно-практической конференции. - Барнаул - Белокуриха, 2009. - С. 98-102.

15. Мартусевич, Я.А Изучение клеточных механизмов избыточной регенерации в условиях проточного культивирования / Я.А. Мартусевич // Науки о человеке. Материалы X конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2009.-С. 89-90.

16. Мартусевич, Я.А Изучение патогенеза избыточной регенерации в условиях проточного культивирования / Я.А. Мартусевич, О.И. Кривошеина, И.А. Хлусов, О.Б. Кочмала // Актуальные проблемы офтальмологии. Сборник научных работ IV Всероссийской научной конференции молодых ученых. -Москва, 2009.-С. 47-49.

17. Мартусевич, Я.А Внутриклеточный гомеостаз и гомеокинез фибробла-стов в условиях направленного движения жидкости / Я.А. Мартусевич, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов, И.А. Хлусов, О.Б. Кочмала // Биомеханика глаза. Сборник научных трудов конференции. - Москва, 2009. - С. 158-161.

18. Martusevich Ya.A. Morphofunctional properties of stromal stem cells studt-ing in vitro cultivation / Ya.A. Martusevich, O.I. Krivosheina, O.B. Kochmala // Advances in ophthalmology. Сборник тезисов общероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Москва, 2009. - С. 50-51.

19. Мартусевич, Я.А Морфофункциональные свойства стромальных стволовых клеток при культивировании in vitro в динамических условиях / Я.А. Мартусевич, И.В. Запускалов, О.И. Кривошеина, И.А. Хлусов, Н.М. Шевцова, К.В. Зайцев, О.Б. Кочмала // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. -№4 (8).-С. 28-32.

20. Martusevich, Ya.A. The cells excess regeneration mechanisms studying in vitro bioreactor / Ya.A. Martusevich, O.I. Krivosheina, I.V. Zapuskolov, O.B. Kochmala, I.A. Khlusov, I.A. Dashko, J.I. Khoroshikh, O.B. Zapuskalova // AR-VO/ISOCB. - 2009 - Vol.B, Issue 28. - p. 37.

21. Мартусевич, Я.А Изучение клеточных механизмов развития фиброва-скулярной пролиферации в эксперименте in vitro / Я.А. Мартусевич, О.И. Кривошеина, И.А. Хлусов, О.Б. Кочмала // Биомеханика глаза. Сборник научных трудов конференции. - Москва, 2009. - С. 158-161.

22. Martusevich, Ya.A Peculiarities of inflammatory-reparative reaction of sclera after diatermo-coagulation in experiment in vivo / Ya.A. Martusevich, O.I. Kri-

vosheina, J.I. Khoroshikh, I.A. Dashko, O.B. Kochmala, I.V. Zapuskolov // Inves tigative Ophthalmology Visual Science. - 2010. - Vol. 51. - P. 2989. 23. Мартусевич, Я.Л Особенности внутриклеточного метаболизма стро мальных стволовых клеток при культивировании in vitro в динамических ус ловиях / Я.А. Мартусевич // Науки о человеке. Материалы XI конгресса мо лодых ученых и специалистов. - Томск, 2010. - С. 61-62.

Патенты РФ

1. Устройство для культивирования клеток // Патент на полезную модел1 № 95663 от 10.07.2010 г. (Соавт. Запускалов И.В., Кривошеина О.И., Хлусов И.А., Кочмала О.Б.).

2. Способ оценки состоятельности фильтрационной подушки после анти глаукоматозных операций П Патент № 2400126 от 27.09.2010 г. (Соавт. Запускалов И.В., Кривошеина О.И., Кочмала О.Б.).

СПИСОК ПРИНЯТЫХ В ДИССЕРТАЦИИ СОКРАЩЕНИЙ

±ш — границы доверительного интервала средней арифметической величины п - количество наблюдений в выборке р - уровень значимости О - квартиль X - медиана

ВГД - внутриглазное давление ВГЖ - внутриглазная жидкость

М - средняя арифметическая величина вариационного ряда ПОУГ - первичная открытоугольная глаукома

Отпечатано в ООО «НИП» г. Томск, ул. Советская, 47, тел.: 53-14-70 заказ № 5349, тираж 100 экз.

Проблема патогенеза пролиферативных процессов в хирургии первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ), снижающих в конечном итоге гипотензивный эффект, занимает одно из важных мест в современной офтальмологии [9, 73, 75, 76, 78, 181, 221, 236]. Хирургическое лечение глаукомы в настоящее время является приоритетным направлением в стабилизации уровня внутриглазного давления (ВГД) и отличается высокой эффективностью [4, 32, 96, 98, 123]. По данным различных авторов гипотензивный эффект в раннем послеоперационном периоде достигается в 90-97% случаев [5, 153, 164, 198, 218].

Однако, согласно клиническим наблюдениям отечественных и зарубежных исследователей, в отдаленные сроки после хирургического вмешательства, в среднем, в течение 5 лет, у 30% прооперированных больных отмечается рецидив гипертензии [1, 2, 3, 4, 35, 49, 56, 92, 121, 153]. Однако с учетом того факта, что в значительном количестве случаев требуется проведение мер, направленных на снижение ВГД в послеоперационном периоде (выполнение десцеметогониопунктуры либо назначение местной гипотензивной терапии), количество больных сокращается до 34% [16, 77, 199, 216].

По данным ряда авторов, [10, 119, 137] первый пик декомпенсации ВГД после оперативного лечения отмечается в течение 1-го месяца и составляет, в среднем, 16%.

В течение 3-х месяцев после операции повышение ВГД выявляется у 12% больных; через 6 месяцев - еще в 11% случаев, через 9 месяцев, в среднем, у 7% прооперированных пациентов. В дальнейшем наблюдается постепенное уменьшение количества больных с повышенным ВГД и составляет, в среднем, по 3% через 2 и 3 года после операции.

С увеличением периода наблюдения эффективность антиглаукомных операций еще более снижается, что, в конечном счете, требует повторного хирургического вмешательства со всеми возможными негативными явлениями [23, 45, 73, 91, 94, 97, 145].

Основной причиной снижения эффективности оперативного лечения является рубцевание вновь созданных путей оттока внутриглазной жидкости [1, 3, 7, 47, 55, 97, 119, 197, 219, 220, 236, 239]. Причем рубцевание фильтрационной "подушечки" встречается в 10-40% случаев, рубцевание внутренней фистулы — в 9-23% случаев, сращения поверхностного лоскута склеры и подлежащего ложа - в 10-28% случаев, что подтверждается данными ультразвуковой биомикроскопии [1, 197].

В настоящее время большое внимание уделяется выявлению факторов риска рубцевания в зоне вмешательства у больных, страдающих ПОУГ [1, 10, 119, 137]. Многочисленные исследования посвящены анализу взаимосвязи между полом, возрастом, стадией заболевания, наличием псевдоэксфолиативного синдрома, концентрацией определенных биохимических показателей в сыворотке крови и во влаге передней камеры, и послеоперационным рубцеванием путей оттока [8, 13, 36, 56, 75, 77, 78, 92, 137, 151, 159, 174, 177, 191, 210, 211, 228]. Также исследуются различные факторы, непосредственно участвующие в процессе заживления тканей глаза после антиглаукомных операций или оказывающие на них существенное влияние. Среди большого числа разнородных факторов, роль ведущих из них в развитии избыточной регенерации в области сформированных путей оттока, принадлежит местным трофическим изменениям соединительной ткани дренажной системы и склеры при глаукоме, местной воспалительной реакции и активации коллагеногенеза после операции [75].

Проблема патогенеза избыточной регенерации после антиглаукомных операций является сложной и многомерной по характеру. Перед исследователями, изучающими механизмы неадекватного фиброгенеза, стоит ряд вопросов. Прежде всего, недостаточно изучены: 1) этиология этого процесса, и в частности, факторы риска, способствующие рубцеванию; 2) состав и роль клеточных элементов; 3) участие микроокружения в процессе дифференцировки и созревания клеток; 4) не до конца понятны вопросы гидродинамического влияния внутриглазной жидкости на патогенез ПОУГ и избыточной регенерации.

Все выше изложенное создает предпосылки для формулирования ряда научно-исследовательских задач, направленных на более глубокое изучение проблемы патогенеза пролиферативных процессов после антиглаукомных операций.

Цель исследования - выявление механизмов избыточной регенерации тканей глазного яблока после гипотензивных фистулизирующих операций у больных первичной открытоугольной глаукомой.

Задачи исследования:

1. Изучить клиническую эффективность гипотензивных фистулизирующих операций у больных первичной открытоугольной" глаукомой в зависимости от линейных параметров вновь сформированных путей оттока внутриглазной жидкости.

2. Определить влияние диатермокоагуляции сосудов конъюнктивы склеры на клинико-функциональные результаты гипотензивных фистулизирующих операций у больных ПОУГ в разные сроки наблюдения.

3. В эксперименте in vitro изучить влияние направленного потока жидкости, моделирующего движение внутриглазной жидкости после гипотензивных операций при глаукоме, на механизмы морфофункционального созревания фибробластоидных клеток.

4. Изучить влияние диатермокоагуляции сосудов конъюнктивы склеры на процессы репаративной регенерации тканей глаза в эксперименте.

Научная новизна

В результате клинико-экспериментальных исследований получены новые данные о факторах, предрасполагающих к избыточной регенерации тканей глаза у больных ПОУГ после гипотензивных операций.

Впервые при длительном, в течение 3-х лет, наблюдении прооперированных больных ПОУГ прослежена прямая зависимость между площадью созданной фильтрационной зоны и продолжительностью гипотензивного эффекта. Чем меньше площадь фильтрационной зоны, тем короче гипотензивный эффект.

В результате длительного срока наблюдения впервые выявлено, что проведение диатермокоагуляции в ходе фистулизирующих гипотензивных операций у больных ПОУГ сокращает продолжительность гипотензивного эффекта в среднем на 8 месяцев.

Впервые в эксперименте in vitro доказано, что при биомеханическом воздействии направленного потока жидкости, моделирующего движение внутриглазной жидкости (ВГЖ) после фистулизирующих операций, в фибробластоидных клетках отмечается значительное повышение активности внутриклеточных ферментативных систем, свидетельствующее об ускорении процессов их морфофункционального созревания в зрелые, коллагенсинтезирующие формы.

Впервые в эксперименте in vivo установлено, что после диатермокоагуляции склеры отмечается развитие выраженной воспалительной реакции в зоне воздействия с замедлением смены клеточных фаз, что может способствовать избыточному фиброгенезу.

Практическая значимость

Предложен новый способ культивирования стромальных стволовых клеток и получен патент РФ на полезную модель № 95663 «Устройство для культивирования клеток» от 10. 07. 2010 года.

Предложен новый способ оценки состоятельности фильтрационной подушки после антиглаукоматозных операций и получен патент РФ № 2400126 «Способ оценки состоятельности фильтрационной подушки после антиглаукоматозных операций» от 27. 09. 2010 года.

Установлено, что уменьшение линейных параметров разрезов при фистулизирующих гипотензивных операциях у больных глаукомой до 2 мм нецелесообразно, так как способствует увеличению скорости оттока внутриглазной жидкости и, как следствие, интенсификации процессов рубцевания вновь сформированных путей оттока.

Клиническими и экспериментальными исследованиями in vivo выявлено неблагоприятное влияние диатермокоагуляции тканей в области хирургического вмешательства, способствующее выраженной местной воспалительной реакции, что является дополнительным фактором риска рубцевания вновь сформированных путей оттока ВГЖ у больных глаукомой.

Технология проточного культивирования клеток обеспечивает возможность получения биоинженерных конструкций, состоящих из скеффолдов, заселенных дифференцированными клетками, в более короткие сроки, чем при стационарном культивировании.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Высокая скорость оттока внутриглазной жидкости при выполнении фистулизирующих операций у больных первичной открытоугольной глаукомой в позднем послеоперационном периоде приводит к интенсификации процессов рубцевания в области хирургического вмешательства, и, как следствие, - сокращению срока компенсации офтальмотонуса.

2. При моделировании оттока внутриглазной жидкости после фистулизирующих операций в виде проточного культивирования in vitro фибробластоидных клеток человека происходит ускорение их морфофункционального созревания, что лежит в основе клеточных механизмов избыточной регенерации тканей глазного яблока после операций у больных первичной открытоугольной глаукомой.

3. Проведение диатермокоагуляции тканей глазного яблока в области хирургического вмешательства у больных первичной открытоугольной глаукомой способствует выраженной местной воспалительной реакции с замедлением смены клеточных фаз, что приводит к увеличению сроков заживления и создает предпосылки для рубцевания вновь сформированных путей оттока внутриглазной жидкости.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты работы используются в программах лекционных курсов, практических занятий на кафедре офтальмологии и кафедре морфологии и общей патологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Апробация работы

Основные положения и материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Томского областного общества офтальмологов (2008 - 2010); V Международной научно-практической конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2008); IV Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2009); Международном конгрессе «The Association for Research in Vision and Ophthalmology (Ericeira, Portugal, 2009); XI конгрессе с международным участием молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010); конкурсе научных работ молодых ученых СибГМУ (Томск, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 23 научные работы, в том числе 3 -в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований, 2 - в международной печати.

Получен патент РФ на полезную модель № 95663 «Устройство для культивирования клеток» от 10. 07. 2010 года.

Получен патент РФ № 2400126 «Способ оценки состоятельности фильтрационной подушки после антиглаукоматозных операций» от 27. 09. 2010 года.

Структура и объём диссертации

Диссертационное исследование состоит из введения, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 135 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 30 рисунками. Список литературы включает 243 источника, в том числе: 154 - отечественных авторов и 89 - зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что оптимальные линейные параметры зоны гипотензивного фистулизирующего вмешательства при хирургическом лечении больных первичной открытоугольной глаукомой составляют не менее 4 мм с общей площадью зоны фильтрации в пределах 9 мм2.

2. Сокращение зоны фистулизирующего вмешательства с уменьшением линейных параметров разрезов при хирургическом лечении первичной открытоугольной глаукомы нецелесообразно, так как приводит к увеличению скорости оттока внутриглазной жидкости, что способствует более быстрой реализации дифференцировочного потенциала фибробластоидных клеток и рубцеванию вновь сформированных путей оттока.

3. Моделирование in. vitro потока внутриглазной жидкости, аналогичного при фистулизирующих операциях у больных первичной открытоугольной глаукомой, выявило, что он вызывает ускорение морфофункционального созревания фибробластоидных клеток в зрелые, коллагенсинтезирующие формы, что, в свою очередь, приводит к избыточной регенерации тканей глазного яблока и снижает эффект операции.

4. Диатермокоагуляция тканей глазного яблока является дополнительным фактором риска избыточной регенерации вновь сформированных путей оттока ВГЖ при фистулизирующих операциях у больных первичной открытоугольной глаукомой, что в среднем на 8 месяцев укорачивает срок нормализации внутриглазного давления.

5. Экспериментальное течение репаративной регенерации после диатермокоагуляции сосудов конъюнктивы склеры характеризуется развитием выраженной местной воспалительной реакции с массивной инфильтрацией клеточными элементами, а также замедлением смены нейтрофильной популяции на лимфоцитарно-фибробластическую, что удлиняет сроки заживления и является предрасполагающим фактором рубцевания вновь сформированных путей оттока внутриглазной жидкости.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При выполнении фистулизирующих гипотензивных операций у больных первичной открытоугольной глаукомой линейный размер глубокого склерального лоскута должен быть не менее 4 мм.

2. Проведение диатермокоагуляции тканей глаза в ходе фистулизирующих операций при лечении первичной открытоугольной глаукомы необходимо ограничить, так как это способствует развитию выраженной местной воспалительной реакции, увеличению сроков заживления, и, как следствие, избыточной регенерации в зоне оперативного вмешательства.

3. Применение проточного культивирования клеток в ходе экспериментальных исследований обеспечивает возможность получения биоинженерных конструкций, заселенных дифференцированными клетками, в более короткие сроки, чем при стационарном культивировании.