Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение производного тиазолидин-2,4-диона (микозидина) в качестве потенциального противогрибкового средства

На правах рукописи

ШИЛОВА Ирина Борисовна

ИЗУЧЕНИЕ ПРОИЗВОДНОГО ТИАЗОЛИДИН-2,4-ДИОНА (МИ-КОЗИДИНА) В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ПРОТИВОГРИБКОВОГО СРЕДСТВА.

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Купавна 2007

003062350

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии Центре по химии лекарственных средств (ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ)

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Гуськова Татьяна Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Березовская Ирина Владимировна доктор медицинских наук, профессор Яворский Александр Николаевич

Ведущая организация - НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова

л *

Защита состоится « ЗО » _2007 г. в /О часов на заседании

диссертационного совета Д 217.004.01 при Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ по адресу: 142450, Московская область, п. Старая Купавна, ул. Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ.

Автореферат разослан «__ /9 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Корольченко Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Лечение грибковых инфекций кожи и ногтей представляет давнюю проблему с неубывающей актуальностью, так как это одно из наиболее длительно существующих, широко распространённых и трудно излечиваемых контагиозных заболеваний человека. По частоте, быстроте распространения и глобальности распространения грибковые инфекции приближаются к обычным простудным заболеваниям. Среди дерматофитий наиболее распространённой инфекцией, занимающей второе место после микозов стоп, является микроспория гладкой кожи.

Несмотря на достаточно обширный класс разнообразных химических соединений, как природного происхождения, так и полученных путём химического синтеза, обладающих специфической активностью в отношении патогенных грибов, существующие противогрибковые препараты полностью не решают проблемы химиотерапии микозов. Трудности лечения определяются локализацией и характером патологического процесса, а также хроническим течением заболевания и частыми рецидивами. Наличие у пациентов нарушений в иммунной системе, периферической иннервации и кровоснабжении на фоне сопутствующих заболеваний, длительного приёма антибиотиков широкого спектра действия, цитостатиков, влияния вредных факторов внешней среды ослабляет устойчивость организма к патогенным грибам В связи с этим растёт число больных микозами кожи и её придатков, вызванными не только облигатными возбудителями, но и оппортунистическими грибами (О. В. Бакланова, E.H. Па-дейская 1987; Ю.С. Бутов 2002; О.И. Мендель 2002; С.А. Бурова и соавт. 1999).

В настоящее время в клинической практике имеется определенный выбор препаратов, обладающих антимикотической активностью, как системного, так и локального действия, но вызываемые ими побочные или токсические эффекты нередко ограничивают их применение в медицинской практике. Например, антибиотик гризеофульвин обладает высокой токсичностью, тератогенным и эмбриотоксическим действием. Производные имидазола и триазола (кетокона-зол, итраконазол, бифоназол, оксиконазол, флуконазол, клотримазол) при системном применении в разной степени обладают гепатотоксичностью и неблагоприятным действием на эндокринные органы, при местном применении способствуют возникновению аллергических реакций. Производные группы алли-ламинов (тербинафин, толнафтат, нафтифин) при системном применении оказывают побочное действие на желудочно-кишечный тракт и отрицательное инотропное действие. При длительном местном применении способствуют развитию аллергических реакций.

В связи с этим поиск, разработка и внедрение в практическое здравоохранение высокоактивных и малотоксичных лекарственных средств, способных специфически воздействовать на патогенные грибы, не оказывая при этом нежелательного действия на организм, является актуальным.

В ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ с 1983 года ведутся систематические исследования по синтезу и биологическому изучению в ряду производных тиазолидин-2,4-диона. Противогрибковые лекарственные средства в этом ряду соединений не описаны. Синтезировано 105 оригинальных производных тиазолидин-2,4-

диона. На основании скрининговых исследований было отобрано одно соединение, показавшее противогрибковую активность, что явилось основанием для углублённого изучения этого вещества, которое получило название микозидин.

Представлялось целесообразным изучить широту спектра противогрибковой активности микозидина, его влияние на клетку патогенного гриба, возможность развития устойчивости к нему патогенных грибов; оценить другие виды биологической активности микозидина, его резорбтивное и местное воздействие на организм животных. Решение данной проблемы позволило бы предложить для клинического изучения новое средство лечения грибковой инфекции гладкой кожи.

Цель исследования: изучить противогрибковую и другие виды биологической активности оригинального отечественного средства микозидина в исследованиях in vitro и in vivo, для создания потенциального антифунгального лекарственного препарата в виде мази. Задачи исследования:

1. Изучить спектр антимикотической активности микозидина в опытах in vitro в отношении различных видов патогенных грибов.

2. Определить влияние микозидина на ультраструюуру клеток патогенного гриба и возможность развития к нему устойчивости возбудителей.

3. На модели экспериментальной микроспории морских свинок установить зависимость противогрибкового эффекта микозидина от его концентрации при местном применении в виде мази.

4. Оценить местное и резорбтивное действие микозидина в виде мази 3% концентрации, как наиболее эффективной на модели экспериментальной микроспории морских свинок.

5. Оценить химиотерапевтическую эффективность микозидина в виде 3 % мази на модели экспериментальной микроспории морских свинок в сравнении с широко применяемыми в настоящее время противогрибковыми препаратами (канестен, микозолон, микоспор, мифунгар, низорал, нитрофунгин).

6. Исследовать другие виды биологической активности микозидина (антибактериальную и противовирусную), а также его влияние на фагоцитарное звено иммунитета.

Научная новизна работы.

1. Установлено, что микозидин обладает широким спектром биологической активности: противогрибковой, антибактериальной и противовирусной.

2. Впервые изучено повреждающее действие микозидина на ультраструктуры клетки патогенного гриба.

3. Впервые в опытах in vitro путем многократных пассажей установлено отсутствие развития резистентности к микозидину у патогенных грибов.

4. Впервые установлена зависимость противогрибковой эффективности и переносимости микозидина от его концентрации при местном применении в виде мази, что позволило отобрать для клинических исследований мазь 3% концентрации.

5. На модели экспериментальной микроспории морских свинок впервые показано при местном применении преимущество 3 % мази микозидина перед ши-

роко применяемыми в настоящее время противогрибковыми препаратами: ка-нестеном, мифунгаром и низоралом.

Научно-практическая значимость работы:

1. Полученные результаты, свидетельствующие о высокой противогрибковой активности и хорошей переносимости микозидина в виде 3% мази, включены в пакет документов для получения разрешения на проведение его клинических исследований в качестве противогрибкового средства.

2. Наличие у микозидина антибактериальной и противовирусной активности, а также положительного влияния на фагоцитарное звено иммунитета обеспечивает его значительные преимущества перед применяющимися в настоящее время противогрибковыми средствами (канестен, микозолон, микоспор, мифунгар, низорал, нитрофунгин).

3. В настоящее время клинические испытания 3 % мази микозидина прошли успешно, и препарат рекомендован к медицинскому применению (Протокол №1 от 18.01.2007 г. заседания Бюро ФГУ НЦЭСМП Росздрава).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На модели микроспории морских свинок микозидин при местном применении обладает высокой эффективностью, превосходящей современные противогрибковые средства для местного применения.

2. В опытах in vitro микозидин оказывает антибактериальное и противовирусное действие, стимулирует фагоцитарное звено иммунитета.

3. Отсутствует развитие устойчивости к микозидину у патогенных грибов.

Апробация результатов диссертационной работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на коллоквиуме ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ и получен 1 патент на изобретение. Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 135 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 26 таблицами. Библиография включает 142 источника литературы, среди которых 21 ссылка на иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Субстанция микозидин.

3- Метоксикарбонил-5-(4-хлор-бензилиден)-тиазолидин-2,4-дион

"-О"

C^HgClNOiS

М.м. 297,70

Выпускается в соответствии с ФСП 42-0067740006.

От белого до белого с легким желтоватым оттенком цвета кристаллический порошок без запаха. Растворим в хлороформе, умеренно растворим в толуоле, практически нерастворим в воде и спирте 95%. Температура плавления от 153 до 160°С.

Лекарственное средство мазь микозидина 3% выпускается в соответствии с ФСП. Состав: Микозидин - 3,0 г, Воск эмульсионный -10,0 г, Парафин нефтяной твёрдый -7,0 г, Кислота стеариновая - 6,5 г, Кислота бензойная - 0,2 г, Масло вазелиновое до 100,0 г

Описание: однородная мазь белого цвета. Соответствует требованиям ГФ XI, вып. 2, с. 145.

1. Исследования in vitro.

а) Изучение противогрибковой активности проведено на 28 штаммах.

В экспериментах использовали лабораторные и госпитальные штаммы патогенных грибов: Microsporum canis 3/84, 50, 53, 4111, 4304; Trichophyton gyrseum 5/85, 2/92; Candida albicans 1755, 13 и Candida tropicalis (Ленинград). Методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде Сабу-ро препарат в виде субстанции изучен в концентрациях от 500,0 до 1,95 мкг/мл. В автоматической системе MS-2 среда «Abbott» использовали концентрации в диапазоне от 1,0 мкг/мл до 3000 мкг/мл.

Микробная нагрузка патогенных грибов составляла (2x10® кое/мл). Время

инкубации для дерматофитов при температуре 37°С составляло 6 суток, для Candida -24 часа. Активность препарата учитывали визуально, результаты выражали в МПК (минимальная подавляющая концентрация), мкг/мл, при которой видимого роста гриба не наблюдалось. Изучение фунгицидной активности проводилось методом посева на чашки с агаром Сабуро содержимого пробирок, в которых не обнаружено роста, после выдерживания их при температуре 37°С в течение 10 суток.

В исследованиях на плотной питательной среде (агар Сабуро) использовали госпитальные штаммы грибов: Microsporum canis 3/84, 50, 53, 4111, 4304; Trichophyton gyrseum 5/85, 2/92; Trichophyton mentagrophytes (var. Intradigitalis) 317/26, 6/85, 7/85, 8/85, 1147/85, 2184, 1239/85; Candida albicans 1755, "Федотов", 401/885-653, 520, 1798, 2118; Mucor pussilus 158/3848; Cryptococcus neoformans 232/168A; Pseudoallecheria boydii; Trichophyton rubrum 309/631; Aspergillus fumigatus 132/8804, 194/6654H. Микробная нагрузка составляла 1х108 кое/мл. Исследуемый препарат в концентрациях от 1,0 мкг/мл до 300,0 мкг/мл разводили в ДМСО, вносили в лунки сделанные в агаре в объеме 0,2 мл и инкубировали в термостате при 37°С для грибов рода Candida 24 часа, для дерматофитов - 6 суток. Результаты антифунгального действия учитывали визуально по диаметру зоны задержки роста гриба вокруг лунки в миллиметрах.

Методом электронной микроскопии изучалось влияние суббактериостати-ческих концентраций субстанции микозидина (2,0; 3,9; 7,8; 15,6 мкг/мл) на

ультраструктуры клеток грибов рода Candida albicans после непосредственного контакта с клетками патогенного гриба в жидкой питательной среде Сабуро при экспозиции 3; 6; 24 и 48 часов.

б) Изучение развития устойчивости патогенных грибов к микозидину.

Изучение возможности развития устойчивости грибов к микозидину проводилось путем 13 последовательных пассажей штаммов Candida albicans, Candida tropicalis и Microsporum canis на среде Сабуро с субстанцией микози-дина.

в) Изучение антибактериальной активности.

В исследовании были использованы аэробные бактерии: референс штаммы Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosae АТСС 27853, Proteus vulgaris АТСС 6869, Bacillus subtilis ATCC 6635 и ряд других клинических госпитальных штаммов (всего 25 штаммов).

Изучение активности субстанции микозидина на жидкой питательной среде (бульон Хоттингера) проводили методом двукратных серийных разведений в концентрациях препарата от 500,0 до15,6 мкг/мл. Микробная нагрузка составляла 2,5x106 кое/мл. Бактерии инкубировали при температуре 37°С в течение 18 - 24 часов. Активность препарата учитывали визуально по отсутствию видимого роста бактерий (помутнения). Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) выражали в мкг/мл.

Изучение активности субстанции на плотной питательной среде (мясопеп-тонный агар) проводили путем нанесения на поверхность агара тест-культур бактерий. Микробная нагрузка составляла 1x106 кое/мл. Исследуемый препарат вносили в предварительно сделанные лунки в объеме 0,2 - 0,5 мл. Концентрации микозидина в лунках составляли: 10000, 20000, 30000 мкг/мл. После инкубации в термостате при 37°С, в течение 24 часов определяли величину зоны задержки роста бактерий вокруг лунок в миллиметрах.

Активность субстанции микозидина в отношении облигатных неспорооб-разующих анаэробных бактерий (Bacteroides ruminicola, Fusobacterum nucleatum, Peptococcus constellatus) определяли методом двукратных серийных разведений препарата в кровяном анаэробном бульоне. Микробная нагрузка составляла 2,5x106 кое/мл. Культивирование проводили в микроанаэростатах в бескислородной среде трёхкомпонентного газа (азота — 80 %, водорода - 10 % и

СОг - 10 %). Результаты учитывали визуально по отсутствию видимого роста бактерий (помутнение, изменение окраски среды) через 48 часовой экспозиции в термостате при температуре 37 °С.

г) Изучение противовирусной активности.

Изучение противовирусного (вирулицидного) действия субстанции микозидина проведено в отношении вируса гриппа Az/Aichi (H3N2) и вируса простого герпеса (ВПГ-1 типа), штамм «ЕС», штамм «Коптев». Исследования проводили в контактных опытах in vitro с последующим изучением остаточной инфекционности вируса на мышах (для вируса гриппа при интраназальном заражении на модели гриппозной пневмонии мышей, для вируса простого герпе-

са при иитраперитонеальном заражении на модели герпетического энцефаломиелита мышей) по известной методике (Г.Й. Першин,1971). Микозидин в виде субстанции использовали в концентрациях от 0,25 мг/мл до 2,0 мг/мл. Заражающие дозы вируса составляли 100; 10 и 1 Ю50. Контакт микозидина с вирусом составлял один час. Затем полученными скесями заражали мышей интра-назально (вирус гриппа А) или интраперитонеалъно (вирус простого герпеса 1 типа). Наблюдение за мышами проводили в течение 14 дней. Погибших мышей вскрывали и оценивали макроскопически патологические изменения в легких (гриппозная пневмония). Вирулицидную активность оценивали, сравнивая результаты гибели животных в опытных и контрольных группах.

Вирулицидную активность 3 % мази микозидина изучали в контактных опытах in vitro в отношении вируса простого герпеса 1 типа, штамм «Коптев» по выше описанной методике.

д) Изучение влияния микозидина на фагоцитарное звено иммунитета.

Макрофаги получали из перитонеальной полости белых мышах, которым внутрибрюшинно вводили мясопептонный бульон для стимуляции выхода клеток. Для определения количества клеток использовали фотоэлектроколори-метр.

Для оценки фагоцитоза использовали суточную культуру стафилококка (штамм 178) по общепринятой методике. В макрофагах просчитывали количество бактерий в одной клетке, количество макрофагов в препарате. Для оценки фагоцитарной активности использовали следующие показатели: МФА (макро-фагальная фагоцитарная активность) - количество макрофагов с поглощенными бактериями при просчете 100 клеток; ФИ (фагоцитарный индекс) - среднее число микробных клеток в одном макрофаге при просчете 100 клеток и ФЧ (фагоцитарное число) - среднее количество микробов в 1 активном макрофаге. В качестве испытуемых концентраций препарата в виде субстанции использовали дозу 10,0 мкг/мл и сверхмалые дозы (1,15-108 - 1,15-10 ~и мг/кг). 2. Исследования in vivo.

Представленные в работе экспериментальные исследования были проведены на 78 морских свинках-альбиносах, самцах массой 250-300 г. и на 90 белых мышах массой 18-20 г. животные содержались в виварии ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ согласно санитарно-гигиеническим нормам и принципам Европейской конвенции по защите лабораторных животных и получали сбалансированное питание. Исследования проведены с соблюдением правил гуманного обращения с животными.

а) Изучение противогрибковой эффективности микозидина.

Исследования проводили на модели экспериментальной микроспории морских свинок по известной методике (Першин Г.Н. 1971). Для заражения животных использовали штамм Microsporum canis, типичный по своим культу-ральным и биохимическим свойствам. Инфекционный процесс без лечения длился около 6 недель и заканчивался самоизлечением. Наблюдение за животными продолжалось в течение 35 дней с момента заражения.

Наличие возбудителя в очагах подтверждали специфическим свечением в лучах лампы Вуда. Проводилось микроскопическое исследование материала,

взятого из очагов поражения, и посев его на питательную среду. После установления наличия грибкового поражения начинали соответствующее лечение. Ми-козидин готовили в виде мазей с различной концентрацией. Критерием излечения являлось отсутствие специфического свечения и патогенных грибов при микроскопическом и культуральном исследованиях. Лечебную эффективность мазей оценивали по следующим параметрам: 1) специфическое свечение очагов поражения в лучах лампы Вуда при наличии возбудителя, в баллах, в зависимости от площади и интенсивности свечения; 2) посев и микроскопическое исследование материала (чешуйки, волоски); 3) время восстановления шёрстного покрова; 4) местно-раздражающее действие (язвы, струпья, их количество и размеры). Оценку проводили I раз в 7 дней на протяжении всего периода наблюдения. Интенсивность и площадь свечения оценивали в баллах: 0 баллов - нет свечения; 0,04 балла - свечение 1 % площади; 1 балл - свечение 1-25 % площади; 2 балла -свечение 26-50 % площади; 3 балла - свечение 51-75 % площади; 4 балла - свечение 76-100 % площади. Для количественной оценки химиотерапевтической эффективности определяли показатели: индекс поражения (ИП) и терапевтической эффект (ТЭ). ИП представляет собой соотношение степени интенсивности местного проявления инфекции, по площади свечения в баллах, к числу исследуемых животных в группе. £ баллов

ИП =----------;

п

£ - сумма баллов свечения в группе, п - число животных в группе.

ТЭ - показатель химиотерапевтической эффективности в %, по отношению к контрольным не леченным животным высчитывали по формуле: ТЭ- ИП к - ИП л х 100% ИП к

ИП л - индекс поражения леченных животных ИП к - индекс поражения контрольных животных

Микроскопическое и культуралыюе исследования материала взятого из очага поражения производилось дважды: на 7 день после заражения, для подтверждения наличия инфекционного процесса и по окончании эксперимента, для контроля излеченности. Материал высевали на агар Сабуро в чашках Петри. Посевы инкубировали при температуре 22-30 °С. Рост пушистых, серых с концентрическими кругами колоний Мкгозрогит саше отмечался к 6 - 7-му дню инкубации в точках внесения материала. При отсутствии роста культуры в точках внесения материала в течение 20 дней, результаты посева считали отрицательными. Микроскопия чешуек взятых из очагов поражения проводилась после их просветления в 20 % растворе гидроокиси калия. Результаты считались положительными, если в исследуемом материале обнаруживались извитые нити мицелия гриба.

Мазь втирали в пораженный участок кожи размером 5x5 см2 ежедневно в течение 21 дня в количестве 0,2 г. Животные были разделены на группы по 6 особей в каждой, включая группу контроля (без лечения).

Использовали микозидин в виде мазей 2; 3 и 5% концентраций.

б) Изучение переносимости и местно-раздражающего действия 3% мази микозидина при местном применении.

На модели экспериментальной микроспории морских свинок проводилось изучение переносимости и местно-раздражающего действия мази микозидина. Оценивали общее состояние животных (внешний вид, подвижность, нарастание массы тела). После прекращения применения препарата животных подвергали эвтаназии и определяли гематологические показатели: содержание гемоглобина (на эритрогемометре); количество эритроцитов и лейкоцитов (на приборе PSL -1); гематокрит с помощью центрифуги ТН-12; количество тромбоцитов (под микроскопом, окраска по Романовскому-Гимза); лейкоцитарная формула (под микроскопом, окраска по Романовскому-Гимза); время свертывания крови по методу Maca и Магро. В сыворотке крови определяли биохимические показатели: активность аланиновой и аспарагиновой амино-трансфераз (по Рейтману и Френкелю); активность щелочной фосфатазы (каталитической концентрации щелочной фосфатазы; общий белок (Диаком ОБ); холестерин (диагностический метод определения концентрации холестерина); сахар (глюкозооксидазный метод); альбумин (бромкрезоловый метод, Диаком ЧСА); мочевина (салицилат-ногипохлоритным реактивом). Проводили макроскопическое и микроскопическое исследование кожи животных.

Дополнительно было изучено влияние 3% мази микозидина на здоровую кожу морских свинок. Оценка наличия или отсутствия местно-раздражающего действия проводилась визуально по наличию изменений на коже животных (отек, гиперемия, шелушение и др.) на фоне нанесения препарата.

в) Изучение влияния 3% мази микозидина на фагоцитарное звено иммунитета.

Исследования проводили на белых мышах, которым местно на выбритую поверхность кожи площадью 3-3 см наносили 3 % мазь микозидина ежедневно в течение 7 дней в количестве 0,01 г однократно. После окончания введения препарата мышей подвергали эвтаназии с помощью гильотины, из брюшной полости извлекали макрофаги, которые подвергали изучению по методике, описанной в разделе in vitro.

Все результаты исследований обрабатывались статистически с использованием метода Стьюдента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение антимикотической активности микозидина в экспериментах in vitro. Показатели активности субстанции микозидина в отношении патогенных грибов дерматофитов на жидкой питательной среде представлены в табл.1.

Дерматофиты Штамм Минимальная подавляющая концентрация мкг/мл Фунгицидное действие мкг/мл

Microsporum canis 3/84 3.9 15,6

Microsporum canis 50 7,8 31,2

Microsporum canis 53 3,9 15,6

Microsporum canis 4111 3,9 7,8

Microsporum canis 4304 7,8 7,8

Trichophyton gyrseum 5/85 7,8 31,2

Trichophyton gyrseum 2/92 3,9 15,6

Субстанция микозидина показала значительную активность в отношении 5 штаммов Microsporum canis (минимальная подавляющая концентрация 3,9-7,8 мкг/мл) и 2 штаммов Trichophyton gyrseum (минимальная подавляющая концентрация 3,9-7,8 мкг/мл) на жидкой питательной среде. Фунгицидное действие проявлялось в концентрации равной или в 2 - 4 раза превышающей минимальная подавляющая концентрация.

Противогрибковая активность субстанции микозидина на плотной пита-т ельной среде в отношении дерматофитов представлена в табл.2.

___Таблица 2.

Дерматофиты Число штаммов Минимальная подавляющая концентрация мкг/мл Зона задержки роста, мм Длительность задержки роста, сут.

Microsporum canis 5 10,0-15,6 полная отсутствие роста

Trichophyton mentagrophytes 7 15,6 полная отсутствие роста

Trichophyton rubrum 1 31,2 полная отсутствие роста

На плотной питательной среде активность субстанции микозидина в отношении дерматофитов находилась в пределах минимальных подавляющих концентраций, установленных в исследованиях на жидкой питательной среде (3,9 -7,8 мкг/мл).

Противогрибковая активность субстанции микозидина на плотной питательной среде в отношении возбудителей глубоких микозов представлена в табл.3.

Возбудители глубоких ми- Число Минималь- Зона задерж- длитель-

козов штам- ная подав- ки роста, мм ность за-

мов лающая держки

концентра- роста, сут.

ция мкг/мл

Aspergillus fumigatus 2 50,0 до 2-3 2

Cryptococcus neoformans 1 >200,0 ДО 1 3

Mucor pusillus 1 200,0 до 2-3 5

Pseudoallesheria boydii 1 200,0 до 2-3 5

Активность в отношении возбудителей глубоких микозов (гистоплазмоза, аспергиллёза и др.) была существенно ниже, чем у дерматофитов.

Противогрибковая активность микозидина на различных питательных средах в отношении дрожжеподобных грибов рода Candida представлена в табл. 4.

Таблица 4.

Дрожжеподобные грибы Среда Сабуро минимальная подавляющая концентрация мкг/мл Среда «Abbott» (MS-2) минимальная подавляющая концентрация мкг/мл Агар Сабуро минимальная подавляющая концентрация мкг/мл

Candida albicans 1755 15,6 4,0 62,5

Candida albicans 13 - 31,2-62,5 62,5

Candida tropicalis - 31,2-62,5 125,0

Субстанция микозидина проявляет несколько меньшую активность в от-

ношении дрожжеподобных грибов рода Candida по сравнению с активностью в отношении дерматофитов.

Таким образом, все 18 изученных штаммов различных патогенных грибов были чувствительны к микозидину в опытах in vitro.

Электронно-микроскопические исследования показали, что микозидин во всех исследованных концентрациях вызывает изменения структуры клеток гриба Candida albicans. Вначале изменения появляются в клеточной стенке, компоненты которой истончаются и лизируются с образованием сквозных пор и разрывов (фрагмент «б»). Глубина и протяжённость повреждений зависит от дозы микозидина и времени экспозиции. При использовании микозидина в дозах 7,8 и 15,6 мкг/мл у большинства клеток стенка была почти полностью лизирована (фрагменты «в»; «г»). Лизис компонентов клеточной стенки вызывает нарушение проницаемости и жесткости стенки, в связи с этим клетки под влиянием соединения приобретают неправильную угловатую форму (фрагмент «д»). Наряду с изменениями в клеточной стенке определяются нарушения в структуре ядра, которые характеризуются фрагментарным распадом (фрагмент «е»). Изменения в ядре клетки проявляются в основном при воздействии микозидина в

концентрациях 7.8 и 15,6 мкг/мл. Эти изменения регистрируют«^ у 75 - 90 % поврежденных клеток, по отношению к 100 исследуемых (Рис. I).

Рисунок 1

а - клетки С. albicans в норме: б - небольшие изменения в клеточной стенке С. albicans; в - лизис структуры клеточной стенки; г полное разрушение клеточной стенки; л - клетки С. albicans неправильной формы: с - фрагментарный распад структуры ядра.

* Исследования проведены совместно с к. б. п. Л.Ф. Стебаевой

Изучение возможности развитии лекарственной резистентности грибок к микозиднну показало, что после 12 последовательных пассажей штамма Microspore) m can is 3/84 на среду Сабуро с микозидином чувствительность грибов к препарату не изменяется (минимальная подавляющая концентрация составляет 7,8 мкг/мл). 13 последовательных Пассажей штаммов Candida albicans и Candida tropical!:; (Ленинград) на среде Сабуро с микозидином Привело к увеличению показателя Исходной концентрации с 31,2 - 62,5 мкг/мл до 1000 - 2000 мкг/мл, что свидетельствует о некотором нарастании резистентности. Следует отметить, что при последующих 7 пассажах культивирования на среде без микози-дина устойчивость культуры грибов к препарату практически не изменялась (исходная концентрация в пределах 500,0 - 1000 мкг/мл в зависимости от штамма).

Изучение химиотерапевгнческой эффективности микозидииа на экспериментальной модели микроспории морских свинок. Инфекционный процесс характеризовался наличием гиперемии кожи, изъязвлений, геморрагических корок, обильного крупно- и мелко пластинчатого шелушения в очагах поражения, специфическим свечением пораженных волосков в лучах лампы Вуда. Результаты посева и микроскопии материала из области поражения в контрольной группе были положительные. В контрольной группе животных стихание патологического процесса наблюдалось к 35 дню после инфицирования. При применении животным мази микозидина на 14 день явления roc паления регрессировали, на коже s очагах наблюдалось обильное мелкопластинчатое шелушение. К 2) дню поверхность очагов очищалась, и кожа приобретала бледно-розовую окраску. Восстановление шерстного покрова наблюдалось по окончании применения мази. Специфическое свечение отросших волосков в лучах лампы Вуда прекращалось. Результаты посева и микроскопий отросших волосков становились отрицательными.

баллы

Рисунок 2

Ш 2% мая, Я контроль

□ 3% мазь

□ 5% мазь ■ контроль

дни лечения

р < 0,05 относительно контроля для 2% мази;

р < 0,01 относительно контроля для 3% и 5% мазей.

На рисунке 2 четко Прослеживается разница в уменьшении площади свечения у контрольных и леченных животных и незначительные различия при лечении мазью ми коз иди на в разных концентрациях.

Химиотерапевтическая эффективность 2%, 3% и 5% мази микозидина на модели микроспории морских свинок.

Препарат Результат

7 день лечения 14 день лечения 21 день лечения 7 день после окончания лечения

ИП (баллы) ИП (%) ТЭ (%) ИП (баллы) ИП (%) ТЭ (%) ИП (баллы) ИП (%) ТЭ (%) ИП (баллы) ИП (%) ТЭ (%)

Мазь микозидина 2% 3,5 87,5 12,5 0,7 20,0 80,0 0,18 9,5 90,5 0,08 8,9 91,1

Контроль 4,0 100 0 3,5 100 0 1,9 100 0 0,9 100 0

Мазь микозидина 3% 2,8 96,56 3,44 1,8 62,5 37,5 0,6 22,3 77,7 0,2 7,7 92,3

Мазь микозидина 5% 2,3 79,4 20,6 1 25,8 64,2 0,2 7,5 92,5 0,18 7,0 93,0

Контроль 2,9 100 0 2,8 100 0 2,7 100 0 2,6 100 0

ИП - индекс поражения

ТЭ - терапевтическая эффективность

Изучение химиотералевтической эффективности микозидина в виде мазей 2%, 3% и 5% концентраций, показало, что все они оказывают одинаковое химиотерапевтическое действие на указанной модели (Табл.5).

Сравнение полученных результатов показало, что различия в химиотералевтической эффективности мазей микозидина во всех изученных концентрациях (2%, 3% и 5%) на одинаковой основе статистически несущественны (2% - 91,1%; 3% - 92,3%; 5% - 93,0%, соответственно). Однако в процессе исследований было отмечено раздражающее действие (геморрагические корки, эрозии) при применении 5 % мази в течение всего периода нанесения препарата. По срокам излечения животных эффективность микозидина в виде мази 2% и 3% практически не различались. Однако в группе животных леченных 3 % мазью микозидина инфекционный процесс протекал менее интенсивно, пораженные очаги в процессе эксперимента были покрыты белыми чешуйками с последующим быстрым очищением кожи и равномерным восстановлением шерстного покрова с 20-го дня лечения.

По окончании исследования визуальное обследование кожи не выявило покраснения, трещин, нарушения эластичности, отёчности свидетельствующих о наличии раздражающего действия у животных получавших аппликации 3 % мази микозидина. Гистологическое исследование* показало, что препарат не вызывает изменений в соотношении толщины слоев и сдвигов в интенсивности пролиферативно-десквамативных процессов в эпидермисе. Поверхностный слой эпидермиса с признаками структурно-функциональной активности пронизан выводными протоками желез и волосками шерстного покрова. В волокнистой дерме расположены волосяные фолликулы и неповрежденные потовые и сальные железы. Следов экспериментального воздействия не обнаружено. Таким образом, мазь микозидина местно-раздражающим действием не обладает.

Макроскопическое исследование внутренних органов статически достоверных различий между контрольными и подопытными животными не выявило. Гистологическое исследование не выявило структурных изменений во внутренних органах животных. Патологических изменений в гематологических и биохимических показателях крови животных не обнаружено. Таким образом, аппликация 3% мази микозидина не вызывает патологических изменений в структуре внутренних органов и крови морских свинок.

В связи со всем вышеизложенным для проведения дальнейших исследований выбрана 3% мазь микозидина.

Изучение антибактериальной активности микозидина.

Учитывая возможность присоединения вторичной бактериальной инфекции при развитии местных грибковых поражений кожи, было изучено влияние микозидина (субстанция) на различные виды бактерий. Результаты представлены в таблицах 6, 7 и 8.

* Исследования проведены совместно с к. м. н. С.А. Шаровой.

Таблица 6.

Антибактериальная активность микозидина в отношении факультатив-

Микроорганизмы кол-во штам- Минимальная

мов подавляющая

концентрация

мкг/мл

Bacillus cereus 1 31,2

Сorynebaterium diphtheriae 1 125,0

Staphylococcus aureus 5 31,2-62,5

Streptococcus pyogenes 2 31,2

Таблица 7.

Антибактериальная активность в отношении грамположительных аэробных бактерий на плотной питательно среде.

Микроорганизмы кол-во штам- Минимальная по-

мов давляющая концентрация мкг/мл

Bacillus cereus 3 62,5-125,0

Bacillus subtilis 2 125,0-250,0

Corynebaterium diphtheriae 1 125,0

Micrococcus spp. 2 62,5-125,0

Staphylococcus aureus 9 62,5-125,0

Staphylococcus epidermidis 1 31,2

Streptococcus pyogenes j 62,5-250,0

Streptococcus faecium 4 125,0-250,0

Показано, что микозидин (субстанция) п концентрациях 31,2 - 62,5 мкг/мл проявляет бактериостатический эффект, а в концентрации 250,0 мкг/мл, что соответствует 0,25 % концентрации действующего вещества, оказывает бактерицидное действие в отношении стафилококка при 24 часовой экспозиции.

Таблица 8.

Антибактериальная активность микозидина в отношении факультативных

грамотрицательных аэробных бактерий на жидкой питательной среде.

Микроорганизмы кол-во штаммов Минимальная подавляющая концентрация мкг/мл

Escherichia coli 1 500,0

Klebsiella pneumoniae 1 > 500,0

Proteus vulgaris 1 500,0

Pseudomonas aeruginosa 1 500,0

Salmonella typhi 1 > 500,0

Shigella flecsneri 1 > 500,0

Минимальная подавляющая концентрация микозидина (субстанции) в отношении грамотрицательных бактерий (кишечная палочка, протей и си-негнойная палочка) на жидкой питательной среде - > 500,0 мкг/мл. Препарат не оказывает бактерицидного действия в отношении этих бактерий.

Изучение противовирусной активности микозидина* с целью выявления широты его биологического действия проведенное в отношении вируса гриппа Аг/АюЫ (№N2) и вируса простого герпеса (ВПГ-1 типа), штамм «ЕС», штамм «Коптев», показало, что субстанция микозидина в концентрации 1,0 мг/мл и 0,5 мг/мл оказывает вирулицидное действие, подавляя инфекционные свойства одной пятидесяти процентной дозы (1Л)50) вируса гриппа. При использовании меньшей концентрации микозидин не активен. 3 % мазь микозидина оказывает вирулицидное действие в отношении вируса герпеса простого, нейтрализуя инфекционные свойства Ш)50 (50 % летальной дозы) вируса в концентрациях 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл. Мазевая основа ви-рулицидного действия на вирус герпеса простого не оказывает.

Изучение влияния микозидина на фагоцитарную активность пери-

тониальных макрофагов* показало, что субстанция микозидина в изученных дозах в той или иной степени активизировала показатели фагоцитоза. Ингибирование активности ни в одном случае не наблюдалось табл. 9.

Таблица 9.

Влияние микозидина на фагоцитарную активность макрофагов в опытах т

vitro.

макрофагальная фа- фагоцитарное фагоцитарный

Доза гоцитарная актив- число индекс

ность

Усл.ед. % Усл.ед. % Усл.ед. %

. 10 мкг\мл 64 125 5,9 170 3,8 214

1,15-10"8 66 139 , 4,5 130 3,0 168

мг\кг

' 1,15-10"* 67 148 6,1 192 2,8 148

1,15-10 -1и 80 177 6,5 204 4,1 218

1,15-10'" 54 105 3,3 93 2,8 155

1,15-10~" 54 105 3,4 97 2,9 167

Контроль 51 100 3,5 100 1,8 100

Наибольшая активность макрофагов проявляется под влиянием доз 10 мкг\мл и сверхмалой дозы до 1,15 • 10''0 мг/кг.

^Исследования проведены совместно с к. б. н. И.С. Николаевой.

* Исследования проведены совместно с к. б. н. Л.Ф. Стебаевой

Применение микозидина в виде 3% мази в течение 7 дней активизирует фагоцитоз. При этом в 2 и более раз по отношению к контролю (мазевой основе) увеличиваются показатели фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа, т.е. значительно активизируются отдельно взятые клетки (Табл.10).

Таблица 10.

Влияние микозидина в виде мази на фагоцитарную активность макрофагов в экспериментах in vivo.

Доза макрофагаль-ная фагоцитарная активность фагоцитарное число фагоцитарный индекс

Усл. ед. % Усл. ед. % Усл. ед. %

Мазь 3% 75,7 117,3 16,02 240 5,91 131

Контроль 64,5 100 6,65 100 4,5 100

Изучение антимикотической активности микозидина в сравнении с итраконазолом и кетоконазолом.

Результаты сравнительного изучения противогрибковой активности субстанции микозидина с другими противогрибковыми препаратами в опытах in vitro представлены в таблице 11.

Таблица 11.

Антимикотическая активность субстанции микозидина

в сравнении с итраконазолом и кетоконазолом_

Микроорганизмы Число штам MOB Минимальная подавляющая концентрация мкг/мл

Микозидин Итраконазол Кетоконазол

Candida albicans 5 4,0-125,0 0,12 0,02-80,0*

Candida tropicalis 1 31,2-62,5 0,06 0,06-0,12

Microsporum canis 5 3,9-7,8 7,8-31,2 0,1-64,0*

Mucor pusillus 1 200,0 - 100,0

Pseudoallesheria boydii 1 50,0 - 1,0

Trichophyton gyrseum 2 3,9-15,6 3,9-31,2 -

Trichophyton mentagrophytes 8 3,9-15,6 3,9-62,5 0,01-128,0*

Trichophyton rubrum 1 31,2 - 0,01-128,0*

*Примечания: по данным литературы. - нет данных

Микозидин в виде субстанции был активен в отношении возбудителей микроспории и трихофитии (минимальная подавляющая концентрация 3,9 -15,6 мкг/мл); фунгицидное действие препарата отмечено в концентрации, равной или в 2 - 4 раза превышающей минимальную подавляющую концен-

трацию. Препарат сравнения итраконазол проявляет близкую активность (минимальная подавляющая концентрация 3,9-31,2 мкг/мл). По данным литературы кетоконазол подавляет рост Microsporum canis (24 штамма) в пределах концентрации от ОД до 64,0 мкг/мл в зависимости от штамма.

В опытах с Candida albicans минимальная подавляющая концентрация составила 4,0 - 125,0 мкг/мл в зависимости от штамма, питательной среды и условий эксперимента. В концентрации 0,25 % и выше субстанция микози-дина оказывала фунгицидное действие на Candida albicans. Используемые в исследовании штаммы Candida albicans были чувствительны к итраконазолу в концентрации 0,12 мкг/мл. Активность субстанции микозидина в опыте с Candida albicans в зависимости от штамма колебалась от 4,0 до 250,0 мкг/мл. Пределы колебаний минимальной подавляющей концентрации для кетокона-зола по данным литературы (472 штамма), составляют от 0,02 до 80,0 мкг/мл. Исследуемые нами штаммы Candida tropicalis были чувствительны к субстанции микозидина в концентрациях 31,2 - 62,5 мкг/мл. Препараты сравнения оказывали противогрибковое действие на испытуемый гриб в концентрациях 0,06 - 0,12 мкг/мл.

Субстанция микозидина в концентрации 100,0 мкг/мл оказывала фунги-статическое действие на Mucor pussilus 158/3848, что проявлялось в задержке роста гриба на 3-е суток; в концентрации 200,0 мкг/мл препарат обеспечивал задержку роста гриба на 5 суток. Кетоконазол в концентрациях 100,0 и 200,0 мкг/мл также оказывал на испытуемый гриб фунгистатическое действие. Субстанция микозидина в концентрации 50,0 мкг/мл задерживала рост гриба Pseudoallecheria boydii в течение 5 суток. Кетоконазол сдерживает рост этого гриба в течение 3 суток уже в концентрации 1,0 мкг/мл; в течение 4 суток в концентрации 10,0 мкг/мл, а в концентрации 50,0 мкг/мл оказывал фунгицидное действие. Субстанция микозидина в концентрации 3,9-31,2 мкг/мл подавляла рост грибов Trichophyton rubrum 309/631 и Trichophyton mentagrophytes (var. Intradigitalis) 317/26 и по антифунгальной активности была близка к кетоконазолу. По данным литературы активность кетоконазола в опытах с Trichophyton mentagrophytes (75 штаммов) проявлялась в концентрациях от 0,01 до 128,0 мкг/мл.

Сравнительное изучение эффективности 3 % мази микозидина и других противогрибковых препаратов на модели экспериментальной микроспории морских свинок показало что микозидин и референтные препараты оказывают выраженный терапевтический эффект при местном применении на модели экспериментальной микроспории морских свинок (табл. 12).

Таблица 12.

Эффективность различных противогрибковых препаратов и 3% мази микозидина на модели микроспории морских свинок.

Препарат % Индекс Начало вос- Химиотера- Результаты

дей- пора- становле- певтическая посева и

ствую жения ния шерст- эффектив- микроско-

щего (%) ного по- ность пии

веще- крова, дни (%)

ства лечения

крем Канестен (клотримазол) 1 77,8 23 22,2 Полож.

мазь Микозидин 3 30,0 20 70,0 Отриц.

мазь Микозолон 83,1 15 16,9 Полож.

(миконазол + мазипредон)

крем Микоспор (бифоназол) 1 2,5 25 97,5 Отриц.

крем Мифунгар (оксиконазол) 1 34,7 18 65,3 Отриц.

крем Низорал (кетоконазол) 2 57,5 15 42,5 Полож.

раствор Нитрофунгин 1 55,6 25 44,4 Полож.

Контроль 100 30 0 Полож.

Использование всех изученных препаратов на фоне развившейся грибковой инфекции укорачивало период заболевания. Однако степень эффективности препаратов была различной. Наибольшей эффективностью обладали два препарата: 1 % крем Микоспора (бифоназол) и 3 % мазь Микозидина. В группах животных, леченных этими препаратами, был отмечен высокий процент излеченности грибковой инфекции, при 21 дневном курсе лечения, что было подтверждено различными методами исследования. В группах животных, леченных кремом Микоспор 1 % (бифоназол), кремом Канестен 1 % (клотримазол) и раствором Нитрофунгин в областях поражения длительно сохранялись явления воспаления в виде гиперемии и некрозов кожи, что может свидетельствовать о местно-раздражающем действии этих препаратов. У животных этих групп отмечено и более позднее восстановление шёрстного покрова, которое наблюдалось только после окончания нанесения препаратов на кожу. Применение остальных исследуемых противогрибковых препаратов не приводило к санации области поражения за данный период времени, что приводило к необходимости продолжения лечения после купирования всех видимых проявлений заболевания, до получения отрицательных результатов микроскопического и культурального исследований. Таким образом, на данной модели были показаны преимущества 3% мази микозидина перед другими изученными противогрибковыми средствами.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Углубленное изучение антимикотической активности на 28 лабораторных и клинических штаммах патогенных грибов в опытах in vitro на различных питательных средах, выявило значительную активность субстанции ми-козидина. Минимальная подавляющая концентрация при воздействии на дерматофиты составляла 3,9 - 7,8 мкг/мл и на дрояокеподобные грибы 4,0 -125,0 мкг/мл. Фунгицидное действие на вышеперечисленных возбудителей субстанция микозидина оказывает в концентрациях равных или в 2 - 4 раза превышающих фунгистатическую концентрацию. Активность микозидина в отношении возбудителей глубоких микозов (Mucor pussilus, Cryptococcus neoformans, Pseudoallecheria boydii, Aspergillus ilimigatus) оказалась значительно ниже.

Электронно-микроскопические исследования показали, что субстанция микозидина в исследуемых концентрациях обладает фунгицидным типом действия на клетки патогенных грибов. Отсутствие лекарственной резистентности у грибов Microsporum canis и медленное развитие ее у Candida albicans и Candida tropicalis к субстанции микозидина имеет большое значение при терапии грибковых инфекций, требующих длительного применения лекарственных средств.

На основании проведенных исследований химиотерапевтической эффективности микозидина на экспериментальной модели микроспории морских свинок выбрана наиболее эффективная лекарственная форма в виде мази 3% концентрации. Показана хорошая переносимость животными 3% мази микозидина при длительном местном применении.

Препарат не оказывал отрицательного воздействия на состояние гомео-стаза экспериментальных животных, что было подтверждено клиническими гематологическими, биохимическими и патоморфологическими методами исследования. При применении исследуемой мази у интактных животных местно-раздражающего действия не выявлено.

Наличие антибактериальной и противовирусной активности у микозидина имеет большое значение при лечении микозов, осложненных вторичной инфекцией бактериями или вирусами. Результаты, полученные при изучении влияния микозидина на фагоцитарное звено иммунитета, показали, что даже при применении небольших доз препарата происходит активизация фагоцитоза. Грибковые поражения гладкой кожи нередко протекают на фоне сниженного иммунитета, поэтому наличие у микозидина способности положительно влиять на фагоцитарное звено иммунитета может обеспечить его преимущество перед другими противогрибковыми препаратами (канестен, мико-золон, микоспор, мифунгар, низорал, нитрофунгин).

Сравнение эффективности и переносимости 3% мази микозидина с различными противогрибковыми препаратами показало, что микозидин сопоставим по эффективности с бифоназолом и превышает клотримазол, нитрофунгин, оксиконазол и кетоконазол. При применении бифоназола, клотрима-зола и нитрофунгина на пораженной грибом коже животных длительно сохранялись гиперемия и участки некроза, отмечалось более позднее восста-

новление шерстного покрова, что не наблюдалось при лечении микозиди-ном. Все это свидетельствуют о более высокой эффективности и хорошей переносимости 3% мази микозидина.

На основании экспериментальных данных были разработаны рекомендации по клиническому изучению 3% мази микозидина. Препарат исследовался в лечении больных микозами гладкой кожи и других локализаций, вызванными дерматофитами: Microsporum canis, Trichophyton gyrseum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum и дрожжеподобными грибами рода Candida.

На основании данных, полученных при клинических исследованиях, установлено, что 3% мазь микозидина эффективна при лечении дерматомико-зов гладкой кожи. Химиотерапевтическая эффективность мази составила от 76,6 до 90% в зависимости от вида возбудителя, локализации и распространенности процесса. После окончания лечения не было выявлено изменений в данных лабораторных исследований крови пациентов. Таким образом, клинические исследования подтвердили высокую эффективность 3% мази микозидина при хорошей переносимости, и препарат был рекомендован к медицинскому применению.

ВЫВОДЫ

1.Микозидин (субстанция) в опытах in vitro ингибирует рост патогенных грибов дерматофитов (минимальная подавляющая концентрация от 3,9 до 31,2 мкг/мл) и дрожжеподобных грибов рода Candida (минимальная подавляющая концентрация от 4,0 до 125,0 мкг/мл), что показано на 23 лабораторных и клинических штаммах этих возбудителей.

2.Микозидин (субстанция) вызывает изменение структуры клеток грибов рода Candida, что подтверждается методом электронной микроскопии и свидетельствует о его фунгицидной активности.

3.Показано отсутствие развития резистентности к микозидину (субстанция) у патогенных грибов Microsporon canis и медленное развитие ее у Candida albicans и Candida tropicalis.

4.Микозидин (субстанция) оказывает бактерицидное действие в отношении аэробных грамположительных бактерий и бактериостатическое в отношении облигатных неспорообразующих анаэробных бактерий.

5.Микозидин (3% мазь и субстанция) обладает противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа Аг/Aichi (H3N2) и вируса простого герпеса (ВПГ-1 типа).

6.Микозидин (3% мазь) стимулирует активность перитониальных макрофагов, оказывая положительное влияние на клеточное звено иммунитета.

7.Микозидин в виде 3% мази оказывает высокий химиотерапевтический эффект на модели экспериментальной микроспории морских свинок, сопоставимый с эффектом бифоназола и превосходящий эффект известных противогрибковых препаратов: клотримазола, нитрофунгина, кетоконазола, оксико-назола.

8. Лекарственная форма микозидина в виде 3% мази хорошо переносится экспериментальными животными и не оказывает местно-раздражающего действия.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шилова И.Б., Т.А. Гуськова, Т.В. Пушкина, Р.Г. Глушков. Химиоте-рапевтическая эффективность РГ-04 и препарата низорал в эксперименте.// Тезисы докладов V Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии». Москва 2003 г. с. 53. в).

2. Шилова И.Б., Т.А. Гуськова, Р.Г. Глушков. Антимикробная активность нового противогрибкового средства. //Тезисы докладов V Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии». Москва 2003 г. с. 60.

3. Шилова И.Б., Т.А. Гуськова, Р.Г. Глушков). Современные лекарственные средства для лечения дерматомикозов.// Химико-фармацевтический журнал, т 38, № 4, Москва, 2004 г. с. 3-9.

4. Шилова И.Б., Т.А. Гуськова, Т.В. Пушкина, Р.Г. Глушков, И.Б. Лев-шин. Химиотерапевтическая активность производного тиазолидин-2,4-диона и препарата мифунгар в эксперименте. // Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» Москва 2004 г. с. 403.

5. Шилова И.Б, Т.А. Гуськова, Н.В. Волчкова. Сравнительная эффективность некоторых современных противогрибковых средств.// Химико-фармацевтический журнал, т 39, № 5, Москва 2005, с 3-5.

6. Шилова И.Б., Т.В. Пушкина, Т.А. Гуськова. Сравнительная химиотерапевтическая эффективность нового антимикотика, производного тиазоли-дин-2,4-диона и препаратов Мифунгар и Низорал в эксперименте.// Материалы четвёртого всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва 2006 г. том VII. глава 5, с 156-157.

7. Т.В. Пушкина, Шилова И.Б., С.А. Шарова, В.В. Чистяков, Ж.В. Степанова, А.Ю. Новоселов, Н.В. Кожичкина, O.A. Козюкова. Экспериментально-клиническое изучение мази нового производного тиазолидин-2,4-диона - микозидина при лечении дерматомикозов гладкой кожи.// Материалы пятого всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва 2007 г. том X. глава 4, с 94-95.

8. Р.Г. Глушков, Т.А. Левчук, И.Б. Шилова, Т.А. Гуськова. Патент изобретения № 2 295 958 Фармацевтический состав для лечения грибковых заболеваний и способ его получения// Бюллетень № 9 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам. «Изобретения» 27.03.2007 г.

Шилова Ирина Борисовна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 16.04.2007 г. Формат 60x90, 1/16. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 175

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Краснопрудная, вл. 13. т. 264-30-73 www.blokO 1 centre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы:

Лечение грибковых инфекций кожи и ногтей представляет давнюю проблему с неубывающей актуальностью, так как это одно из наиболее длительно существующих, широко распространённых и трудно излечиваемых контагиозных заболеваний человека. По частоте, быстроте распространения и глобальности грибковые инфекции приближаются к обычным простудным заболеваниям. Среди дерматофитий наиболее распространённой инфекцией, занимающей, второе место после микозов стоп является микроспория гладкой кожи.

Несмотря на достаточно обширный класс разнообразных химических соединений, как природного происхождения, так и полученных путём химического синтеза, обладающих специфической активностью в отношении патогенных грибов, существующие противогрибковые препараты полностью не решают проблемы химиотерапии микозов. Трудности лечения определяются локализацией и характером патологического процесса, а также хроническим течением заболевания и частыми рецидивами. Наличие у пациентов нарушений в иммунной системе, периферической иннервации и кровоснабжении на фоне сопутствующих заболеваний, длительного приёма антибиотиков широкого спектра действия, цитостатиков, влияния вредных факторов внешней среды ослабляет устойчивость организма к патогенным грибам. В связи, с этим растёт число больных микозами кожи и её придатков, вызванными не только облигатными возбудителями, но и оппортунистическими грибами (О. В. Бакланова, Е.Н. Падейская 1987; Ю.С. Бутов 2002; О.И. Мендель 2002; С.А. Бурова и соавт. 1999).

В настоящее время в клинической практике имеется определенный выбор препаратов, обладающих антимикотической активностью, как системного, так и локального действия, но вызываемые ими побочные или токсические эффекты нередко ограничивают их применение в медицинской практике. Например, антибиотик гризеофульвин обладает высокой токсичностью, тератогенным и эмбриотоксическим действием. Производные имидазола и триазола (кетоконазол, итраконазол, бифо-назол, оксиконазол, флуконазол, клотримазол) при системном применении в разной степени обладают гепатотоксичностью и неблагоприятным действием на эндокринные органы, при местном применении способствуют возникновению аллергических реакций. Производные группы аллиламинов (тербинафин, тол-нафтат, нафтифин) при системном применении оказывают побочное действие на желудочно-кишечный тракт и отрицательное инотропное действие. При длительном местном применении способствуют развитию аллергических реакций.

В связи с этим поиск, разработка и внедрение в практическое здравоохранение высокоактивных и малотоксичных лекарственных средств, способных специфически воздействовать на патогенные грибы, не оказывая при этом нежелательного действия на организм, является актуальным.

В ФГУП Центре химии лекарственных средств - ВНИХФИ с 1983 года, ведутся систематические исследования по синтезу и биологическому изучению в ряду производных тиазолидин

2,4-диона. Противогрибковые лекарственные средства в этом ряду соединений не описаны. Синтезировано 105 оригинальных производных тиазолидин-2,4-диона. На основании скрининго-вых исследований было отобрано одно соединение, показавшее противогрибковую активность, что явилось основанием для углублённого изучения этого вещества, которое получило название микозидин.

Представлялось целесообразным изучить широту спектра противогрибковой активности микозидина, его влияние на клетку патогенного гриба, возможность развития устойчивости к нему патогенных грибов; оценить другие виды биологической активности микозидина, его резорбтивное и местное воздействие на организм животных. Решение данной проблемы позволило бы предложить для клинического изучения новое средство лечения грибковой инфекции гладкой кожи.

Цель исследования:

Изучить противогрибковую и другие виды биологической активности оригинального отечественного средства микозидина в исследованиях in vitro и in vivo, для создания потенциального антифунгального лекарственного препарата в виде мази.

Задачи исследования:

1. Изучить спектр антимикотической активности микозидина в опытах in vitro в отношении различных видов патогенных грибов.

2. Определить влияние микозидина на ультраструктуру клеток патогенного гриба и возможность развития к нему устойчивости возбудителей.

3. На модели экспериментальной микроспории морских свинок установить зависимость противогрибкового эффекта микозидина от его концентрации при местном применении в виде мази.

4. Оценить местное и резорбтивное действие микозидина в виде мази 3% концентрации, как наиболее эффективной на модели экспериментальной микроспории морских свинок.

5. Оценить химиотерапевтическую эффективность микозидина в виде 3 % мази на модели экспериментальной микроспории морских свинок в сравнении с широко применяемыми в настоящее время противогрибковыми препаратами (канестен, микозолон, микоспор, мифунгар, низорал, нитрофунгин).

6. Исследовать другие виды биологической активности (антибактериальную и противовирусную), а также его влияние на фагоцитарное звено иммунитета.

Научная новизна работы:

1. Установлено, что микозидин обладает широким спектром биологической активности: противогрибковой, антибактериальной и противовирусной.

2. Впервые изучено повреждающее действие микозидина на ультраструктуры клетки патогенного гриба.

3. Впервые в опытах in vitro путем многократных пассажей установлено отсутствие развития резистентности к мико-зидину у патогенных грибов.

4. Впервые установлена зависимость противогрибковой эффективности и переносимости микозидина от его концентрации при местном применении в виде мази, что позволило отобрать для клинических исследований мазь 3% концентрации.

5. На модели экспериментальной микроспории морских свинок впервые показано при местном применении преимущество 3 % мази микозидина перед широко применяемыми в настоящее время противогрибковыми препаратами: ка-нестеном, мифунгаром и низоралом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На модели микроспории морских свинок микозидин при местном применении обладает высокой эффективностью, превосходящей современные противогрибковые средства для местного применения.

2. В опытах in vitro микозидин оказывает антибактериальное и противовирусное действие, стимулирует фагоцитарное звено иммунитета.

3. Отсутствует развитие устойчивости к микозидину у патогенных грибов.

Научно-практическая значимость работы:

1. Полученные результаты, свидетельствующие о высокой противогрибковой активности и хорошей переносимости микозидина в виде 3% мази, включены в пакет документов для получения разрешения на проведение его клинических исследований в качестве противогрибкового средства.

2. Наличие у микозидина антибактериальной и противовирусной активности, а также положительного влияния на фагоцитарное звено иммунитета обеспечивает его значительные преимущества перед применяющимися в настоящее время противогрибковыми средствами (канестен, микозолон, микоспор, мифунгар, низорал, нитрофунгин).

3. В настоящее время клинические испытания 3 % мази микозидина прошли успешно, и препарат рекомендован к медицинскому применению (Протокол №1 от 18.01.2007 г. заседания Бюро Федерального государственного учреждения Научного центра экспертизы средств медицинского применения Росздрава).

ВЫВОДЫ

1.Микозидин (субстанция) в опытах in vitro ингибирует рост патогенных грибов дерматофитов (минимальная подавляющая концентрация от 3,9 до 31,2 мкг/мл) и дрожжеподоб-ных грибов рода Candida (минимальная подавляющая концентрация от 4,0 до 125,0 мкг/мл), что показано на 23 лабораторных и клинических штаммах этих возбудителей.

2.Микозидин (субстанция) вызывает изменение структуры клеток грибов рода Candida, что подтверждается методом электронной микроскопии и свидетельствует о его фунгицидной активности.

3.Показано отсутствие развития резистентности к мико-зидину (субстанция) у патогенных грибов Microsporum canis и медленное развитие ее у Candida albicans и Candida tropicalis.

4.Микозидин (субстанция) оказывает бактерицидное действие в отношении аэробных грамположительных бактерий и бактериостатическое в отношении облигатных неспорообра-зующих анаэробных бактерий.

5.Микозидин (3% мазь и субстанция) обладает противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа Аг/Aichi (H3N2) и вируса простого герпеса (ВПГ-1 типа).

6.Микозидин (3% мазь) стимулирует активность перито-ниальных макрофагов, оказывая положительное влияние на фагоцитарное звено иммунитета.

7.Микозидин в виде 3% мази оказывает высокий химио-терапевтический эффект на модели экспериментальной микроспории морских свинок, сопоставимый с эффектом бифоназола и превосходящий эффект известных противогрибковых препаратов: клотримазола, нитрофунгина, кетоконазола, оксиконазо-ла.

8.Лекарственная форма микозидина в виде 3% мази хорошо переносится экспериментальными животными и не оказывает местно-раздражающего действия.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Углубленное изучение in vitro антимикотической активности субстанции микозидина, проведенное на 28 лабораторных и клинических штаммах патогенных грибов: Microsporum canis 3/84, 50, 53, 4111, 4304; Trichophyton gyrseum 5/85, 2/92; Candida albicans 1755, 13 и Candida tropicalis (Ленинград), показало значительную его активность.

Минимальная подавляющая концентрация микозидина (субстанция) при воздействии на дерматофиты (Microsporum canis 3/84, 50, 53, 411 1, 4304; Trichophyton gyrseum 5/85, 2/92) составляла 3,9 - 7,8 мкг/мл.

Минимальная подавляющая концентрация субстанции микозидина в отношении патогенных дрожжеподобных грибов рода Candida spp. (Candida albicans 1755, 13 и Candida tropicalis (Ленинград) определялась в пределах 4,0 - 125,0 мкг/мл.

Фунгицидное действие в отношении вышеперечисленных возбудителей субстанция микозидина оказывала в концентрациях равных или в 2 - 4 раза превышающих его фунгистатические концентрации.

Возбудители глубоких микозов (Mucor pussilus, Crypto-coccus neoformans, Pseudoallecheria boydii, Aspergillus fumigatus) были менее чувствительны к микозидину (субстанция). Если минимальная подавляющая концентрация субстанции микозидина в отношении Aspergillus fumigatus и Pseudoal-lesheria boydii составляла 50 мкг/мл, то в отношении Cryptococ-cus neoformans она была больше или равна 200 мкг/мл. Штамм Mucor pusillus был чувствителен к микозидину (субстанция) в концентрации 200 мкг/мл.

Сравнительное изучение активности субстанции микозидина и субстанций итраконазола и кетоконазола, взятых как действующих веществ, наиболее часто использующихся в клинической практике для лечения грибковых поражений кожи, показало, что активность микозидина (субстанция) в отношении дерматофитов сопоставима с активностью препаратов сравнения. Так, микозидин в виде субстанции проявил активность в отношении Microsporum canis и Trichophyton gyrseum в незначительных пределах колебаний минимальных подавляющих концентраций 3,9 - 15,6 мкг/мл, препарат сравнения итракона-зол был также активен, но в больших пределах колебаний минимальных подавляющих концентраций 3,9 - 31,2 мкг/мл.

Фунгицидное действие обоих препаратов проявлялось в равных концентрациях и было примерно в 2 - 4 раза выше фун-гистатических концентраций. Наши данные согласуются с данными литературы по активности кетоконазола в отношении дерматофитов. Так, по данным литературы пределы колебаний минимальных подавляющих концентраций кетоконазола в отношении Microsporum canis составляют от 0,1 до 64,0 мкг/мл в зависимости от штамма и питательной среды.

Сопоставима активность субстанции микозидина с активностью другого противогрибкового препарата - итраконазола. В наших исследованиях показатели активности этих двух препаратов были близки друг другу в отношении грибов Trichophyton rubrum и Trichophyton mentagrophytes (var. Intradigitalis). Активность кетоконазола в отношении этих возбудителей, по данным литературы, колебалась в значительных пределах концентраций от 0,01 до 128,0 мкг/мл.

По показателю активности в отношении дрожжеподобных грибов рода Candida, исследуемых в данном эксперименте, микозидин (субстанция) был менее активен, чем итраконазол и ке-токоназол. Концентрация субстанции микозидина, оказывающая фунгистатическое действие, значительно колебалась в зависимости от штамма возбудителя и питательной среды и составляла 4,0 - 125,0 мкг/мл. Фунгистатическая концентрация субстанций итраконазола и кетоконазола находилась в пределах 0,06 -0,12 мкг/мл.

Противогрибковая активность субстанции микозидина была сопоставима в наших экспериментах с активностью кетоконазола в отношении патогенного гриба Mucor pusillus, относящегося к возбудителям глубоких микозов. Фунгистатическая концентрация для обоих препаратов составляла 100,0 мкг/мл.

Электронно-микроскопические исследования показали, что субстанция микозидина в определенных концентрациях обладает фунгицидным типом действия на клетки патогенных грибов. Степень воздействия препарата на клетки гриба напрямую зависит от концентрации микозидина и времени экспозиции. При воздействии препарата в концентрациях 3,9 и 7,8 мкг/мл в течение 48 часов отмечено изменение 46,4 - 62,3 % клеток, а при воздействии в концентрации 15,6 мкг/мл в тот же промежуток времени 81 % по отношению к 100 исследуемым клеткам. В большинстве случаев эти изменения были необратимы, что может свидетельствовать о фунгицидной активности микозидина при определенных условиях использования. Установленное влияние микозидина на структуру гриба можно расценивать как механизм, обеспечивающий противогрибковую активность препарата.

Очень важным является установленное отсутствие лекарственной резистентности у грибов Microsporum canis и медленное развитие ее у Candida albicans и Candida tropicalis к субстанции микозидина. Это свойство препарата может иметь решающее значение при терапии грибковых инфекций, требующих длительного применения лекарственных средств. Хорошо известно, что ко многим современным противогрибковым препаратам быстро развивается устойчивость грибов, в связи с чем микозидин может иметь преимущества перед ними.

Изучение химиотерапевтической эффективности микозидина в виде мази 2%, 3% и 5% концентраций при местном применении на модели микроспории морских свинок показало высокую эффективность препарата при 21- дневном применении.

Химиотерапевтическая эффективность мазей микозидина была сопоставима во всех изученных концентрациях.

Лечение животных, начатое на фоне развившегося инфекционного процесса на 7 сутки после заражения, когда на коже в местах внесения инфекта были сформированы эритематозно-отечные пятна с четким периферическим валиком, покрытым пузырьками и чешуйками, частично сливавшимися между собой, образуя инфильтративные очаги, приводило к регрессии отмеченной патологии. Клиническая картина поражений к началу лечения подтверждалась наличием изумрудного свечения в лучах люминесцентного излучения, что характерно для патогенного гриба Microsporum canis, микроскопическими и культу-ральными показателями и была оценена в 3,5 балла в каждой из групп.

В процессе лечения животных, получавших накожные аппликации мази микозидина, проявления инфекционного процесса на коже (гиперемия, инфильтрация, шелушение, изъязвления, геморрагические корки) начали регрессировать через 14 дней применения препарата, в то время как в контрольной группе животных перечисленные выше явления сохранялись в течение всего периода наблюдения (28 дней). К 21 дню в подопытной группе животных поверхность очагов заражения полностью очищалась, кожа приобретала бледно-розовую окраску, начиналось равномерное восстановление шерстного покрова. Результаты посева и микроскопии отрастающих волосков по окончании эксперимента (28 день) в группах животных получавших лечение, были отрицательными. В контрольной группе животных до окончания наблюдения признаков восстановления шерстного покрова у животных не наблюдалось. Результаты посева и микроскопии единичных волосков по окончании эксперимента были положительными.

По эффективности мази, содержащие 2%, 3% или 5% микозидина, были сопоставимы. Однако в процессе сравнительной оценки всех параметров воздействия изученных мазей на экспериментальных животных для дальнейших исследований была выбрана 3% мазь микозидина.

Было отмечено, что при применении мази микозидина 5 % концентрации патологические явления (геморрагические корки, эрозии) сохраняются у животных более длительный срок, чем при применении мази 3% концентрации; очищение кожи в очагах начиналось только после окончания нанесения мази, что может быть косвенным свидетельством наличия раздражающего эффекта мази микозидина 5% концентрации. Кроме того, у животных, которых лечили 3% мазью микозидина, равномерный рост здоровых (не светящихся) волос отмечался в среднем с 20

- 21 дня эксперимента, а при использовании 5 % мази микозидина наблюдалось неравномерное восстановление шерстного покрова с 24 - 25 дня эксперимента, то есть после прекращения нанесения мази на кожу животных.

Снижение концентрации микозидина в мази до 2% нецелесообразно, поскольку в исследованиях in vitro была показана более низкая активность микозидина в отношении патогенных грибов родов Trichophyton и Candida, чем в отношении гриба Microsporum canis, который был использован в моделировании грибковой инфекции на морских свинках.

Таким образом, на основании проведенных исследований химиотерапевтической эффективности микозидина на экспериментальной модели микроспории морских свинок выбрана наиболее эффективная лекарственная форма в виде мази 3% концентрации. Показана хорошая переносимость животными 3% мази микозидина при длительном местном применении.

Препарат не оказывал отрицательного воздействия на состояние гомеостаза экспериментальных животных, что было подтверждено клиническими гематологическими, биохимическими и патоморфологическими методами исследования. При применении исследуемой мази у интактных животных местно-раздражающего действия не выявлено.

Наличие антибактериальной и противовирусной активности у микозидина, установленное в данном исследовании, имеет большое значение при лечении микозов, осложненных вторичной инфекцией бактериями или вирусами. Результаты, полученные при изучении влияния микозидина на фагоцитарное звено иммунитета, показали, что даже при применении небольших доз препарата происходит активизация фагоцитоза. Грибковые поражения гладкой кожи нередко протекают на фоне сниженного иммунного статуса, поэтому наличие у микозидина способности положительно влиять на фагоцитарное звено иммунитета может обеспечить его преимущество перед другими противогрибковыми препаратами.

Сравнение эффективности и переносимости 3% мази микозидина с различными противогрибковыми препаратами (кане-стен, микозолон, микоспор, мифунгар, низорал, нитрофунгин) показало, что микозидин сопоставим по эффективности с бифо-назолом и превышает клотримазол, нитрофунгин, оксиконазол и кетоконазол. При применении бифоназола, клотримазола и нит-рофунгина на пораженной грибом коже животных длительно сохранялись гиперемия и участки некроза, отмечалось более позднее восстановление шерстного покрова, что не наблюдалось при лечении микозидином. Применение остальных исследуемых противогрибковых препаратов не приводит к санации области поражения за данный период времени, что делает необходимым продолжение лечения после купирования всех видимых проявлений заболевания до получения отрицательных результатов микроскопического и культурального исследований.

Все это свидетельствуют о высокой эффективности и хорошей переносимости 3% мази микозидина.

На основании экспериментальных данных были разработаны рекомендации по клиническому изучению 3% мази микозидина. Клинические испытания, в ходе которых препарат исследовался у больных микозами гладкой кожи и других локализаций, вызванными дерматофитами: Microsporum canis, Trichophyton gyrseum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum и дрожжеподобными грибами рода Candida, была подтверждена высокая эффективность 3% мази микозидина.

Химиотерапевтическая эффективность мази составила от 76,6 до 90% в зависимости от вида возбудителя, локализации и распространенности процесса. После окончания лечения не было выявлено изменений в данных лабораторных исследований крови пациентов. Таким образом, клинические исследования подтвердили высокую эффективность 3% мази микозидина при хорошей переносимости, и препарат был рекомендован к медицинскому применению.